專利名稱：：樹枝狀聚合物納米技術(shù)用于將生物分子投遞入植物細(xì)胞中的用途的制作方法樹枝狀聚合物納米技術(shù)用于將生物分子投遞入植物細(xì)胞中的用途優(yōu)先權(quán)要求本申請要求2009年10月16日提交的關(guān)于“USEOFDENDRIMERNANOTECHNOLOGYFORDELIVERYOFBI0M0LECULESINTOPLANTCELLS”的美國臨時專利申請流水號61/252,607的權(quán)益。
背景技術(shù)：
：納米顆粒具有的獨特性質(zhì)已經(jīng)被利用于將DNA投遞至細(xì)胞。金屬納米顆粒，諸如金(Au)納米顆粒由于其低細(xì)胞毒性和容易用各種有生物學(xué)意義的配體官能化而已經(jīng)用于DNA投遞。在金屬納米顆粒外,還已經(jīng)使用大小范圍3-5nm內(nèi)的半導(dǎo)體納米顆粒(例如量子點)(“QD”)作為載體來將分子投遞到細(xì)胞中。DNA和蛋白質(zhì)可以連接到附接于QD表面的配體(見例如F.Patolsky等，J.Am.Chem.Soc.125，13918(2003))。已經(jīng)使用納米顆粒來將質(zhì)粒DNA投遞到多種動物細(xì)胞。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了，在將經(jīng)DNA包被的納米顆粒與沒有細(xì)胞壁的細(xì)胞一起溫育時，細(xì)胞吸收納米顆粒，并開始表達(dá)DNA上編碼的任何基因。然而，由于植物細(xì)胞壁的存在，當(dāng)前的植物基因投遞是挑戰(zhàn)性的，這導(dǎo)致對用于植物遺傳轉(zhuǎn)化的侵入性投遞手段的常見依賴。在期望對通常具有細(xì)胞壁的細(xì)胞進(jìn)行納米顆粒介導(dǎo)的投遞的情況中，在將顆粒添加至植物原生質(zhì)體前將細(xì)胞壁剝離(見F.Torney等，NatureNanotechnol.2,(2007))。在植物細(xì)胞中，細(xì)胞壁作為投遞外源施用的分子的障礙。已經(jīng)采用許多侵入性方法，如基因槍(生物射彈)、顯微注射、電穿孔、和土壤桿菌來實現(xiàn)向這些有壁的植物細(xì)胞中的基因和小分子投遞，但是僅僅通過顯微注射實現(xiàn)了蛋白質(zhì)投遞。在存在植物細(xì)胞壁的情況中投遞小分子和蛋白質(zhì)仍是未經(jīng)探索的，并且為了開發(fā)要應(yīng)用于完整的植物細(xì)胞/組織或器官以進(jìn)行體外和體內(nèi)操作的使能技術(shù)其會是有利的。細(xì)胞穿透肽(CPP)是一類新的且快速增長的短肽，已知其在將一大批包含蛋白質(zhì)和DNA的貨物復(fù)合物易位穿過哺乳動物和人細(xì)胞系的生物膜時發(fā)揮重要的作用。J.Schwartz和S.Zhang(2000)，PeptideMediatedCellularDelivery,Curr.Opin.Mol.Ther.2:162-167;Langel(2002)，Prefacein:CellPenetratingPeptides;ProcessesandApplications,·Langel,Editor,CRCPress,BocaRaton;E.Vives和B.Lebleu(2002),TheTatDerivedCellPenetratingPeptidein:CellPenetratingPeptides;ProcessesandApplications,U.Langel,Editor,CRCPress,BocaRaton:第3頁-第22頁。雖然已經(jīng)顯示了CPP有助于哺乳動物細(xì)胞中的貨物投遞，但是在植物細(xì)胞中使用CPP以進(jìn)行轉(zhuǎn)染的研究受限于許多因素。使此技術(shù)適合于植物的主要障礙在于，與動物細(xì)胞不同，植物細(xì)胞給CPP及其貨物的內(nèi)在化呈現(xiàn)出雙重屏障系統(tǒng)(細(xì)胞壁和質(zhì)膜)。因此，為了有效易位CPP必須克服這兩種屏障。CPP已經(jīng)在植物細(xì)胞中使用，但是通常依賴于與使用CPP—起的透化劑和技術(shù)的使用以實現(xiàn)對植物細(xì)胞投遞貨物投遞。HIVITAT蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域(PTD)是得到最充分研究的易位肽之一。最近的報告已經(jīng)顯示了TATPTD及其寡聚物用于質(zhì)粒投遞的潛力，其通過與哺乳動物細(xì)胞中帶負(fù)電荷的DNA形成復(fù)合物來實現(xiàn)。I.Ignatovich,E.Dizhe,A.Pavlotskaya,B.Akifiev,S.Burov,S.Orlov和A.Perevozchikov(2003)，ComplexesofPlasmidDNAwithBasicDomain4757oftheHIVITatProteinAreTransferredtoMammalianCellsbyEndocytosismediatedPathways,J.Biol.Chem.278:4262542636;C.Rudolph,C.Plank,J.Lausier,U.SchillingerjR.H.MiillerjandJ.Rosenecker(2003)，OligomersoftheArginineRichMotifoftheHIVITATProteinareCapableofTransferringPlasmidDNAintoCells,J.Biol.Chem.278:11411-11418;Z.SiprashvilijF.Scholl,S.Oliver,A.Adams,C.ContagjP.WenderjandP.Khavari(2003),GeneTransferviaReversiblePlasmidCondensationwithCysteineFlanked,InternallySpacedArginineRichPeptides,Hum.Gene.Ther.14(13):122533;I.HellgrenjJ.Gorman,andC.Sylven(2004),FactorsControllingtheEfficiencyofTatmediatedPlasmidDNATransfer,J.Drug.Target.12(I):3947。樹枝狀聚合物(dendrimer)是具有獨特的核心-殼大分子結(jié)構(gòu)的“級聯(lián)分子”。樹枝狀聚合物在1979年由DonaldTomalia在實驗室中首先創(chuàng)建(D.A.Tomalia等，Preprintsofthe1stSPSJIntJIPolymerconference,SocietyofPolymerScience,Japan,Kyoto,1984,第65頁；還可見美國專利No.6,316,694)。已經(jīng)使用樹枝狀聚合物來將DNA和其它生物分子投遞入動物細(xì)胞中。然而，植物細(xì)胞壁的存在對植物中的基因投遞提出了挑戰(zhàn)。另外，尚未在植物中報告或證明使用基于樹枝狀聚合物的投遞實現(xiàn)的轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定基因組整合。如此，仍需要經(jīng)由使用基于樹枝狀聚合物的投遞來在植物中穩(wěn)定摻入基因和其它感興趣分子的方法。發(fā)明概述以下結(jié)合系統(tǒng)、工具和方法來描述各實施方案，所述系統(tǒng)、工具和方法意為例示性和說明性，而非對范圍的限制。本發(fā)明涉及使用樹枝狀聚合物和任選地一種或多種CPP來將分子物質(zhì)非侵入性投遞入具有細(xì)胞壁的細(xì)胞中以在其中穩(wěn)定摻入所述分子物質(zhì)的方法。本發(fā)明的一個實施方案包括將感興趣的分子導(dǎo)入具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞中以實現(xiàn)植物和種子的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的方法。該方法包括提供具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞，并將樹枝狀聚合物和任選地一種或多種CPP與感興趣的分子相互作用以形成活化的樹枝狀聚合物結(jié)構(gòu)。將所述細(xì)胞和活化的樹枝狀聚合物結(jié)構(gòu)在允許其被攝取入所述具有細(xì)胞壁的細(xì)胞中的條件下置于相互接觸中。本發(fā)明的另一個實施方案包括穩(wěn)定表達(dá)基因的方法。該方法包括提供具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞，并將樹枝狀聚合物和任選地一種或多種CPP與基因相互作用以形成活化的樹枝狀聚合物結(jié)構(gòu)。將所述具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞和活化的樹枝狀聚合物結(jié)構(gòu)置于相互接觸中，并將所述樹枝狀聚合物和所述基因置于允許其被攝取入所述具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞中的條件下。然后，表達(dá)在具有所述植物細(xì)胞的植物的后代中的所述基因。本發(fā)明的又一個實施方案包括用于將分子物質(zhì)轉(zhuǎn)移入植物細(xì)胞中的方法。該方法包括將樹枝狀聚合物和任選地一種或多種CPP與質(zhì)粒DNA相互作用以形成活化的樹枝狀聚合物結(jié)構(gòu)。將所述活化的樹枝狀聚合物結(jié)構(gòu)在允許所述樹枝狀聚合物和來自質(zhì)粒DNA的基因被攝取入植物細(xì)胞中的條件下置于與攜帶完整壁的植物細(xì)胞的接觸中。在上文所描述的例示性方面和實施方案外，其它方面和實施方案會因以下描述而變得顯而易見。附圖簡述圖I顯示了質(zhì)粒pDAB3831。圖2顯示了質(zhì)粒pDAB7331。圖3是經(jīng)溴化乙錠染色的凝膠圖像,其顯示了來自擬南芥(Arabidopsis)轉(zhuǎn)基因植物的基因組DNA的PATPCR擴增100DNA梯(PromegaInc)I;來自SUPERFECT及PDAB3831處理的擬南芥轉(zhuǎn)基因系2;質(zhì)粒DNApDAB3831作為陽性對照；星號標(biāo)示了PATPCR擴增子。圖4是顯示來自擬南芥轉(zhuǎn)基因植物的基因組DNA的YFPPCR擴增的凝膠圖像100DNA梯(PromegaInc)I;來自SUPERFECT及pDAB3831處理的的擬南芥轉(zhuǎn)基因系2;質(zhì)粒DNApDAB3831作為陽性對照；星號標(biāo)示了YFPPCR擴增子?！D5顯示了來自樹枝狀聚合物介導(dǎo)的(SUPERFECT)經(jīng)轉(zhuǎn)化的擬南芥植物的葉組織的PAT蛋白質(zhì)表達(dá)水平；使用商業(yè)ELISA試劑盒，在樹枝狀聚合物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因植物中檢出PAT蛋白，并將其與經(jīng)由根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)轉(zhuǎn)化的植物相比。發(fā)明詳述在以下的描述和表中，使用了許多術(shù)語。為了提供對說明書和權(quán)利要求書(包括此類術(shù)語給予的范圍)的清楚且一致的理解，提供了以下定義回交?；亟豢梢允怯N人員將雜種后代往回與親本之一，例如第一代雜種F1與F1雜種的親本基因型之一重復(fù)雜交的方法。胚。胚可以是成熟的種子內(nèi)含有的小植物。樹枝狀聚合物。樹枝狀聚合物是通過反復(fù)順序的反應(yīng)獲得的三維的、高分枝的、單分散納米級大分子(threedimensional,hyperbranched,monodispersenanometricmacromolecule)。樹枝狀聚合物以可調(diào)的“納米結(jié)構(gòu)”常規(guī)合成,所述納米結(jié)構(gòu)可以進(jìn)行設(shè)計并作為其大小、形狀、表面化學(xué)和內(nèi)部空隙空間的函數(shù)調(diào)節(jié)。樹枝狀聚合物可以用與傳統(tǒng)生物大分子，諸如DNNPNA或蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)控制接近的結(jié)構(gòu)控制獲得，并根據(jù)其精確的納米級支架和納米容器特性進(jìn)行區(qū)別。樹枝狀聚合物是具有至少一個納米級尺寸，通常小于IOOnm的微觀顆粒。適合于在本發(fā)明中使用的樹枝狀聚合物可以具有l(wèi)nm-0.4um的大小。對草甘膦的抗性。對一定劑量的草甘膦的抗性指植物幸免于(即植物可以不被殺死)所述劑量的草甘膦的能力。在一些情況中，耐受性植物可以暫時變黃或者在其它方面展現(xiàn)出一些草甘膦誘導(dǎo)的損傷(例如，過度分蘗和/或生長抑制)，但是能恢復(fù)。穩(wěn)定化的。穩(wěn)定化的指從同一品種的近交植物的一個世代可再現(xiàn)地(reproducibly)傳遞給下一世代的植物特征。攝取。攝取指顆粒,諸如樹枝狀聚合物穿過細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的易位,其中所述易位不僅僅由于除攝取顆粒的細(xì)胞外的某物對顆粒賦予的動量而發(fā)生。僅由于對顆粒賦予的動量而引起顆粒穿過細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的易位的裝置或方法的非限制性例子是生物射彈、基因槍、顯微注射、和/或刺穿感染(impalefection)技術(shù)。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明涉及應(yīng)用樹枝狀聚合物作為形成有效載荷的納米工程的選項以使材料適合于在小分子、生物分子投遞、基因投遞、成像、和各種生物技術(shù)診斷學(xué)和感測功能中應(yīng)用。樹枝狀聚合物結(jié)構(gòu)提供許多區(qū)別性的特性，這些特性將它們與其它聚合物和納米顆粒區(qū)別，諸如逐漸的逐步合成方法，其可以提供充分限定的大小和具有相當(dāng)?shù)偷亩喾稚⑿灾笖?shù)的結(jié)構(gòu)。另外，樹枝狀聚合物化學(xué)可以是可改編的，并且如此，便于合成一大批具有不同功能性的分子。依照本發(fā)明的特定方法的樹枝狀聚合物的使用經(jīng)由使用高密度的末端基團而便于生物分子和基因投遞。在本發(fā)明的其它實施方案中，可以在樹枝狀聚合物上在各種和/或多個位點處工程化改造“添加”或“訪客”分子的多個附接位點或填充。此特性可以例如在細(xì)胞內(nèi)的分子位點的特異性靶向和編輯中采用，用于諸如生物模擬物、靶向投遞等領(lǐng)域，用于非遺傳修飾生物體選項，及在性狀和疾病抗性選項方面在多種樹或蔬菜作物中的瞬時轉(zhuǎn)化選項(Thispropertycanbeemployed,forexample,inspecifictargetingandeditingofmolecularsiteswithincellsforareassuchasbiomimetics，targeteddeliveries,fornongeneticallymodifiedorganismoptions,andtransienttransformationoptionsinavarietyoftreeorvegetablecropsfortraitanddiseaseresistanceoptions)。也可以采用本發(fā)明的實施方案來開發(fā)合適的生物傳感器。另外，可以與本發(fā)明的方法一起采用人工染色體(ACES)作為目前的真核載體的備選，用于精確靶向和同源重組選項。依照本發(fā)明的實施方案，可以提供一種將感興趣的分子導(dǎo)入包含細(xì)胞壁的植物中的方法，該方法包括將含有感興趣的分子的樹枝狀聚合物置于與植物細(xì)胞的接觸中，并允許所述樹枝狀聚合物被攝取穿過植物細(xì)胞壁。在本發(fā)明的特定方面，所述樹枝狀聚合物可以是任何樹枝狀聚合物，并且可以可逆地或不可逆地含有所述感興趣的分子，可以與所述感興趣的分子相互作用，或者以其它方式結(jié)合和/或攜帶所述感興趣的分子。在某些實施方案中，可以在與具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞接觸前或在將所述樹枝狀聚合物導(dǎo)入具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞的同時將所述感興趣的分子引入樹枝狀聚合物。依照本發(fā)明的實施方案，具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞可以是包含完整且全部細(xì)胞壁的任何植物細(xì)胞。具有細(xì)胞壁的細(xì)胞的例子包括但不限于藻類、煙草、胡蘿卜、玉米、蕓苔(canola)、油菜籽、棉花、棕櫚、花生、大豆、甘鹿、稻屬物種(Oryzasp.)、擬南芥屬物種(Arabidopsissp.)、和蓖麻屬物種(Ricinussp.),優(yōu)選地?zé)煵?、胡蘿卜、玉米、棉花、蕓苔、大豆和甘蔗；更優(yōu)選地?zé)煵莺秃}卜。本發(fā)明的實施方案可以包括來自任何組織或它們存在的任何地方的包含細(xì)胞壁的細(xì)胞，包括但不限于在胚、分生細(xì)胞、愈傷組織、花粉、葉、花藥、根、根尖、花、種子、莢果、莖和組織培養(yǎng)物中。在本發(fā)明的實施方案中，感興趣的分子可以是可以投遞到依照本發(fā)明的植物細(xì)胞的任何分子。感興趣的分子或感興趣分子的組分可以包含但不限于核酸、DNA、RNA、RNAi分子、基因、質(zhì)粒、粘粒、YAC、BAC、植物人工染色體、植物微型染色體、植物工程性狀基因座DNA;多肽、酶、激素、糖肽、糖、脂肪、信號傳導(dǎo)肽、抗體、維生素、信使、第二信使、氨基酸、cAMP、藥物、除草劑、殺真菌劑、抗生素、和/或其組合。本發(fā)明的實施方案包括用于預(yù)防或治療疾病的方法。非限制性的例示性實施方案包括使用本發(fā)明的方法對有此需要的細(xì)胞投遞殺真菌劑、抗生素、和/或其它藥物。在本發(fā)明的方面，樹枝狀聚合物可以被攝取入細(xì)胞的各個部分中。可以攝取樹枝狀聚合物的位置的例子包括但不限于胞質(zhì)溶膠、細(xì)胞核、液泡形成體、質(zhì)體、黃化質(zhì)體、色質(zhì)體、白色體、油質(zhì)體、蛋白質(zhì)體、造粉體、葉綠體、和雙層膜的腔。在本發(fā)明的其它實施方案中，可以經(jīng)由共質(zhì)體或質(zhì)外體途徑發(fā)生包含細(xì)胞壁的細(xì)胞對樹枝狀聚合物的攝取。本發(fā)明的其它實施方案包括經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞及其生成方法，其中植物細(xì)胞具有經(jīng)由本發(fā)明的方法導(dǎo)入其中的一種或多種核酸。在實施方案的一個例子中，可以經(jīng)由依照本發(fā)明的樹枝狀聚合物將包含感興趣的基因和選擇標(biāo)志的質(zhì)粒導(dǎo)入具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞中。在其它實施方案中，可以選擇已經(jīng)穩(wěn)定地整合了感興趣的基因和/或選擇標(biāo)志的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體。在備選的實施方案中，可以增殖現(xiàn)在包含感興趣的基因的植物細(xì)胞以生成包含感興趣的分子的其它細(xì)胞。在其它實施方案中，現(xiàn)在包含感興趣的分子的植物細(xì)胞可以是可再生細(xì)胞，其可以用于再生包含感興趣的分子的全植物。在另一方面，本發(fā)明提供了創(chuàng)建在組織培養(yǎng)中使用的包含感興趣分子的可再生植物細(xì)胞的方法。優(yōu)選地，組織培養(yǎng)將能夠再生與所述可再生細(xì)胞具有基本上相同的基因型的植物。此類組織培養(yǎng)物中的可再生細(xì)胞可以是胚、原生質(zhì)體、分生細(xì)胞、愈傷組織、花粉、葉、花藥、根、根尖、花、種子、莢果或莖。更進(jìn)一步，本發(fā)明的實施方案提供了自本發(fā)明的組織培養(yǎng)物再生的植物?；蛘?，本發(fā)明提供了將期望的性狀導(dǎo)入具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞中的方法，其中該方法包括將樹枝狀聚合物和能夠為植物細(xì)胞提供期望的性狀的感興趣分子置于與細(xì)胞的接觸中，并允許所述樹枝狀聚合物被攝取穿過細(xì)胞壁。期望性狀的例子包括但不限于選自下組的性狀雄性不育、除草劑抗性、昆蟲抗性、和對細(xì)菌性疾病、真菌性疾病、和/或病毒性疾病的抗性。本發(fā)明的其它方面提供了生成包含期望的性狀或感興趣分子的穩(wěn)定化植物系的方法，其中可以首先通過穿過植物細(xì)胞壁攝取樹枝狀聚合物來導(dǎo)入期望的性狀或感興趣的分子。生成穩(wěn)定化的植物系的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的，并且可以包括如下的技術(shù)，諸如但不限于自交、回交、雜種生成、群體雜交等。包含首先通過穿過細(xì)胞壁攝取樹枝狀聚合物來導(dǎo)入植物細(xì)胞(或其祖先)中的期望的性狀或感興趣分子的所有植物和植物細(xì)胞在本發(fā)明范圍內(nèi)。有利地，包含首先通過穿過細(xì)胞壁攝取樹枝狀聚合物來導(dǎo)入植物或細(xì)胞(或其祖先)中的期望的性狀或感興趣分子的植物細(xì)胞可以用于與其它不同植物細(xì)胞雜交以生成具有卓越特征的第一代(F1)雜種細(xì)胞、種子、和/或植物。在感興趣的分子包含一種或多種基因的實施方案中，基因可以是顯性或隱性等位基因。舉例而言，所述基因會賦予的性狀諸如除草劑抗性、抗蟲性、細(xì)菌抗性、真菌抗性、病毒疾病抗性、雄性能育、雄性不育、提高的營養(yǎng)質(zhì)量、和工業(yè)用途。隨著使分離和表征編碼特定蛋白質(zhì)或RNA產(chǎn)物(例如RNAi)的基因成為可能的分子生物學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)，植物生物學(xué)領(lǐng)域的科學(xué)家對以下方面形成了強烈的興趣，即工程化改造細(xì)胞的基因組以含有和表達(dá)外來基因，或者另外的或經(jīng)修飾型式的天然或內(nèi)源基因(可能由不同啟動子驅(qū)動)，以便以特定的方式改變細(xì)胞的性狀。此類外來的另外的和/或經(jīng)修飾的基因在本文中統(tǒng)稱為“轉(zhuǎn)基因”。在過去15至20年里，已經(jīng)開發(fā)了數(shù)種用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的方法，并且在具體的實施方案中，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)化型式的細(xì)胞及其生成方法，其通過經(jīng)由穿過細(xì)胞壁攝取樹枝狀聚合物將轉(zhuǎn)基因?qū)刖哂屑?xì)胞壁的細(xì)胞來進(jìn)行。在本發(fā)明的實施方案中，轉(zhuǎn)基因可以包含在表達(dá)載體中。細(xì)胞轉(zhuǎn)化可以牽涉構(gòu)建會在特定細(xì)胞中發(fā)揮功能的表達(dá)載體。此類載體可以包含包括在調(diào)節(jié)元件(例如啟動子)控制下的或者與調(diào)節(jié)元件(例如啟動子)可操作連接的基因的DNA。表達(dá)載體可以含有一種或多種此類可操作連接的基因/調(diào)節(jié)元件組合。載體可以是質(zhì)粒形式，而且可以單獨或者與其它質(zhì)粒聯(lián)合使用，以如下文所描述的那樣使用轉(zhuǎn)化方法提供經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，從而將轉(zhuǎn)基因摻入包含細(xì)胞壁的植物細(xì)胞的遺傳物質(zhì)中。在本發(fā)明的具體的實施方案中，多用途S1ARBURSTPAMAM(聚酰胺胺(polyamidoamine))樹枝狀聚合物原型展現(xiàn)出以下的特性,其適合于用作(i)祀向性、診斷MRI(磁共振成像)INIR(近IR)造影劑，(ii)和/或用于癌癥療法的受控投遞。它們之中，引導(dǎo)候選物是(核心1，4二氨基丁烷(diaminobotane);G(代)[PAMAM(C02Na)64J。此樹枝狀納米結(jié)構(gòu)(即，-5.Onm直徑)是基于非常有利的生物相容性概況(profile)進(jìn)行選擇的(納米技術(shù)表征實驗室(NanotechnologyCharacterizationLaboratory,NCL),即國家癌癥研究所(NationalCancerinstitute,NCI)的一個分支機構(gòu)已經(jīng)完成了關(guān)于引導(dǎo)化合物的廣泛體外研究，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了它是非常良性的且高度生物相容的，預(yù)期是它會展現(xiàn)出合意的哺乳動物腎排泄特性，并且表明靶向特征。與本發(fā)明的方法一起使用的樹枝狀聚合物代表具有高度分子一致性和低多分散性的一類以其充分限定的結(jié)構(gòu)為特征的聚合物。另外，已經(jīng)顯示了這些樹枝狀聚合物能夠繞過流出轉(zhuǎn)運體。依照本發(fā)明方法的樹枝狀聚合物的使用已經(jīng)生成了穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物，并且以表型表明了穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的除草劑基因的表達(dá)，在所述表型中賦予了轉(zhuǎn)基因Tl植物高除草劑耐受性。顯示了此植物是能育的，因為它生成了T2種子。在一個具體的實施方案中，使用SUPERFECT轉(zhuǎn)染試劑。此試劑是一種具有限定形狀和直徑的聚陽離子物質(zhì)(polycation)，作為特定設(shè)計的活化樹枝狀聚合物的溶液可作為Qiagen的SUPERFECT試劑(Qiagen產(chǎn)品目錄編號#301307)購得。樹枝狀聚合物是具有自中心核心輻射并在帶電荷的氨基基團處終止的分枝的球狀聚酰胺胺分子?；瘜W(xué)活化促進(jìn)真核細(xì)胞高效攝取DNA。雖然不限于特定的理論，認(rèn)為此試劑將DNA裝配成緊湊的結(jié)構(gòu)，由此優(yōu)化DNA進(jìn)入細(xì)胞中。為了在其轉(zhuǎn)運到細(xì)胞核期間穩(wěn)定化SUPERFECTDNA復(fù)合物，將SUPERFECT試劑設(shè)計為在與內(nèi)體融合后緩沖溶酶體，導(dǎo)致對溶酶體核酸酶的pH抑制。用于經(jīng)由樹枝狀聚合物攝取的表達(dá)載體標(biāo)志物基因表達(dá)載體可以包括至少一種與調(diào)節(jié)元件(例如啟動子)可操作連接的遺傳標(biāo)志，其容許通過負(fù)選擇(即抑制不含該選擇標(biāo)志基因的細(xì)胞生長)或者通過正選擇(即篩選由該遺傳標(biāo)志編碼的產(chǎn)物)回收含有所述標(biāo)志的經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞。許多用于轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)志基因是轉(zhuǎn)化領(lǐng)域中公知的，包括例如編碼在代謝上使可以作為抗生素或除草劑的選擇性化學(xué)劑解毒的酶的基因，或者編碼可對抑制劑不敏感的改變了的靶物的基因。幾種正選擇方法也是本領(lǐng)域中已知的。一種通常適合于植物轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)志基因可以包括在植物調(diào)節(jié)信號控制下的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(nptll)基因，其賦予對卡那霉素的抗性。參見例如Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,80:4803(1983)。另一種常用的選擇標(biāo)志基因可以是潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，其賦予對抗生素潮霉素的抗性。參見例如VandenElzen等，PlantMol.Biol.,5:299(1985)。賦予對抗生素抗性的細(xì)菌起源的另外的選擇標(biāo)志基因包括慶大霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、鏈霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、氨基糖苷-3’-腺苷酰轉(zhuǎn)移酶(adenyltransferase)和博來霉素抗性決定子。參見Hayford等，PlantPhysiol.86:1216(1988);Jones等，Mol.Gen.Genet.,210:86(1987)；Svab等,PlantMol.Biol.14:197(1990)；Hille等,PlantMol.Biol.7:171(1986)。其它選擇標(biāo)志基因賦予對除草劑諸如草甘膦、草銨膦(glufosinate)或溴苯臆(bromoxynil)的抗性。參見Comai等，Nature317:741-744(1985)；GordonKamm等，PlantCell2:603-618(1990);和Stalker等，Science242:419-423(1988)。其它適合于植物轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)志基因不是細(xì)菌起源的。這些基因包括例如小鼠二氫葉酸還原酶、植物5-烯醇丙酮酰莽草酸(enolpyruvylshikimate)-3-磷酸合酶和植物乙酸乳酸合酶。參見Eichholtz等，SomaticCellMol.Genet.13:67(1987);Shah等，Science233:478(1986);Charest等，PlantCellRep.8:643(1990)。另一類適合于植物轉(zhuǎn)化的標(biāo)志基因需要篩選據(jù)推測經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，而不對經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞直接遺傳選擇對毒性物質(zhì)諸如抗生素的抗性。這些基因特別可用于量化或顯現(xiàn)基因在特定組織中表達(dá)的空間樣式，并且通常稱為報告基因，因為它們可以與基因或基因調(diào)節(jié)序列融合以調(diào)查基因表達(dá)。通常用于篩選經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的基因包括葡糖醛酸糖苷酶(OTS)、β-半乳糖苷酶、螢光素酶和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶。參見R.A.，Jefferson,PlantMol.Biol.Rep.5:387(1987);Teeri等，EMBOJ.8:343(1989);Koncz等，Proc.Natl.Acad.SciU.S.A.84:131(1987);DeBlock等，EMBOJ.3:1681(1984)。最近，已經(jīng)可獲得用于顯現(xiàn)⑶S活性的體內(nèi)方法，其不需要破壞植物組織。MolecularProbespublication2908,Imagene,GreenTM,第I頁-第4頁(1993)；和Naleway等，J.CellBiol.115:151a(1991)。然而，還沒有證明這些用于顯現(xiàn)⑶S活性的體內(nèi)方法對于回收經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是有用的，這是由于低靈敏度、高熒光背景和與使用螢光素酶基因作為選擇標(biāo)志有關(guān)的限制。新近，已經(jīng)利用編碼熒光蛋白(例如，GFP、EGFP,EBFP,ECFPjPYFP)的基因作為原核和真核細(xì)胞中基因表達(dá)的標(biāo)志物。參見Chalfie等，Science263:802(1994)。熒光蛋白和熒光蛋白突變體可以作為可篩選標(biāo)志物使用。用于經(jīng)由樹枝狀聚合物攝取的表達(dá)載體啟動子表達(dá)載體中包含的基因必須由包含調(diào)節(jié)元件(例如啟動子)的核苷酸序列驅(qū)動。數(shù)種類型的啟動子現(xiàn)在是轉(zhuǎn)化領(lǐng)域中公知的，可以單獨使用或者與啟動子聯(lián)合使用的其它調(diào)節(jié)元件也是如此。如本文中所使用的，“啟動子”包括提及如下的DNA區(qū)域，其可以在轉(zhuǎn)錄起始的上游，而且可以牽涉識別和結(jié)合RNA聚合酶和其它蛋白質(zhì)以啟動轉(zhuǎn)錄?！爸参飭幼印笨梢允悄軌蛟谥参锛?xì)胞中啟動轉(zhuǎn)錄的啟動子。在發(fā)育控制下的啟動子的例子包括優(yōu)先在某些組織諸如葉、根、種子、纖維、木質(zhì)部導(dǎo)管、管胞、或厚壁組織中啟動轉(zhuǎn)錄的啟動子。此類啟動子稱為“組織優(yōu)選性的”。僅在某些組織中啟動轉(zhuǎn)錄的啟動子稱為“組織特異性的”。“細(xì)胞類型”特異性啟動子主要在一種或多種器官中的某些細(xì)胞類型(例如根或葉中的維管細(xì)胞)中驅(qū)動表達(dá)。“誘導(dǎo)型”啟動子可以是可在環(huán)境控制下的啟動子?？烧兄抡T導(dǎo)型啟動子轉(zhuǎn)錄的環(huán)境條件的例子包括缺氧條件或光的存在。組織特異性的、組織優(yōu)選性的、細(xì)胞類型特異性的、和誘導(dǎo)型啟動子構(gòu)成“非組成性”啟動子類?！敖M成性”啟動子可以是可在大多數(shù)環(huán)境條件下有活性的啟動子。A.誘導(dǎo)型啟動子可以將誘導(dǎo)型啟動子與細(xì)胞中表達(dá)的基因可操作連接。任選地，可以將誘導(dǎo)型啟動子與編碼信號序列的核苷酸序列可操作連接，所述核苷酸序列可以與用于在細(xì)胞中表達(dá)的基因可操作連接。通過誘導(dǎo)型啟動子，轉(zhuǎn)錄速率響應(yīng)誘導(dǎo)劑而升高?？梢栽诒景l(fā)明中使用任何誘導(dǎo)型啟動子。參見Ward等，PlantMol.Biol.22:361-366(1993)。例示性誘導(dǎo)型啟動子包括但不限于那些響應(yīng)銅的ACEI系統(tǒng)的啟動子(Mett等，PNAS90:4567-4571(1993));響應(yīng)苯磺酰胺除草劑安全劑的來自玉米的In2基因(Hershey等，Mol.Gen.Genetics227:229-237(1991);和Gatz等，Mol.Gen.Genetics243:32-38(1994));和來自TnlO的Tet阻抑物(Gatz等，Mol.Gen.Genetics227:229-237(1991))。特別有用的誘導(dǎo)型啟動子可以是響應(yīng)植物正常不響應(yīng)的誘導(dǎo)劑的啟動子。例示性誘導(dǎo)型啟動子可以是來自類固醇激素基因的誘導(dǎo)型啟動子，其轉(zhuǎn)錄活性可以受糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)。Schena等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:0421(1991)。B.組成性啟動子將組成性啟動子與細(xì)胞中表達(dá)的基因可操作連接，或者可以將組成性啟動子與編碼信號序列的核苷酸序列可操作連接，所述編碼信號序列的核苷酸序列可以與用于在細(xì)胞中表達(dá)的基因可操作連接?？梢栽诒景l(fā)明中利用不同的組成性啟動子。例示性的組成性啟動子包括但不限于來自植物病毒的啟動子，諸如來自CaMV的35S啟動子(Odell等，Nature313:810-812(1985));來自稻肌動蛋白基因的啟動子(McElroy等，PlantCell2:163-171(1990))；來自泛素的啟動子(Christensen等，PlantMol.Biol.12:619-632(1989)，和Christensen等,PlantMol.Biol.18:675-689(1992))；來自pEMU的啟動子(Last等，Theor.Appl.Genet.81:581-588(1991));來自MAS的啟動子(Velten等，EMB0J.3:2723-2730(1984));和來自玉米H3組蛋白的啟動子(Lepetit等，Mol.Gen.Genetics231:276-285(1992),和Atanassova等，PlantJournal2(3):291-300(1992))oALS啟動子，即歐洲油菜(Brassicanapus)ALS3結(jié)構(gòu)基因5’的Xbal/Ncol片段(或與所述Xbal/Ncol片段相似的核苷酸序列)代表一種特別有用的組成性啟動子。參見PCT申請WO96/30530。C.組織特異性或組織優(yōu)選性啟動子可以將組織特異性啟動子與用于在細(xì)胞中表達(dá)的基因可操作連接。任選地，可以將組織特異性啟動子與編碼信號序列的核苷酸序列可操作連接，所述編碼信號序列的核苷酸序列可以與用于在細(xì)胞中表達(dá)的基因可操作連接。用與組織特異性啟動子可操作連接的感興趣基因轉(zhuǎn)化的植物可以專門或優(yōu)先在特定組織中生成轉(zhuǎn)基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物?？梢栽诒景l(fā)明中利用任何組織特異性或組織優(yōu)選性啟動子。例示性組織特異性或組織優(yōu)選性啟動子包括但不限于根優(yōu)選性啟動子，諸如來自菜豆蛋白基因的啟動子(Murai等,Science23:476-482(1983)，和SenguptaGopalan等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:3320-3324(1985))；葉特異性和光誘導(dǎo)型啟動子，諸如來自cab或1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(rubisco)的啟動子(Simpson等，EMBOJ.4(11):2723-2729(1985)，和Timko等，Nature318:579-582(1985));花藥特異性啟動子，諸如來自LAT52的啟動子(Twell等，Mol.Gen.Genetics217:240-245(1989));花粉特異性啟動子，諸如來自Zml3的啟動子(Guerrero等，Mol.Gen.Genetics244:161-168(1993))或小孢子優(yōu)選性啟動子，諸如來自apg的啟動子(Twell等，Sex.PlantReprod.6:217-224(1993))?？梢酝ㄟ^將編碼信號序列的核苷酸序列可操作連接至編碼感興趣蛋白質(zhì)的基因的5’和/或3’區(qū)域的手段來實現(xiàn)由轉(zhuǎn)基因生成的蛋白質(zhì)向亞細(xì)胞區(qū)室諸如葉綠體、液泡、過氧化物酶體、乙醛酸循環(huán)體、細(xì)胞壁或線粒體的轉(zhuǎn)運或者分泌入質(zhì)外體中?？梢栽诘鞍踪|(zhì)合成和加工過程中測定在結(jié)構(gòu)基因的5’和/或3’端的靶向序列，其中編碼的蛋白質(zhì)最后可以被區(qū)室化(compartmentalized)?；蛘?可以將此類亞細(xì)胞區(qū)室祀向性蛋白質(zhì)與樹枝狀聚合物直接連接以將用感興趣的分子包被的樹枝狀聚合物引導(dǎo)至期望的亞細(xì)胞區(qū)室。信號序列的存在將多肽引導(dǎo)至胞內(nèi)細(xì)胞器或亞細(xì)胞區(qū)室，或者分泌至質(zhì)外體。許多信號序列是本領(lǐng)域中已知的。參見例如Becker等，PlantMol.Biol.20:49(1992)；P.S.Close,Master’sThesis,IowaStateUniversity(1993)；C.Knox等,“StructureandOrganizationofTwoDivergentAlpha-AmylaseGenesfromBarley,，，PlantMol.Biol.9:3-17(1987)；Lerner等，PlantPhysiol.91:124-129(1989)；Fontes等，PlantCell3:483-496(1991)；Matsuoka等，Proc.NatlAcadSci.88:834(1991)；Gould等，J.Cell.Biol.108:1657(1989);Creissen等，PlantJ.2:129(1991)；Kalderon等,Ashortaminoacidsequenceabletospecifynuclearlocation,CelI39:499-509(1984);Steifel等，Expressionofamaizecellwallhydroxyproline-richglycoproteingeneinearlyleafandrootvasculardifferentiation,PlantCell2:785-793(1990)。外來蛋白質(zhì)基因和農(nóng)藝學(xué)基因通過根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物，可以以商業(yè)量生產(chǎn)外來蛋白質(zhì)。如此，用于選擇和繁殖經(jīng)轉(zhuǎn)化植物的技術(shù)(它們是本領(lǐng)域中充分了解的)產(chǎn)生多種轉(zhuǎn)基因植物，它們以常規(guī)方式收獲，然后可以從感興趣的組織或總生物量提取外來蛋白質(zhì)?？梢酝ㄟ^由例如Heney和Orr,Anal.Biochem.114:92-6(1981)所討論的已知方法來實現(xiàn)從植物生物量的蛋白質(zhì)提取。在本發(fā)明的各方面，為商業(yè)生產(chǎn)外來蛋白質(zhì)提供的轉(zhuǎn)基因植物可以是細(xì)胞或植物。在其它方面，感興趣的生物量可以是種子。對于相對少數(shù)的顯示較高表達(dá)水平的轉(zhuǎn)基因植物，可以主要經(jīng)由常規(guī)的RFLP、PCR和SSR分析(其鑒定整合DNA分子的近似染色體位置)來產(chǎn)生遺傳圖譜。關(guān)于這方面的例示性方法，參見Glick和Thompson,MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology,CRCPress,BocaRaton269:284(1993)。關(guān)于染色體位置的圖譜信息對于主題轉(zhuǎn)基因植物的所有權(quán)保護(hù)可以是有用的。如果可以進(jìn)行未經(jīng)授權(quán)的繁殖和與其它種質(zhì)進(jìn)行雜交，則可以將整合區(qū)域的圖譜與可疑植物的類似圖譜進(jìn)行比較以確定后者是否與主題植物具有共同親本(parentage)。圖譜比較會牽涉雜交、RFLP,PCR、SSR和測序，它們都是常規(guī)技術(shù)。同樣地，可以在經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或其后代中表達(dá)農(nóng)藝學(xué)基因。更具體地，可以經(jīng)由本發(fā)明的方法對植物進(jìn)行遺傳工程化改造以表達(dá)農(nóng)藝學(xué)感興趣的各種表型。可以在這方面使用的例示性基因包括但不限于下文進(jìn)行歸類的基因。I.賦予對害蟲或疾病的抗性并編碼下列各項的基因A)植物疾病抗性基因。植物防御常常由植物中的疾病抗性基因(R)產(chǎn)物與病原體中相應(yīng)無毒力(Avr)基因產(chǎn)物之間的特異性相互作用激活。可以用克隆的抗性基因轉(zhuǎn)化植物品種以工程化改造對特定病原體株有抗性的植物。參見例如Jones等，Science266:789(1994)(克隆對黃枝孢霉(Cladosporiumfulvum)有抗性的番茄Cf_9基因)；Martin等,Science262:1432(1993)(對丁香假單胞菌番爺致病變種(Pseudomonassyringaepv.tomato)有抗性的番爺Pto基因編碼蛋白質(zhì)激酶)；Mindrinos等，Cell78:1089(1994)(對丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)有抗性的擬南芥(Arabidops)RSP2基因)。B)賦予對害蟲諸如大豆胞囊線蟲有抗性的基因。參見例如PCT申請WO96/30517；PCT申請WO93/19181。C)蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)蛋白、其衍生物或以其為模型的合成多肽。參見例如Geiser等，Gene48:109(1986)，其披露了Btδ-內(nèi)毒素基因的克隆和核苷酸序列。此外，編碼S-內(nèi)毒素基因的DNA分子可以購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection),Manassas,Va.,例如以ATCC保藏號40098、670136、31995和31998購得。D)凝集素。參見例如VanDamme等，PlantMolec.Biol.24:25(1994)的公開內(nèi)容，其披露了數(shù)種君子蘭(Cliviaminiata)甘露糖結(jié)合凝集素基因的核苷酸序列。E)維生素結(jié)合蛋白諸如抗生物素蛋白。參見PCT申請US93/06487。該申請教導(dǎo)了抗生物素蛋白和抗生物素蛋白同源物作為針對蟲害的殺幼蟲劑的用途。F)酶抑制劑，例如蛋白酶或蛋白水解酶抑制劑或淀粉酶抑制劑。參見例如Abe等，J.Biol.Chem.262:16793(1987)(稻半胱氨酸蛋白水解酶抑制劑的核苷酸序列);Huub等，PlantMolec.Biol.21:985(1993)(編碼煙草蛋白水解酶抑制劑I的cDNA的核苷酸序列)；Sumitani等,Biosci.Biotech.Biochem.57:1243(1993)(硝抱鏈霉菌(Streptomycesnitrosporeus)α-淀粉酶抑制劑的核苷酸序列)；和美國專利號5，494，813(Hepher和Atkinson,1996年2月27日公開)。G)昆蟲特異性激素或信息素，諸如蛻皮類固醇或保幼激素，其變體、基于其的模擬物、或其拮抗劑或激動劑。參見例如Hammock等，Nature344:458(1990)披露的克隆的保幼激素酯酶(即一種保幼激素滅活劑)的桿狀病毒表達(dá)的內(nèi)容。H)昆蟲特異性肽或神經(jīng)肽，其在表達(dá)后破壞受到影響的害蟲的生理學(xué)。例如參見Regan,J.Biol.Chem.269:9(1994)(表達(dá)克隆產(chǎn)生編碼昆蟲利尿激素受體的DNA)和Pratt等,Biochem.Biophys.Res.Comm.163:1243(1989)(可以在太平洋折翅爐(Diplopterapuntata)中鑒定出咽側(cè)體抑制素(allostatin))的公開內(nèi)容。還可參見Tomalski等的美國專利號5，266，317，其披露了編碼昆蟲特異性、麻痹性神經(jīng)毒素的基因。I)在自然界由蛇、黃蜂(wasp)或任何其它生物體生成的昆蟲特異性毒液。例如參見Pang等，Gene116:165(1992)，是關(guān)于編碼蝎昆蟲毒性肽的基因在植物中的異源表達(dá)的公開內(nèi)容。J)酶，其負(fù)責(zé)超積累單萜、倍半萜、類固醇、異羥肟酸、類苯丙烷衍生物或另一具有殺昆蟲活性的非蛋白質(zhì)分子。K)牽涉對生物學(xué)活性分子的修飾(包括翻譯后修飾)的酶；例如，糖酵解酶、蛋白水解酶、脂肪分解酶、核酸酶、環(huán)化酶、轉(zhuǎn)氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、彈性蛋白酶、殼多糖酶(chitinase)和葡聚糖酶(不管是天然的還是合成的)。參見以Scott等名義的PCT申請WO93/02197，其披露了callase基因的核苷酸序列。含有殼多糖酶編碼序列的DNA分子可以例如從ATCC以保藏號39637和67152獲得。還可參見Kramer等,InsectBiochem.Molec.Biol.23:691(1993)(其教導(dǎo)了編碼煙草天蛾殼多糖酶的cDNA的核苷酸序列)和Kawalleck等，PlantMolec.Biol.21:673(1993)(其提供了歐芹ubi4_2多聚泛素基因的核苷酸序列)。L)刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子。例如參見Botella等，PlantMolec.Biol.24:757(1994)(關(guān)于綠豆I丐調(diào)蛋白cDNA克隆的核苷酸序列)和Griess等,PlantPhysiol.104:1467(1994)(其提供了玉米鈣調(diào)蛋白cDNA克隆的核苷酸序列)的公開內(nèi)容。M)疏水矩妝(hydrophobicmomentpeptide)。參見PCT申請WO95/16776(抑制真菌植物病原體的鱟抗菌肽(Tachyplesin)的肽衍生物的公開內(nèi)容)和PCT申請WO95/18855(教導(dǎo)了賦予疾病抗性的合成抗微生物肽)。N)膜通透酶、通道形成劑或通道阻斷劑。例如參見Jaynes等，PlantSci.89:43(1993)公開的殺菌肽-β溶胞肽類似物(cecropin-βlyticpeptideanalog)的異源表達(dá)以使轉(zhuǎn)基因煙草植物對青枯假單胞菌(Pseudomonassolanacearum)有抗性。0)病毒侵入蛋白或自其衍生的復(fù)合毒素。例如，病毒外殼蛋白在經(jīng)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞中的積累賦予對由可衍生出該外殼蛋白基因的病毒及相關(guān)病毒招致的病毒感染和/或疾病形成的抗性。參見Beachy等，Ann.rev.Phytopathol.28:451(1990)。已經(jīng)對經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物賦予了針對苜?；ㄈ~病毒、黃瓜花葉病毒、煙草線條病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、煙草蝕刻病毒、煙草脆裂病毒和煙草花葉病毒的外殼蛋白介導(dǎo)的抗性。同上。P)昆蟲特異性抗體或自其衍生的免疫毒素。如此，靶向昆蟲腸中的重要代謝功能的抗體會使受影響的酶失活，這殺死昆蟲。參見Taylor等，摘要號497，SeventhInt’ISymposiumonMolecularPlant-MicrobeInteractions(Edinburgh,Scotland)(1994)(經(jīng)由生成單鏈抗體片段進(jìn)行的轉(zhuǎn)基因煙草中的酶促失活)。Q)病毒特異性抗體。參見例如Tavladoraki等，Nature366:469(1993),其顯示了表達(dá)重組抗體基因的轉(zhuǎn)基因植物受到保護(hù)免于病毒攻擊。R)在自然界由病原體或寄生物生成的發(fā)育阻滯蛋白(developmental-arrestiveprotein)。例如，真菌內(nèi)a-I,4_D_多聚半乳糖醛酸酶通過溶解植物細(xì)胞壁同-a-1，4-D-半乳糖醒酸酶(galacturonase)來促進(jìn)真菌定殖(colonization)和植物營養(yǎng)物釋放。參見Lamb等，Bio/Technology10:1436(1992)。編碼豆內(nèi)多聚半乳糖醒酸酶抑制蛋白的基因的克隆和表征可以由Toubart等，PlantJ.2:367(1992)描述。S)在自然界由植物生成的發(fā)育阻滯蛋白。例如Logemann等，Bio/Technology10:305(1992)顯示了表達(dá)大麥核糖體失活基因的轉(zhuǎn)基因植物對真菌疾病具有升高的抗性。2.賦予對除草劑的抗性的基因A)抑制生長點或分生組織的除草劑，諸如咪唑啉酮、磺酰胺或磺酰脲。在這類中的例示性基因編碼突變的ALS和AHAS酶，如分別由例如Lee等，EMBOJ.7:1241(1988)和Miki等,Theor.Appl.Genet.80:449(1990)所描述的。B)草甘膦(分別由例如突變體5-烯醇丙酮酰莽草酸(enolpyruvylshikimate)-3-磷酸合酶(EPSP)基因(經(jīng)由導(dǎo)入重組核酸和/或天然EPSP基因的體內(nèi)誘變的各種形式)、aroA基因和草甘膦乙?；D(zhuǎn)移酶(GAT)基因賦予的抗性)、其它膦?；衔镏T如草銨膦(glufosinate)(來自鏈霉菌屬物種(Streptomycesspecies),包括吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)和綠色產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesviridichromogenes)的草銨膦乙?；D(zhuǎn)移酶(PAT)基因)、和卩比唳氧基或苯氧基丙酸和環(huán)己酮(ACC酶抑制劑編碼基因)，見例如Shah等的美國專利No.4，940,835和Barry等的美國專利6，248，876，其披露了可以對植物賦予草甘膦抗性的EPSP形式的核苷酸序列。編碼突變體aroA基因的DNA分子可以以ATCC保藏號39256獲得，并且突變體基因的核苷酸序列可以在Comai的美國專利No.4，769，061中披露。Kumada等的歐洲專利申請No.O333033和Goodman等的美國專利No.4，975，374披露了對除草劑諸如L-膦絲菌素(L-phophinothricin)賦予抗性的谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列。PAT基因的核苷酸序列可以參見Leemans等的歐洲申請No.O242246,DeGreef等，Bio/Technology7:61(1989)描述了生成表達(dá)編碼PAT活性的嵌合bar基因的轉(zhuǎn)基因植物。賦予對苯氧基丙酸和環(huán)己酮,諸如稀禾定(sethoxydim)和卩比氟氯禾靈(haloxyfop)的抗性的基因的例子包括Marshall等，Theor.Appl.Genet.83:435(1992)描述的AcclSl、AcclS2和AcclS3基因。能夠賦予草甘膦抗性的GAT基因記載于Castle等的WO2005012515。賦予對2，4_D、苯氧基丙酸和卩比唳基氧基生長素除草劑的抗性的基因記載于歸于DowAgroSciencesLLC的TO2005107437。C)抑制光合作用的除草劑，諸如三嗪(psbA和gs+基因)或苯基氰(腈水解酶基因)。Przibila等，PlantCell3:169(1991)描述了用編碼突變的psbA基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化衣滴蟲(Chlamydomonas)。腈水解酶基因的核苷酸序列披露于Stalker的美國專利號4，810，648，并且含有這些基因的DNA分子可以以ATCC保藏號53435、67441、和67442獲得。編碼谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的DNA的克隆和表達(dá)可以由Hayes等，Biochem.J.285:173(1992)描述。3.賦予或促成增值(value-added)性狀的基因,諸如A)經(jīng)修飾的脂肪酸代謝，例如通過用硬脂酰-ACP去飽和酶的反義基因轉(zhuǎn)化植物以提高植物的硬脂酸含量。參見Knultzon等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:2624(1992)。B)降低的肌醇六磷酸鹽含量——I)肌醇六磷酸酶編碼基因的導(dǎo)入會增強肌醇六磷酸鹽的分解，向經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物添加更多游離的磷酸鹽。例如，參見VanHartingsveldt等，Gene127:87(1993),關(guān)于黑曲霉(Aspergillusniger)肌醇六磷酸酶基因的核苷酸序列的公開內(nèi)容。2)可以導(dǎo)入降低肌醇六磷酸鹽含量的基因。例如在玉米中，這可以如下實現(xiàn)，即克隆與單一等位基因有關(guān)的DNA，然后再次導(dǎo)入，所述單一等位基因可以負(fù)責(zé)特征為低水平肌醇六磷酸的玉米突變體。參見Raboy等，Maydica35:383(1990)。C)例如通過用編碼改變淀粉分支樣式的酶的基因轉(zhuǎn)化植物來實現(xiàn)的經(jīng)修飾的碳水化合物組成。參見Shiroza等，J.Bacteol.170:810(1988)(鏈球菌(Streptococcus)突變體果糖基轉(zhuǎn)移酶基因的核苷酸序列),Steinmetz等，Mol.Gen.Genet.20:220(1985)(枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的核苷酸序列可以是果聚糖鹿糖酶(Ievansucrase)基因)；Pen等，Bio/Technology10:292(1992)(表達(dá)地衣芽胞桿菌(Bacilluslichenifonn)α-淀粉酶的轉(zhuǎn)基因植物的生成)；Elliot等，PlantMolec.Biol.21:515(1993)(番茄轉(zhuǎn)化酶基因的核苷酸序列)；Sogaard等，J.Biol.Chem.268:22480(1993)(定點誘變可以是大麥α-淀粉酶基因的)JPFisher等，PlantPhysiol.102:1045(1993)(玉米胚乳淀粉分支酶II)。實施例本發(fā)明在以下實施例中進(jìn)一步描述，所述實施例作為例示提供，而并不意圖以任何方式限制本發(fā)明。實施例I樹枝狀聚合物/DNA復(fù)合物的制備和細(xì)胞處理I.I質(zhì)粒的制備將pDAB3831質(zhì)粒DNA(圖I)(SEQ.ID.NO.I和2)分離，并準(zhǔn)備好進(jìn)行樹枝狀聚合物介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化。使用環(huán)化DNA和線性化DNA兩者來測試轉(zhuǎn)化實驗。為了線性化PDAB3831，完成PCR反應(yīng)。使用連續(xù)熱循環(huán)系統(tǒng)(其先前已經(jīng)記載于例如WO2008045288)來PCR擴增pDAB3831。與使用小管不同，連續(xù)熱循環(huán)儀使用重復(fù)通過不同溫度區(qū)的恒定或連續(xù)流體流來擴增DNA。將PCR反應(yīng)混合物注射入與PCR反應(yīng)混合物不可混合的載體流體中。然后，將載體流體通過多個溫度區(qū)以便于PCR反應(yīng)混合物內(nèi)的DNA擴增。制備樣品，其含有12%MgCI2(25mM),O.33%TaqDNA聚合酶(5個單位/μI)、2.0%dNTP(脫氧腺苷三磷酸(dATP)、脫氧胞苷三磷酸(dCTP)、脫氧鳥苷三磷酸(dGTP)和脫氧胸苷三磷酸(dTTP)、8·0%模板(2μg/ml)、61·66%PluronicF108溶液(I.5%溶液)、4%正向引物、4%反向引物、和8%反應(yīng)緩沖液(10Χ濃度)。為了解離、退火和延伸目的，分別將系統(tǒng)的相鄰部分設(shè)置為于95°C、59°C和72°C的溫度。以13.79N/cm2使用加壓容器將PCR反應(yīng)混合物泵抽通過該系統(tǒng)。在將反應(yīng)混合物供應(yīng)給溫度控制體后，使用礦物油來推動樣品通過管道的整個長度。用流動閥以O(shè).25ml/分鐘控制反應(yīng)混合物的流速。樣品中存在的特定DNA序列隨著其周期性通過溫度區(qū)而被擴增。在第30次循環(huán)后，收集內(nèi)容物。將PCR產(chǎn)物在凝膠過濾柱上純化，接著進(jìn)行乙醇沉淀。將純化產(chǎn)物的樣品在Agilent生物分析儀及Agarose凝膠電泳上分析以確認(rèn)PCR產(chǎn)物的大小和濃度。用于上文所描述的PCR的模板是DAS質(zhì)粒pDAB3831，其含有由擬南芥屬泛素10啟動子(AtUbilO)驅(qū)動的PAT選擇標(biāo)志基因和由木薯葉脈花葉病毒啟動子(CsVMV)驅(qū)動的杯水母(Philadium)黃色熒光蛋白基因(PhiYFP)。合成正向引物SEQIDN0:3和反向引物SEQIDNO:4以擴增含有這兩種基因和其啟動子的4.6kbp完整表達(dá)盒(即線性化的DNA)。另外，為了便于線性dsDNA與納米顆粒表面的綴合，使用生物素-TEG-CE-亞磷酰胺來將生物素分子與引物的磷酸根基團化學(xué)連接。此亞磷酰胺具有基于三乙二醇接頭的延伸的15個原子的混合極性間隔物臂。此延伸的間隔物臂可以將生物素功能與寡聚物的剩余部分分開以有利地降低結(jié)合鏈霉親合素分子期間任何可能的位阻效應(yīng)。在標(biāo)記正向引物時，生物素在DNA的起始處。在標(biāo)記反向引物時，生物素在DNA片段的末端。因此，可以將生物素化的(兩個取向)DNA片段附接于經(jīng)鏈霉親合素包被的納米顆粒。使用生物素化的寡聚物和連續(xù)熱循環(huán)系統(tǒng)，生成約20mg線性DNA片段。I.2制備DNA/樹枝狀聚合物復(fù)合物用于這些實驗的樹枝狀聚合物是由表面上的伯胺和內(nèi)部中的叔胺組成的球狀陽離子聚酰胺胺(PAMAM)級聯(lián)聚合物。樹枝狀聚合物在溶劑分解溶劑中通過熱處理部分降解，由此導(dǎo)致較小的空間約束和較大的柔性。樹枝狀聚合物的高度正電荷便于與DNA的靜電相互作用，并且柔性結(jié)構(gòu)允許樹枝狀聚合物在結(jié)合DNA時壓緊，而在自DNA釋放時膨脹。轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化效率由于樹枝狀聚合物的正電荷和柔性結(jié)構(gòu)特性而升高。樹枝狀聚合物獲自Qiagen(Germantown,MD)，其以SUPERFECT轉(zhuǎn)染試劑(產(chǎn)品目錄編號301305)銷售。將質(zhì)粒DNA與O.6mlSUPERFECT試劑混合，并于24°C溫育30分鐘以形成DNA/樹枝狀聚合物復(fù)合物。使用不同濃度的環(huán)化質(zhì)粒DNA(O.Img和O.5mg)來形成DNA/樹枝狀聚合物復(fù)合物。另外，使用在實施例I.I中的上述線性化DNA來形成DNA/樹枝狀聚合物復(fù)合物。使用O.Img和O.5mg濃度的線性DNA。在形成DNA/樹枝狀聚合物復(fù)合物后，將含有5%蔗糖和.02-.04%Silwet-L77的IOml體積溶液添加至DNA/樹枝狀聚合物反應(yīng)。實施例2DNA/樹枝狀聚合物復(fù)合物投遞和擬南芥的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化2.I供植物內(nèi)(inplanta)轉(zhuǎn)化用的植物材料種子的同步萌發(fā)對于確保TO植物中的花發(fā)育的一致性是重要的。將擬南芥Columbia栽培種種子在O.1%瓊脂溶液中懸浮，并于4°C溫育48小時以完成分層。將60mg種子稱重，并轉(zhuǎn)移至15ml管。添加13mlO.1%瓊脂溶液，并渦旋振蕩，直至將種子均勻地分散。這創(chuàng)建4.6mg種子/Iml溶液(或約230個種子/ml)的濃度。制備6管(72ml溶液)以播種4個含有每盤中的18個(31/2英寸)盆的平臺。將溶液于4°C溫育48小時以完成分層。以每盆I.Oml分層種子溶液個別地播種每個盆。在播種所有盆時，將增殖罩放置在盤上以使土壤保持濕潤。在播種日后5天除去罩。使種子萌發(fā)，并將植物在CONVIRON(模型CMP4030和CMP3244,ControlledEnvironmentsLimited,Winnipeg,Manitoba,Canada)中在長日照條件(16小時光照/8小時黑暗)下以120-150μmol/m2sec的光強度在恒定的溫度(22°C)和濕度(40-50%)下種植。在播種植物后10至14天，用霍格蘭(Hoagland)氏溶液，隨后用DI水給植物燒水以使土壤保持潤而不濕(moistbutnotwet)。在播種日后4周后,將花切下以產(chǎn)生次生花(secondaryflower)的更均勻生長。在播種后第5周中，將植物準(zhǔn)備好進(jìn)行轉(zhuǎn)化過程。2.2植物內(nèi)轉(zhuǎn)化和篩選Tl抗性植物使用來自Clough和Bent的改良方案來完成擬南芥Columbia栽培種的樹枝狀聚合物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。(S.J.Clough和A.F.Bent,1998，PlantJ16:73543)。用DNA/樹枝狀聚合物溶液生成IOml懸浮液，并用于處理擬南芥屬植物(主要為未成熟的花簇及一些已受精的長角果)。環(huán)形DNA/樹枝狀聚合物復(fù)合物和線性DNA/樹枝狀聚合物復(fù)合物兩者彼此獨立使用。在浸潰植物前，將濃度0.05%(250ul/500ml)-0.005%的SilwetL-77添加至DNA/樹枝狀聚合物溶液，并充分混合。將植物的地上部分在DNA/樹枝狀聚合物溶液中浸潰2-30秒，期間溫和攪動。將經(jīng)處理的植物在塑料罩覆蓋物下于22-24°C保持16-24小時。將植物轉(zhuǎn)移至CONVIRONS，并允許其生長至成熟，并生長出種子。使用選擇盤(10.5”χ2Γ’χ?！P)來篩選來自TO植物的大量收獲種子，每個盆上約10，000粒種子。使用兩個對照來確保正確地完成選擇噴霧=Col-O陰性轉(zhuǎn)化體對照和摻入有在PAT(膦絲菌素乙?；D(zhuǎn)移酶)選擇標(biāo)志方面純合的種子的ColumbiaCol-O野生型作為陽性轉(zhuǎn)化體對照。為了實現(xiàn)同步，將種子在播種前在0.1%瓊脂溶液中分層48小時。為了提供每個選擇盤10，000粒種子，將200mg種子添加至0.1%瓊脂溶液，并渦旋振蕩，直至將種子均勻地懸浮。然后，將分層的種、子在用Sunshine混合物L(fēng)P5填充并用霍格蘭氏溶液在下灌溉(sub-irrigated)的選擇盤上播種。為了提高選擇噴霧的效力，將40ml懸浮種子均勻地播種至選擇盤上。播種后，將增殖罩在每個選擇盤上放置，并種植植物以進(jìn)行選擇，在播種后約5天除去增殖罩。另外，完成對照實驗，其中使用僅含有DNA，沒有樹枝狀聚合物的溶液來轉(zhuǎn)化擬南芥。使用先前描述的方案來轉(zhuǎn)化裸DNA。線性和環(huán)形形式的DNA兩者彼此獨立使用。完成使用土壤桿菌屬進(jìn)行的擬南芥的別的對照轉(zhuǎn)化。使用此轉(zhuǎn)化作為基準(zhǔn)來測定樹枝狀聚合物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的效率。使用來自Hanahan(1983)的改良方案來將質(zhì)粒PDAB7331(圖2)轉(zhuǎn)化入土壤桿菌屬中，使用此菌株來進(jìn)行擬南芥Columbia栽培種的土壤桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。使用由Clough和Bent所描述的浸花法來轉(zhuǎn)化擬南芥。使用選定的土壤桿菌菌落來接種一個或多個IOOml含有壯觀霉素(100mg/L)和卡那霉素(50mg/L)的YEP培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)物。將培養(yǎng)物于28。C在以225rpm不斷搖動的情況中溫育過夜。將細(xì)胞以約5000xg于室溫沉淀10分鐘，并棄去所得的上清液。將細(xì)胞團粒在400ml浸泡培養(yǎng)基中溫和重懸，所述浸泡培養(yǎng)基含有5%(w/v)蔗糖、10yg/L6-芐基氨基嘌呤、和0.04%SilwetL-77。將約一個月齡的植物在溫和攪動的情況中浸入培養(yǎng)基中達(dá)5-10分鐘。將植物在其側(cè)面放下，并覆蓋(透明物或不透明物)2-3天，然后豎立放置。將植物于22°C以16小時光照/8小時黑暗光周期培養(yǎng)。浸潰后約4周，收獲種子。2.3選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物允許新鮮收獲的T1種子于室溫干燥7天。將T1種子在26.5x51cm萌發(fā)盤中播種，每個萌發(fā)盤接受200mg等分試樣的分層T1種子(約10，000粒種子)，其先前已經(jīng)在40mlO.1%瓊脂糖溶液中懸浮，并于4°C貯存兩天以完成休眠需要并確保同步種子萌發(fā)。將Sunshine混合物L(fēng)P5用細(xì)蛭石覆蓋，并用霍格蘭氏溶液在下灌溉，直至潮濕，然后允許重力排水。用移液管將每個40ml等分試樣的分層種子均勻地播種至蛭石上，并用濕度罩覆蓋4-5天。除去罩，之后一天使用出現(xiàn)后草銨膦噴霧進(jìn)行初始轉(zhuǎn)化體選擇。種植后7天(DAP)，使用每次應(yīng)用投遞有效速率280gae/ha草銨膦的DeVilbiss壓縮空氣噴霧尖端用Liberty除草劑(200gae/L草銨膦，BayerCropSciences,KansasCity,MO)的0.2%溶液以噴霧體積IOml/盤(703L/ha)在5天內(nèi)將T1植物(分別為子葉和2-4-lf階段)噴霧5次。在最終的噴霧后4-7天鑒定存活者(活躍生長的植物)，并個別地移植入用盆栽培養(yǎng)基(MetroMix360)制備的3英寸盆中。將移植的植物用濕度罩覆蓋3-4天，并如先前那樣在22°C生長室中放置或直接移到溫室。隨后，將罩除去，并將植物在溫室(22±5。C，50±30%RH，14小時光照:10小時黑暗，最小值500μEAi2S1自然光+補充光)中培養(yǎng)。實施例3對轉(zhuǎn)基因在擬南芥COLUMBIA栽培種的Tl后代中的基因組整合的分子分析3.I轉(zhuǎn)基因的gDNAPCR擴增使用植物DNAZOL試劑盒依照制造商的指令自六周齡植物的總體葉材料提取來自擬南芥轉(zhuǎn)基因植物的基因組DNA。設(shè)計PCR引物以檢測YFP和PAT轉(zhuǎn)基因。YFP引物以SEQIDN0:5和SEQIDN0:6代表。PAT引物以SEQIDN0:7和SEQIDN0:8代表。使用TaKaRaEXTAQ試劑盒(Takara,Otsu,Shiga,Japan)來完成PAT和YFP的PCR擴增反應(yīng)。將基因產(chǎn)物在50μI的總反應(yīng)體積中擴增。PCR反應(yīng)含有IOOng基因組DNA模板、IXExTaq反應(yīng)緩沖液、O.2mMdNTP、IOpMol每種引物、和.025個單位/μLExTaq0使用以下PCR條件于96°C持續(xù)5分鐘的I個循環(huán)和下列條件的31個循環(huán)94°C達(dá)15秒，65°C達(dá)30秒，72°C達(dá)I分鐘，及72°C達(dá)7分鐘的最終延伸。將PCR擴增產(chǎn)物通過O.8%TAE瓊脂糖凝膠電泳分析，并通過溴化乙錠染色顯現(xiàn)。圖5和圖6顯示了自這些條件獲得的擴增產(chǎn)物。使用先進(jìn)的Sanger測序技術(shù)(MWGBiotech,Huntsville,AL)使用PAT正向引物(SEQIDNO:7)和YFP反向引物(SEQIDNO:5)來對PCR片段測序。使用Sequencher軟件來分析序列數(shù)據(jù)。PAT和YFPPCR擴增子的測序結(jié)果與這些基因預(yù)期的核苷酸序列匹配。這些結(jié)果指示使用SUPERFECT轉(zhuǎn)染試劑將來自pDAB3831的PAT和YFP序列穩(wěn)定整合入擬南芥的gDNA中。3.2PAT的ELISA篩選自六周齡轉(zhuǎn)基因擬南芥植物葉提取蛋白質(zhì)以經(jīng)由ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定法)來檢測表達(dá)的PAT蛋白。將含有葉樣品的微量離心管在液氮中冷卻。使用一次性勻漿器將葉材料研磨成粉末。在冰上平衡5分鐘后，添加200μI提取緩沖液(PBST;含有.05%(ν/V)TWEEN20的20mM磷酸鹽緩沖液鹽水)。將內(nèi)容物以渦旋振蕩混合，并于4°C以13，OOOxg離心10分鐘。將上清液自細(xì)胞碎片萃取，并在冰上貯存，直至進(jìn)一步分析。使用用于L.1BERTYLINKPAT/pat-的QUALIPLATE試劑盒(Envirologix,Portland,ME)的改良方案來實施ELISA。將ELISA板和其它試劑于室溫平衡。將50μI酶綴合物添加至板的每孔。將另外的50μI提取緩沖液添加至板的每孔。將純化的轉(zhuǎn)基因擬南芥屬蛋白質(zhì)的連續(xù)稀釋添加至孔。使用10、5、2.5、和I.25ng/ml的濃度。將其它標(biāo)準(zhǔn)品和植物提取物添加至孔作為對照。將板以200rpm搖動，并于室溫溫育2小時。溫育后，將板在洗板儀中用提取緩沖液清洗5次。對于檢測，將100μI來自試劑盒的底物添加至每孔，并將板溫育30分鐘。使用微板讀板儀于595nm的吸光度讀取并記錄活性。來自標(biāo)準(zhǔn)品的ELISA信號的吸光度指示吸光度信號與每孔中存在的PAT量成正t匕。圖5中描繪此數(shù)據(jù)。SUPERFECT和土壤桿菌介導(dǎo)的經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物的樣品顯示來自ELISA的強烈信號。這些量比10ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品(測定法中測試的最高標(biāo)準(zhǔn)品)高三倍。這些結(jié)果指示PAT在經(jīng)由SUPERFECT介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化來轉(zhuǎn)化的擬南芥屬轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)。雖然本發(fā)明已經(jīng)在某些實施方案中進(jìn)行了描述，但是可以在本公開內(nèi)容的精神和范圍內(nèi)進(jìn)一步修飾本發(fā)明。因此，本申請意圖覆蓋本發(fā)明使用其一般原理的任何變型、用途、或改編。此外，本申請意圖覆蓋諸如在本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的已知或習(xí)慣實踐內(nèi)和落入所附權(quán)利要求書的限定內(nèi)的對本公開內(nèi)容的偏離。權(quán)利要求1.一種將感興趣的分子導(dǎo)入具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞以實現(xiàn)對植物和種子的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的方法，該方法包括提供具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞；將樹枝狀聚合物，和任選地ー種或多種CPP，與感興趣的分子相互作用以形成活化的樹枝狀聚合物結(jié)構(gòu)；將所述具有細(xì)胞壁的細(xì)胞和所述活化的樹枝狀聚合物結(jié)構(gòu)置于相互接觸中；并允許所述樹枝狀聚合物和所述感興趣的分子攝取入所述包含細(xì)胞壁的植物細(xì)胞中。2.依照權(quán)利要求I的方法，其中將樹枝狀聚合物與感興趣的分子相互作用包括將所述感興趣的分子裝配到所述樹枝狀聚合物的表面上。3.依照權(quán)利要求I的方法，其中將樹枝狀聚合物與感興趣的分子相互作用包括將所述感興趣的分子的帶負(fù)電荷的基團與在所述樹枝狀聚合物末端的帶電荷的氨基基團相互作用。4.依照權(quán)利要求I的方法，其進(jìn)ー步包括允許所述樹枝狀聚合物攝取入所述包含細(xì)胞壁的植物細(xì)胞的區(qū)室中。5.依照權(quán)利要求4的方法，其中所述區(qū)室選自下組胞質(zhì)溶膠、細(xì)胞核、液泡形成體、質(zhì)體、黃化質(zhì)體、色質(zhì)體、白色體、油質(zhì)體、蛋白質(zhì)體、造粉體、葉綠體、和雙層膜的腔。6.依照權(quán)利要求I的方法，其中所述包含細(xì)胞壁的植物細(xì)胞選自下組煙草、胡蘿卜、玉米、蕓苔(canola)、油菜籽(rapeseed)、棉花、棕櫚、花生、大豆、稻屬物種(Oryzasp.)、擬南芥屬物種(Arabidopsissp.)、蓖麻屬物種(Ricinussp.)、和甘鹿細(xì)胞。7.依照權(quán)利要求I的方法，其中所述植物細(xì)胞來自選自下組的組織胚、分生組織、愈傷組織、花粉、葉、花藥、根、根尖、花、種子、莢果和莖。8.依照權(quán)利要求I的方法，其中所述樹枝狀聚合物包含聚酰胺胺樹枝狀聚合物。9.依照權(quán)利要求I的方法，其進(jìn)ー步包括衍生化所述樹枝狀聚合物的表面。10.依照權(quán)利要求I的方法，其中所述感興趣的分子包括選自下組的組分核酸、DNA、RNA,RNAi分子、基因、質(zhì)粒、粘粒、YAC、BAC、多肽、酶、激素、糖肽、糖、脂肪、信號傳導(dǎo)肽、抗生素、維生素、信使、第二信使、氨基酸、cAMP、藥物、除草劑、殺真菌劑、抗生素、及其組合。11.依照權(quán)利要求9的方法，其中所述感興趣的分子包括基因。12.依照權(quán)利要求10的方法，其中所述基因是外來蛋白質(zhì)基因、農(nóng)學(xué)基因、或標(biāo)志物基因。13.依照權(quán)利要求10的方法，其進(jìn)ー步包括選擇具有穩(wěn)定整合的所述感興趣分子的細(xì)胞。14.依照權(quán)利要求12的方法，其中所述選定的細(xì)胞是可再生細(xì)胞。15.依照權(quán)利要求13的方法，其進(jìn)ー步包括自所述可再生細(xì)胞再生植物。16.依照權(quán)利要求I的方法，其中所述樹枝狀聚合物包含樹枝狀聚合物試劑。17.—種穩(wěn)定表達(dá)基因的方法,該方法包括提供具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞；將樹枝狀聚合物，和任選地ー種或多種CPP，與基因相互作用以形成活化的樹枝狀聚合物結(jié)構(gòu)；將所述具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞和所述活化的樹枝狀聚合物結(jié)構(gòu)置于相互接觸中；允許所述樹枝狀聚合物和所述基因攝取入所述包含細(xì)胞壁的植物細(xì)胞中；并在具有所述植物細(xì)胞的植物的后代中表達(dá)所述基因。18.依照權(quán)利要求17的方法，其中所述基因在葉綠體中表達(dá)。19.依照權(quán)利要求17的方法，其進(jìn)ー步包括選擇穩(wěn)定表達(dá)所述基因的細(xì)胞。20.ー種用于將分子物質(zhì)轉(zhuǎn)移入植物細(xì)胞中的方法，包括將樹枝狀聚合物，和任選地ー種或多種CPP，與質(zhì)粒DNA相互作用以形成活化的樹枝狀聚合物結(jié)構(gòu)；并使所述活化的樹枝狀聚合物結(jié)構(gòu)與攜帶完整壁的植物細(xì)胞在允許所述樹枝狀聚合物和來自所述質(zhì)粒DNA的基因攝取入所述植物細(xì)胞中的條件下接觸。21.權(quán)利要求20的方法，其進(jìn)ー步包括在具有所述植物細(xì)胞的植物的后代中穩(wěn)定表達(dá)所述基因。全文摘要提供了通過使用樹枝狀聚合物和任選地一種或多種CPP來將感興趣的分子導(dǎo)入具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞中的方法。提供了用于遺傳或以其它方式修飾植物及用于治療或預(yù)防包含細(xì)胞壁的植物細(xì)胞中的疾病的方法。文檔編號C12N15/82GK102686733SQ201080046682公開日2012年9月19日申請日期2010年10月6日優(yōu)先權(quán)日2009年10月16日發(fā)明者F.G.伯勒斯,J.P.薩繆爾,K.Y.姚,N.C.薩姆博朱,S.R.韋伯申請人:陶氏益農(nóng)公司