專利名稱：純化腺病毒顆粒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒制備領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及從細(xì)胞懸液純化腺病毒顆粒的改進(jìn)方法。
背景技術(shù)：
疫苗制備領(lǐng)域近來(lái)的進(jìn)展產(chǎn)生了對(duì)大規(guī)模生產(chǎn)的需求。亟需穩(wěn)健和高效的方法來(lái)為全世界提供足量的(重組)疫苗以對(duì)抗傳染病。針對(duì)傳染病的疫苗可以基于重組腺病毒顆粒。為此進(jìn)行了大量的努力以優(yōu)化基于細(xì)胞的腺病毒制備方法。將細(xì)胞以漸增密度培養(yǎng)，隨后感染以獲得更高的總病毒收率。
這樣的高細(xì)胞密度方法公開(kāi)于例如Crucell Holland BV的WO 2010/060719和Yuk etal. (2004)。其中描述了制備高濃度重組腺病毒的方法。這種優(yōu)化方法依賴于這樣的能力，即以高細(xì)胞密度(例如，高于5xl06細(xì)胞/ml)感染培養(yǎng)物并保留高的每細(xì)胞病毒產(chǎn)率。這提供一種在單生物反應(yīng)器中獲得高病毒濃度的收獲病毒溶液的方法。所述方法通常的病毒顆粒(VP)收率為約 I. 5-2. 5xl012VP/mL。以高密度培養(yǎng)細(xì)胞的方法易于積累大量的細(xì)胞碎片和宿主細(xì)胞DNA。在純化過(guò)程中必須進(jìn)一步除去這些污染物，而這是繁瑣的操作。US7326555最近公開(kāi)一種從收獲的細(xì)胞培養(yǎng)物除去宿主細(xì)胞DNA的方法。所述方法由選擇性地從細(xì)胞培養(yǎng)物沉淀宿主細(xì)胞DNA組成。選擇性沉淀劑可以特異性地結(jié)合宿主細(xì)胞DNA，并且不沉淀腺病毒顆粒。然而，該文獻(xiàn)中的方法僅對(duì)低細(xì)胞密度細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行描述，其中細(xì)胞碎片和宿主細(xì)胞DNA存在的量不聞。目前尚未知所述方法可以應(yīng)用于包含高細(xì)胞密度的培養(yǎng)物。相比之下，從現(xiàn)有技術(shù)可以推知的強(qiáng)烈建議是，當(dāng)以高濃度使用時(shí)用于所述方法的沉淀劑不會(huì)選擇性地從培養(yǎng)物沉淀宿主細(xì)胞DNA，并且會(huì)沉淀病毒顆粒(Goerke et al. 2004)。由于細(xì)胞培養(yǎng)方法是放大級(jí)別上升的，并且細(xì)胞以漸增的密度進(jìn)行培養(yǎng)，所以工業(yè)中亟需允許處理高細(xì)胞密度懸液的下游方法。這特別適用于腺病毒制備領(lǐng)域。發(fā)明概述本發(fā)明涉及從高細(xì)胞密度懸液中純化來(lái)自細(xì)胞裂解物的腺病毒顆粒的方法。我們?cè)诒疚闹邪l(fā)現(xiàn)，高細(xì)胞密度懸液中的宿主細(xì)胞DNA可以從裂解的細(xì)胞懸液選擇性地沉淀，而留下病毒顆粒不被沉淀。宿主細(xì)胞DNA的選擇性沉淀用陽(yáng)離子洗滌劑進(jìn)行。例如，此前US7326555中描述了低細(xì)胞密度懸液中的選擇性沉淀。然而，實(shí)現(xiàn)高細(xì)胞密度懸液中的選擇性沉淀尚無(wú)先例，并且是很難預(yù)期的。在現(xiàn)有技術(shù)中，例如在US7326555中，確實(shí)證實(shí)在低細(xì)胞密度懸液中(高達(dá)Ix IO6細(xì)胞/ml)，腺病毒顆粒在陽(yáng)離子洗滌劑濃度增加時(shí)發(fā)生沉淀。根據(jù)推測(cè)，這表明，大量增加陽(yáng)離子洗滌劑濃度(例如2倍)會(huì)導(dǎo)致存在于懸液中的總體腺病毒顆粒的沉淀。在高細(xì)胞密度懸液中，其中細(xì)胞密度為例如高10倍因而宿主細(xì)胞DNA濃度也高10倍，預(yù)期實(shí)現(xiàn)宿主細(xì)胞DNA沉淀所需的洗滌劑濃度也會(huì)明顯更高。因此，基于低細(xì)胞密度懸液的結(jié)果預(yù)期，這樣的濃度增加的洗滌劑會(huì)具有使存在于溶液中的所有病毒顆粒沉淀的效果O在高細(xì)胞密度(增加10倍)的實(shí)驗(yàn)測(cè)試中，我們發(fā)現(xiàn)，與基于現(xiàn)有技術(shù)任何建議或預(yù)期相反，增加濃度的陽(yáng)離子洗滌劑(增加2. 5倍)確實(shí)沉淀宿主細(xì)胞DNA(至少80%)，但是不沉淀腺病毒顆粒。令人驚訝的是，洗滌劑的選擇性沉淀效果保留下來(lái)。本發(fā)明提供一種可以用于在利用高細(xì)胞密度培養(yǎng)物的大規(guī)模腺病毒純化方法中除去宿主細(xì)胞DNA的方法。本發(fā)明提供一種從包含5x106-150x106細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液中純化腺病毒顆粒的方法，所述方法包括a)將所述細(xì)胞懸液中的細(xì)胞裂解；b)通過(guò)加入選擇性沉淀劑從腺病毒顆粒選擇性沉淀宿主細(xì)胞DNA ;以及c)將包含所述腺病毒顆粒的懸液澄清以獲得純化的含腺病毒懸液，其中將至少80%的宿主細(xì)胞DNA從所述含腺病毒懸液中沉淀。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述病毒純化自細(xì)胞懸液，其具有的細(xì)胞密度范圍為
5xl06-50xl06 細(xì)胞/ml，例如 10xl06_50xl06 細(xì)胞/ml 或 10xl06_30xl06 細(xì)胞/ml。在某些實(shí)施方案中，步驟b)中所用的選擇性沉淀劑為陽(yáng)離子洗滌劑。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述選擇性沉淀劑為度米芬(DB)。在某些實(shí)施方案中，所述選擇性沉淀劑添加至濃度范圍為I. 2_5mM。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述選擇性沉淀劑添加至濃度范圍為I. 3-2. 2mM。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法還包括陰離子交換步驟和超濾步驟。


圖I :低(2. 5x106-3. 5xl06vc/ml)和高(20xl06_30xl06vc/ml)密度細(xì)胞懸液中，針對(duì)度米芬濃度作圖的腺病毒回收率和沉淀的宿主細(xì)胞DNA。圖2 :低(2. 5x106-3. 5xl06vc/ml)和高(18xl06-25xl06vc/ml)密度細(xì)胞懸液中，針對(duì)度米芬濃度作圖的腺病毒回收率和沉淀的宿主細(xì)胞DNA。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及從高細(xì)胞密度懸液純化來(lái)自細(xì)胞裂解物的腺病毒顆粒的方法。根據(jù)本發(fā)明，所述高細(xì)胞密度懸液通過(guò)將細(xì)胞培養(yǎng)至高細(xì)胞密度而獲得。這樣的培養(yǎng)可以(不限于)批量、供料批量或灌注模式來(lái)進(jìn)行。將細(xì)胞培養(yǎng)至高細(xì)胞密度的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。獲得高細(xì)胞密度培養(yǎng)物的具體方法公開(kāi)于，例如W02004/099396、W02005/095578、W02008/006494、WO 2010/060719。根據(jù)本發(fā)明，高細(xì)胞密度懸液包含約5x106-150xl06細(xì)胞/mL，例如約8x106-120x106 細(xì)胞 /mL,如約 12xl06-100xl06 細(xì)胞 /mL,如約 20xl06-80xl06 細(xì)胞 /mL。在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述高細(xì)胞密度懸液的細(xì)胞密度為約10x106-50x106細(xì)胞/mL，例如至少約15xl06細(xì)胞/mL，如至少約20xl06細(xì)胞/mL，如至少約25xl06,如高達(dá)約30xl06細(xì)胞/mL，如高達(dá)約35xl06細(xì)胞/mL，如高達(dá)約40xl06細(xì)胞/mL，如高達(dá)約45x106細(xì)胞/mL。根據(jù)本發(fā)明，用腺病毒顆粒感染高細(xì)胞密度培養(yǎng)物以允許所述腺病毒在細(xì)胞懸液增殖。在本文中，在單生物反應(yīng)器中獲得高細(xì)胞密度懸液，其包含高濃度的腺病毒。感染高細(xì)胞密度培養(yǎng)物的方法也是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。獲得高病毒濃度的高細(xì)胞密度培養(yǎng)物的具體方法公開(kāi)于，例如EP0816818L 9、Cortin et al. 2004和Yuk et al. 2004。這些參考文獻(xiàn)描述了用于制備大量重組腺病毒的方法。這些方法依賴于用每細(xì)胞高腺病毒產(chǎn)率的保存物感染高細(xì)胞密度的培養(yǎng)物的能力。本文則提供了一種在單生物反應(yīng)器中獲得高腺病毒濃度的高細(xì)胞密度懸液的方法。本發(fā)明方法的典型收率，例如對(duì)于重組腺病毒35 (rAd35)為約I. 5-2. 5xl012VP/mL。根據(jù)本發(fā)明，一旦腺病毒在細(xì)胞培養(yǎng)物中增殖并殺死大部分細(xì)胞，則從高細(xì)胞密度懸液純化腺病毒顆粒。本發(fā)明方法的第一步驟包括將高細(xì)胞密度懸液中所包含的細(xì)胞裂解。裂解用腺病毒顆粒感染的高細(xì)胞密度懸液導(dǎo)致大量細(xì)胞碎片和宿主細(xì)胞DNA積累在所述細(xì)胞懸液中。這些積累使得細(xì)胞懸液隨后的下游加工冗長(zhǎng)繁瑣。本發(fā)明提供一種適合于從高細(xì)胞密度懸液的細(xì)胞裂解物純化腺病毒顆粒的方法。通過(guò)向細(xì)胞裂解物加入選擇性沉淀劑可以從高細(xì)胞密度懸液中的腺病毒顆粒選擇性沉淀大量宿主細(xì)胞DNA，從而從包含腺病毒顆粒的高細(xì)胞密度懸液沉淀至少約80%的宿主細(xì)胞DNA分子。如本文所公開(kāi)的，在澄清(例如，深層過(guò)濾)后，沉淀步驟允許沉淀污染宿主細(xì)
胞DNA，至少減少80 %的宿主細(xì)胞DNA，優(yōu)選90 %，并且如本文所示例的，甚至更優(yōu)選減少約95%的宿主細(xì)胞DNA。所述方法的第一步驟包括將細(xì)胞懸液中的細(xì)胞裂解。其中裂解細(xì)胞膜的第一步驟允許從感染的高細(xì)胞密度懸液收獲細(xì)胞相關(guān)(細(xì)胞內(nèi))和非細(xì)胞相關(guān)(細(xì)胞外)腺病毒。裂解包含病毒的宿主細(xì)胞的優(yōu)選方法宿主細(xì)胞洗滌劑裂解可以由非機(jī)械裂解方法(如酶處理)和和/或機(jī)械剪切方法(如中空纖維超濾)代替以釋放最大量的腺病毒。可以用于激活細(xì)胞裂解的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，并且例如討論于WO 98/22588，P. 28-35。這一方面可用的方法例如冷凍-解凍、固體剪切、高滲和/或低滲裂解、液體剪切、超聲、高壓擠出、洗滌劑裂解、上述方法的組合等。在本發(fā)明的一實(shí)施方案中，利用至少一種洗滌劑將細(xì)胞裂解。使用洗滌劑裂解的優(yōu)勢(shì)在于其是一種容易的方法，并且容易放大。可以使用的洗滌劑及其使用方法通常為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。例如幾種實(shí)例討論于TO 98/22588，p. 29-33。本文所用的洗滌劑可以包括但不限于陰離子、陽(yáng)離子、兩性離子和非離子洗滌劑。洗滌劑的實(shí)例例如Triton和/或聚山梨酯-80。在一實(shí)施方案中，所用的洗滌劑為T(mén)riton X-IOO0此外，可以向裂解物或澄清的裂解物加入低濃度的諸如TNBP的溶劑以補(bǔ)充這些洗滌劑失活包裝的病毒的能力。另外，感染的宿主細(xì)胞由其中的腺病毒的自裂解可以提供細(xì)胞內(nèi)腺病毒的主要釋放，并且可以用于本發(fā)明的方法。因此，本領(lǐng)域已知的任何形式的宿主細(xì)胞裂解可以用于向宿主細(xì)胞培養(yǎng)基中釋放細(xì)胞內(nèi)病毒以用于通過(guò)本文公開(kāi)的方法進(jìn)行最后收獲。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解，洗滌劑的最優(yōu)濃度可以變化，例如在O. 1% -1% (w/w)的范圍內(nèi)變化。詵擇件沉淀裂解后，通過(guò)加入濃縮的選擇性沉淀劑(SPA)溶液來(lái)選擇性沉淀DNA，同時(shí)將腺病毒顆粒留在液相中。這一步驟允許選擇性沉淀宿主細(xì)胞DNA，而且還改進(jìn)下游穩(wěn)健性。如本文所示例的，這一早期沉淀步驟在澄清后導(dǎo)致至少約80%的(宿主細(xì)胞)核酸減少?？梢杂糜趯?shí)施本發(fā)明的SPA包括但不限于胺共聚物、季銨化合物及其任何各自的混合物。更具體地，許多形式的聚乙烯(PEI)非常有效地中和過(guò)量的陰離子電荷(DNA雜質(zhì))?？梢院线m地用于本發(fā)明的一系列可能的SPA列于(12欄,56-67行和13欄，1-28行)，其援引加入本文。適合用于本發(fā)明的SPA包括但不限于以下可商購(gòu)產(chǎn)品的類型和實(shí)例單烷基三甲基銨鹽(可商購(gòu)產(chǎn)品的實(shí)例包括十六烷基三甲基溴化銨或十六烷基三甲基氯化銨，CTAB ;四癸基三甲基溴化銨或四癸基三甲基氯化銨(TTA);烷基三甲基氯化銨；烷基芳基三甲基氯化銨；十二烷基三甲基溴化銨或十二烷基三甲基氯化銨；十二烷基二甲基-2-苯氧基乙基溴化銨；十六烷基胺鹽酸鹽或氫溴酸鹽；十二烷基胺或鹽酸鹽；以及十六烷基二甲基乙基溴化銨或十六烷基二甲基乙基氯化銨)；單烷基二甲基芐基銨鹽(實(shí)例包括烷基二甲基芐基氯化銨和芐索氯銨，BTC) ;二烷基二甲基銨鹽(商業(yè)產(chǎn)品包括度米芬(DB) ;二癸基二甲基鹵化銨和辛基十二烷基二甲基氯化銨或辛基十二烷基二甲基溴化銨)；雜芳香銨鹽(商業(yè)產(chǎn)品包括十六烷基鹵化吡啶鎗(CPC或氫溴酸鹽和十六烷基溴化吡啶鎗或十六烷基氯化吡啶鎗)；順式異構(gòu)體I-[3-氯烯丙基]-3，5，7-三氮雜-I-氮鎗金剛烷；烷基-溴化異喹啉鎗；以及烷基二甲基萘基-甲基氯化銨(BTC 1110)。多取代的季按鹽(可商購(gòu)的廣品包括但不限于燒基~■甲基節(jié)基糖精按和燒基~■甲基乙基節(jié)基環(huán)己基氨基磺酸銨)；雙季銨鹽(產(chǎn)品實(shí)例包括1，10-雙(2-甲基-4-氨基氯化喹啉鎗)_癸烷；1，6_雙{I-甲基-3-(2，2，6-三甲基環(huán)己基)-丙基二甲基氯化銨]己烷或曲比氯銨以及
Buckman Brochures的稱為CDQ的bis-quat);和聚合季銨鹽(包括polyionene,如聚[氧化乙烯(二甲基亞氨基)亞乙基(二甲基亞氨基)亞乙基二氯化物];聚[N-3-二甲基銨基)丙基]N-[3_亞乙基氧化乙烯二甲基銨基)丙基]脲二氯化物；和α-4_[1-三(2-羥基乙基)氯化銨)。本領(lǐng)域技術(shù)人員從US7326555應(yīng)當(dāng)理解，其中這些化合物中的幾種據(jù)證實(shí)發(fā)揮作用，并且其中據(jù)證實(shí)本領(lǐng)域技術(shù)人員可以常規(guī)地發(fā)現(xiàn)這些化學(xué)選擇性沉淀DNA的合適濃度，這些為SPA的實(shí)例，并且基于其公開(kāi)和本發(fā)明的公開(kāi)，這些化合物顯然也適合于本發(fā)明。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，陽(yáng)離子洗滌劑用于本發(fā)明。在甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，二烷基二甲基銨鹽如度米芬(DB)用于本發(fā)明。度米芬用作純化方案的選擇性沉淀劑，所述方案要求從任何數(shù)目的不同類型生物學(xué)產(chǎn)物除去任何數(shù)量的細(xì)胞組分，特別是核酸，所述生物學(xué)產(chǎn)物包括但不限于病毒顆粒、病毒樣顆?；蚩梢酝ㄟ^(guò)選擇性沉淀步驟從污染基于培養(yǎng)物的組分大量分離的任何其他生物學(xué)產(chǎn)物。盡管大量潛在的SPA可以用于實(shí)施本發(fā)明，但是度米芬主要由于其作為GMP等級(jí)原料的可用性以及目前用在目的是人用途的其他產(chǎn)品而引起特別關(guān)注。更特別地，由于度米芬廣泛用作口服衛(wèi)生產(chǎn)品以及局部抗生素乳膏的活性成分，所以這種分子在cGMP條件下大量生產(chǎn)并分配。本文測(cè)定在高細(xì)胞密度懸液中用于從細(xì)胞懸液沉淀宿主細(xì)胞DNA的最優(yōu)SPA濃度。盡管基于現(xiàn)有技術(shù)預(yù)期，當(dāng)腺病毒顆粒與高濃度SPA接觸時(shí)會(huì)立即沉淀，但是意料之外的是腺病毒顆粒仍保持未沉淀。確實(shí)，例如在US7326555中，據(jù)現(xiàn)有技術(shù)證實(shí)，在低細(xì)胞密度懸液(高達(dá)Ix IO6細(xì)胞/ml)中，腺病毒顆粒當(dāng)陽(yáng)離子洗滌劑濃度增加時(shí)發(fā)生沉淀。如本文所公開(kāi)的，通過(guò)裂解高細(xì)胞密度培養(yǎng)物而制備的懸液會(huì)包含大量增加量的宿主細(xì)胞DNA和其他雜質(zhì)，并因此需要增加量的陽(yáng)離子洗滌劑(例如，增加2.5倍)。因此基于低細(xì)胞密度結(jié)果的外推，預(yù)期陽(yáng)離子洗滌劑濃度的這種增加會(huì)導(dǎo)致懸液中存在的腺病毒顆粒的整體的沉淀。然而，令人驚訝地，在高SPA濃度下，從包含病毒顆粒的高細(xì)胞密度懸液選擇性除去污染宿主細(xì)胞DNA仍然是可以的。在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施方案中，加入的SPA(優(yōu)選DB)的濃度為1.2-5mM。在一甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，加入的SPA(優(yōu)選DB)的濃度為I. 3-2. 2mM，如I. 4_2mM，如I. 4-1. 8mM，如I. 5-1. 6mM。基于本發(fā)明的公開(kāi)，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)清楚對(duì)于給定的收獲時(shí)的細(xì)胞密度，如何確定合適的SPA濃度窗。用于處理包含腺病毒的高細(xì)胞密度懸液(包含的細(xì)胞密度為10χ106-150χ106細(xì)胞/mL)的DB的合適濃度為約I. 2mM-5mM。用于處理包含腺病毒的高細(xì)胞密度懸液(包含的細(xì)胞密度為10xl06-50xl06細(xì)胞/mL)的DB的合適濃度為約I. 3mM_2. 2mM。用于處理包含腺病毒的高細(xì)胞密度懸液收獲物(包含的細(xì)胞密度為10χ106-30χ106細(xì)胞/mL)為約I. 3_2mM，如約 I. 4-1. 9mM,如約 L 4-1. 8mM,如約 L 4-1. 7mM,如約 L 45-1. 65mM,如約 L 5-1. 55mM。在這一步驟中不再要求核酸酶(包括但不限于BENZONASE 、DNase和RNase)，但是核酸酶對(duì)于最大DNA減少仍然是有益的。由于這種沉淀步驟除去主要污染核酸的能力，后期的陰離子交換色譜對(duì)于產(chǎn)物純化不是必須的(取決于最終劑量)。然而，所述方法中可
以保留AEX以用于穩(wěn)健性。如本文對(duì)度米芬(DB)所示例的，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解如何測(cè)試本文公開(kāi)的SPA的潛在代替物以鑒定有效地從腺病毒顆粒沉淀核酸分子和其他細(xì)胞碎片的化合物。因此，本發(fā)明部分地涉及從高細(xì)胞密度懸液純化腺病毒顆粒的方法，所述方法包括通過(guò)向裂解后宿主細(xì)胞培養(yǎng)基中加入選擇性沉淀劑來(lái)選擇性地從裂解后的高細(xì)胞密度懸液沉淀宿主細(xì)胞核酸分子。澄渣然后將獲得自之前步驟的SPA處理的細(xì)胞裂解物澄清以除去沉淀的雜質(zhì)和細(xì)胞碎片。所述澄清可以通過(guò)深層過(guò)濾進(jìn)行。進(jìn)行或不進(jìn)行拋光(polishing)深層過(guò)濾的離心也是可行的。因此，如US7326555所述，沉淀的裂解物的澄清可以利用單獨(dú)的離心，或者離心接連拋光的澄清步驟(如深層過(guò)濾)來(lái)實(shí)現(xiàn)。在選擇濾器或?yàn)V器方案中，需要確保發(fā)生上游改變或變化時(shí)的穩(wěn)健性能。維持良好的澄清性能與步驟收率之間的平衡可以通過(guò)測(cè)試改變的內(nèi)部介質(zhì)的各種濾器類型來(lái)研究。合適的濾器可以使用纖維素濾器、再生的纖維素纖維、與無(wú)機(jī)濾器助劑(例如硅藻土、珍珠巖、氣相二氧化硅)組合的纖維素纖維、與無(wú)機(jī)助劑和有機(jī)樹(shù)脂組合的纖維素纖維、或其任何組合，以及聚合濾器(實(shí)例包括但不限于尼龍、聚丙烯、聚醚砜)以實(shí)現(xiàn)有效的除去和可接受的病毒回收率。通常優(yōu)選多階段方法，但并非必須的。示例性的2或3階段方法會(huì)由粗濾器除去大沉淀物和細(xì)胞碎片，以及隨后的拋光第二階段濾器(表觀孔徑大于0.2μπι，但小于Ιμπι)組成。最優(yōu)條件是沉淀物大小分布以及其他變量的函數(shù)。此外，使用較密集的濾器或離心也可以制備良好質(zhì)量的產(chǎn)物。更常見(jiàn)地，對(duì)于實(shí)施本發(fā)明可接受的是包括死端(dead-end)過(guò)濾、微過(guò)濾、離心或?yàn)V器助劑的主體供料(body feed)(如娃藻土)在內(nèi)的任何澄清方法聯(lián)合死端或深層過(guò)濾，這提供合適地澄清的濾液從而不使隨后步驟中的膜和/或樹(shù)脂結(jié)垢。深層過(guò)濾表現(xiàn)為本發(fā)明的穩(wěn)健澄清方法?？缮藤?gòu)的深層過(guò)濾膜公開(kāi)于US 7326555 (14欄，65行至15欄，19行)，其援引加入本文。沉淀與澄清步驟的組合在澄清(例如，單獨(dú)的深層過(guò)濾或與拋光深層過(guò)濾步驟組合的深層過(guò)濾)后，從腺病毒顆粒除去至少70%、更可能至少80%并且甚至更優(yōu)選至少90%宿主細(xì)胞DNA。
進(jìn)一步純化的方法在某些實(shí)施方案中，將收獲的病毒顆粒進(jìn)一步純化。如WO 2005080556所述(其援引加入本文)，病毒的進(jìn)一步純化可以在幾個(gè)步驟中進(jìn)行，包括濃縮、超濾、滲濾或用色譜進(jìn)行分離。也可以使用其他步驟，例如陰離子交換膜色譜、滅菌過(guò)濾、反相吸附、羥基磷灰石色譜。這些步驟例如公開(kāi)于US 7326555，其援引加入本文。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解如何發(fā)現(xiàn)每個(gè)純化步驟的最優(yōu)條件。此外，WO 98/22588描述了制備和純化病毒顆粒的方法，其援引加入本文。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，澄清的腺病毒顆粒懸液可以通過(guò)超濾進(jìn)行處理。超濾用于濃縮病毒懸液。懸液可以濃縮5-20倍，并可以用核酸酶進(jìn)行處理(如上文所述)。本發(fā)明的另一方面是隨后通過(guò)滲濾引入離子交換緩沖液。利用超濾器的滲濾或緩沖液交換是一種除去和交換鹽、糖等的方式。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解緩沖液交換發(fā)生的條件以及何種緩沖液適合于這一步驟。所選的特定超濾膜會(huì)的大小足夠小以保留腺病毒顆粒，但是足夠大以有效地清除雜質(zhì)。取決于生產(chǎn)商和膜類型，IO-IOOOkDa的表觀分子量截止是合適的。利用切向流模式的超濾是優(yōu)選的。在所述模式中，所述步驟可以通過(guò)設(shè)定具有或不具有滲余物返回上的背壓的固定錯(cuò)流(cross-flow)、設(shè)定固定的跨膜壓力或者固定錯(cuò)流和滲透物通量來(lái)控制。在這一點(diǎn)上，所述方法還可以考慮包括核酸酶處理，但這并非必須的。核酸酶處理可以包括使用廣譜核酸酶(如BENZONASE )、DNase、RNase或其任何組合。核酸酶或者具有RNase和DNase活性的混合物(cocktail)是優(yōu)選的。可以在所述方法的任何點(diǎn)考慮核酸酶處理步驟，只要最終產(chǎn)物中的殘留核酸酶含量對(duì)于應(yīng)用是可以接受的。優(yōu)選地，核酸酶處理在澄清后進(jìn)行，特別優(yōu)選地，核酸酶處理在澄清和濃縮步驟之后，但是在陰離子交換色譜步驟之前進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明，隨后步驟可以是陰離子交換色譜步驟。在所述步驟中，腺病毒顆粒結(jié)合至帶正電荷的材料，如膜、筒或柱。隨后的洗脫允許從雜質(zhì)和剩余的宿主細(xì)胞DNA分離病
毒顆粒。對(duì)于用Mustang Q膜吸附劑純化腺病毒，用于進(jìn)樣和洗滌的NaCl濃度在pH 7. 5下任何時(shí)候大概可以為O. 3-0. 4M，并且在pH交替時(shí)可以變化。更優(yōu)選的NaCl濃度為O. 35M。緩沖液的PH需要足夠高以使得腺病毒結(jié)合(大于約6. 5)。此外，緩沖體系的pH也應(yīng)當(dāng)足夠低以避免病毒不穩(wěn)定?？捎玫木_最大PH取決于腺病毒特定的穩(wěn)定性譜和緩沖液組分，并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)于特定應(yīng)用而容易地確定。作為指導(dǎo)，當(dāng)然并非限制，PH可以潛在地為約5-10。緩沖液中存在O. l%PS-80對(duì)于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物中的低殘留DNA水平是高度優(yōu)選的，因?yàn)檫@減弱腺病毒/DNA結(jié)合和腺病毒聚集。確定可以用于促進(jìn)腺病毒顆粒與其他腺病毒以及各種細(xì)胞污染物解離的較高或較低洗滌劑濃度或替代性洗滌劑在本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)。為方法的緩沖劑選擇替代性洗滌劑也在本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)。這樣的替代性洗滌劑的實(shí)例可見(jiàn)US 7326555。陰離子交換膜色譜產(chǎn)物，如Pall (如Mustang 系列)和Sartorius (如Sartobind系列)生產(chǎn)的那些適合于根據(jù)本發(fā)明來(lái)純化病毒。美國(guó)專利6，485，958或WO 05/080556描述了使用陰離子交換色譜來(lái)純化重組腺病毒。
病毒對(duì)膜吸附劑如Mustang Q (Pal I Corporation)的結(jié)合能力非常高，在7xl013VP/ml數(shù)量級(jí)。適合于這種方法的腺病毒純化的其他膜吸附劑包括但不限于Source15Q 和 Source 30Q (GE life sciences)、Q-Sepharose XL (GE life sciences)、FractogelTMAE (EM industries)、Sartobind Q(Sartorius)、Adsept Q(Natrix separations)、CIMQA (BI A separations)。優(yōu)選利用包含NaCl的緩沖液來(lái)進(jìn)行腺病毒洗脫。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解如何優(yōu)化NaCl濃度。在某些實(shí)施方案中，優(yōu)選使用至少一個(gè)陰離子交換色譜步驟。陰離子交換色譜步驟后，腺病毒可以足夠純。然而，在某些實(shí)施方案中，進(jìn)一步進(jìn)行尺寸排阻色譜步驟以增加方法的穩(wěn)健性。這一步驟可以在陰離子交換色譜步驟之前或之后。顯然，其他純化步驟也可以合適地與陰離子交換色譜步驟組合。使用陰離子交換色譜進(jìn)行腺病毒純化已經(jīng)得到廣泛描述，因此這一方面也在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。許多不同的色譜基質(zhì)可以用于純化腺病毒，并且是合適的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地發(fā)現(xiàn)純化腺病毒的最優(yōu)陰離子交換材料。在本發(fā)明的任何具體實(shí)施方案中，可以將陰離子交換產(chǎn)品滲濾入配置緩沖液中，并滅菌過(guò)濾。或者，可以在滲濾之前或之后加入額外的色譜步驟(如陽(yáng)離子交換)以潛在地改進(jìn)雜質(zhì)和/或病毒/朊病毒清除的穩(wěn)健性。在這一階段還可以進(jìn)行額外的超濾步驟。切向流超濾用于除去殘留的蛋白和核酸以及將腺病毒交換入配制緩沖液。收率與改進(jìn)的雜質(zhì)清除之間的折衷使得選擇300kDa-500kDa的膜。其他膜配置(如中空纖維)是可接受的替代。所選的超濾膜的大小足夠小以保留腺病毒顆粒，但是足夠大以有效地清除雜質(zhì)。取決于生產(chǎn)商和膜類型，IOO-IOOOkDa的表觀分子量截止可以使合適的。所述方法可以包括滅菌過(guò)濾步驟，這有助于消除生物負(fù)荷。產(chǎn)物可以通過(guò)O. 22微米的改性聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(如Millipore, Millipak)進(jìn)行過(guò)濾。所述方法中可以加入任選的下游加工步驟。這些步驟可以包括，例如尺寸排阻色譜步驟、反相吸附步驟和/或羥基磷灰石色譜步驟。這些步驟的每一個(gè)的更多細(xì)節(jié)可以參見(jiàn)，例如 US 7326555、TO 03/097797、TO02/44348。國(guó)際申請(qǐng)WO 97/08298描述了利用某些色譜基質(zhì)純化腺病毒以防止對(duì)病毒的損傷，包括陰離子交換和大小排阻步驟。如WO 2006/108707所公開(kāi)的，某些超濾方法也非常適合于純化腺病毒。這樣的步驟可以除了某些色譜純化步驟之外或者代替某些色譜純化步驟進(jìn)行。細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的放大和下游加工系統(tǒng)本發(fā)明的方法可以放大。本發(fā)明所用的細(xì)胞培養(yǎng)物從小規(guī)模培養(yǎng)物(如1-10升運(yùn)行)至中等規(guī)模培養(yǎng)物(如20-1000L運(yùn)行)，高達(dá)大規(guī)模商業(yè)制備物，如1000-50000L生產(chǎn)運(yùn)行。初始方法步驟(裂解、深層過(guò)濾和超濾)隨培養(yǎng)體積而放大，而陰離子交換色譜和后續(xù)步驟則隨腺病毒顆粒輸入而放大。因此，后期步驟的大小基于至少IxlO12腺病毒顆粒/mL(vp/mL)的生物反應(yīng)器的產(chǎn)率估計(jì)。這些高腺病毒收率可以例如通過(guò)感染高細(xì)胞密度培養(yǎng)物而獲得(例如EP08168181.9所述)。這些含高濃度腺病毒顆粒的高密度細(xì)胞懸液的進(jìn)一步純化可以利用本發(fā)明進(jìn)行。加工包含大量細(xì)胞碎片和宿主細(xì)胞DNA的這些懸液的可能性允許純化每體積懸液的大量腺病毒顆粒。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于提供一種加工包含高濃度腺病毒顆粒的高細(xì)胞密度細(xì)胞培養(yǎng)物批次的方法，從而允許每加工體積的非常高的病毒收率。盡管應(yīng)用于大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)物的本發(fā)明方法允許較小規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞，但是也應(yīng)用于較高細(xì)胞密度，并達(dá)到高腺病毒收率，其可以有效地進(jìn)一步加工。所述方法提供加工高度濃縮的腺病毒批次的可能性，這對(duì)整個(gè)腺病毒純化工業(yè)會(huì)產(chǎn)生極大影響。腺病毒和牛.產(chǎn)細(xì)胞本發(fā)明涉及腺病毒的純化。本發(fā)明的腺病毒可以使任何野生型、修飾的、突變的腺病毒和/或重組腺病毒載體?；蛞呙绾?或基因治療應(yīng)用中引起特別關(guān)注的是使用第一或第二代復(fù)制缺陷型腺病毒，帶有El或其他缺失，包括“空殼(gutless)”腺病毒載體。腺病毒基因組通常與人的良性病理有關(guān)?；蚪M可進(jìn)行操作，這取決于構(gòu)建各自載體所用的策略。復(fù)制缺陷病毒如重組腺病毒35(rAd35)或26 (rAd26)載體(如本文示例)需要彌補(bǔ)(complement)所述缺失的生產(chǎn)細(xì)胞系。生產(chǎn)細(xì)胞(有時(shí)在本領(lǐng)域和本文中稱為“包裝細(xì)胞”或“補(bǔ)充細(xì)胞”或“宿主細(xì)胞”)可以使任何生產(chǎn)細(xì)胞，其中可以增殖期望的腺病毒。例如，在互補(bǔ)腺病毒缺陷的生產(chǎn)細(xì)胞中進(jìn)行重組腺病毒載體的增殖。這樣的生產(chǎn)細(xì)胞優(yōu)選在其基因組中具有至少腺病毒El序列，由此能夠互補(bǔ)重組腺病毒El區(qū)中的缺失。另外，腺病毒可以在E3區(qū)中具有缺失，其對(duì)于Ad基因組并非必需的，因此，這樣的缺失不必被互補(bǔ)?？梢允褂萌魏蜤l互補(bǔ)型生產(chǎn)細(xì)胞，例如通過(guò)El永生化的人視網(wǎng)膜細(xì)胞，如911或PER. C6細(xì)胞(參見(jiàn)美國(guó)專利5，994，128) ；E1-轉(zhuǎn)化的羊水細(xì)胞(參見(jiàn)歐洲專利1230354) ；E1-轉(zhuǎn)化的A549細(xì)胞(參見(jiàn)，例如 WO 98/39411、美國(guó)專利 5，891，690) ；GH329: HeLa (Gao et al, 2000, Human GeneTherapy 11:213-219)，293等。在某些實(shí)施方案中，所述生產(chǎn)細(xì)胞為例如HEK293細(xì)胞、或PER. C6細(xì)胞、或911細(xì)胞、IT293SF細(xì)胞等。優(yōu)選將PER. C6細(xì)胞(ECACC，保藏號(hào)96022940，1996年2月29日保藏于ECACC, CAMR,波頓當(dāng)，薩利斯伯里SP4 0JG，英國(guó)；參見(jiàn)美國(guó)專利5，994，128)或由其衍生的細(xì)胞用作生產(chǎn)細(xì)胞。復(fù)制缺陷腺病毒載體可以利用作為載體DNA來(lái)源的腺病毒或嵌合腺病毒的任何物種、菌株、亞型或者物種、菌株、亞型的混合物產(chǎn)生(參見(jiàn)例如WO 96/26281, WO00/03029)，其例如可以提供能夠感染某些期望細(xì)胞類型的腺病毒載體。在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施方案中，rAd35或rAd26用作腺病毒。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解利用例如公開(kāi)于美國(guó)專利6，492，169或TO03/104467及其中的參考文獻(xiàn)所公開(kāi)的方法來(lái)在特定宿主細(xì)胞上增殖不同血清型的腺病毒載體的可能性。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如，對(duì)于El-缺陷的rAd35的增殖,可以構(gòu)建表達(dá)Ad35的E1B-55K的特定生產(chǎn)細(xì)胞，例如基于表達(dá)Ad5的ElA和ElB的現(xiàn)有生產(chǎn)細(xì)胞，例如PER. C6或HEK293細(xì)胞(參見(jiàn)，例如US 6，492，169)?；蛘咔覂?yōu)選地，例如WO 03/104467充分公開(kāi)的(其援引加入本文)，通過(guò)將Ad5的E4-orf6編碼序列引入rAd35或rAd26載體，可以使用現(xiàn)有的(Ad5_)互補(bǔ)細(xì)胞系(例如PER. C6或HEK293)無(wú)需細(xì)胞的修飾而用于El-缺陷的rAd35或rAd26的增殖。因此,任何血清型的腺病毒載體的增殖可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的手段和方法在生產(chǎn)細(xì)胞上進(jìn)行。腺病毒載體、其構(gòu)建方法及其增殖方法為本領(lǐng)域公知，并描述于例如 U. S. Pat. Nos. 5，559，099，5，837，511，5，846，782，5，851，806，5，994，106，5, 994, 128,5, 965, 541,5, 981, 225,6, 040, 174,6, 020, 191,和 6,113,913 以及 ThomasShenk, " Adenoviridae and their Replication" , M. S. Horwitz, " Adenoviruses",Chapters 67and 68，respectively，in Virology,B. N. Fields et al. ,eds. , 3d ed. , RavenPressiLtd.，New York(1996)，及其中所描述的其他參考文獻(xiàn)。在以下實(shí)施例中進(jìn)一步解釋本發(fā)明。這些實(shí)施例并不以任何方式限制本發(fā)明而僅用于示例本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例I :高細(xì)胞密度懸液中的選擇性宿主細(xì)胞DNA沉淀現(xiàn)有技術(shù)(Goerke et al, US7326555)證實(shí)了對(duì)于高達(dá)IxlO6細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度的選擇性宿主細(xì)胞DNA沉淀。其中證實(shí)，(在低細(xì)胞密度下)，至少80%的宿主細(xì)胞DNA從細(xì)胞懸液沉淀，并且病毒顆粒的回收率為90%。然而，目前完全不了解這樣的選擇性沉淀在高細(xì)胞密度下是否可行，因?yàn)檫@樣的細(xì)胞懸液會(huì)包含高得多的量的宿主細(xì)胞DNA和細(xì)胞碎片，因此預(yù)期需要高得多的量的DNA沉淀劑，而從現(xiàn)有技術(shù)外推的數(shù)據(jù)建議這樣更高濃
度的DNA沉淀劑也會(huì)沉淀腺病毒。為了研究高細(xì)胞密度下DNA沉淀的可能性，在包含高達(dá)30xl06細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度的小規(guī)模試管中測(cè)試宿主細(xì)胞DNA沉淀。小規(guī)模試管模型用作快速篩選以測(cè)試選擇性DNA沉淀在高細(xì)胞密度下是否仍然發(fā)生。使PER. C6細(xì)胞在生物反應(yīng)器中生長(zhǎng)，用腺病毒35 (Ad35)感染，并于37°C下在無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)3天。在2-30xl06細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度和8χ101(ι-1. 5xl012VP/ml的病毒滴度時(shí)收獲細(xì)胞。通過(guò)加入非離子洗滌劑Triton X-100和Tween-80至終濃度各自為0. 1%和0. 05%，細(xì)胞裂解進(jìn)行2-24小時(shí)(hr)。向3. 5ml裂解的收獲物中加入40mM NaCl中的漸增濃度的度米芬(DB)，然后立即渦旋I分鐘。用0. 45 μ m聚偏二氟乙烯(PVDF)注射器濾器除去沉淀的材料。分別利用HPLC-AEX和Q-PCR分析濾液的Ad35和宿主細(xì)胞DNA濃度。圖I示出對(duì)度米芬濃度作圖的病毒回收率和沉淀的宿主細(xì)胞DNA。三角形標(biāo)示的曲線獲得自細(xì)胞密度為2. 5x106-3. 5xl06細(xì)胞/ml的細(xì)胞培養(yǎng)收獲物。圓形標(biāo)示的曲線獲得自細(xì)胞密度為20xl06-30xl06細(xì)胞/ml的細(xì)胞培養(yǎng)收獲物。在圖中高亮低和高細(xì)胞密度以及相關(guān)百分比的沉淀的宿主細(xì)胞DNA的C*(表現(xiàn)出90%病毒回收率的度米芬濃度)。在20χ106-30χ106細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度下，沉淀超過(guò)90 %的宿主細(xì)胞DNA所需的DB濃度與低10倍的細(xì)胞密度所需的DB濃度相比增加至少2. 5倍。令人驚訝地，如在較低細(xì)胞密度獲得的曲線外推所預(yù)期的，增加的DB濃度不沉淀病毒顆粒。用細(xì)胞密度為18x106-25xl06細(xì)胞/ml的細(xì)胞培養(yǎng)收獲物重復(fù)實(shí)驗(yàn)。圖2示出對(duì)度米芬濃度作圖的病毒回收率和沉淀的宿主細(xì)胞DNA。三角形標(biāo)示的曲線獲得自細(xì)胞密度為2. 5xl06-3. 5xl06細(xì)胞/ml的細(xì)胞培養(yǎng)收獲物。圓形標(biāo)示的曲線獲得自細(xì)胞密度為18xl06-25xl06細(xì)胞/ml的細(xì)胞培養(yǎng)收獲物。在圖中高亮低和高細(xì)胞密度以及相關(guān)百分比的沉淀的宿主細(xì)胞DNA的C*(表現(xiàn)出90%病毒回收率的度米芬濃度)。如圖I和2中的圖可知，對(duì)于高細(xì)胞密度懸液表現(xiàn)出90%病毒回收率的DB濃度(C*)在各個(gè)實(shí)驗(yàn)中略有不同，這是正常偏差的一部分。然而，圖一致地證實(shí)，在高細(xì)胞密度下DNA的選擇性沉淀也是可以的，并且SPA (在本文中為DB)的合適濃度明顯高于低細(xì)胞密度培養(yǎng)物，但是遠(yuǎn)低于基于外推所預(yù)期的。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，對(duì)于選擇性沉淀劑的合適濃度，存在范圍而不是固定的點(diǎn)，并且基于本文的公開(kāi)可以發(fā)現(xiàn)合適的范圍。例如，對(duì)于處理包含約10χ106-30χ106細(xì)胞/mL的細(xì)胞密度的含腺病毒高細(xì)胞密度懸液收獲物，合適的DB濃度為約I. 3-2mM?；谶@些結(jié)果，本領(lǐng)域技術(shù)人員現(xiàn)在了解，DNA沉淀可以外推至含腺病毒懸液，其包含甚至更高的細(xì)胞密度，如約40xl06細(xì)胞/mL，如約50xl06細(xì)胞/mL，如高達(dá)約IOOxlO6細(xì)胞/mL，如高達(dá)約150xl06細(xì)胞/mL ;并且來(lái)自這樣的高細(xì)胞密度懸液的腺病毒可以用本發(fā)明的方法進(jìn)行純化。實(shí)施例2 :較大規(guī)模的高細(xì)胞密度懸液中的選擇性宿主細(xì)胞DNA沉淀以O(shè). 5L-20L的規(guī)模測(cè)試DNA沉淀。DNA沉淀所用的DB濃度基于之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖2)。使用約80%的在小規(guī)模試管模型中所測(cè)定的C*濃度。在2L或IOL生物反應(yīng)器中，以批量或灌注模式培養(yǎng)PER. C6細(xì)胞。在批量模式中，將細(xì)胞培養(yǎng)4天，在達(dá)到IxlO6-L 6xl06細(xì)胞/ml的密度后將其感染。感染后，將細(xì)胞再培
養(yǎng)3天，然后收獲。在灌注模式中，用ATF系統(tǒng)進(jìn)行的灌注在約2. 5xl06總細(xì)胞/mL的細(xì)胞密度接種后4天開(kāi)始。灌注14天后，將細(xì)胞懸液用新鮮的無(wú)血清培養(yǎng)基在生物反應(yīng)器中稀釋至細(xì)胞密度為約13xl06細(xì)胞/mL。隨后，將生物反應(yīng)器用Ad35病毒感染。ATF系統(tǒng)在感染后5小時(shí)開(kāi)始，培養(yǎng)基更新率為每天2容器體積。3天(感染后)后收獲細(xì)胞。收獲時(shí)的細(xì)胞密度(CDAH) 于表 I。收獲之后，通過(guò)加入非離子洗滌劑TritonX-IOO和Tween-80至終濃度各自為
O.1%和O. 05%將細(xì)胞裂解2-24小時(shí)。之后，向裂解的收獲物加入度米芬至終濃度為40mMNaCl中的O. 72mM和I. 52mM。將沉淀的裂解物利用兩個(gè)載樣的(charged)深度過(guò)濾器澄清，并且兩個(gè)濾器估計(jì)的孔徑分別為 10- 5 μ m(Millistak+CE20)和 I- O. 2 μ m(CunoZeta plus 50CP)。以100LMH(升/平方米/小時(shí))的恒定通量進(jìn)行澄清，直至壓力達(dá)到5psi ο表I示出方法參數(shù)和純化方法的結(jié)果。利用8種不同的收獲物進(jìn)行裂解、DNA沉淀(DNA ptt)和澄清，這些收獲物在體積、收獲時(shí)的細(xì)胞密度和病毒滴度上不同。收獲物取自2L或IOL生物反應(yīng)器。測(cè)定了沉淀步驟的沉淀的宿主細(xì)胞DNA(HC-DNA)和病毒回收率。表I
權(quán)利要求
1.一種從細(xì)胞懸液純化腺病毒顆粒的方法，所述方法包括以下步驟 a)將所述細(xì)胞懸液中的細(xì)胞裂解； b)通過(guò)加入選擇性沉淀劑從腺病毒顆粒選擇性沉淀宿主細(xì)胞DNA； c)將包含所述腺病毒顆粒的懸液澄清以獲得純化的含腺病毒懸液，其中將至少80%的宿主細(xì)胞DNA從所述含腺病毒懸液沉淀。
所述方法的特征在于所述細(xì)胞懸液的細(xì)胞密度范圍為5X106-150X106細(xì)胞/ml。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述細(xì)胞密度范圍為10x106-50x106細(xì)胞/ml。
3.如權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述選擇性沉淀劑為陽(yáng)離子洗滌劑。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述選擇性沉淀劑為度米芬(DB)。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中度米芬(DB)的濃度范圍為1.2-5mM。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其中度米芬(DB)的濃度范圍為1.3-2.2mM。
7.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述細(xì)胞密度范圍為約10xl06-30xl06細(xì)胞/ml，并且度米芬(DB)的濃度范圍為I. 3-2mM。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法還包括陰離子交換步驟和超濾步驟。
全文摘要
本發(fā)明提供利用宿主細(xì)胞DNA破碎隨后進(jìn)行澄清步驟從高細(xì)胞密度懸液大規(guī)模純化腺病毒的方法。
文檔編號(hào)C12N7/02GK102791852SQ201080046428
公開(kāi)日2012年11月21日 申請(qǐng)日期2010年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月15日
發(fā)明者M·L·德沃克特, M·維斯特拉 申請(qǐng)人:克魯塞爾荷蘭公司