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      重力變動應激的負荷方法、航空器、航空器的運行方法、5-羥色胺合成系基因表達促進方...的制作方法

      文檔序號:392919閱讀:240來源:國知局
      專利名稱:重力變動應激的負荷方法、航空器、航空器的運行方法、5-羥色胺合成系基因表達促進方 ...的制作方法
      技術領域
      本發(fā)明涉及重力變動應激的負荷方法、航空器、航空器的運行方法、5-羥色胺合成系基因表達促進方法、5-羥色胺合成方法、中樞神經(jīng)系統(tǒng)刺激方法、及藥效測定方法。
      背景技術
      作為以往的應激負荷方法,已知有通過使用高架十字迷宮或高架平臺賦予高處恐懼,向?qū)嶒瀯游镓摵杉毙詰さ姆椒?例如,參照非專利文獻I和非專利文獻2)。已知實驗動物由上述高架十字迷宮而引發(fā)的生物體反應,是不適或恐懼等應激所引發(fā)的情緒波動造成的反應(例如,參照非專利文獻I)。還已知上述高架平臺試驗法作為抗焦慮藥的篩選法。另外,使用上述高架平臺試驗法,對于抗應激性和糖尿病等疾病的關系也進行了研究(例如,參照非專利文獻2)。現(xiàn)有技術文獻非專利文獻非專利文獻I :山口拓等4人,“高架式十字迷路試験f用^ &不安水準^評価i子乃応用”日本藥理學雜志,2005年,126(2)p. 99-105非專利文獻2 宮田茂雄等3人,“高架式卜* 一 A試験法Z卜> 7抵抗性乃評価t二適^ &簡便々行勤解析法”日本藥理學雜志,2008年,132(4)p. 213-21
      發(fā)明內(nèi)容
      發(fā)明所要解決的問題然而,在非專利文獻I記載的使用高架十字迷宮的應激負荷方法中,由于除5-羥色胺以外,還促進多巴胺、GABA( Y-氨基丁酸,Gamma-Amino Butyric Acid)等多個氨基酸在腦內(nèi)游離,所以不能選擇性地分泌5-羥色胺,即,不能特異性地表達5-羥色胺合成系基因。另外,在使用非專利文獻2記載的高架平臺的應激負荷方法中,雖然確認了上述負荷急性應激引起的生物體反應與5-羥色胺神經(jīng)系統(tǒng)以某種形式相關聯(lián),但沒有開發(fā)出可以解明其機理的具體方法。本發(fā)明是鑒于這樣的情況完成的,其目的在于提供可以使被檢者或?qū)嶒瀯游锂a(chǎn)生新的急性應激反應的重力變動應激的負荷方法、航空器、航空器的運行方法、5-羥色胺合成系基因表達促進方法、5-羥色胺合成方法、中樞神經(jīng)系統(tǒng)刺激方法、及藥效測定方法。解決問題的方法為了解決上述問題,本發(fā)明的重力變動應激的負荷方法、航空器、航空器的運行方法、5-羥色胺合成系基因表達促進方法、5-羥色胺合成方法、中樞神經(jīng)系統(tǒng)刺激方法、及藥效測定方法采用以下的方案。
      即,本發(fā)明的第I方式為重力變動應激的負荷方法,該方法至少包含I次通過微重力對被檢者或?qū)嶒瀯游镓摵蓱さ牡谝粦へ摵刹襟E。根據(jù)上述本發(fā)明的第I方式的重力變動應激的負荷方法,能夠?qū)Ρ粰z者或?qū)嶒瀯游镔x予通過在陸地上無法得到的微重力(UG)引起的物理的刺激。其中,微重力是指小于約IG的重力,例如在航空器的拋物線飛行中,為約KT2G左右的重力。優(yōu)選使上述微重力保持在約3 X KT2G以下。發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)上述通過微重力的應激負荷方法,產(chǎn)生了在以往的應激負荷方法中 無法產(chǎn)生的新的應激應答。上述新的應激應答是指中樞神經(jīng)系統(tǒng)通過特異的路徑受到刺激,即受到5-羥色胺特異性刺激而產(chǎn)生的急性應激應答。另外,發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的重力變動應激的負荷方法可使發(fā)揮合成、保持作為神經(jīng)傳導物質(zhì)的5-羥色胺作用的基因系選擇性表達。另外,根據(jù)上述本發(fā)明的第I方式的重力變動應激的負荷方法,能夠制形成使上述新的應激應答產(chǎn)生的應激應答產(chǎn)生模型。使用該應激應答產(chǎn)生模型,能夠探索用于作用在5-羥色胺參與的中樞神經(jīng)系統(tǒng)上的新的藥物開發(fā)對象分子(創(chuàng)薬対象分子)。另外,根據(jù)上述本發(fā)明的第I方式的重力變動應激的負荷方法,作為對被認為是5-羥色胺參與的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的恐慌障礙或焦慮障礙產(chǎn)生機理進行解明的工具,能夠使用上述應激應答產(chǎn)生模型。在上述本發(fā)明的第I方式的重力變動應激的負荷方法中,也可以再包含至少I次通過過重力對上述被檢者或上述實驗動物負荷應激的第二應激負荷步驟。通過這樣操作,能夠賦予被檢者或?qū)嶒瀯游锿ㄟ^在陸地上無法得到的微重力和過重力的重力變動引起的物理的刺激。其中,過重力是指例如從IG到2. 5G這樣的大于IG的重力,是指比通常重力過大的重力狀態(tài)。優(yōu)選使上述過重力保持在約1.4G以下。在上述本發(fā)明的第I方式的重力變動應激的負荷方法中,也可以交替重復上述第一應激負荷步驟和上述第二應激負荷步驟。通過這樣操作,能夠賦予被檢者或?qū)嶒瀯游锿ㄟ^在陸地上無法得到的微重力和過重力的重力變動弓I起的交替的物理的刺激。在上述本發(fā)明的第I方式的重力變動應激的負荷方法中,也可以I小時進行20次以下次數(shù)的上述第一應激負荷步驟。優(yōu)選至少進行8次以上上述第一應激負荷步驟。通過這樣操作,在I次第一應激負荷步驟中,由于能夠確保至少約15秒鐘到20秒鐘的通過微重力的應激負荷時間,所以能夠充分進行微重力環(huán)境下的應激負荷。另外,在由航空器等進行本發(fā)明的第I方式的重力變動應激的負荷方法時,航空器等的機體姿勢恢復時會產(chǎn)生過重力。此時,通常在產(chǎn)生從約2. OG到2. 5G的過重力時,可以邊抑制為從約I. 3G到約2. OG的過重力,邊充分確保用于使機體的姿勢恢復的時間。由此,在第二應激負荷步驟中,能夠交替重復第一應激負荷步驟和第二應激負荷步驟而不會因產(chǎn)生必須以上的過重力而對被檢者或?qū)嶒瀯游镔x予過大的負荷。另外,本發(fā)明的第2方式為進行重力變動應激的負荷方法的航空器,該重力變動應激的負荷方法至少包含I次通過進行拋物線飛行在機內(nèi)形成微重力環(huán)境對被檢者或?qū)嶒瀯游镓摵晌⒅亓さ牡谝粦へ摵刹襟E。根據(jù)上述本發(fā)明的第2方式的航空器,通過拋物線飛行在航空器內(nèi)形成微重力環(huán)境,從而能夠賦予由在陸地上無法得到的微重力造成的物理的刺激,因此,能夠使被檢者或?qū)嶒瀯游锂a(chǎn)生上述新的應激應答。需要說明的是,拋物線飛行(Parabolic flight)也被稱為拋物線飛行,是指邊對航空器等進行速度調(diào)整邊操縱以進行拋物線運動,在機內(nèi)形成無重力狀態(tài)的飛行方法。需要說明的是,實驗動物是指屬于供應給一般的動物實驗等利用的哺乳類動物。另外被檢者是指在得到關于實驗內(nèi)容的知情同意后,滿足無重力飛行的健康診斷條件的健康正常人。
      另外,本發(fā)明的第3方式是航空器的運行方法,其包括至少一次通過進行拋物線飛行在航空器內(nèi)形成微重力環(huán)境對被檢者或?qū)嶒瀯游镓摵晌⒅亓さ牡谝粦へ摵刹襟E。根據(jù)上述本發(fā)明的航空器的運行方法,由于通過拋物線飛行在航空器內(nèi)形成微重力環(huán)境,可以進行賦予由在陸地上無法得到的微重力造成的物理的刺激的航空器的運行,因此能夠使被檢者或?qū)嶒瀯游锂a(chǎn)生上述新的應激應答。另外,本發(fā)明的第4方式是5-羥色胺合成系基因表達促進方法,其使用了上述重力變動應激的負荷方法,該5-羥色胺合成系基因表達促進方法包括通過進行上述第一應激負荷步驟使上述被檢者或上述實驗動物產(chǎn)生應激應答的應激應答產(chǎn)生步驟;和在上述被檢者或上述實驗動物的細胞中使5-羥色胺合成系基因選擇性表達的基因表達步驟。根據(jù)上述本發(fā)明的第4方式的5-羥色胺合成系基因表達促進方法,由于通過微重力引起的物理的刺激所產(chǎn)生的上述新的應激應答特異地作用于染色體DNA的5-羥色胺合成系基因,能夠使5-羥色胺合成系基因選擇性表達,因此能夠用于利用5-羥色胺合成系基因的各種實驗系統(tǒng)。另外,本發(fā)明的第5方式是5-羥色胺合成方法,其使用了上述5-羥色胺合成系基因表達促進方法,該5-羥色胺合成方法包括通過進行上述基因表達步驟,利用上述細胞合成5-羥色胺的合成步驟。根據(jù)上述本發(fā)明的第5方式的5-羥色胺合成方法,通過使5-羥色胺合成系基因選擇性地表達,可以使作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的5-羥色胺選擇性地合成,因此針對尚未解明部分多的5-羥色胺對神經(jīng)系統(tǒng)的作用,能夠作為以in vivo (體內(nèi))分析等而解明其機理的方法使用。另外,本發(fā)明的第6方式是中樞神經(jīng)系統(tǒng)刺激方法,其使用了上述5-羥色胺合成方法,該中樞神經(jīng)系統(tǒng)刺激方法包括通過進行上述合成步驟,使用所合成的上述5-羥色胺刺激上述被檢者或上述實驗動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)刺激步驟。根據(jù)上述本發(fā)明的第6方式的中樞神經(jīng)系統(tǒng)刺激方法,能夠使用選擇性合成的5-羥色胺,通過5-羥色胺特異的刺激來刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)。另外,根據(jù)上述本發(fā)明的第6方式的中樞神經(jīng)系統(tǒng)刺激方法,能夠?qū)⑼ㄟ^上述5-羥色胺特異的刺激而刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)的實驗動物等檢測體,作為用于對被認為是5-羥色胺參與的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病的恐慌障礙或焦慮障礙產(chǎn)生的機理進行解析的檢測體使用。另外,能夠?qū)纳鲜霰粰z者或上述實驗動物采集到的檢測體和測定值作為工具,進行用于作用于神經(jīng)系統(tǒng)的藥物開發(fā)對象分子的探索和新藥的開發(fā)。特別是也能夠用于篩選針對5-羥色胺參與的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾患的有用的藥物。另外,本發(fā)明的第7方式是藥效測定方法,其使用了上述重力變動應激的負荷方法,該藥效測定方法包括 通過進行上述第一應激負荷步驟使上述被檢者或上述實驗動物產(chǎn)生應激應答的應激應答產(chǎn)生步驟;給上述被檢者或上述實驗動物投與藥物的藥物投與步驟;和測定上述藥物的藥效的測定步驟。根據(jù)上述本發(fā)明的第7方式的藥效測定方法,在尋找或開發(fā)有作用于神經(jīng)系統(tǒng)而發(fā)揮效果的可能性的藥物開發(fā)對象分子時,能夠向作為產(chǎn)生上述新的應激應答的被檢查對象的被檢者或?qū)嶒瀯游锸┯煤兴幬镩_發(fā)對象分子的藥物,觀察、測定該藥物開發(fā)對象分子對神經(jīng)系統(tǒng)的作用、效力。由此,能夠確認藥物開發(fā)對象分子對神經(jīng)系統(tǒng)的有效性,因此能夠作為用于探索、提出對恐慌障礙或焦慮障礙等神經(jīng)系統(tǒng)疾病有效的藥物開發(fā)對象分子的新工具有效使用。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明,可以發(fā)揮能夠使被檢者或?qū)嶒瀯游锂a(chǎn)生新的急性應激反應的效果。另外,通過上述新的急性應激反應,發(fā)揮可以使發(fā)揮合成、保持作為神經(jīng)傳導物質(zhì)的5-羥色胺的作用的基因系選擇性表達的效果。


      圖I是說明本發(fā)明的第I實施方式的拋物線飛行的圖。圖2是示出圖I的拋物線飛行的環(huán)境加速度數(shù)據(jù)的圖。圖3是說明由高處恐懼引起的應激負荷方法的圖。圖4是示出由本發(fā)明的重力變動應激的負荷方法引起的血中的血清皮質(zhì)酮的變化的圖。圖5是示出由應激負荷的基因表達的解析結果的圖表。圖6A是示出由本發(fā)明的重力變動應激的負荷方法引起的基因表達的變化的圖。圖6B是示出由本發(fā)明的重力變動應激的負荷方法引起的基因表達的變化的圖。圖7A是示出由本發(fā)明的重力變動應激的負荷方法引起的基因表達的變化的圖。圖7B是示出由本發(fā)明的重力變動應激的負荷方法引起的基因表達的變化的圖。圖8A是示出由本發(fā)明的重力變動應激的負荷方法引起的基因表達的變化的圖。圖SB是示出由本發(fā)明的重力變動應激的負荷方法引起的基因表達的變化的圖。圖9A是示出由本發(fā)明的重力變動應激的負荷方法引起的基因表達的變化的圖。圖9B是示出由本發(fā)明的重力變動應激的負荷方法引起的基因表達的變化的圖。圖IOA是示出由本發(fā)明的重力變動應激的負荷方法引起的基因表達的變化的圖。圖IOB是示出由本發(fā)明的重力變動應激的負荷方法引起的基因表達的變化的圖。圖IlA是示出由高處恐懼應激的應激負荷方法引起的基因表達的變化的圖。圖IlB是示出由高處恐懼應激的應激負荷方法引起的基因表達的變化的圖。圖12A是示出由高處恐懼應激的應激負荷方法引起的基因表達的變化的圖。圖12B是示出由高處恐懼應激的應激負荷方法引起的基因表達的變化的圖。圖13A是示出由高處恐懼應激的應激負荷方法引起的基因表達的變化的圖。圖13B是示出由高處恐懼應激的應激負荷方法引起的基因表達的變化的圖。
      圖14A是示出由高處恐懼應激的應激負荷方法引起的基因表達的變化的圖。圖14B是示出由高處恐懼應激的應激負荷方法引起的基因表達的變化的圖。圖15A是示出由高處恐懼應激的應激負荷方法引起的基因表達的變化的圖。圖15B是示出由高處恐懼應激的應激負荷方法引起的基因表達的變化的圖。圖16是說明5-羥色胺合成系統(tǒng)的圖。圖17是說明5-羥色胺代謝系統(tǒng)的圖。符號說明 SI第一應激負荷步驟S2第二應激負荷步驟Tl拋物線飛行開始高度T2拋物線飛行終止高度
      具體實施例方式以下,參照附圖對本發(fā)明的實施方式進行說明。[第I實施方式]接著,說明本發(fā)明的第I實施方式。本實施方式為通過由使用航空器的拋物線飛行引起的重力變動,對實驗動物等賦予物理的刺激的重力變動應激的負荷方法。以下,對于本實施方式,使用圖I和圖2進行說明。圖I是說明由使用航空器的拋物線飛行引起的重力變動應激負荷方法的圖。在本實施方式中,使用小鼠作為實驗動物。乘載有該小鼠的航空器起飛,上升至給定的高度(拋物線飛行開始高度Tl)并保持高度。作為檢查對象的小鼠裝在盒子中。該盒子被帶子等固定在航空器的座席等確保安全的給定位置。到達給定的高度、機體穩(wěn)定后,從拋物線飛行開始高度Tl開始拋物線飛行。下降到給定的高度以前,使其持續(xù)由拋物線飛行的高度的降低(第一應激負荷步驟SI)。I次拋物線飛行的持續(xù)時間為約15秒鐘,充分保持微重力環(huán)境。該微重力環(huán)境的微重力約為IO^2G0將高度下降到給定的高度后,終止拋物線飛行(拋物線飛行終止高度T2),邊恢復機體姿勢使得朝向陸地方向的航空器的頭部向著上空方向,邊使機體緩慢上升至再次達到拋物線飛行開始高度Tl的高度(第二應激負荷步驟S2)。航空器上升期間機內(nèi)形成過重力環(huán)境。該過重力環(huán)境的過重力為約I. 4G。如圖I所示,起飛的航空器上升至拋物線飛行開始高度Tl后,開始第2次第一應激負荷步驟SI。這樣,分別重復8次第一應激負荷步驟SI和第二應激負荷步驟S2后,從拋物線飛行開始高度Tl緩慢降低高度并著陸。這樣,分別重復8次第一應激負荷步驟SI和第二應激負荷步驟S2時所需的時間為約I小時。圖2是示出以圖I所示的方法分別重復8次第一應激負荷步驟SI和第二應激負荷步驟S2時的環(huán)境加速度的圖。縱軸表示航空器的加速度,橫軸表示時間。橫軸的I個刻度為6分鐘。另外,加速度Gx表示相對于航空器的行進方向的前后方向的加速度,加速度Gy表示相對于行進方向的橫向的加速度,加速度Gz表示相對于行進方向的上下方向的加速度。如圖2所示,加速度Gy所示的橫向的加速度從航空器的起飛時起到著陸時為止大致為零,可知航空器在相對于行進方向的左右方向沒有移動而是筆直飛行。加速度Gz所示的上下方向的加速度,在拋物線飛行即將開始前加速度暫時略微降低,在第一應激負荷步驟SI進行拋物線飛行期間,向下方向的加速度增加,曲線圖向上方大幅變動。而且,當達到拋物線飛行終止高度T2時,加速度暫時大致為零。然后,在第二應激負荷步驟S2邊使機體姿 勢恢復,邊升高高度至拋物線飛行開始高度Tl為止的期間,向上方向的加速度增加,曲線圖向上方變動。伴隨航空器的上升,向上方向的加速度緩慢下降,當航空器達到拋物線飛行開始高度Tl的高度時,與拋物線飛行開始前的加速度大致相同。就加速度Gx所示的前后方向的加速度而言,由于在第一應激負荷步驟SI進行拋物線飛行的期間和第二應激負荷步驟S2使機體姿勢恢復而上升的期間,主要在相對于行進方向的上下方向飛行,因此前后方向的加速度大致為零。圖3是說明作為比較對照實驗使用的通過高處恐懼應激(EPS(高架平臺應激)Elevated-platform stress)的應激負荷方法的圖。在高度約140厘米的帶腿的棒狀構件上放置透明的圓筒狀的構件作成圓形的立足處,在該圓形立足處放置從籠中放出的小鼠,給小鼠施加10分鐘高處恐懼應激。通過上述方法施加了 10分鐘高處恐懼應激后使小鼠返回籠中,從小鼠返回籠中經(jīng)過30分鐘后進行采血,測定血中皮質(zhì)酮濃度。皮質(zhì)酮已知是在感到應激時在腎上腺皮質(zhì)的產(chǎn)生得到促進的激素。如圖3所示,負荷了 10分鐘高處恐懼應激的小鼠的血中皮質(zhì)酮濃度,與沒有負荷高處恐懼應激的對照組的小鼠的血中皮質(zhì)酮濃度相比,顯著上升。由此,可知對小鼠負荷了由高處恐懼引起的應激。圖4是示出通過由圖I所示的拋物線飛行的重力變動應激負荷方法進行了應激負荷后的小鼠(C57BLK/6J,雄性,8周齡)血中皮質(zhì)酮濃度的圖。具體而言,對于進行了 I次由圖I所示的拋物線飛行的重力變動應激負荷方法后(Parab flight I)、進行了 8次后(Parab flight 8)、從拋物線飛行結束3小時后(post3hr)、6小時后(post 6hr)、24小時后(post 24hr)的小鼠,測定了血中皮質(zhì)酮濃度的結果。作為對照,測定了放在陸地上的小鼠的血中皮質(zhì)酮濃度(Grd Cont)、和進行拋物線飛行前在航空器內(nèi)測得的小鼠的血中皮質(zhì)酮濃度(Flight Cont) 0圖的括號內(nèi)的數(shù)字表示測定的個體數(shù)。根據(jù)圖4,可知與作為進行拋物線飛行前在航空器內(nèi)測得的小鼠的血中皮質(zhì)酮濃度的Flight Cont2相比較,進行了 8次拋物線飛行時血中皮質(zhì)酮濃度顯著上升。由此,可知對于小鼠負荷了由拋物線飛行引起的應激。另外,從拋物線飛行結束經(jīng)過3小時以后,血中皮質(zhì)酮濃度顯著降低,可知從由拋物線飛行引起的應激中得到釋放。使用圖5至圖17說明由應激負荷引起的基因表達的變化。圖5是對圖I所示的重力變動應激、圖3所示的高處恐懼負荷應激、和負荷社會應激(未圖示)的細胞中的基因表達進行比較的表。
      圖5中相對于紙面向上的黑色箭頭表示應激負荷后的基因表達與應激負荷前相比較在升高方向上有顯著差異。相對于紙面向上的白色箭頭表示應激負荷后的基因表達與應激負荷前相比較沒有顯著差異,但有基因表達有升高的趨勢。
      相對于紙面向下的箭頭表示應激負荷后的基因表達與應激負荷前相比較在降低方向上有顯著差異。負(-)標記表示基因表達在檢出限以下或沒有顯著差異。需要說明的是,ND標記表示沒有對對象基因進行解析。圖6A至圖IOB是示出圖I所示的重力變動應激負荷前和負荷后代表中樞神經(jīng)系統(tǒng)的中腦(mid brain)和代表末梢神經(jīng)系統(tǒng)的小腸(small intestine)的基因表達的變化的圖。圖IlA至圖15B是示出圖3所示的高處恐懼負荷應激負荷前和負荷后中腦與小腸的基因表達的變化的圖。圖I所示的重力變動應激負荷前后與圖3所示的高處恐懼負荷應激負荷前后的基因表達的解析如下進行以針對目標基因和標準基因合成的cDNA為模板,使用SYBRPremix Ex Taq II (Takara Bio 株式會社制)通過插入(Intercalation)法,從實時 PCR 反應,定量地算出RNA的表達量。圖5的記載為“社會的”的欄的基因表達的結果是歷經(jīng)5周每天對于實驗用大鼠,負荷通過負荷與大而兇猛的陰溝老鼠(彳、^ ^ )的接觸應激而引起的慢性的社會應激后,使用扣除雜交(Subtractive hybridization)法解析目標基因的5_輕色胺神經(jīng)核(DRN :背側中縫核)的基因表達的結果(引用自Abumaria等人“Identification of GenesRegulated by Chronic Social Stress in the Rat Dorsal Raphe Nucleus’’Cellular andMolecular Neurobiology,2006 年 3 月,26 (2)p. 145-162。)。圖5所示的記載為“重力變動”的欄的基因表達解析結果是通過圖I所示的拋物線飛行的重力變動應激負荷方法進行應激負荷后的小鼠的基因解析結果。具體而言,進行圖I所示的利用拋物線飛行的重力變動應激負荷方法且航空器著陸后,進行8次拋物線飛行中的第I次拋物線飛行起經(jīng)過6小時后,測定小鼠的中腦細胞與小腸細胞的基因表達得到的解析結果(圖6A至圖10B的PF后(post PF))。拋物線飛行的保持時間每次約15秒鐘。經(jīng)過6小時后測定是為了充分確保用于基因表達的時間。另外,航空器起飛后最開始到達拋物線飛行開始高度Tl且高度穩(wěn)定時,解析小鼠(C57BLK/6J,雄性,8周齡)的細胞的基因表達,將其結果作為拋物線飛行前的解析結果(圖6A 至圖 10B 的 PF 前(before PF))使用。圖5所示的記載為“高處恐懼”的欄的基因表達解析結果是通過圖3所示的高處恐懼應激負荷方法進行應激負荷后的小鼠的基因解析結果。具體而言,以圖3所示的方法給小鼠施加10分鐘高處恐懼應激后使小鼠返回籠中,小鼠返回籠中起經(jīng)過6小時后解析小鼠的包含中縫核的中腦細胞和包含嗜鉻細胞的小腸細胞的基因表達(圖IlA至圖15B的EPS)。另外,對于一直關在籠中的小鼠的基因表達進行解析,將其結果作為高處恐懼應激負荷前的解析結果(圖IlA至圖15B的關籠(Homecage))使用。
      已知Tphl (tryptophan hydroxylase (色氨酸輕化酶)I)是與作用于小腸等的末梢神經(jīng)系統(tǒng)的色氨酸輕化酶相關的基因。已知Tph2 (tryptophan hydroxylase (色氨酸輕化酶)2)是與作用于腦等的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的色氨酸羥化酶相關的基因。已知Tphl和Tph2都是5-羥色胺合成系統(tǒng)基因。圖16是說明5-羥色胺合成系統(tǒng)的圖。如圖16所示,由于通過色氨酸羥化酶的作用合成5-羥色胺,因此可以說由于Tphl表達的提高,促進了在小腸等的末梢神經(jīng)系統(tǒng)的5-輕色胺合成。還可以說由于Tph2表達的提高,促進了在腦等的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的5-羥色胺合成。如圖5、圖6A和圖IIA所示,可知通過重力變動應激負荷和高處恐懼應激負荷中的任意一種,中腦和小腸中的Tphl的基因表達在表達量上都沒有大的變化。與此相對,如圖5、圖6B和圖IlB所示,可知中腦和小腸中的Tph2的基因表達,在 高處恐懼應激負荷下,基因表達量沒有變化,在重力變動應激負荷下僅中腦的基因表達顯著亢進。另外,通過社會的應激負荷,Tph2的基因表達不產(chǎn)生變化。從上述結果,可知通過重力變動應激負荷,在中腦作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的Tph2表達特異性地亢進。因此,根據(jù)本實施方式,通過使用航空器的重力變動應激負荷產(chǎn)生新的應激應答,能夠選擇性地促進腦內(nèi)的5-羥色胺的合成。已知Maoa (Monoamine oxidase (單胺氧化酶)A)是與以5_輕色胺作為底物的5-輕色胺分解系統(tǒng)酶相關的基因。已知Maob (Monoamine oxidase (單胺氧化酶)B)是與以多巴胺作為底物的多巴胺分解系統(tǒng)酶相關的基因。圖17是說明5-羥色胺代謝系統(tǒng)的圖。如圖17所示,通過以5-羥色胺作為底物的5-羥色胺分解系統(tǒng)酶Maoa的作用5_羥色胺被代謝,因此可以說通過Maoa表達的亢進,促進了 5-羥色胺代謝。另外,盡管通過以多巴胺作為底物的多巴胺分解系統(tǒng)酶Maob的作用多巴胺被代謝但5-羥色胺沒有被代謝,因此可以說通過Maob表達的亢進僅促進了多巴胺代謝。如圖5、圖7A和圖12A所示,可知中腦和小腸中的Maoa的基因表達,在重力變動應激負荷前后和高處恐懼應激負荷前后,基因表達均沒有產(chǎn)生變化。與此相對,如圖5、圖7B和圖12B所示,可知中腦和小腸中的Maob的基因表達,在高處恐懼應激負荷下基因表達量沒有變化,在重力變動應激負荷下僅在中腦基因表達顯著
      .、rr.幾進。從上述結果,可知通過重力變動應激負荷,在腦內(nèi)多巴胺分解系統(tǒng)酶Maob的表達特異性地提高,選擇性地促進多巴胺的代謝。即,可以說以在不代謝5-羥色胺而是在保持其的方向上作用的方式,基因表達被選擇性地亢進。因此,根據(jù)本實施方式,通過使用航空器的重力變動應激負荷產(chǎn)生新的應激應答,能夠選擇性地促進腦內(nèi)的5-羥色胺的保持。已知Sert (5_羥色胺轉運子)是與5_羥色胺傳導物質(zhì)相關的、與希望有效地使用所合成的5-羥色胺的5-羥色胺再利用相關的基因。已知Slc7a5 (溶質(zhì)載體家族 7 成員 5 (Solute Carrier Family 7Member 5))是大型中性氨基酸轉運體。另外,已知色氨酸是5-羥色胺的合成材料。色氨酸通過上述轉運體的作用被攝入細胞內(nèi),并在此通過接受酶反應來合成5-羥色胺。如圖5、圖8A和圖13A所示,可知中腦中的Sert的基因表達在高處恐懼應激負荷下基因表達量沒有變化,在重力變動應激負荷下基因表達顯著亢進。可知小腸中的Sert的基因表達,在重力變動應激負荷下表達量沒有變化,在高處恐懼應激負荷下基因表達顯著降低。另外,在社會的應激負荷下Sert的基因表達不發(fā)生變化。如圖5、圖8B和圖13B所示,可知中腦中的Slc7a5的基因表達在高處恐懼應激負荷下基因表達量沒有變化,在重力變動應激負荷 下基因表達顯著亢進。可知小腸中的Slc7a5的基因表達在重力變動應激負荷前后和高處恐懼應激負荷前后,基因表達量均不產(chǎn)生變化。從上述結果可知通過重力變動應激負荷,在腦內(nèi)Sert的基因表達量特異性增加,選擇性地促進5-羥色胺的再利用。另外從在小腸Sert的基因表達降低,可知以提高在腦內(nèi)的5-羥色胺的再利用率、特異性刺激中樞神經(jīng)的方式,基因表達亢進。因此,根據(jù)本實施方式,能夠通過使用航空器的重力變動應激負荷使作為實驗動物的小鼠產(chǎn)生新的應激應答,選擇性地促進腦內(nèi)的5-羥色胺的再利用率。另外,從上述結果可知在腦內(nèi)Slc7a5的基因表達特異性地提高,由此細胞外的色氨酸被攝取到細胞內(nèi),5-羥色胺的生成被選擇性地促進。另外,從在小腸中Slc7a5的基因表達沒有變化,可知以在腦內(nèi)產(chǎn)生5-羥色胺,特異性刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)的方式,基因表達
      .、rr.幾進。因此,根據(jù)本實施方式,能夠通過使用航空器的重力變動應激負荷產(chǎn)生新的應激應答選擇性地促進腦內(nèi)的5-羥色胺的產(chǎn)生、保持、再利用率,從而以特異的路徑、即以5-羥色胺選擇性的路徑刺激中樞神經(jīng)。由此,能夠作為對被認為是5-羥色胺參與的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病的恐慌障礙或焦慮障礙產(chǎn)生的機理進行解明的工具有效利用。特別能夠用于篩選對于5-羥色胺參與的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾患有用的藥物。已知Htrla(5_羥色胺IA受體)是與接受所合成的5_羥色胺的5_羥色胺受體相關的基因。已知Th(酪氨酸羥化酶)是與作為腎上腺素、去甲腎上腺素和多巴胺的材料的酪氨酸的第一階段的合成酶相關的基因。已知Gadl (谷氨酸脫羧酶I)是分子量67kDa的谷氨酸脫羧酶,是與在抑制腦的活化的方向上作用的神經(jīng)傳導物質(zhì)的GAVA相關的基因。已知Gad2 (谷氨酸脫羧酶2)是分子量65kDa的谷氨酸脫羧酶,與Gadl同樣地是與GAVA相關的基因。如圖5、圖9A和圖14A所示,可知中腦中的Htrla的基因表達,在重力變動應激負荷下基因表達量沒有變化,在高處恐懼應激負荷下基因表達顯著亢進。另外,通過社會的應激負荷,Htrla的基因表達不產(chǎn)生變化。中腦中的Th的基因表達在高處恐懼應激負荷下表達量沒有變化,在重力變動應激負荷下雖然沒有顯著差異,但有基因表達升高的趨勢。另外,如圖10A、圖IOB和圖15A、圖15B所示,可知中腦和小腸中的Gadl和Gad2的基因表達,在重力變動應激負荷前后和高處恐懼應激負荷前后,基因表達量均沒有變化。從上述結果,可以說由于通過重力變動應激負荷,在腦內(nèi)有Th的基因表達提高的趨勢,因此可以說具有促進腎上腺素神經(jīng)系統(tǒng)、去甲腎上腺素神經(jīng)系統(tǒng)和多巴胺神經(jīng)系統(tǒng)等的活化從而使神經(jīng)系統(tǒng)整體活化的趨勢。但是,還不能說Th的基因表達的程度有顯著差異,因此可以認為雖然有基因表達亢進趨勢,但其影響較小。
      從以上結果,可以說根據(jù)本實施方式,通過使用航空器的重力變動應激負荷可以產(chǎn)生由以往的應激負荷方法無法產(chǎn)生的新的應激應答。需要說明的是,在本實施方式中,設定為分別重復8次第一應激負荷步驟SI和第二應激負荷步驟S2,但并不局限于此,例如也可以僅進行I次第一應激負荷步驟SI。因為即使僅為I次但只要能夠形成微重力環(huán)境,就能夠發(fā)揮本申請發(fā)明的效果。另外,也可以分別進行8次以上第一應激負荷步驟SI和第二應激負荷步驟S2。另外,在本實施方式中,將包含第一應激負荷步驟SI和第二應激負荷步驟S2的重力變動應激負荷時間設為約I小時,但并不局限于此,根據(jù)進行第一應激負荷步驟SI和第二應激負荷步驟S2的次數(shù)也可以為I小時以上,或I小時以下。在本實施方式中,使第一應激負荷步驟SI的微重力為約10_2G,但并不局限于此,也可以使其處于IG以下的IO-6G到KT2G的范圍。另外,在本實施方式中,使第二應激負荷步驟S2的過重力為約I. 4G,但并不局限于此,也可以使其處于IG到2.5G的范圍。另外,在本實施方式中,拋物線飛行開始高度Tl、拋物線飛行終止高度T2分別設為給定的高度,但并不局限于此,只要能夠在航空器內(nèi)保持給定期間的微重力環(huán)境,例如可以是第I次拋物線飛行和第2次以后的拋物線飛行的開始高度為不同的高度,也可以是第I次拋物線飛行終止高度和第2次以后的拋物線飛行終止高度為不同的高度。另外,在本實施方式中,由于拋物線飛行開始高度Tl、拋物線飛行終止高度T2分別為給定的高度,所以從第I次到第8次的拋物線飛行的保持時間一定,但并不局限于此,例如可以是將第I次的拋物線飛行的保持時間設為15秒鐘,第2次以后的拋物線飛行的保持時間設為20秒鐘。另外,拋物線飛行的保持時間,例如可以是設為如10秒鐘等15秒鐘以下,沒有特別限定。[第2實施方式]接著,說明本發(fā)明的第2實施方式。本實施方式是例如將小鼠等實驗動物或被驗者作為被檢查對象,進行上述第I實施方式的重力變動應激負荷后,施用藥物測定其藥效的藥效測定方法。作為施用的藥物,例如是包含藥物開發(fā)對象分子的藥物,所述藥物開發(fā)對象分子是被發(fā)現(xiàn)了作用于抑郁癥、恐慌障礙或焦慮障礙等其他神經(jīng)系統(tǒng)的疾病而發(fā)揮效果的可能性,但并不局限于此。作為測定對象,例如設定為經(jīng)時地測定藥物施用后的藥物開發(fā)對象分子的血中濃度,但并不局限于此,也可以是血液、細胞、染色體DNA、蛋白質(zhì)等可以從上述被檢查對象采集的檢測體或可以測定參數(shù)。作為測定藥效的方法,設為使用氣相色譜質(zhì)譜儀(GC-MS)、液相色譜(HPLC)、流式細胞儀等測定裝置,但并不局限于此,也可以組合使用所有公知的測定裝置。另外,也可以使用取代基的至少I個被125i、3h、14c等放射性標記所標記的藥物開發(fā)對象分子進行藥效測定,測定放射活性。根據(jù)本實施方式,能夠使用第I實施方式的重力變動應激負荷方法使實驗動物或被驗者產(chǎn)生新的應激應答,然后施用含有藥物開發(fā)對象分子的藥物,觀察、測定該藥物開發(fā)對象分子對神經(jīng)系統(tǒng)如何作用。由此,由于能夠研究、開發(fā)含有藥物開發(fā)對象分子的藥物的有效性,因此可以有效地用作用來探索、提出對于恐慌障礙或焦慮障礙等神經(jīng)系統(tǒng)的疾病有效的藥物開發(fā)對象分子的新的工具。
      此外,本發(fā)明并不局限于上述的實施方式,只要在不脫離本發(fā)明的宗旨的范 圍內(nèi)可以適當變更。
      權利要求
      1.ー種重力變動應激的負荷方法,其包括至少I次通過微重力對被檢者或?qū)嶒瀯游镓摵蓱さ牡谝粦へ摵刹襟E。
      2.根據(jù)權利要求I所述的重力變動應激的負荷方法,其還包括至少I次通過過重力對所述被檢者或所述實驗動物負荷應激的第二應激負荷步驟。
      3.根據(jù)權利要求2所述的重力變動應激的負荷方法,其中,交替重復所述第一應激負荷步驟和所述第二應激負荷步驟。
      4.根據(jù)權利要求I 3中任一項所述的重力變動應激的負荷方法,其中,以I小時20次以下的次數(shù)進行所述第一應激負荷步驟。
      5.一種進行重力變動應激的負荷方法的航空器,所述重力變動應激的負荷方法包括至少一次第一應激負荷步驟,在所述步驟中,通過進行拋物線飛行,在航空器內(nèi)形成微重力環(huán)境對被檢者或?qū)嶒瀯游镓摵晌⒅亓ぁ?br> 6.ー種航空器的運行方法,其包括至少一次第一應激負荷步驟,在所述步驟中,通過進行拋物線飛行,在航空器內(nèi)形成微重力環(huán)境對被檢者或?qū)嶒瀯游镓摵晌⒅亓ぁ?br> 7.—種5-羥色胺合成系基因表達促進方法,其使用了權利要求I 4中任一項所述的重力變動應激的負荷方法,所述5-羥色胺合成系基因表達促進方法包括 通過進行所述第一應激負荷步驟,使所述被檢者或所述實驗動物產(chǎn)生應激應答的應激應答產(chǎn)生步驟;以及 在所述被檢者或所述實驗動物的細胞中,使5-羥色胺合成系基因選擇性表達的基因表達步驟。
      8.—種5-羥色胺合成方法,其使用了權利要求7所述的5-羥色胺合成系基因表達促進方法,所述5-羥色胺合成方法包括 通過進行所述基因表達步驟、并利用所述細胞合成5-羥色胺的合成步驟。
      9.ー種中樞神經(jīng)系統(tǒng)刺激方法,其使用了權利要求8所述的5-羥色胺合成方法,所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)刺激方法包括 通過進行所述合成步驟,使用所合成的所述5-羥色胺刺激所述被檢者或所述實驗動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)刺激步驟。
      10.一種藥效測定方法,其使用了權利要求I 4中任一項所述的重力變動應激的負荷方法,所述藥效測定方法包括 通過進行所述第一應激負荷步驟,使所述被檢者或所述實驗動物產(chǎn)生應激應答的應激應答產(chǎn)生步驟; 給所述被檢者或所述實驗動物投與藥物的藥物投與步驟;以及 測定所述藥物的藥效的測定步驟。
      全文摘要
      本發(fā)明提供可以使被檢者或?qū)嶒瀯游锏犬a(chǎn)生新的急性應激反應的重力變動應激的負荷方法。本發(fā)明提供一種重力變動應激的負荷方法,其包括至少1次通過微重力對被檢者或?qū)嶒瀯游镓摵蓱さ牡谝粦へ摵刹襟E(S1)。
      文檔編號C12P13/00GK102665400SQ20108004902
      公開日2012年9月12日 申請日期2010年11月4日 優(yōu)先權日2009年11月4日
      發(fā)明者吉岡充弘, 太田尚, 落合俊昌, 行德淳一郎 申請人:三菱重工業(yè)株式會社
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