專利名稱：使用抗-內(nèi)皮因子抗體和抗-vegf劑聯(lián)合治療癌癥的制作方法
使用抗-內(nèi)皮因子抗體和抗-VEGF劑聯(lián)合治療癌癥交叉引用
本申請(qǐng)要求2009年8月17日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/234，574的權(quán)益，該申請(qǐng)通過引用整體并入本文。
背景技術(shù)：
癌癥是僅次于冠狀動(dòng)脈疾病第二大人類死亡原因。在世界上，每年有數(shù)百萬人死于癌癥。僅在美國(guó)，癌癥每年造成超過50萬人死亡，并且每年有140萬新確診的病例。盡管因心臟病死亡已經(jīng)明顯下降，由癌癥引起的死亡通常是在增加。在下一世紀(jì)的早期，預(yù)測(cè)癌癥會(huì)變成最主要的死因。此外，即使對(duì)于最初度過他們的原發(fā)性癌的那些癌癥患者，共同的經(jīng)歷已經(jīng)證實(shí)， 他們的壽命急劇改變。許多癌癥患者會(huì)經(jīng)歷強(qiáng)烈的焦慮，所述焦慮由對(duì)復(fù)發(fā)或治療失敗的可能性的知曉驅(qū)動(dòng)。許多癌癥患者在治療以后經(jīng)歷顯著的身體虛弱。一般而言，致命性癌癥的控制的根本問題是，缺乏有效的且無毒的全身療法。癌癥是一種復(fù)雜的疾病，其特征在于導(dǎo)致失控的細(xì)胞生長(zhǎng)的遺傳突變。癌細(xì)胞存在于所有生物體中，在正常情況下，它們的過度生長(zhǎng)受到不同生理因子的緊密調(diào)節(jié)。血管生成是從現(xiàn)有血管形成新血管的生理過程。已經(jīng)提出，血管生成在正常過程和病理過程中都起作用。例如，血管生成過程涉及動(dòng)物器官和組織的血管系統(tǒng)的發(fā)育。在某些病理狀態(tài)下，血管生成受到刺激，作為為受累組織內(nèi)的細(xì)胞提供充足的血液和營(yíng)養(yǎng)物供給的方式。許多這樣的病理狀態(tài)包括異常的細(xì)胞增殖和/或調(diào)節(jié)。實(shí)體癌和滲出性黃斑變性依賴于為連續(xù)的生長(zhǎng)以及轉(zhuǎn)移募集新的血液供應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
本文提供了結(jié)合內(nèi)皮因子的嵌合抗體。這樣的抗體具有體外和體內(nèi)純化、檢測(cè)、診斷和治療用途。本文也提供了這樣的嵌合抗體其結(jié)合內(nèi)皮因子的一種或多種物質(zhì)或變體，并抑制血管生成。本文另外提供了用結(jié)合內(nèi)皮因子的嵌合抗體治療血管生成相關(guān)疾病的方法。嵌合的抗-內(nèi)皮因子抗體可與抗-VEGF劑聯(lián)合地用于治療或預(yù)防不同形式的癌癥、實(shí)體瘤和轉(zhuǎn)移灶等。本文描述了通過施用本文所述組合物來治療或預(yù)防不同形式的癌癥、實(shí)體瘤和轉(zhuǎn)移灶等的方法。本文所述組合物也可以收縮血管、抑制與疾病有關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖和/或防止血管的滲漏。本文所述的嵌合的抗-內(nèi)皮因子抗體可以用于治療或預(yù)防黃斑變性、脈絡(luò)膜新血管生成(CNV)、糖尿病視網(wǎng)膜病變或增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變。本文描述了通過施用本文所述的抗體和抗原結(jié)合片段來治療或預(yù)防黃斑變性、CNV、糖尿病視網(wǎng)膜病變或增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變的方法。本文所述的嵌合的抗-內(nèi)皮因子抗體也可以收縮血管、抑制與眼病有關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖、清除出血的征狀、治療視力模糊、提供視力損失的停滯和/或防止血管的滲漏。本文所述的嵌合的抗-內(nèi)皮因子抗體也可以用于藥物中，所述藥物用于治療黃斑變性、CNV、糖尿病視網(wǎng)膜病變或增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變。本文提供了嵌合的抗-內(nèi)皮因子抗體，其具有具有SEQ ID NO: 3所述的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)(Vh);具有SEQ ID NO: 4所述的氨基酸序列的重鏈恒定區(qū)(Fe);具有SEQID NO: I所述的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)(');和具有SEQ ID NO: 2所述的氨基酸序列的輕鏈恒定區(qū)(CJ。在一個(gè)方面，可以修飾本文所述的抗體，以改變化合物的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，例如，體內(nèi)穩(wěn)定性、溶解度、生物利用度或半衰期。這樣的修飾包括、但不限于聚乙二醇化和/或
糖基化。使用常規(guī)方式，可以將本文所述的抗體配制成用于快速的或延長(zhǎng)遞送。在一個(gè)非限制性實(shí)施方案中，快速遞送是，例如，通過靜脈內(nèi)注射。在另一個(gè)非限制性實(shí)施方案中，延 長(zhǎng)的遞送是，例如，通過皮下蓄池。本文提供了本文所述的抗體和抗原結(jié)合片段和可接受的載體或賦形劑的組合物。本文所述的抗體及其抗原結(jié)合片段可以用于治療與血管生成有關(guān)的不同的疾病和病癥，例如，不同形式的癌癥、實(shí)體瘤和轉(zhuǎn)移灶。另外，本文所述的這些抗體及其抗原結(jié)合片段可以用于藥物制劑中，所述藥物制劑用于預(yù)防、治療或診斷與不同形式的癌癥、實(shí)體瘤和轉(zhuǎn)移灶有關(guān)的疾病和病癥。本文所述的抗體及其抗原結(jié)合片段可以用于治療特征在于血管生成/新生血管形成的不同形式的眼的或非眼的疾病(例如，黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病變)、糖尿病腎病、慢性炎性疾病(例如，IBD)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎。另外，本文所述的這些抗體及其抗原結(jié)合片段可以用于藥物制劑中，所述藥物制劑用于預(yù)防、治療或診斷與血管生成有關(guān)的疾病和病癥，例如，特征在于血管生成/新生血管形成的不同形式的眼的或非眼的疾病(例如，黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病變)、糖尿病腎病、慢性炎性疾病(例如，IBD)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎。本文提供了一種用于在患者中誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答的方法，其中給患者施用含有嵌合的抗-內(nèi)皮因子抗體的第一組合物和含有抗-VEGF抗體或其抗原結(jié)合片段的第二組合物，由此誘導(dǎo)有效的宿主免疫應(yīng)答。本文提供了一種用于在患者中誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答的方法，其中給患者施用組合物，所述組合物含有嵌合的抗-內(nèi)皮因子抗體和抗-VEGF抗體或其抗原結(jié)合片段，由此誘導(dǎo)有效的宿主免疫應(yīng)答。宿主免疫應(yīng)答可以是體液免疫應(yīng)答或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。所述免疫應(yīng)答可以是抑制血管生成、血管生成依賴性的疾病或血管生成依賴性的障礙的應(yīng)答。免疫應(yīng)答也包括細(xì)胞信號(hào)傳遞途徑(例如Smad信號(hào)傳遞)的誘導(dǎo)或阻滯。在一個(gè)實(shí)施方案中，應(yīng)答會(huì)抑制血管生成。本文提供了一種影響與血管生成有關(guān)的細(xì)胞信號(hào)傳遞途徑的方法?？梢允寡苌杉?xì)胞與一種或多種本文所述的組合物接觸(體外、體內(nèi)或離體)，所述組合物的量足以改變細(xì)胞信號(hào)傳遞途徑。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是嵌合的抗-內(nèi)皮因子抗體。在一個(gè)非限制性實(shí)施例中，響應(yīng)于抗體結(jié)合，血管生成細(xì)胞中的Smad 1、5和/或8信號(hào)傳遞被抑制了約I. 5倍或更多。在另一個(gè)非限制性實(shí)施例中，Smad 3水平增加了約I. 5倍或更多，提示細(xì)胞正在恢復(fù)至靜止?fàn)顟B(tài)。含有抗-VEGF抗體或其抗原結(jié)合片段的組合物也與含有嵌合的抗-內(nèi)皮因子抗體的組合物結(jié)合地施用。本文提供了一種抑制受試者的血管生成或血管生成依賴性的疾病或障礙的方法，其中將一種或多種本文提供的組合物施用給患者。所述血管生成依賴性的疾病或障礙可以下述的任一種不同形式的癌癥、實(shí)體瘤和轉(zhuǎn)移灶。在一個(gè)實(shí)施方案中，抑制血管生成或血管生成依賴性的疾病或障礙會(huì)減輕與所述疾病或障礙有關(guān)的征狀。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抑制血管生成或血管生成依賴性的疾病或障礙會(huì)導(dǎo)致腫瘤大小的減小、腫瘤進(jìn)展的預(yù)防、細(xì)胞增殖的減少、細(xì)胞凋亡的增加或受試者存活期的增加。本文提供了一種預(yù)防或治療受試者的癌癥或轉(zhuǎn)移的方法，其中試驗(yàn)一種或多種本文提供的組合物。所述組合物的施用可以延長(zhǎng)被治療的受試者的壽命。要治療的癌癥/腫瘤包括實(shí)體瘤；腫瘤可以是原發(fā)性腫瘤或轉(zhuǎn)移性腫瘤。示例性的實(shí)體瘤屬于選自下述的組織或器官皮膚、黑素瘤、肺、胰腺、乳房、卵巢、結(jié)腸、直腸、胃、甲狀腺、喉部、卵巢、前列腺、結(jié)腸直腸、頭部、頸部、眼、嘴、喉、食管、胸部、骨、睪丸、淋巴、骨髓、骨、肉瘤、腎、汗腺、肝、腎、腦(例如多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤)和類似的組織。在一個(gè)非限制性實(shí)施例中，實(shí)體瘤是結(jié)腸 腫瘤、乳腺腫瘤、腎腫瘤、肺腫瘤、前列腺癌、卵巢腫瘤或這些腫瘤中任一種的轉(zhuǎn)移灶。本文提供了一種預(yù)防或治療下述任一種的方法特征在于血管生成/新生血管形成的不同形式的眼的或非眼的疾病(例如，黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病變)、糖尿病腎病、慢性炎性疾病(例如，IBD)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎。在一個(gè)實(shí)施方案中，抑制血管生成或血管生成依賴性的疾病或障礙會(huì)減輕與所述疾病或障礙有關(guān)的征狀。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抑制血管生成或血管生成依賴性的疾病或障礙會(huì)產(chǎn)生患者的功能。要治療的眼組織是，例如，具有糖尿病視網(wǎng)膜病變、黃斑變性或新生血管性青光眼的患者的視網(wǎng)膜組織，要抑制的血管生成是視網(wǎng)膜組織血管生成，其中存在視網(wǎng)膜組織的新生血管形成。所述方法可以另外包括外科手術(shù)切除腫瘤，和/或施用一種或多種抗癌劑。可以在施用本文所述組合物之前、同時(shí)或之后，施用額外的抗癌劑?？梢栽谒鼋M合物之前一周內(nèi)、在所述組合物之后一周內(nèi)，施用額外的抗癌劑，或者可以在所述組合物同一天施用額外的抗癌劑。如果在所述組合物同一天施用額外的抗癌劑，施用可以是并行的。本文提供了一種抑制血管生成的方法，其中使細(xì)胞或組織接觸足以抑制血管生成的治療有效量的一種或多種本文所述的組合物。本文提供了一種抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)的方法，其中使腫瘤細(xì)胞接觸或給受試者施用足以抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的治療有效量的一種或多種本文所述的組合物。本文提供了一種方法，所述方法包括使組織接觸一種或多種本文所述的組合物，其中接觸會(huì)抑制血管生成、細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、細(xì)胞分裂等。所述組織可以是培養(yǎng)的組織活組織檢查樣品，或可以存在于受試者中。本文提供了一種預(yù)防或治療細(xì)胞增殖障礙的方法，其中給具有細(xì)胞增殖障礙的受試者或處于該風(fēng)險(xiǎn)中的受試者施用有效量的一種或多種本文提供的組合物，以有效地治療細(xì)胞增殖障礙。所述細(xì)胞增殖障礙可以是，例如良性或惡性實(shí)體瘤或非實(shí)體瘤，所述腫瘤可以是轉(zhuǎn)移性的或非轉(zhuǎn)移性的。所述治療可以導(dǎo)致改善受試者的病癥，且可以通過確定是否已經(jīng)發(fā)生下述因素中的一個(gè)或多個(gè)來評(píng)估細(xì)胞增殖的減少、細(xì)胞數(shù)目的減少、細(xì)胞凋亡的增加或至少一部分構(gòu)成細(xì)胞增殖障礙的細(xì)胞的存活期減小。在某些情況下，這些事件中的一個(gè)或多個(gè)可能導(dǎo)致腫瘤或轉(zhuǎn)移灶的部分或完全消除和患者存活期的延長(zhǎng)。
本文提供了一種治療患者的糖尿病視網(wǎng)膜病變、黃斑變性、脈絡(luò)膜新血管生成或新生血管性青光眼的方法，其中給患者施用治療有效量的一種或多種本文提供的組合物。所述治療可以導(dǎo)致改善受試者的病癥，且可以通過確定是否已經(jīng)發(fā)生下述因素中的一個(gè)或多個(gè)來評(píng)估黃斑水腫的減少、CNV面積的減小或視敏度的增加。另一個(gè)方面是，通過施用一種或多種本文所述的組合物來治療受試者的慢性炎性疾病。慢性炎性疾病的非限制性實(shí)施例包括IBD、克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎。另一個(gè)方面是，通過施用一種或多種本文所述的組合物來治療受試者的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。另一個(gè)方面是，通過施用一種或多種本文所述的組合物來治療受試者的骨關(guān)節(jié)炎。通過不同的方式，包括根據(jù)公開的指南測(cè)量的ACR評(píng)分的適當(dāng)分類的提高，可以評(píng)估具有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和/或骨關(guān)節(jié)炎的受試者的治療。在本文提供的方法中，要治療的受試者可以是人或非人受試者。本文提供的組合物和抗癌劑或治療可以施用一次或多次，取決于患者的健康、疾病或病癥的進(jìn)展、和治療的效能。在治療過程中，可以調(diào)節(jié)療法和治療(例如，組合物中抗體的劑量)?？梢跃植康?locally)、區(qū)域性地(regionalIy)或全身地施用組合物,例如,通過皮下的、玻璃體內(nèi)的、真皮內(nèi)的、靜脈內(nèi)的、動(dòng)脈內(nèi)的、腹膜內(nèi)的或肌肉內(nèi)的注射來施用。另外，嵌合的抗-內(nèi)皮因子抗體也可以與其它已知的療法和/或抑制VEGF途徑的抗-VEGF抗體聯(lián)合地使用。這樣的化合物的實(shí)例包括、但不限于ranibizumab(LUCENTIS ), aflibercept (VEGF-Trap),舒尼替尼(SUTENT )、索拉非尼(NEXAVAR )、axitinib、培加尼布和 pazopanib。另外，本文所述的嵌合的抗-內(nèi)皮因子抗體和抗-VEGF抗體或其抗原結(jié)合片段也可以與其它已知的療法和/或化合物聯(lián)合地用于治療癌癥。這樣的化合物的實(shí)例包括、但不限于ranibizumab (LUCENTIS )>aflibercept (VEGF-Trap)、舒尼替尼(SUTENT )、索拉非尼(NEXAVAR )、axitinib、培加尼布和pazopanib。其它療法的實(shí)例包括、但不限于福照、外科手術(shù)或施用一種或多種化療劑。本文提供了一種監(jiān)測(cè)本文提供的方法中的任意一種或多種的效能的方法。增加的可溶性內(nèi)皮因子的水平，已經(jīng)與癌癥患者的降低的存活期相關(guān)聯(lián)。因而，在一個(gè)方面，可以在治療之前和過程中，監(jiān)測(cè)可溶性內(nèi)皮因子的水平。因此，可溶性內(nèi)皮因子的水平的降低可以指示，治療方案有效地治療患者。本申請(qǐng)的一個(gè)實(shí)施方案預(yù)見到，本文所述的任一種組合物用于配制藥物的用途，所述藥物用于治療本文所述的障礙。可以基于需要治療的患者/受試者的身體特征來配制藥物，且可以基于例如癌性組織的階段，配制成單個(gè)制劑或多個(gè)制劑?？梢詫⑺幬锇b在具有適當(dāng)標(biāo)簽的合適包中以分配給醫(yī)院和診所，其中所述標(biāo)簽是用于指示治療受試者的本文所述的障礙。藥物可以包裝成單個(gè)或多個(gè)單元。在包中可以包括關(guān)于劑量和本文所述組合物的施用的說明書。通過引用并入
在本說明書中提及的所有出版物和專利申請(qǐng)都通過引用并入本文中，其程度如同具體 地且單個(gè)地指出每篇單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾?qǐng)通過引用整體并入，除非另外特別指出。


圖I提供了 TGF- ^ /ALK5信號(hào)傳遞途徑的簡(jiǎn)圖。TGF- ^ /ALK5途徑(A)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖的抑制。TGF-P/ALKl途徑(B)會(huì)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并需要⑶105 (內(nèi)皮因子)進(jìn)行ALKl信號(hào)傳遞。虛線指示無活性的或阻斷的途徑。加粗的箭頭指示信號(hào)傳遞途徑的刺激。圖2提供了本文所述的嵌合的抗-內(nèi)皮因子抗體(TRC105)的氨基酸序列。圖2A是嵌合的抗-內(nèi)皮因子抗體的代表性的可變輕鏈(SEQ ID NO :1);圖2B是嵌合的抗-內(nèi)皮因子抗體的代表性的恒定輕鏈(SEQ ID NO :2);圖2C是嵌合的抗-內(nèi)皮因子抗體的代表性的可變重鏈(SEQ ID NO :3);圖2D是嵌合的抗-內(nèi)皮因子抗體的代表性的恒定Y I重鏈(SEQ ID NO :4)。圖3表明，使用接種在膠原中的HUVEC球狀體，TRC105會(huì)以劑量依賴性的方式抑制VEGF誘導(dǎo)的出芽(N=3)。 圖4表明，盡管TRC105會(huì)阻斷VEGF誘導(dǎo)的出芽(對(duì)角線陰影)，它不會(huì)抑制bFGF誘導(dǎo)的HUVEC球狀體的出芽(菱形陰影)(N=2)。圖5表明，當(dāng)與VEGF抑制劑貝伐單抗(菱形陰影)組合時(shí)，會(huì)增強(qiáng)TRC105對(duì)VEGF誘導(dǎo)的出芽的抑制作用(對(duì)角線陰影)，使得HUVEC出芽被完全抑制。圖6表明，當(dāng)與VEGF受體激酶的抑制劑(菱形陰影)組合時(shí)，不會(huì)增強(qiáng)TRC105對(duì)VEGF誘導(dǎo)的出芽的抑制作用(對(duì)角線陰影)。
具體實(shí)施例方式應(yīng)當(dāng)理解，本申請(qǐng)不限于特定制劑或工藝參數(shù)，因?yàn)檫@些當(dāng)然可以變化。還應(yīng)當(dāng)理解，在本文中使用的術(shù)語僅用于描述具體實(shí)施方案的目的，無意進(jìn)行限制。此外，應(yīng)當(dāng)理解，與本文所述的那些類似或等效的許多方法和材料可以用于實(shí)踐本發(fā)明。根據(jù)本申請(qǐng)，可以采用常規(guī)的分子生物學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)，如本領(lǐng)域完全解釋的。嵌合的抗-內(nèi)皮因子抗體可以與抗-VEGF劑聯(lián)合地用于治療或預(yù)防不同形式的癌癥、實(shí)體瘤和轉(zhuǎn)移灶等。本文描述了通過施用本文所述組合物來治療或預(yù)防不同形式的癌癥、實(shí)體瘤和轉(zhuǎn)移灶等的方法。本文所述組合物也可以收縮血管、抑制與疾病有關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖和/或防止血管的滲漏。抗體術(shù)語
本文使用的術(shù)語“抗體”表示免疫球蛋白(Ig)，無論天然的還是部分地或完全地合成生產(chǎn)的。該術(shù)語也涵蓋具有結(jié)合域的任意多肽或蛋白，所述結(jié)合域是抗原結(jié)合域或與抗原結(jié)合域同源。該術(shù)語另外包括“抗原結(jié)合片段”和諸如下述的類似結(jié)合片段的其它可互換的術(shù)語。該術(shù)語也包括嵌合抗體。天然抗體和天然免疫球蛋白通常是約150，000道爾頓的異源四聚體糖蛋白，其由2個(gè)相同的輕(L)鏈2個(gè)相同的重(L)鏈組成。每個(gè)輕鏈通常通過一個(gè)共價(jià)二硫鍵與重鏈相連，而二硫鍵的數(shù)目在不同免疫球蛋白同種型的重鏈之間存在差異。每個(gè)重鏈和輕鏈也具有規(guī)則分布的鏈內(nèi)二硫鍵。每個(gè)重鏈具有在一個(gè)末端處的可變結(jié)構(gòu)域(“VH”或“VH”)，其后是許多恒定結(jié)構(gòu)域(“CH”或“CH”)。每個(gè)輕鏈具有在一個(gè)末端處的可變結(jié)構(gòu)域(“'”或“VL”)和在它的另一個(gè)末端處的恒定結(jié)構(gòu)域(“CJ或“CL”)；輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域與重鏈的第一個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域?qū)R，輕鏈可變結(jié)構(gòu)域與重鏈的可變結(jié)構(gòu)域?qū)R。認(rèn)為特定氨基酸殘基會(huì)形成輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域之間的接口。本文使用的術(shù)語“合成的多核苷酸”、“合成的基因”或“合成的多肽”表示，對(duì)應(yīng)的多核苷酸序列或其一部分或氨基酸序列或其一部分源自已經(jīng)設(shè)計(jì)的序列，或從新合成，或與等效的天然存在的序列相比被修飾。通過本領(lǐng)域已知的方法，可以制備合成的多核苷酸(抗體或抗原結(jié)合片段)或合成的基因，所述方法包括但不限于核酸或氨基酸序列的化學(xué)合成。合成的基因通常在氨基酸或多核苷酸水平(或在兩個(gè)水平)不同于天然存在的基因，且通常位于合成的表達(dá)控制序列的背景內(nèi)。與天然的基因相比，合成的基因多核苷酸序列可能不一定編碼具有不同氨基酸的蛋白；例如，它們也可以包括合成的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列摻入不同的密碼子，但是它們編碼相同的氨基酸(即，核苷酸變化代表在氨基酸水平的沉默突變)。
關(guān)于抗體，術(shù)語“可變結(jié)構(gòu)域”表示，在每個(gè)特定抗體與它的特定抗原的結(jié)合和特異性中使用的抗體可變結(jié)構(gòu)域。但是，變異性不均勻地分布在抗體的可變結(jié)構(gòu)域中。相反，它集中在3個(gè)稱作高變區(qū)(也稱作CDR)的區(qū)段中，所述區(qū)段在輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域中?？勺兘Y(jié)構(gòu)域的更高度保守的部分被稱作“框架區(qū)”或“FR”。未修飾的重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域各自含有4個(gè)FR (FR1、FR2、FR3和FR4)，它們主要采取P -折疊構(gòu)型，其間散布著3個(gè)⑶R，所述⑶R形成環(huán)，并在某些情況下連接P -折疊結(jié)構(gòu)部分。每個(gè)鏈中的⑶R被FR保持緊密靠在一起，并與來自其它鏈的CDR —起，促進(jìn)抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的形成(參見Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版.Public HealthService, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)，第 647-669 頁(yè))。在本文中使用的術(shù)語“高變區(qū)”和“CDR”表示，抗體的負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。CDR包括來自3個(gè)序列區(qū)的氨基酸殘基，所述序列區(qū)以互補(bǔ)方式結(jié)合抗原，并被稱作CDRKCDR2 和 CDR3(對(duì)于每個(gè) Vh 和 Vl 鏈)。根據(jù) Kabat 等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第 5 版.Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda, Md. (1991 ))，在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中，CDR通常大致對(duì)應(yīng)著殘基24-34(CDRLl)、50-56 (CDRL2)和89-97 (CDRL3)，在重鏈可變結(jié)構(gòu)域中，CDR通常大致對(duì)應(yīng)著殘基殘基 31-35 (CDRHl )、50-65 (CDRH2)和 95-102 (CDRH3)。應(yīng)當(dāng)理解，不同抗體的 CDR 可以含有插入序列，因而氨基酸編號(hào)可能不同。Kabat編號(hào)系統(tǒng)用下述編號(hào)方案來補(bǔ)償這樣的插入序列所述方案利用與特定殘基相連的字母(例如，在輕鏈中，⑶RLl的27A、27B、27C、27D、27E和27F)來反映在不同抗體之間的編號(hào)的任何插入?；蛘?，根據(jù)Chothia和Lesk， J. Mol. Biol. , 196: 901-917 (1987))，在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中，CDR通常大致對(duì)應(yīng)著殘基26-32 (CDRLl)、50-52 (CDRL2)和91-96 (CDRL3)，在重鏈可變結(jié)構(gòu)域中，CDR通常大致對(duì)應(yīng)著殘基 26-32 (CDRHl)、53-55 (CDRH2)和 96-101 (CDRH3)。本文使用的“框架區(qū)”或“FR”表示，形成抗原結(jié)合槽或溝的一部分的框架氨基酸殘基。在有些實(shí)施方案中，所述框架殘基形成環(huán)，所述環(huán)是抗原結(jié)合槽或溝的一部分，且在所述環(huán)中的氨基酸殘基可以接觸或不接觸抗原?？蚣軈^(qū)通常包括在CDR之間的區(qū)域。根據(jù) Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版.PublicHealth Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)),在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中，F(xiàn)R通常大致對(duì)應(yīng)著殘基0-23 (FRLl ),35-49 (FRL2)、57_88 (FRL3)和98-109，在重鏈可變結(jié)構(gòu)域中，F(xiàn)R通常大致對(duì)應(yīng)著殘基0-30 (FRHl ),36-49 (FRH2)、66_94 (FRH3)和103-133。如上面關(guān)于輕鏈的Kabat編號(hào)所討論的，重鏈也以類似的方式補(bǔ)償插入(例如，在重鏈中，CDRHl 的 35A、35B)?；蛘?，根據(jù) Chothia 和 Lesk, J. Mol. Biol. , 196: 901-917(1987))，在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中，F(xiàn)R通常大致對(duì)應(yīng)著殘基0-25 (FRLl),33-49 (FRL2) 53-90(FRL3)和97-109 (FRL4)，在重鏈可變結(jié)構(gòu)域中，F(xiàn)R通常大致對(duì)應(yīng)著殘基0_25 (FRH1)、33-52 (FRH2)、56-95 (FRH3)和 102-113 (FRH4)。抗體的恒定結(jié)構(gòu)域(Fe)不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但是相反地表現(xiàn)出不同的效應(yīng)子功能,諸如通過與例如Fe受體(FcR)的相互作用,抗體參與抗體依賴性的細(xì)胞毒性。Fe結(jié)構(gòu)域也可以增加抗體在施用給患者以后在循環(huán)中的生物利用度。用鼠Fe結(jié)構(gòu)域置換人Fe結(jié)構(gòu)域，也可以減少HAMA副反應(yīng)。根據(jù)它們的重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，可以將免疫球蛋白歸入不同的類 另IJ。存在5個(gè)主要的免疫球蛋白類別1§么、1§0、1§￡、1§6和1§11，它們中的幾個(gè)可以進(jìn)一步分成子類(同種型)，例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。與不同類別的免疫球蛋白相對(duì)應(yīng)的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域(Fe)分別被稱作a、S、e、Y和ii。不同類別的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是眾所周知的。基于它們的恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，可以將來自任意脊椎動(dòng)物物種的抗體的“輕鏈”歸入2個(gè)明顯不同的類型(稱作K和入)之一。術(shù)語“抗體的抗原結(jié)合部分”、“抗原結(jié)合片段”、“抗原結(jié)合域”、“抗體片段”或“抗體的功能片段”在本文中互換地用于表示抗體的一個(gè)或多個(gè)片段，所述片段保留特異性地結(jié)合抗原的能力。在這樣的術(shù)語內(nèi)包括的抗體片段的非限制性實(shí)施例包括、但不限于(i)Fab片段，即由\、VH、Cl和Chi結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；(ii) F(ab’ )2片段，即含有2個(gè)通過在鉸鏈區(qū)處的二硫鍵相連的Fab片段的二價(jià)片段；(iii)由Vh和Chi結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iv)含有抗體的單臂的Vl和Vh結(jié)構(gòu)域的Fv片段；(V) dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341:544 546)，其含有Vh結(jié)構(gòu)域；和(vi )分離的CDR。在該定義中另外包括含有單個(gè)重鏈和單個(gè)輕鏈的“一半”抗體。在本文中也包括其它形式的單鏈抗體，諸如雙特異抗體。通過用蛋白酶(諸如胃蛋白酶和木瓜蛋白酶)處理Ig，可以生產(chǎn)“F(ab’)2”和“Fab’ ”部分，且包括通過在二硫鍵附近消化免疫球蛋白所產(chǎn)生的抗體片段，所述二硫鍵存在于2個(gè)重鏈中的每一個(gè)內(nèi)的鉸鏈區(qū)之間。例如，木瓜蛋白酶會(huì)在存在于2個(gè)重鏈中的每一個(gè)內(nèi)的鉸鏈區(qū)之間的二硫鍵的上游切割I(lǐng)gG，以產(chǎn)生2個(gè)同源的抗體片段，其中由\和Q組成的輕鏈(輕鏈恒定區(qū))和由Vh和Chy1 ( Y I)區(qū)組成的重鏈片段(在重鏈的恒定區(qū)中)在它們的C端區(qū)域通過二硫鍵相連。這2個(gè)同源的抗體片段中的每一個(gè)被稱作Fab’。胃蛋白酶也會(huì)在存在于2個(gè)重鏈中的每一個(gè)內(nèi)的鉸鏈區(qū)之間的二硫鍵的上游切割I(lǐng)gG，以產(chǎn)生這樣的抗體片段所述片段稍微大于2個(gè)上述的Fab’在其中在鉸鏈區(qū)處相連的片段。該抗體片段被稱作F(ab’)2。Fab片段也含有輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域和重鏈的第一個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域(ChI)。Fab’片段與Fab片段的差別在于，在重鏈ChI結(jié)構(gòu)域的羧基端處添加了幾個(gè)殘基，包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸。Fab’-SH在本文中表示這樣的Fab’ 其中恒定結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸殘基攜帶游離的巰基。F(ab’)2抗體片段最初被生產(chǎn)為Fab’片段對(duì)，它們具有在它們之間的鉸鏈半胱氨酸?？贵w片段的其它化學(xué)偶聯(lián)也是已知的?！癋v”表示含有完整抗原識(shí)別和抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段。該區(qū)域由緊密地非共價(jià)或共價(jià)結(jié)合的一個(gè)重鏈和一個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的ニ聚體組成(本領(lǐng)域已經(jīng)描述了ニ硫鍵連接的 Fv,Reiter 等人(1996)Nature Biotechnology 14:1239-1245)。在該構(gòu)型中，姆個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的3個(gè)CDR相互作用，以限定在Vh-んニ聚體的表面上的抗原結(jié)合位點(diǎn)。來自每個(gè)Vh和\鏈的ー個(gè)或多個(gè)CDR的組合一起賦予抗體抗原結(jié)合特異性。例如，應(yīng)當(dāng)理解，例如，當(dāng)轉(zhuǎn)移至受體抗體的Vh和\鏈或其抗原結(jié)合片段上吋，CDRH3和CDRL3足以賦予抗體抗原結(jié)合特異性，且可以使用本文所述的任意技術(shù)測(cè)試該CDR組合的結(jié)合、親和カ等。甚至單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域(或僅包含對(duì)抗原特異性的3個(gè)CDR的Fv的一半)具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，盡管親和力可能比與第二個(gè)可變結(jié)構(gòu)域相組合時(shí)更低。此外，盡管Fv片段的2個(gè)結(jié)構(gòu)域(\和Vh)由単獨(dú)的基因編碼，使用重組方法，通過合成的連接物可以連接它們，所述連 接物使它們能夠制成單個(gè)蛋白鏈，其中\(zhòng)和Vh區(qū)配對(duì)形成單價(jià)分子(稱作單鏈Fv (scFv);Bird等人(1988)Science 242:423-426; Huston等人(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA85:5879-5883 ;和 Osbourn 等人(1998) Nat. Biotechnol. 16:778)。在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”內(nèi)，也意圖包括這樣的scFv?？梢詫⑻囟╯cFv的任意Vh和Vlj序列連接到Fe區(qū)cDNA或基因組序列上，以便制備編碼完整Ig (例如，IgG)分子或其它同種型的表達(dá)載體。Vh和\也可以用于制備Fab、Fv或Ig的其它片段，其中使用蛋白化學(xué)或重組DNA技術(shù)?！皢捂淔v”或“sFv”抗體片段包含抗體的Vh和\結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于單個(gè)多肽鏈中。在有些實(shí)施方案中，所述Fv多肽另外包含在Vh和ん結(jié)構(gòu)域之間的多肽連接物，其使sFv能夠形成抗原結(jié)合所希望的結(jié)構(gòu)。關(guān)于sFv的綜述,參見,例如，Pluckthunin The Pharmacology of Monoclonal Antiboaies, Vol. 113, Rosenourg 和 Moore 編Springer-Verlag, New York,第 269-315 頁(yè)(1994)。術(shù)語“AVIMER ”表示ー類人起源的治療蛋白，它們與抗體和抗體片段無關(guān)，由幾個(gè)模塊的且可重復(fù)使用的結(jié)合域組成，所述結(jié)合域稱作A-結(jié)構(gòu)域(也稱作A類模塊、補(bǔ)體型重復(fù)序列或LDL-受體類A結(jié)構(gòu)域)。它們通過體外外顯子改組和噬菌體展示從人胞外受體結(jié)構(gòu)域發(fā)展而成(Silverman 等人，2005，Nat. Biotechnol. 23:1493-1494;Silverman等人，2006，Nat. Biotechnol. 24:220)。得到的蛋白可以含有多個(gè)獨(dú)立結(jié)合域，它們與單表位結(jié)合蛋白相比，可以表現(xiàn)出提高的親和カ(在某些情況下，低于納摩爾)和特異性。參見，例如，美國(guó)專利申請(qǐng)
發(fā)明者B.K.瑟恩, C.P.瑟伊爾 申請(qǐng)人:特雷康制藥公司