專利名稱：籃狀菌轉化體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)籃狀菌(Talaromyces)轉化體的方法、涉及Talaromyces轉化體和涉及使用Talaromyces轉化體生產(chǎn)多肽的方法。本發(fā)明還涉及糖化木質(zhì)纖維素材料的方法，其中木質(zhì)纖維素材料與轉化體或轉化體生產(chǎn)的纖維素酶、半纖維素酶和/或果膠酶接觸，并且產(chǎn)生糖。本發(fā)明還涉及制備發(fā)酵產(chǎn)物(例如乙醇)的方法，其中用發(fā)酵微生物，優(yōu)選地用酵母發(fā)酵這些糖，以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物。
背景技術：
碳水化合物組成地球上最豐量的有機化合物。然而，許多這類碳水化合物隱蔽在復雜聚合物中，包括淀粉(種子和谷物中的主要儲存碳水化合物)和已知為木質(zhì)纖維素的碳水化合物與木質(zhì)素的集合。木質(zhì)纖維素的主要碳水化合物組分是纖維素、半纖維素和果膠。這些復雜的聚合物通常被統(tǒng)稱為木質(zhì)纖維素。從由于OPEC減少石油輸出而導致石油危機爆發(fā)的70年代開始，可再生的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)成為可發(fā)酵的糖的生物轉化吸引了研究人員強烈的注意力，所述可發(fā)酵的糖隨后被發(fā)酵產(chǎn)生醇(例如乙醇)，作為液體燃料的替代品。在過去二十年間，乙醇已被廣泛使用，在美國作為與汽油的10%的摻合物，或在巴西作為車輛的純?nèi)剂?。更最近實現(xiàn)了 E85(85%乙醇摻合物)的使用，特別是用于清潔城市應用。燃料生物乙醇的重要性將會隨著油價的提高及其來源的逐漸耗盡而提高。另外，可發(fā)酵的糖被用于生產(chǎn)塑料、聚合物和其他基于生物的制品，并且預期這一工業(yè)將大幅增長，從而提高了對豐量的低成本可發(fā)酵糖的需求，所述可發(fā)酵糖可以被用作原料來代替基于石油的原料。這類大量碳水化合物在植物生物質(zhì)中的吸集提供了糖(五碳糖以及六碳糖)形式的大量潛在的能量來源，所述糖能夠被用于大量工業(yè)和農(nóng)業(yè)過程。然而，這些碳水化合物的大量能源潛力目前利用不足，因為糖封閉在復雜聚合物中并因此不容易進行發(fā)酵。從植物生物質(zhì)產(chǎn)生糖的方法會提供大量的、經(jīng)濟上有競爭性的原料，用于發(fā)酵成化學品、塑料例如琥珀酸、和(生物)燃料，所述(生物)燃料包括乙醇、甲醇、丁醇、合成液化燃料和沼氣。無論何種纖維素原料，酶的成本和水解效率是限制生物質(zhì)生物轉化方法商業(yè)化的主要因素。微生物生產(chǎn)的酶的生產(chǎn)成本與產(chǎn)酶菌株的生產(chǎn)力和發(fā)酵液中最終的活性產(chǎn)率密切相關。盡管過去幾十年為了理解酶促木質(zhì)纖維素生物質(zhì)降解和纖維素酶生產(chǎn)而進行了持續(xù)的研究，但是仍然期望發(fā)現(xiàn)或者改造新的有高度活性的纖維素酶和半纖維素酶。還高度期望構建能夠進行迅速和高效的木質(zhì)纖維素材料生物降解的高效的酶組合物。此類酶組合物可被用來生產(chǎn)糖，用于發(fā)酵為化學品、塑料例如琥珀酸、和(生物) 燃料，所述(生物)燃料包括乙醇、甲醇、丁醇、合成液化燃料和沼氣；用于青貯；并在其他工業(yè)方法例如食品和飼料、紡織、制漿或造紙或洗滌劑工業(yè)和其他工業(yè)中用作酶。已知生產(chǎn)用于酶促木質(zhì)纖維素生物質(zhì)降解的合適的酶的微生物的一個屬是 Talaromyces M° TalaromycesJain, S. et al, Mol Gen Genet (1992)，234，489-493 公開了真菌 iTalaromyces spCL240的轉化體系。沒有公開多肽的表達。Murray, F. R. et al, Curr Genet (1997)，32，367-375 公開了來自 Talaromyces flavus的葡萄糖氧化酶基因在Talaromyces macrosporus中的過表達。研究了真菌分離株對V. dahliae的生長抑制作用。W0200170998 公開了 Talaromyces emersonii β -葡聚糖酶。在 16 頁，其描述了 β-葡聚糖酶的多核苷酸可在宿主例如酵母細胞中異源表達。W0200224926 公開了 Talaromyces emersonii 木聚糖酶。在 M 頁第 5 段，其描述了可通過木聚糖酶DNA序列在合適的同源或異源宿主細胞中重組表達來實現(xiàn)多肽的生產(chǎn)。 在第7段，其講述了宿主細胞可過表達多肽，用于工程制造過表達的技術是從W099/3^17 中已知的。W099/3^17涉及表達克隆，但沒公開在Talaromyces宿主中的克隆。W02007091231公開了熱穩(wěn)定的并編碼熱穩(wěn)定酶的Talaromyces emersonii菌株， 還公開了由Talaromyces emersonii菌株生產(chǎn)的酶組合物。沒有公開同源或異源多肽的重組生產(chǎn)。在表1中顯示了誘導性碳源被以0. 2-6%的量添加。Solka floe和葡萄糖) 被包括用于比較目的。在78頁觀行，其講述了 “葡萄糖不能完全抑制通過T. emersonii 菌株的葡糖苷外切酶生產(chǎn)”(表31A)。表31A示出了用葡萄糖作為碳源，IMI393751產(chǎn)生 31. 90IU的β-葡糖苷酶活性，但沒有其他纖維素酶活性例如葡聚糖酶或木糖酶。由于缺少此類酶活性，菌株ΙΜΙ393751不適于生產(chǎn)葡萄糖作為碳源時用于轉化木質(zhì)纖維素的纖維素酶。

發(fā)明內(nèi)容
在Talaromyces纖維素酶生產(chǎn)方法中的迄今為止必要的纖維素酶誘導物的存在具有若干缺點。第一，誘導物例如植物材料可具有可變組分，這對纖維素酶生產(chǎn)方法的可控性不利。第二，需要能量來滅菌用于誘導的植物材料。第三，植物材料會嚴重污染環(huán)境。第四，誘導物可導致纖維素酶生產(chǎn)培養(yǎng)基的粘性較高。第五，存在誘導物時，特別是當是當其已被預處理時，可導致對Talaromyces有害的抑制劑產(chǎn)生。這因而需要改進的方法和改進的Talaromyces菌株，用于在Talaromyces中生產(chǎn)適于酶促木質(zhì)纖維素生物質(zhì)降解的多肽組合物。因而本發(fā)明的一個目的是提供適用于木質(zhì)纖維素向糖的轉化的Talaromyces菌株。另一目的是提供可在沒有纖維素酶誘導物的葡萄糖培養(yǎng)基中生產(chǎn)的Talaromyces菌株。本發(fā)明現(xiàn)提供了生產(chǎn)Talaromyces轉化體的方法，其包括下述步驟(a)提供一種或多種表達盒，其能生產(chǎn)感興趣的一種或多種多肽并包含編碼纖維素酶、半纖維素酶和/或果膠酶的感興趣的一個或多個多核苷酸和用于多核苷酸的表達的至少一個啟動子；(b)提供包含在(a)的表達盒中的選擇標記物或包含在專用選擇標記物多核苷酸中的選擇標記物；(C)用來自(a)的一種或多種表達盒和/或來自(b)的選擇標記物轉染 Talaromyces 宿主；(d)選擇Talaromyces轉化體，其含有編碼纖維素酶、半纖維素酶和/或果膠酶的一個或多個多核苷酸；和
(e)分離 Talaromyces 轉化體。本發(fā)明還提供了根據(jù)上述方法可獲得的Talaromyces轉化體，其包含一個或多個重組基因，無纖維素酶誘導物時能在葡萄糖培養(yǎng)基中生產(chǎn)纖維素酶，其在16倍或更多倍稀釋的上清液或發(fā)酵液中具有2WSU/ml或更大的纖維素酶活性。本發(fā)明的Talaromyces轉化體可在包含合適的碳源(例如糖，例如葡萄糖)而沒有纖維素酶誘導物(葡萄糖在本文中不是纖維素酶誘導物，即纖維素酶誘導物不包括葡萄糖)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)并產(chǎn)生具有木質(zhì)纖維素降解活性的纖維素酶。本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)一種或多種纖維素酶、半纖維素酶和/或果膠酶的多肽組合物的方法，其包括下述步驟(a)提供一種或多種表達盒，其能生產(chǎn)感興趣的一種或多種多肽并包含編碼纖維素酶、半纖維素酶和/或果膠酶的感興趣的一個或多個多核苷酸和用于多核苷酸的表達的至少一個啟動子；(b)提供包含在(a)的表達盒中的選擇標記物或包含在專用選擇標記物多核苷酸中的選擇標記物；(C)用來自(a)的一種或多種表達盒和/或來自(b)的選擇標記物轉染 Talaromyces 宿主；(d)任選地選擇含有編碼纖維素酶、半纖維素酶和/或果膠酶的一個或多個多核苷酸的Talaromyces轉化體；(e)通過在其中基本無纖維素酶誘導物的適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)Talaromyces轉化體，以生產(chǎn)多肽；和(f)任選地回收多肽組合物。以下在本發(fā)明的詳細說明書中描述其他實施方式。


圖1. pAN8-l的β -內(nèi)酰胺酶基因的PCR片段的檢測。示出了 T. emersonii轉化體中的278個核苷酸的β-內(nèi)酰胺酶基因PCR片段的瓊脂糖凝膠。泳道1-10含有使用 10ρΑΝ8-1 Τ. emersonii轉化體的染色體DNA作為模板進行PCR反應的PCR片段；泳道11含有分子量標記物；泳道12含有使用pANS-l質(zhì)粒作為PCR的模板進行PCR反應的PCR片段； 泳道13含有使用een空菌株的染色體DNA作為模板的PCR反應混合物。圖2. pAN8-l整合進T. emersonii基因組的檢測。使用標記的β -內(nèi)酰胺酶探針的 PAN8-1DNA的Southern印跡檢測。泳道1含有分子量標記物；泳道2和3分別含有0. 5和 5ng的pAN8-l質(zhì)粒DNA ；泳道4和5含有兩種不同的pAN8_l Τ. emersonii轉化體的Mlul 消化的染色體DNA (具體的條帶通過箭頭指示)；泳道6含有空菌株的Mlul消化的染色體 DNA。圖3.用于表達FLAG-標記的T. emersonii的β -葡聚糖酶CEB蛋白的pGBFINEBA7 的圖譜。PGBFINEBA7是基于pGBFIN5的質(zhì)粒。描繪了從Aspergillus niger葡糖淀粉酶啟動子(PglaA)表達的FLAG-標記的T. emersonii β -葡聚糖酶CEB蛋白(EBA7+FLAG)。此外，描繪了從Aspergillus nidulans甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子(Pgpd)表達的選擇標記物基因(amdS)和表達盒的葡糖淀粉酶側翼(3‘ glaA和3" glaA)。圖4.在T. emersonii中表達的FLAG-標記的T. emersonii β -葡聚糖酶CEB蛋白的檢測。(4A)在生長于籃狀菌(Talaromyces)培養(yǎng)基1 (泳道1-3)和籃狀菌 (Talaromyces)2 ('btM 5-7)巾白勺 Τ· emersonii + 白勺 FUVG-1示i己白勺 Τ· emersonii β -葡聚糖酶CEB蛋白的SDS-PAGE檢測。從72小時培養(yǎng)物中收獲的T. emersonii PGBFINEBA7轉化體1#6 (泳道1，5)和1#14 (泳道2，6)的上清液；泳道3和7含有空菌株的72小時培養(yǎng)物的上清液；泳道4含有分子量標記物。(4B)使用FLAG-標簽特異性抗體，在生長于籃狀菌培養(yǎng)基1 (泳道2_7)和籃狀菌培養(yǎng)基2 (泳道9-14)中的T. emersonii中表達的FLAG-標記的T. emersonii β -葡聚糖酶CEB蛋白的Wfestern印跡檢測。泳道1和8包含分子量標記物；泳道2、3、9和10包含從 72小時(泳道2,9)和96小時(泳道3，10)培養(yǎng)物中收獲的pGBFINEBA7 Τ. emersonii轉化體1#6的上清液；泳道4、5、11和12含有從72小時(泳道4，11)和96 (泳道5，12)培養(yǎng)物中收獲的pGBFINEBA7 T. emersonii轉化體1#14的上清液；泳道6和13，以及7和14分別含有空菌株的72小時和96小時培養(yǎng)物的上清液。(4C)通過PCR的轉化體的拷貝數(shù)目測定。示出了 T. emersonii轉化體的1285個核苷酸的表達盒PCR片段和373個核苷酸的肌動蛋白基因組對照/參比PCR片段的瓊脂糖凝膠。通過用373nt肌動蛋白基因組參比信號對1285nt PCR信號標準化，EBA7基因的1285 個核苷酸的PCR產(chǎn)物的強度指示基因的拷貝數(shù)目。pGBFINEBA7轉化體1#6和1#14的PCR 片段分別示于泳道1和2 ；泳道3示出了分子量標記物；pGBFIN-Pgpd-EBA7轉化體8#14、 8#18和8#32的PCR片段分別被示于泳道4、5和6。圖5.在gpd啟動子控制下用于FLAG-標記的T. emersonii β -葡聚糖酶CEB蛋白的表達的pGBFIN-Pgpd-EBA7的圖譜。pGBFIN-Pgpd_EBA7是基于pGBFIN38的質(zhì)粒。描繪了從Aspergillus nidulans甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子(Pgpd)表達的FLAG-標記的 T. emersonii β-葡聚糖酶 CEB 蛋白(EBA7+FLAG)。此外，描繪了從 Aspergillus nidulans 甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子(Pgpd)表達的選擇標記物基因(amcK)和表達盒的葡糖淀粉酶側翼(3' glaA 和 3" glaA)。圖 6.在 A. niger glaA 啟動子或 A. nidulans gpd 啟動子的控制下在 T. emersonii 中的T. emersonii β -葡聚糖酶CEB蛋白表達的比較。Western 印跡示出了在 T. emersonii 中表達的 FLAG-標記的 T. emersonii β -葡聚糖酶CEB蛋白。泳道1、10和11含有15 μ 1 (泳道1)、15 μ 1 (泳道10)的空菌株的72小時培養(yǎng)物的10倍稀釋的上清液和5 μ 1 (泳道11)的空菌株的72小時培養(yǎng)物的上清液；泳道3-5含有15 μ 1 (泳道3)的從72小時培養(yǎng)物中收獲的T. emersonii pGBFIN-Pgpd_EBA7 轉化體8#14的10倍稀釋的上清液、5 μ 1 (泳道4)和15 μ 1 (泳道幻從72小時培養(yǎng)物中收獲的Τ. emersonii pGBFIN-Pgpd-EBA7轉化體8#14的上清液；泳道6-8含有15 μ 1 (泳道6)的從72小時培養(yǎng)物中收獲的Τ. emersonii pGBFIN-Pgpd-EBA7轉化體8#18的10倍稀釋的上清液、5 μ 1 (泳道7)和15 μ 1 (泳道8)的從72小時培養(yǎng)物中收獲的T. emersonii pGBFIN-Pgpd-EBA7轉化體8#18的上清液；泳道12-14含有15 μ 1的從72小時培養(yǎng)物中收獲的Τ. emersonii pGBFIN-Pgpd-EBA7轉化體8#32的10倍稀釋的上清液(泳道12)、5 μ 1 (泳道13)和15 μ 1 (泳道14)的從72小時培養(yǎng)物中收獲的T. emersonii pGBFIN-Pgpd-EBA7轉化體8#32的上清液；泳道9和15含有15 μ 1的從72小時培養(yǎng)物中收獲的T. emersonii pGBFINEBA7轉化體1#6 (glaA啟動子)的100倍稀釋的上清液(由于強信號，帶過度曝光)；泳道2含有分子量標記物。圖 7.用于在 T. emersonii 中表達 T. emersonii CBHI 的 pGBT0PraA205 的圖譜。描繪了從葡糖淀粉酶啟動子(PglaA)表達的EBA205。此外，描繪了表達盒的葡糖淀粉酶側翼 (3' glaA)。圖 8.用于在 T. emersonii 中表達 T. emersonii CBHII 的 pGBFINEBA 176 的圖譜。 PGBFINEBA176是基于pGBFimi的質(zhì)粒。描繪了從葡萄糖淀粉酶啟動子(PglaA)表達的 EBA176基因。另外，描繪了從Aspergillus nidulans甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子(Pgpd) 表達的選擇標記基因(amdS)和表達盒葡萄糖淀粉酶側翼(3 ‘ glaA和3" glaA)。圖9.在T. emersonii中多種重組T. emersonii纖維素酶的檢測。(9A).在 T. emersonii 中表達的 T. emersonii 纖維素酶的 SDS-PAGE 檢測。用 pGBT0PEBA4、pGBT0PEBA8、pGBFINEBA 176 和 pGBT0PEBA205 的混合物轉化 Τ· emersonii。約 400個轉化體在96孔平板中生長并通過E-PAGE凝膠分析針對至少一種纖維素酶的表達篩選轉化體。感興趣的轉化體在含有基于葡萄糖的培養(yǎng)基的搖瓶中生長并且從72小時培養(yǎng)物中收獲的上清液中的蛋白被TCA沉淀并通過SDS-PAGE分析來分析。FBG142是空菌株。(9B).示出了轉化體中的WSU活性的圖。轉化體在基于葡萄糖的培養(yǎng)基中生長72 小時并且在培養(yǎng)物的16倍稀釋的上清液中測定WSU活性。FBG142是空菌株。序列表簡述SEQ ID NO 1 展示了 PCR 引物 1 的 DNA 序列；SEQ ID NO 2 展示了 PCR 引物 2 的 DNA 序列；SEQ ID NO :3展示了 FLAG-標記的T. emersonii β -葡聚糖酶CEB(蛋白)的氨基酸序列；SEQ ID NO 4展示了 FLAG-標記的T. emersonii β -葡聚糖酶CEB的編碼序列 (DNA，編碼區(qū))；SEQ ID NO 5 展示了 PCR 引物 3 的 DNA 序列；SEQ ID NO 6 展示了 PCR 引物 4 的 DNA 序列；SEQ ID NO :7展示了 gpd啟動子序列和Kozak序列，gpd啟動子具有殘基1_870， 限制性酶位點殘基871-882和Kozak序列殘基883-892 ；SEQ ID NO 8 展示了 PCR 引物 5 的 DNA 序列；SEQ ID NO 9 展示了 PCR 引物 6 的 DNA 序列；SEQ ID NO 10展示了 T. emersonii纖維二糖水解酶I的氨基酸序列；SEQ ID NO 11 展示了 T. emersonii CBHI 的編碼序列(DNA，編碼區(qū))；SEQ ID NO 12展示了 T. emersonii β -葡聚糖酶CEA(蛋白)的氨基酸序列；SEQ ID NO 13展示了 T. emersonii β -葡聚糖酶CEA的編碼序列(DNA，編碼區(qū))；SEQ ID NO 14展示了 Τ. emersonii β -葡萄糖苷酶(蛋白)的氨基酸序列；SEQ ID NO 15展示了 T. emersonii β -葡萄糖苷酶的編碼序列(DNA，編碼區(qū))；SEQ ID NO 16展示了 Τ. emersonii纖維二糖水解酶II (蛋白)的氨基酸序列；SEQ ID NO 17展示了 T. emersonii纖維二糖水解酶II的編碼序列(DNA，編碼區(qū))，野生型序列；
SEQ ID NO 18展示了來自T. emersonii的大小209個aa的未知蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO 19展示了來自T. emersonii的具有根據(jù)SEQ ID NO 18的氨基酸序列的未知蛋白的編碼序列。SEQ ID NO 20展示了 T. emersonii膨脹因子的氨基酸序列。SEQ ID NO 21展示了 T. emersonii膨脹因子的編碼序列。SEQ ID NO 22展示了 T. emersonii乙?；揪厶酋ッ傅陌被嵝蛄?。SEQ ID NO 23展示了 T. emersonii乙?；揪厶酋ッ傅木幋a序列。SEQ ID NO 24展示了 T. emersonii木聚糖酶的氨基酸序列。SEQ ID NO 25展示了 T. emersonii木聚糖酶的編碼序列。發(fā)明詳述在本說明書和所附權利要求書通篇中，詞語“包含”和“包括”及其變體如“包含”(〃 comprises"，‘‘ comprising")、“包括”(〃 includes" and" including")應被解釋為開放性的。也就是說，在上下文允許時，這些詞語旨在表達可能包括未明確指出的其他要素或成分。冠詞“一個”(“a”和“an”)在本文中被用于表示一個或多于一個(即一個或至少一個)所述冠詞的語法客體。例如，“一個要素”可表示一個要素或多于一個要素。根據(jù)本發(fā)明現(xiàn)已表明，上述轉化技術可被用來在Talaromyces中獲得異源多肽的高水平表達或增強同源多肽的生產(chǎn)。本文中使用的“轉化體”表示已經(jīng)是轉化的客體的細胞?！稗D化體”和“重組細胞” 在本文中用作同義詞?！稗D化”在本文中表示通過重組技術使細胞遺傳改變。通過人為干預，這可導致遺傳材料(DNA，RNA或蛋白)在細胞中吸收、插入和表達或遺傳材料在細胞中突變或缺失。核酸構建體術語“核酸構建體”在本文中是指單鏈或雙鏈的核酸分子，其與天然存在的基因分離，或者已被修飾以含有否則不會天然存在的核酸區(qū)段。當核酸構建體含有本發(fā)明的編碼序列的表達所需的控制序列時，術語“核酸構建體”與術語“表達盒”同義。當在本文中使用時，術語“基因”和“重組基因”是指可從染色體DNA中分離的核酸分子，其包括編碼多肽(例如纖維素酶，例如纖維素二糖水解酶)的開放閱讀框。基因可包括編碼序列、非編碼序列、內(nèi)含子和/或調(diào)節(jié)序列。而且，術語“基因”可指如本文中定義的經(jīng)分離的核酸分子。當在本文中使用時，表述“異源多肽”表示不是通過Talaromyces生產(chǎn)的多肽，而 “同源多肽”表示通過Talaromyces本身生產(chǎn)的多肽。底物(也稱為原料)在本文中用來指包含碳水化合物材料的物質(zhì)，其可用根據(jù)本發(fā)明的酶處理，使得其中的碳水化合物材料被改性。除了碳水化合物材料外，底物還可含有任何其他組分，包括但不限于非碳水化合物材料和淀粉。在本上下文中碳水化合物包括所有的糖，例如多糖、寡糖、二糖或單糖?！袄w維素酶誘導物”在本文中被定義為誘導纖維素酶在Talaromyces中產(chǎn)生的化合物。纖維素酶誘導物的例子是純纖維素纖維二糖、槐糖和龍膽二糖或任何木質(zhì)纖維素材料。根據(jù)本發(fā)明的多肽可通過化學改性或物理改性碳水化合物材料，使該碳水化合物材料改性。碳水化合物材料的化學改性可導致此類材料降解，例如通過水解、氧化或其他化學改性，諸如通過裂合酶的作用來實現(xiàn)。物理改性可以或可以不伴隨化學改性。在下文詳細地描述本發(fā)明的不同的實施方式。Talaromyces 轉化體本發(fā)明提供了 Talaromyces轉化體。通過用重組引入的DNA轉化Talaromyces 宿主,例如Talaromyces emersonii來制備Talaromyces轉化體。如上所示，本發(fā)明提供了無纖維素酶誘導物時能在葡萄糖培養(yǎng)基中生產(chǎn)纖維素酶的Talaromyces轉化體，所述 Talaromyces轉化體在16倍稀釋的上清液或發(fā)酵液中或甚至更多倍稀釋的上清液或發(fā)酵液中具有2WSU/ml或更大的纖維素酶活性。在一種實施方式中，Talaromyces轉化體在16 倍稀釋的上清液或發(fā)酵液中或甚至更多倍稀釋的上清液或發(fā)酵液中具有3WSU/ml或更大的纖維素酶活性，另外實施方式中在16倍稀釋的上清液或發(fā)酵液中或甚至更多倍稀釋的上清液或發(fā)酵液中具有5WSU/ml或更大的纖維素酶活性。在另外實施方式中，Talaromyces 轉化體在16倍至10000倍稀釋的上清液或發(fā)酵液中具有2WSU/ml或更大的纖維素酶活性， 在16倍至5000倍稀釋的上清液或發(fā)酵液中具有3WSU/ml或更大的纖維素酶活性，在16倍至2500倍稀釋的上清液或發(fā)酵液中具有3WSU/ml或更大的纖維素酶活性。在一種實施方式中，Talaromyces轉化體具有50WB⑶/ml或更大的內(nèi)切葡聚糖酶活性。在一種實施方式中，Talaromyces轉化體具有如通過APEX測定的38%或更多、 39%或更多、40%或更多、41%或更多、42%或更多、43%或更多、44%或更多、45%或更多、 46%或更多、47%或更多和/或48%或更大的總纖維素酶含量。在另外實施方式中，根據(jù)權利要求1至4的任一項的Talaromyces轉化體攜帶 (harbour)能表達纖維素酶的兩種或多種重組基因。根據(jù)本發(fā)明的Talaromyces轉化體， 其中能表達纖維素酶的兩種或多種基因包括纖維素二糖水解酶基因、內(nèi)切葡聚糖酶基因和 /或葡萄糖苷酶基因。本發(fā)明還包括Talaromyces轉化體的一種實施方式，其中纖維二糖水解酶基因是纖維素二糖水解酶I和/或纖維素二糖水解酶II。在一種實施方式中，在Talaromyces 轉化體中，一個或多個基因被整合進Talaromyces的基因組中。在另外實施方式中， Talaromyces轉化體無標記物。宿主細胞根據(jù)本發(fā)明使用的宿主細胞是Talaromyces屬的細胞。優(yōu)選地，Talaromyces ^flf 3Ξ ^ Talaromyces emersonii> Talaromyces stipitatus> Talaromyces marxianus 或Talaromyces flavus。在一禾中實施方式中，宿主是Talaromyces emersonii,例如 Talaromyces emersonii ATCC16479。轉化宿主的轉化可通過任何合適的已知方法進行，包括例如電穿孔法、粒子轟擊或微粒轟擊、原生質(zhì)體法和Agrobacterium介導的轉化(AMT)。優(yōu)選地，使用原生質(zhì)體方法° 轉化的禾呈序由 J. R. S. Fincham, Transformation in fungi. 1989, microbiological reviews. 53，148-170 描述。為使用原生質(zhì)體方法獲得轉化體，轉化方案需被優(yōu)化。為生產(chǎn)原生質(zhì)體，從生長8 小時至72小時，優(yōu)選地14小時至M小時的培養(yǎng)物中收獲菌絲體。將菌絲體在含有滲透穩(wěn)定劑和分解酶制劑的緩沖液中再懸浮。滲透穩(wěn)定劑可從下述組中選擇，所述組包括但不限于蔗糖、山梨醇、甘露醇、KCl、NH4Cl、NaCl、MgS04和NaCl，優(yōu)選地蔗糖、山梨醇或KCl，濃度為 0. 4-1. 4M、優(yōu)選地在0. 8至1. 2M、最優(yōu)選地1. 0M。分解酶制劑可從下述組中選擇，所述組包括但不限于溶壁醇 Glucanex 200G、Novozyme 234、Caylase C3、Zymolyase 禾P Driselase， 優(yōu)選地Glucanex 200G。消化可在搖床中在30°C和37°C之間的溫度下進行1至3小時?？墒褂肕iracloth過濾器、燒結玻璃過濾器、紗布、30 μ m篩子或山梨醇墊、離心從菌絲體分離原生質(zhì)體，并且允許菌絲體沉降，通過傾析收獲原生質(zhì)體。在具有滲透穩(wěn)定劑的緩沖液中洗滌原生質(zhì)后，IO4至IO9個原生質(zhì)體被添加至在包含滲透穩(wěn)定劑和10-50mM CaCl2,優(yōu)選地50mM CaCl2的緩沖液中的0. 1-40 μ g的DNA和任選地核酸酶抑制劑(例如金精三羧酸) 中。任選地，混合物在4°C下或在室溫下孵育15-30分鐘。聚乙二醇(PEG4000、PEG6000或 PEG8000，優(yōu)選地PEG4000)以6至55%的終濃度被添加至混合物。PEG的添加可在連續(xù)多個步驟中進行，其中PEG濃度逐漸增加。在PEG添加之間，懸浮液在4-37°C下孵育5_30分鐘。優(yōu)選地，6% PEG4000(終濃度)被添加至原生質(zhì)體和DNA懸浮液，在室溫下孵育10分鐘，并隨后添加第二次量的PEG4000至51 %的終濃度，隨后在25°C下孵育15分鐘。將一小份的混合物直接添加至軟瓊脂并傾倒在選擇性再生平板上，或洗滌原生質(zhì)體并涂覆在選擇性再生平板上。軟瓊脂含有生長培養(yǎng)基，所述生長培養(yǎng)基具有滲透穩(wěn)定劑(有或沒有選擇標記物)和允許在40°C-60°C下傾倒瓊脂的低濃度的瓊脂。再生培養(yǎng)基含有具有滲透穩(wěn)定劑的生長培養(yǎng)基，所述滲透穩(wěn)定劑可以是與原生質(zhì)體形成所用的相同的滲透穩(wěn)定劑。多核苷酸可以是DNA、RNA或蛋白。在DNA的情況下，使用了具有啟動子、編碼區(qū)和終止子序列的載體——所謂的表達盒。使用期望的多核苷酸序列作為雜交探針，可使用標準雜交和克隆技術(例如，如在 Sambrook，J.，F(xiàn)ritsh, Ε. F.，and Maniatis, Τ. Molecular Cloning :A Laboratory Manual. 2nd,ed. , Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 中描述的)分離根據(jù)本發(fā)明的核酸分子(即基因)。可根據(jù)標準PCR擴增技術，使用cDNA、mRNA或者基因組DNA作為模板和適宜的寡核苷酸引物擴增核酸分子。這樣擴增的核酸分子可被克隆進適宜的載體中并通過DNA序列分析表征。而且，可通過標準合成技術，例如使用自動DNA合成儀，制備與根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列對應的或可雜交的寡核苷酸。取決于期望的功能，根據(jù)本發(fā)明的轉化方法的結果可以是(異源)表達、過表達、 受控調(diào)節(jié)和/或特殊基因缺失。本文中多核苷酸或寡核苷酸可以是合成的多核苷酸?；蛞M宿主中可以是游離型的，使用具有感興趣的基因的質(zhì)粒，或基因可在轉化期間以一個或多個拷貝被整合進宿主的基因組中?？芍频孟鄳谋磉_構建體。在本發(fā)明的一種實施方式中，轉化方法可作為共轉化(即用兩種或多種類型的重組DNA轉化)來進行。例如，共轉化可用a)含有標記物的載體和b)含有一種或多種感興趣的基因的載體執(zhí)行。在本發(fā)明的一種實施方式中，轉化可使用DNA、基因組DNA、RNA、cDNA或蛋白的文庫。Talaromyces宿主的轉化可用選擇標記物進行。對于Talaromyces細胞的穩(wěn)定轉化而言，我們已發(fā)現(xiàn)，取決于使用的表達載體和轉染技術，僅小部分的細胞可將外源DNA整合進它們的基因組中。為了鑒別并選擇這些整合體，編碼選擇標記物(例如對抗生素的抗性)的基因通常隨著感興趣的基因被引進宿主細胞中。合適的選擇標記物例如為amdS、 argB(鳥氨酸氨甲酰轉移酶)、bar (草胺膦乙?；D移酶)、萎銹靈抗性、hemA (5-氨基酮戊酸鹽)、hemB(膽色素原合酶)、ble(腐草霉素抗性)、hygB (潮霉素磷酸轉移酶)、natR(諾爾絲菌素抗性)、niaD(硝酸鹽還原酶)、pyrG(乳清酸核苷_5 ‘-磷酸脫羧酶)、DHFR、 sC(硫酸腺苷轉移酶)、trpC(鄰氨基苯甲酸合酶)、pyroA、riboB。適用在Talaromyces 細胞中的是 amdS 基因(EP 635574B1, WO 97/06261)、ble 基因(Mattern，I. Ε.，Punt, P. J. , Van den Hondel, C. A. M. J. J. , 1988. A vector of Aspergillus transformation conferring phleomycin resistance. Fungal Genet. Newsl. 35,25)禾口 hygB 基因(Punt P. J. , Oliver R. P. , Dingemanse M. A. , Pouwels P. H. , van den Hondel C. A. M. J. J. , 1987. Transformation of Aspergillus based on the hydromycin B resistance marker from Escherichia coli. Gene. 56 :117-24)。在一種實施方式中，使用了 amdS基因，例如來自 A. nidulans或A. niger的amdS基因。在一種實施方式中，選擇標記物基因是與A. nidulans gpdA啟動子融合的A. nidulans amdS編碼序列(見EP 635574B1)。還可使用來自其他絲狀真菌的amdS基因(WO 97/06261)。更具體地，已表明，通過使用用于A. niger轉化的標記物基因，對具有編碼期望多肽的DNA的經(jīng)轉化的Talaromyces菌株進行選擇是可能的。由于前一真菌和Talaromyces 之間的種族發(fā)生的間距(phylogenetic distance)，這不能被預知。在一種實施方式中，轉化可進行不止一次，即經(jīng)轉化的菌株可被再次轉化一次、 兩次或更多次。在其一種實施方式中，在第二次轉化中用于轉化的宿主是從第一次轉化中分離的Talaromyces轉化體并且類似地在多次轉化中在前菌株是用于隨后轉化的 Talaromyces宿主。在其一種實施方式中，另一標記物可被用在一個或多個不同轉化步驟中，例如使用腐草霉素和潮霉素作為不同的標記物。產(chǎn)生的多次轉化的菌株在本中命名為多次轉化體。因此，在一種實施方式中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)Talaromyces多次轉化體的方法， 其中在第一次轉化中，經(jīng)分離的Talaromyces轉化體被用作Talaromyces宿主，并在第二次轉化中被轉化并且在第二次轉化的步驟(e)中，Talaromyces多次轉化體被分離。在一種實施方式中，在第一次轉化中，使用了與第二次轉化中不同的選擇標記物， 例如使用腐草霉素和潮霉素作為不同的標記物。在一種實施方式中，在表達構建體引入后，選擇標記物被從經(jīng)轉化的宿主細胞中刪除，以獲得無選擇標記物基因(即無標記物)的能生產(chǎn)多肽的經(jīng)轉化的宿主細胞。此類方法在EP O 635 574中描述并可被用在本發(fā)明中。在如上所述的多次轉化中，其可避免使用不同的標記物。載體本發(fā)明的多核苷酸可被整合進重組可復制載體，例如克隆或表達載體中。所述載體可被用來在相容的宿主細胞中復制核酸。因而，在另外的實施方式中，本發(fā)明提供了制造本發(fā)明的多核苷酸的方法，其通過如下來實現(xiàn)將本發(fā)明的多核苷酸引進可復制載體；將載體引進相容的宿主細胞中；以及在使載體復制的條件下使宿主細胞生長。載體可從宿主細胞回收。合適的宿主在下文描述。
因此，本發(fā)明的其他方面涉及下述載體，其包括克隆和表達載體，所述載體包含本發(fā)明的編碼多肽或其功能等同物的多核苷酸；和涉及在例如其中本發(fā)明的多肽表達發(fā)生的條件下，在合適的宿主細胞中生長、轉化或轉染此類載體的方法。如本文中使用的，術語“載體”是指能運輸與之連接的另一核酸的核酸分子。載體可在體外使用，例如用于生產(chǎn)RNA，或用來轉染或轉化宿主細胞。載體還可包括多核苷酸側翼的序列，所述序列包含與真核基因組序列或病毒基因組序列同源的序列。這將允許本發(fā)明的多核苷酸引進宿主細胞基因組。載體系統(tǒng)可以是單個載體(例如單個質(zhì)粒)，或兩個或多個載體(例如兩個或多個質(zhì)粒)——其一起含有將被引進宿主細胞基因組中的總DNA。本發(fā)明的多核苷酸或表達盒插入其中的載體可以是任何載體，其可方便地經(jīng)受重組DNA過程，并且載體的選擇通常取決于其將被引進的宿主細胞。根據(jù)本發(fā)明的載體可以是自主復制載體，即作為染色體外實體的載體，其復制獨立于染色體復制，例如質(zhì)粒。或者，載體可以是這樣的載體，當其被引進宿主細胞時，其被整合進宿主細胞基因組中并與載體已被整合進其中的染色體一起復制。一種類型的載體是“質(zhì)?！?，其指額外的DNA區(qū)段可被連接到其中的環(huán)狀雙鏈DNA 環(huán)。另一類型的載體是病毒載體，其中額外的DNA區(qū)段可被連接進病毒基因組中。某些載體能在其被引進的宿主細胞中自主復制(例如，具有細菌復制起點的細菌載體和游離型哺乳動物載體)。其他載體(例如非游離型哺乳動物載體)當引進宿主細胞中時被整合進宿主細胞的基因組中并且由此隨同宿主基因組一起復制。而且，某些載體能定向與其可操作地連接的基因的表達。此類載體在本文中被稱為“表達載體”。一般地，在重組DNA技術中利用的表達載體通常是質(zhì)粒形式。術語“質(zhì)?！焙汀拜d體”在本文中可被交換使用，因為質(zhì)粒是載體的最常用形式。但是，本發(fā)明意圖包括表達載體的起等同作用的其他形式，例如粘粒、病毒載體(例如復制缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)和噬菌體載體。根據(jù)本發(fā)明的載體可在體外使用，例如用于生產(chǎn)RNA，或用來轉染或轉化宿主細胞。載體或表達構建體優(yōu)選地被整合進宿主細胞基因組中，以獲得穩(wěn)定轉化體。在其他實施方式中，載體或表達構建體是微型染色體或人工染色體。自主維持的克隆載體可包含 AMAl-序列(見例如 Aleksenko and Clutterbuck(1997)，F(xiàn)ungal Genet. Biol. 21 373-397)。在表達構建體被整合進宿主細胞基因組的情況下，構建體或在基因組中的隨機基因座上被整合或使用同源重組在預定的靶基因座上被整合(在這種情況下，靶基因座優(yōu)選地包含高表達基因)。本發(fā)明的載體可包含例如用于過表達的兩個或更多，例如三個、四個或五個本發(fā)明的多核苷酸。本發(fā)明的重組表達載體包含以適于核酸在宿主細胞中表達的形式的本發(fā)明的核酸，這表示重組表達載體包括一個或多個調(diào)節(jié)序列，所述調(diào)節(jié)序列以將被用于表達的宿主細胞為基礎選擇，其與將被表達的核酸序列可操作地連接。載體，例如表達載體中，“可操作地連接”意圖表示感興趣的核苷酸序列與調(diào)節(jié)序列以允許核苷酸序列表達的方式(例如，在體外轉錄/翻譯系統(tǒng)中或當載體被引進宿主細胞時在宿主細胞中)連接，即術語“可操作地連接”指并置，其中所述的元件處于允許它們以其預期的方式起作用的關系中。與編碼序列“可操作地連接”的調(diào)節(jié)序列(例如啟動子、 增強子或其他表達調(diào)節(jié)信號)以如下方式布置在與控制序列相容的條件下實現(xiàn)編碼序列表達，或排列這些序列使得它們針對其預期目的共同起作用，例如轉錄在啟動子處開始并貫穿編碼多肽的DNA序列進行。針對給定宿主細胞，載體或表達構建體可因而包含，以相對于編碼第一發(fā)明的多肽的序列的編碼鏈的從5’ -末端到3’ -末端的連續(xù)順序彼此可操作地連接的下述元件 (1)啟動子序列，其能定向在給定宿主細胞中的編碼多肽的核苷酸序列的轉錄；包括Kozak 的翻譯起始序列(見W02006/077258) ； (2)任選地，信號序列，其能定向多肽從給定宿主細胞到培養(yǎng)基中的分泌；任選地，用于高效分泌的前-原-序列(a pre-pro-sequence)； (3)編碼具有纖維素酶活性的成熟并優(yōu)選活性形式的多肽的本發(fā)明的DNA序列；和優(yōu)選地，還有(4)轉錄終止區(qū)(終止子)，其能終止編碼多肽的核苷酸序列的下游的轉錄。也見 W02006/07725中的優(yōu)化翻譯終止信號。這還包括用于poly A+mRNA產(chǎn)生的聚腺苷化信號。 控制序列還可以是聚腺苷化序列，這是與核苷酸序列3’末端可操作地相連的序列，并且當被轉錄時該序列能被絲狀真菌細胞作為信號識別以向經(jīng)轉錄mRNA加上聚腺苷殘基。在細胞中具有功能的任何聚腺苷化序列都可用于本發(fā)明。用于絲狀真菌細胞的任選聚腺苷化序列從編碼A. oryzae TAKA-淀粉酶、A. niger葡糖淀粉酶、A. nidulans鄰氨基苯甲酸合成酶、 Fusarium oxysporum胰蛋白酶樣蛋白酶和A. niger α -葡糖苷酶的基因獲得。控制序列還可以是合適的轉錄終止子序列，這是能被真核細胞識別用來終止轉錄的序列。終止子序列與編碼多肽的核苷酸序列的3’末端可操作地相連。在細胞中具有功能的任何終止子可用于本發(fā)明。用于絲狀真菌細胞的任選終止子從編碼A. oryzae TAKA淀粉酶；A. niger葡糖淀粉酶(glaA) ；A. nidulans鄰氨基苯甲酸合成酶；A. niger α -葡糖苷酶；trpC基因和 Fusarium oxysporum胰蛋白酶樣蛋白酶的基因獲得。在根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列的下游可以有含有一個或多個轉錄終止位點(例如終止子)的3’非翻譯區(qū)。終止子的來源較不關鍵。終止子可以是例如編碼多肽的DNA序列的天然終止子。優(yōu)選地，絲狀真菌終止子被用在絲狀真菌宿主細胞中。更優(yōu)選地，終止子對宿主細胞(其中編碼多肽的核苷酸序列將被表達)而言是內(nèi)源的。在轉錄區(qū)，可存在用于翻譯的核糖體結合位點。構建體表達的成熟轉錄本的編碼部分將包含位于起點的翻譯起始AUG和適當?shù)匚挥诖g的多肽末端的終止密碼子。也見如在W02006/07725中的關于Kozak和終止的評述。術語“啟動子”在本文中被定義為結合RNA聚合酶并將聚合酶定向到編碼生物化合物的核酸序列的正確下游轉錄起始位點處從而啟動轉錄的DNA序列。RNA聚合酶有效地催化與編碼區(qū)的適當DNA鏈互補的信使RNA的裝配。術語“啟動子”還可被理解為包括在轉錄成mRNA后用于翻譯的5'-非編碼區(qū)(啟動子和翻譯起點之間)，順式作用轉錄控制元件如增強子，和能夠與轉錄因子相互作用的其他核苷酸序列。啟動子可以是適用于真核或原核宿主細胞的任何合適的啟動子序列，其顯示轉錄活性，包括突變、截短和雜交的啟動子，并且可得自編碼對細胞而言同源(天然)或異源(外源)的細胞外或細胞內(nèi)多肽的基因。啟動子可以是組成型或誘導型啟動子?？梢允褂玫恼T導型啟動子的例子是淀粉誘導型啟動子、銅誘導型啟動子、油酸誘導型啟動子。啟動子可選自下組，所述組包括但不限于，得自編碼A. oryzae TAKA淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、A. niger中性α -淀粉酶、A. niger酸穩(wěn)定性α -淀粉酶、A. niger或A. awamori葡糖淀粉酶(glaA)、R. miehei 脂肪酶、A. oryzae堿性蛋白酶、A. oryzae磷酸丙糖異構酶、A. nidulans乙酰胺酶的基因的啟動子，NA2-tpi啟動子(來自編碼A. niger中性α -淀粉酶和A. oryzae磷酸丙糖異構酶的基因的啟動子的雜交)，得自編碼cbhl、cbh2、egl、eg2、eg3、eg5、eg6、xlnl、xln2或 xyll的基因的啟動子及其突變、截短和雜交的啟動子。在一種實施方式中，啟動子選自編碼多肽的DNA序列的啟動子；或異源啟動子，其選自由A. niger glaA、Τ. emersonii cbhl和 Τ. emersonnii bg啟動子或其功能部分組成的組，任選地之前有上游激活序列。在另外的實施方式中，在絲狀真菌細胞中使用的啟動子是來自蛋白酶基因的啟動子或其功能部分；例如來自F.oxysporum胰蛋白酶樣蛋白酶基因(U. S. 4，288，627)、 A. oryzae堿性蛋白酶基因(alp)、L nigerpacA基因、A. oryzae堿性蛋白酶基因、A. oryzae 中性金屬蛋白酶基因、A. niger曲霉肽酶蛋白酶ρ印A基因或F. venenatum胰蛋白酶基因、 A. niger天冬氨酸蛋白酶ρ印B基因。其他啟動子是在W02006/092396和W02005/100573中描述的啟動子，所述參考文獻通過引用并入本文。在單個菌株使用多個啟動子被描述在WO 2008/098933中。WO 2008/098933的教
導可在本文中應用。本領域技術人員應當理解，表達載體的設計可取決于如期望的多肽的表達水平等等這樣的因素。本發(fā)明的載體，例如表達載體可被引進宿主細胞中，以因此產(chǎn)生由本文描述的核酸編碼的多肽或肽(例如，多肽、多肽的突變體形式、片段、變體或其功能等同物)。 因而，在本發(fā)明中有用的表達載體包括來自染色體、附加體和病毒的載體，例如來自細菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母附加體、酵母染色體元件、病毒(如桿狀病毒、乳多空病毒、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒和反轉錄病毒)的載體和來自其組合的載體，如來自質(zhì)粒和噬菌體遺傳元件的病毒(如粘粒和噬菌粒)。根據(jù)本發(fā)明，在實施例中使用了如本文描述的培養(yǎng)基和在實施例中使用了所述的培養(yǎng)條件或使用了具有類似性能的備選培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。整合根據(jù)本發(fā)明的實施方式實現(xiàn)整合。在此類實施方式中，整合型克隆載體可在其將被整合進的宿主細胞染色體中隨機整合，或在預定的靶基因座處整合。在本發(fā)明的一個的實施方式中，整合型克隆載體可包含與宿主細胞基因組中預定的靶基因座中的DNA序列同源的DNA片段，用于將克隆載體的整合靶向至該預定的基因座。為了促進定向整合，在轉化宿主細胞之前優(yōu)選地將克隆載體線性化。優(yōu)選地進行下述線性化，所述線性化使得克隆載體的至少一端，優(yōu)選地任一端的側翼是與靶基因座同源的序列。靶基因座側翼的同源序列的長度優(yōu)選地至少大約0. 11Λ，例如大約至少0. 21Λ，更優(yōu)選地至少大約0. 51Λ，甚至更優(yōu)選地至少大約11Λ，最優(yōu)選地至少大約21Λ。優(yōu)選地，如在W005/0956M和/或W02007/115886 中所述，針對改進的定向DNA整合的頻率，親本宿主菌株可被改良。優(yōu)選地，通過宿主細胞的增強的同源重組能力提高了定向整合進宿主細胞基因組中(即在預定的靶基因座中整合)的效率。細胞的此類表型優(yōu)選地涉及如W02005/0956M 中所述的缺陷型hdfA或hdfB基因。W02005/0956M公開了獲得包含提高的定向整合效率的絲狀真菌細胞的方法。
載體可含有以反義方向定向的本發(fā)明的多核苷酸，以提供反義RNA的生產(chǎn)。合成的多核苷酸可在密碼子使用中被優(yōu)化，優(yōu)選地根據(jù)W02006/077258和/或PCT/EP2007/055943 中所述的方法被優(yōu)化，所述參考文獻通過引用被并入本文。PCT/EP2007/055943著力于密碼子對優(yōu)化。密碼子對優(yōu)化是一種如下的方法，其中編碼多肽的核苷酸序列在其密碼子使用、 尤其是使用的密碼子對方面被修飾，以獲得編碼多肽的核苷酸序列經(jīng)改進的表達和/或所編碼的多肽經(jīng)改進的生產(chǎn)。密碼子對被定義為編碼序列中的兩個連續(xù)的三聯(lián)體(密碼子) 的對。工程改造實施方式當根據(jù)本發(fā)明的多肽從宿主細胞分泌進培養(yǎng)基中時，適當?shù)男盘栃蛄锌杀惶砑又炼嚯?，以將重新合成的多肽導向宿主細胞的分泌路徑。本領域技術人員知道針對具體宿主選擇適當?shù)男盘栃蛄?。信號序列對宿主細胞而言可以是?nèi)源的或?qū)λ拗骷毎钥梢允峭庠吹?。作為例子，可使用來自對宿主細胞而言天然的多肽的信號序列。?yōu)選地，所述天然多肽是高分泌多肽，即以高于正被分泌的多肽的總量的10%分泌的多肽。作為信號序列的備選，本發(fā)明的多肽可與分泌的載體多肽或其部分融合。通過載體多肽或其部分的信號序列， 此類嵌合構建體(chimeric construct)被導向分泌路徑。此外，載體多肽將向根據(jù)本發(fā)明的多肽提供穩(wěn)定作用和/或可增強穩(wěn)定性。此類載體多肽可以是任何多肽。優(yōu)選地，高分泌多肽被用作載體多肽。載體多肽相對于根據(jù)本發(fā)明的多肽可以是內(nèi)源或外源的。載體多肽相對于宿主細胞可以是內(nèi)源的或可以是外源的。此類載體多肽的例子是葡萄糖淀粉酶、 α -結合因子的前原序列、Clostridium cellulovorans纖維素結合多肽A的纖維素結合域、谷胱甘肽S-轉移酶、Bacillus circulars幾丁質(zhì)酶Al的幾丁質(zhì)結合域、由Ε. coli Κ12 的malE基因編碼的麥芽糖結合域、β -半乳糖苷酶和堿性磷酸酶。用于在Aspergillus細胞中此類嵌合構建體表達的優(yōu)選的載體多肽是葡萄糖淀粉酶。根據(jù)本發(fā)明的載體多肽和多肽可包含特殊的氨基酸基元以協(xié)助多肽分離；根據(jù)本發(fā)明的多肽可通過專用釋放劑釋放。 釋放劑可以是蛋白水解酶或化學試劑。此類氨基酸基元的例子是KEX蛋白酶切割位點，其被本領域技術人員熟知。信號序列可被用于協(xié)助多肽或本發(fā)明多肽的分泌及分離。典型地，信號序列的特征為具有疏水氨基酸核心，分泌期間，在一次或多次切割事件中，通?？蓪⑺鲂盘栃蛄袕某墒斓鞍咨锨懈畹?。此類信號肽含有加工位點，允許信號序列在通過分泌途徑之時被從成熟蛋白上切割掉。信號序列指導多肽的分泌，例如從轉化進表達載體的真核宿主中分泌，信號序列隨后或同時被切割掉。然后通過本領域公知的方法，可以很容易地從胞外培養(yǎng)基中純化出多肽。或者，可用能協(xié)助純化的序列，例如用GST結構域?qū)⑿盘栃蛄羞B接到人們感興趣的多肽上。因此，例如，編碼多肽的序列可與標記物序列(例如編碼協(xié)助融合多肽純化的肽的序列)融合。在本發(fā)明這一方面的某些實施方式中，標記物序列是六組氨酸肽，例如 PQE載體Oliagendnc.)中提供的標簽，很多標記物序列都是可以購買到的。例如，如Gentz et al，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 =821-824(1989)所述，六組氨酸為融合多肽提供了方便的純化。HA標簽是另一種有利于純化的肽，其對應于流感血凝素多肽所得的表位，這已例如由 Wilson et al.，Cell 37:767(1984)進行了描述。通常，可通過減少或消除某些基因的表達來構建轉化體。減少或缺失某些基因可以是有優(yōu)勢的，因為在通過減少或缺失的基因所表達的多肽的影響下，其可增加期望多肽的產(chǎn)率并還可減少期望多肽的分解。減少或缺失可使用本領域中的熟知的一種或多種方法實現(xiàn)，例如插入、打斷、替換或缺失。用于減少或缺失的方法可以是定點誘變方法或隨機誘變方法。將被修飾或失活的基因部分可以是例如編碼區(qū)或編碼區(qū)的表達所需的調(diào)節(jié)元件?；虻拇祟愓{(diào)節(jié)或控制序列的例子可以是啟動子序列或其功能部分，所述功能部分即足夠影響基因表達的部分。用于可能的修飾的其他控制序列包括，但不限于，前導序列、前肽序列、前肽原序列、Kozak、轉錄起始、信號序列、轉錄終止子、 轉錄激活因子、翻譯起始位點和翻譯終止位點。在一種實施方式中，較之其中所述基因沒被過表達的親本微生物菌株，本文所述的本發(fā)明的多核苷酸在本發(fā)明的微生物菌株中可以是過表達的。多核苷酸序列的過表達在本文中被定義為這樣的所述序列基因的表達，其導致在微生物菌株中由所述序列編碼的酶的活性是在親本微生物中的酶的活性的至少大約1. 2倍；是親本微生物中的酶的活性的至少1. 5倍，優(yōu)選地所述酶的活性是親本微生物中的酶的活性的至少大約2倍，至少大約3 倍，至少大約4倍，至少大約5倍，至少大約10倍，至少大約20倍，至少大約50倍，至少大約100倍，至少大約200倍，至少大約500倍，至少大約1000倍。在一種實施方式中，可生產(chǎn)融合多肽。例如，按照傳統(tǒng)技術，將編碼不同多肽序列的DNA片段以符合讀碼框的方式連接到一起，例如，通過采用平末端或交錯切口末端用于連接；采用限制性酶消化以提供合適的末端，根據(jù)需要填平粘末端；采用堿性磷酸酶處理，以避免人們不想要的結合或酶連接。在另一種實施方式中，可以通過傳統(tǒng)技術(包括自動DNA合成儀)來合成融合基因?；蛘?，可以使用錨定引物(anchor primer)來對基因片段進行PCR擴增，所述引物能在兩段連續(xù)的基因片段之間產(chǎn)生互補突出端(overhang)， 隨后可以進行退火和再次擴增，以產(chǎn)生出嵌合基因序列(例如，見Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons :1992)。此夕卜，還可以商業(yè)途徑獲得很多已經(jīng)編碼有融合部分(例如，GST多肽)的表達載體。編碼核酸可被克隆進此類表達載體，以使得融合部分與多肽以符合讀碼框的方式連接，以這種方式，使得融合多肽符合讀碼框方式并且融合多肽的表達在相同啟動子和終止子的控制下。雜交多肽可包含部分或全部多肽序列的組合，所述多肽序列從其中一種或多種多肽就宿主細胞而言是異源的至少兩種不同的多肽中獲得。多肽表達/生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明，通過Talaromyces轉化體表達多肽。Talaromyces轉化體可因而被用在根據(jù)本發(fā)明的多肽的制備中。此類方法包括在保證編碼多肽的編碼序列表達的條件下培養(yǎng)宿主細胞(如上述的經(jīng)轉化的宿主細胞)并任選地回收表達的多肽。在本發(fā)明的上下文中，術語“重組體”指任何遺傳修飾，不僅包括天然發(fā)生的過程和/或通過使宿主細胞經(jīng)受隨機誘變誘導的遺傳修飾，還包括例如基因打斷和/或缺失和/ 或?qū)Ｒ徽T變。結果，重組體和天然發(fā)生的過程和/或通過使宿主細胞經(jīng)受隨機誘變誘導的遺傳修飾的組合被認為是重組體。根據(jù)本發(fā)明的重組體Talaromyces細胞(細胞)可使用本領域已知的程序培養(yǎng)。 針對啟動子和宿主細胞的每一組合，有助于編碼多肽的DNA序列表達的培養(yǎng)條件是可得到的。在達到期望的細胞密度或多肽效價后，停止培養(yǎng)并用已知的程序回收多肽。發(fā)酵培養(yǎng)基可包含含有碳源(例如葡萄糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉、纖維素、木聚糖、果膠、木質(zhì)纖維素生物質(zhì)水解產(chǎn)物等等)、氮源(硫酸銨、硝酸銨、氯化銨等等)、有機氮源 (例如酵母提取物、麥芽提取物、蛋白胨等等)和無機營養(yǎng)源(磷酸鹽、鎂、鉀、鋅、鐵等等)。 任選地，還可包括誘導物(例如纖維素、果膠、木聚糖、麥芽糖、麥芽糊精或木半乳糖醛酸聚糖)。適當培養(yǎng)基的選擇可基于表達宿主的選擇和/或基于表達構建體的調(diào)節(jié)需要。此類培養(yǎng)基對本領域技術人員來說是已知的。如果需要的話，培養(yǎng)基可含有其他成分，所述成分對于其他潛在的污染微生物而言利于經(jīng)轉化的表達宿主。發(fā)酵可進行從大約0. 5到大約30天的時間。其可以是合適地在例如從大約20到 900C，優(yōu)選地20-55°C，更優(yōu)選地40-50°C的范圍內(nèi)的溫度下和/或在例如從大約2到大約 8，優(yōu)選地從大約3到大約5的pH下的分批、補料分批或連續(xù)方法。適當?shù)臈l件通常是基于表達宿主的選擇和將被表達的蛋白所選擇的條件。發(fā)酵后，必要時，可通過離心或過濾手段從發(fā)酵液中去除細胞。在發(fā)酵已停止后或細胞去除后，可接著回收本發(fā)明的多肽，如果需要的話，通過常規(guī)手段純化并分離所述多肽。多肽/多肽組合物本發(fā)明提供了包含纖維素酶和/或半纖維素酶和/或果膠酶的多肽或多肽組合物。本文中，纖維素酶是能降解或改性纖維素和/或葡聚糖的任何多肽。能夠降解纖維素的多肽是能夠催化下述過程的多肽將纖維素降解成更小的單元，例如部分地降解成纖維素糊精，或者完全降解成葡萄糖單體。與纖維素酶接觸時，根據(jù)本發(fā)明的纖維素酶可得到纖維素糊精與葡萄糖單體的混合種群。此類降解將典型地通過水解反應而發(fā)生。本文中，半纖維素是能夠降解或改性半纖維素的任何多肽。也就是說，半纖維素酶可以能夠降解或改性木聚糖、阿拉伯聚糖、葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯半乳聚糖、阿拉伯木聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖和木葡聚糖之一種或多種。能夠降解半纖維素的多肽是能夠催化下述過程的多肽將半纖維素降解成更小的多糖，例如部分地降解成寡糖，或者完全降解成糖單體，例如己糖或戊糖單體。與半纖維素酶接觸時，根據(jù)本發(fā)明的半纖維素酶可得到寡糖與糖單體的混合種群。此類降解將典型地通過水解反應而發(fā)生。本文中，果膠酶是能夠降解或改性果膠的任何多肽。能夠降解果膠的多肽是能夠催化下述過程的多肽將果膠降解成更小的單元，例如部分地降解成寡糖，或者完全降解成糖單體。與果膠酶接觸時，根據(jù)本發(fā)明的果膠酶可得到寡糖與糖單體的混合種群。此類降解將典型地通過水解反應而發(fā)生。因此，本發(fā)明的組合物可包含任何纖維素酶，例如纖維二糖水解酶，內(nèi)切-β-1， 4-葡聚糖酶，β-葡糖苷酶或β_(1，;3) (1，4)_葡聚糖酶。本文中，纖維二糖水解酶(EC 3.2.1.91)是能夠催化纖維素或纖維四糖中1， 4-β-D-葡糖苷鍵水解、從鏈的非還原末端釋放纖維二糖的任何多肽。所述酶也可以被稱作纖維素酶1，4-β-纖維二糖苷酶(1，4-0-(^1101^0&(1￡1^)，1，4-0-纖維二糖水解酶，1， 4- β -D-葡聚糖纖維二糖水解酶，微晶纖維素酶(avicelase)，外切，4_ β -D-葡聚糖酶， 外切纖維二糖水解酶或外切葡聚糖酶。本文中，內(nèi)切-β-1，4_葡聚糖酶(EC 3.2. 1.4)是能夠催化纖維素、地衣淀粉或谷類β-D-葡聚糖中1，4_β-D-葡糖苷鍵內(nèi)切水解的任何多肽。此類多肽也可以能夠水解還含有1，3_鍵的β-D-葡聚糖中的1，4_鍵。所述酶也可以被稱作纖維素酶、微晶纖維素酶、β -1,4-內(nèi)切葡聚糖水解酶、β -1,4-葡聚糖酶、羧甲基纖維素酶、纖維糊精酶、內(nèi)切-1， 4- β -D-葡聚糖酶、內(nèi)切-1，4- β -D-葡聚糖水解酶、內(nèi)切-1，4- β -葡聚糖酶或內(nèi)切葡聚糖酶。本文中，β -葡糖苷酶(EC 3. 2. 1. 21)是能夠催化末端、非還原性β -D-葡萄糖殘基水解并釋放β-D-葡萄糖的任何多肽。這樣的多肽可具有針對β-D-葡糖苷的廣泛特異性，并且也可以水解以下一種或多種β -D-半乳糖苷、α -L-阿拉伯糖苷、β -D-木糖苷或 β-D-巖藻糖苷。所述酶也可以被稱作苦杏仁苷酶、β-D-葡糖苷葡糖水解酶、纖維二糖酶或龍膽二糖酶。本文中，β_(1，3) (1，4)_葡聚糖酶(EC 3. 2. 1. 73)是能夠催化含有1，3_和1， 4-鍵的β-D-葡聚糖中1，4-β-D-葡糖苷鍵水解的任何多肽。此類多肽可作用于地衣淀粉和谷類β-D-葡聚糖，但不作用于僅含1，3_或1，4_鍵的β-D-葡聚糖。所述酶也可以被稱作地衣淀粉酶(licheninase)，1，3-1，4-β -D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，β -葡聚糖酶， 內(nèi)切-β-1，3-1，4葡聚糖酶，地衣多糖酶(lichenase)或混合鍵β-葡聚糖酶。這類酶的替代方案是被描述為內(nèi)切-1，30)-β-葡聚糖酶的EC 3.2.1.6。當下述葡萄糖殘基在C-3 處被自身取代時，這類酶水解β -D-葡聚糖中的1，3-鍵或1，4-鍵，所述葡萄糖殘基的還原基團涉及要水解的鍵。替代性的名稱包括內(nèi)切_1，3-β-葡聚糖酶，昆布多糖酶，1，3-(1，3 ； l，4)-i3-D-葡聚糖3(4)葡聚糖水解酶，底物包括昆布多糖，地衣淀粉和谷類β-D-葡聚糖。本發(fā)明的組合物可以包含任何半纖維素酶，例如內(nèi)切木聚糖酶、β-木糖苷酶、 α -L-阿拉伯呋喃糖苷酶、1，4-β -D-阿拉伯木聚糖阿拉伯呋喃糖水解酶、乙?；?木聚糖酯酶、α-D-葡糖醛酸糖苷酶、纖維素二糖水解酶、阿魏酸酯酶、香豆酸酯酶、α-半乳糖苷酶、β -半乳糖苷酶、β -甘露聚糖酶或β -甘露糖苷酶。本文中，內(nèi)切木聚糖酶(EC 3. 2. 1. 8)是能夠催化木聚糖中1，4_β -D-木糖苷鍵內(nèi)切水解的任何多肽。所述酶也可以被稱作內(nèi)切-1，4- β -木聚糖酶或1，4- β -D-木聚糖木聚糖水解酶。一種替代方案是EC 3. 2. 1. 136，葡糖醛酸阿拉伯木聚糖內(nèi)切木聚糖酶，一種能夠水解葡糖醛酸阿拉伯木聚糖中1，4木糖苷鍵的酶。本文中，β-木糖苷酶(EC 3. 2. 1. 37)是能夠催化1，4_ β-D-木聚糖的水解、從非還原性末端去除相繼的D-木糖殘基的任何多肽。這類酶也可以水解木二糖。所述酶也可以被稱作木聚糖1，4- β -木糖苷酶、1，4- β -D-木聚糖木糖水解酶、外切-1，4- β -木糖苷酶或木二糖酶。本文中，α -L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3. 2. 1. 55)是能夠作用于α -L-阿拉伯呋喃糖苷、含(1，2)和/或(1，3)_和/或(1，5)_鍵的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖的任何多肽。所述酶也可以被稱作α-N-阿拉伯呋喃糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶或阿拉伯糖苷酶。本文中，α -D-葡糖醛酸糖苷酶(EC 3. 2. 1. 139)是能夠催化以下形式反應的任何多肽α -D-葡糖醛酸苷+對2)0 =醇+D-葡糖醛酸酯。所述酶也被稱作α -葡糖醛酸糖苷酶或α-葡糖苷酸酶。這些酶也可水解可作為木聚糖中取代基存在的4-0-甲基化的葡糖醛酸。替代方式是EC 3.2. 1. 131 木聚糖α-1，2-葡糖醛酸糖苷酶，其催化α-1，244_0-甲基)葡糖醛?；B接的水解。本文中，纖維素二糖水解酶(EC 3. 1. 1. 72)是能夠催化木聚糖和木寡糖脫乙?；娜魏味嚯?。此類多肽可催化來自多聚木聚糖、乙?；咎?、乙酰化葡萄糖、α-萘基乙酸酯或?qū)ο趸交宜狨サ囊阴；?，但是一般不催化來自于三乙?；嫉囊阴；?。此類多肽一般不作用于乙?；母事毒厶腔蚬z。本文中，乙?；揪厶酋ッ?EC 3. 1. 1. 6)是能特別水解天然木聚糖的木聚糖部分的多個位置和/或3位置中的乙?；孽ユI的任何多肽。本文中，阿魏酸酯酶(EC 3. 1. 1. 73)是能夠催化以下形式反應的任何多肽阿魏酸-糖+對2)0=阿魏酸酯+糖。糖可以是例如寡糖或多糖。其典型地可以催化來自酯化的糖的4-羥基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基的水解，所述糖通常是“天然”底物中的阿拉伯糖，對硝基苯酚乙酸酯和阿魏酸甲基酯是典型地更弱的底物。所述酶也可以被稱作肉桂?；ニ饷福⑽核狨ッ富蛄u基肉桂酰基酯酶。也可以被稱作半纖維素附屬酶，因為其可幫助木聚糖酶和果膠酶分解植物細胞壁半纖維素和果膠。本文中，香豆?；ッ?EC 3. 1. 1. 73)是能夠催化以下形式反應的任何多肽香豆?；?糖+對2)0=香豆酸酯+糖。糖可以是例如寡糖或多糖。所述酶也可以被稱作反式-4-香豆?；ッ?、反式-對香豆?；ッ浮ο愣辊；ッ富?qū)ο愣顾狨ッ?。所述酶也落入EC 3. 1. 1. 73中，從而也可以被稱作阿魏酸酯酶。本文中，α -半乳糖苷酶(EC 3. 2. 1. 22)是能夠催化α -D-半乳糖苷(包括半乳糖寡糖、半乳甘露聚糖、半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖)中末端、非還原性α-D-半乳糖殘基水解的任何多肽。此類多肽也可以能夠水解α-D-巖藻糖苷。所述酶也可以被稱作蜜二糖酶。本文中，β -半乳糖苷酶(EC 3. 2. 1. 23)是能夠催化β -D-半乳糖苷中末端非還原性β-D-半乳糖殘基水解的任何多肽。這樣的多肽也可以能夠水解α-L-阿拉伯糖苷。 所述酶也可以被稱作外切-(1- > 4)-β-D-半乳聚糖酶或乳糖酶。本文中，β-甘露聚糖酶(EC 3.2. 1.78)是能夠催化甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖中l(wèi)，4-i3_D-甘露糖苷鍵隨機水解的任何多肽。所述酶也可以被稱作甘露聚糖內(nèi)切-1，4- β -甘露糖苷酶或內(nèi)切-1，4-甘露聚糖酶。本文中，β -甘露糖苷酶(EC 3. 2. 1. 25)是能夠催化β -D-甘露糖苷中末端非還原性β-D-甘露糖殘基水解的任何多肽。所述酶也可以被稱作甘露聚糖酶或甘露糖酶。本發(fā)明的組合物可包含任何果膠酶，例如內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶，果膠甲基酯酶， 內(nèi)切-半乳聚糖酶，β -半乳糖苷酶，果膠乙?；ッ?，內(nèi)切-果膠裂合酶，果膠酸裂合酶， α -鼠李糖苷酶，外切-半乳糖醛酸酶，外切多聚半乳糖醛酸酯裂合酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖水解酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖裂合酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖乙?；ッ?，鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳糖醛酸水解酶，木半乳糖醛酸酶。本文中，內(nèi)切-多聚半乳糖醛酸酶(EC 3. 2. 1. 15)是能夠催化果膠酸酯和其他半乳糖醛酸聚糖中1，4_α-D-半乳糖醛酸鍵的隨機水解的任何多肽。所述酶也可以被稱作多聚半乳糖醛酸酶果膠解聚酶，果膠酶(pectinase)，內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶，果膠酶 (pectolase)，果膠水解酶，果膠多聚半乳糖醛酸酶，多聚-α _1，4_半乳糖醛酸苷聚糖水解酶，內(nèi)切半乳糖醛酸酶；內(nèi)切-D-半乳糖醛酸酶或多聚(1，4-α-D-半乳糖醛酸苷)聚糖水解酶。在本文中，果膠甲基酯酶(EC 3. 1. 1. 11)是能夠催化下述反應的任何酶果膠+η H2O = η甲醇+果膠酸。所述酶也已知為果膠酯酶(pectinesterase)，果膠脫甲氧基酶， 果膠甲氧基酶，果膠甲基酯酶，果膠酶，果膠酯酶(pectinoesterase)或果膠果?；饷?(pectin pectylhydrolase)。在本文中，內(nèi)切-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)是能夠催化阿拉伯半乳聚糖中1， 4-β-D-半乳糖苷鍵的內(nèi)切水解的任何酶。所述酶也已知為阿拉伯半乳聚糖內(nèi)切-1， 4- β -半乳糖苷鍵酶，內(nèi)切-1，4- β -半乳聚糖酶，半乳聚糖酶，阿拉伯半乳聚糖酶或阿拉伯半乳聚糖4- β -D-半乳聚糖水解酶。本文中，果膠乙?；ッ冈诒疚闹斜欢x為下述任何酶，所述酶具有催化果膠 GaIUA殘基羥基處的乙?；拿撘阴；饔玫囊阴；ッ富钚?。本文中，內(nèi)切-果膠裂合酶(EC 4.2.2. 10)是能夠催化(1 — 4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖甲基酯的清除性切割，得到在其非還原末端具有4-脫氧-6-0-甲基-a -D-半乳-4-糖醛酰基的寡糖的任何酶。酶也可已知為果膠裂合酶，果膠反式消除酶(trans-eliminase)， 內(nèi)切果膠裂合酶，多聚甲基半乳糖醛酸反式消除酶，果膠甲基反式消除酶，果膠酶 (pectolyase)，PL, PNL或PMGL或(1 — 4) -6-0-甲基-α -D-半乳糖醛酸聚糖裂合酶。本文中，果膠酸裂合酶(EC 4. 2. 2. 2)是能夠催化(1 — 4) - α -D-半乳糖醛酸聚糖的消除性切割，得到在其非還原性末端具有4-脫氧-α -D-半乳-4-糖醛?；墓烟堑娜魏蚊?。酶也可以已知為多聚半乳糖醛酸反式消除酶，果膠酸反式消除酶，多聚半乳糖醛酸酯裂合酶，內(nèi)切果膠甲基反式消除酶，果膠酸反式消除酶，內(nèi)切半乳糖醛酸酯反式消除酶，果膠酸裂合酶，果膠裂合酶，α -1,4-D-內(nèi)切多聚半乳糖醛酸裂合酶，PGA裂合酶，PI^ase-N，內(nèi)切-α -1，4-多聚半乳糖醛酸裂合酶，多聚半乳糖醛酸裂合酶，果膠反式消除酶，多聚半乳糖醛酸反式消除酶或(1 — 4) - α -D-半乳糖醛酸聚糖裂合酶。本文中，α -鼠李糖苷酶(EC 3. 2. 1. 40)是能夠催化α -L-鼠李糖苷或替代地鼠李半乳糖醛酸聚糖中末端非還原性α-L-鼠李糖殘基水解的任何多肽。所述酶也可以已知為α -L-鼠李糖苷酶Τ，α -L-鼠李糖苷酶N或α -L-鼠李糖苷鼠李糖水解酶。本文中，外切-半乳糖醛酸酶(EC 3. 2. 1. 82)是能夠從非還原性末端水解果膠酸、釋放二半乳糖醛酸的任何多肽。酶也可以已知為外切-多聚- α-半乳糖醛酸苷酶(exo-poly-a-galacturonosidase)、外切多聚半乳糖醛酸苷酶(exopolygalacturonosidase)或外切多聚聚半乳糖醛酸苷酶 (exopolygalacturanosidase)。本文中，外切-半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.67)是能夠催化以下的任何多肽(1， 4- α -D-半乳糖醛酸苷)n+H20 = (1，4- α -D-半乳糖醛酸苷)n_i+D-半乳糖醛酸酯。所述酶也可以已知為半乳糖醛1，4-α-半乳糖醛酸苷酶(galacturan 1,4-α-galacturonidase), 外切多聚半乳糖醛酸酶，多聚(半乳糖醛酸酯)水解酶，外切-D-半乳糖醛酸酶，外切-D-半乳糖醛酸聚糖酶，外切多聚-D-半乳糖醛酸酶或多聚(1，4-α-D-半乳糖醛酸苷)半乳糖醛酸水解酶。本文中，外切多聚半乳糖醛酸酯裂合酶(EC 4. 2. 2. 9)是能夠催化從果膠酸(即脫脂化的果膠)的還原末端消除性切割4- (4-脫氧-α -D-半乳-4-糖醛?；?-D-半乳糖醛酸酯的任何多肽。所述酶可已知為果膠酸二糖裂合酶，果膠酸外切裂合酶，外切果膠酸反式消除酶，外切果膠酸裂合酶，外切多聚半乳糖醛酸-反式-消除酶，PATE，外切-PATEjh 切-PGL或(1 — 4) - α -D-半乳糖醛酸聚糖還原末端二糖裂合酶。本文中，鼠李半乳糖醛酸聚糖水解酶是能夠在嚴格交替出現(xiàn)的鼠李半乳糖醛酸聚糖結構中以內(nèi)切方式水解半乳基糖醛酸酸和吡喃鼠李糖基之間鍵的任何多肽，所述鼠李半乳糖醛酸聚糖結構由二糖[(1，2- α -L-鼠李糖基-(1，4) - α -半乳糖醛酸]組成。本文中，鼠李半乳糖醛酸聚糖裂合酶是能夠以內(nèi)切方式在鼠李半乳糖醛酸聚糖中通過β -消除切割α -L-Rhap-(1 — 4) - α -D-GalpA鍵的任何多肽。本文中，鼠李半乳糖醛酸聚糖乙酰基酯酶是能夠催化鼠李半乳糖醛酸聚糖中交替出現(xiàn)的鼠李糖和半乳糖醛酸殘基主鏈的脫乙?；娜魏味嚯?。本文中，鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳糖醛酸水解酶是能夠以外切方式、從嚴格交替出現(xiàn)的鼠李半乳糖醛酸聚糖結構的非還原性末端水解半乳糖醛酸的任何多肽。本文中，木半乳糖醛酸酶是通過以內(nèi)切方式切割β-木糖取代的半乳糖醛酸主鏈而作用于木半乳糖醛酸聚糖的任何多肽。所述酶也可以已知為木半乳糖醛酸聚糖水解酶。本文中，α -L-阿拉伯糖呋喃糖苷酶(EC 3. 2. 1. 55)是能夠作用于α -L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1，2)和/或(1，3)_和/或(1，5)_鍵的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖的任何多肽。所述酶也可以被稱作α-N-阿拉伯糖呋喃糖苷酶，阿拉伯糖呋喃糖苷酶或阿拉伯糖苷酶。本文中，內(nèi)切阿拉伯聚糖酶(EC 3.2. 1.99)是能夠催化1，5_阿拉伯聚糖中1， 5- α -阿拉伯呋喃糖苷鍵內(nèi)切水解的任何多肽。所述酶也已知為內(nèi)切阿拉伯糖酶，阿拉伯聚糖內(nèi)切-1，5- α -L-阿拉伯糖苷酶，內(nèi)切-1，5- α -L-阿拉伯聚糖酶，內(nèi)切-α -1，5_阿拉伯聚糖酶；內(nèi)切-阿拉伯聚糖酶或1，5- α -L-阿拉伯聚糖1，5- α -L-阿拉伯聚糖水解酶。本發(fā)明的組合物將一般包含至少一種纖維素酶和/或至少一種半纖維素酶和/或至少一種果膠酶(其中之一是根據(jù)本發(fā)明的多肽)。本發(fā)明的組合物可包含纖維二糖水解酶，內(nèi)切葡聚糖酶和/或葡糖苷酶。此類組合物也可以包含一種或多種半纖維素酶和 /或一種或多種果膠酶。另外，本發(fā)明的組合物中可以存在淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、木質(zhì)酶、己糖基轉移酶或葡糖醛酸糖苷酶中的一種或多種(例如兩種、三種、四種或所有)。“蛋白酶”包括水解肽鍵的酶(肽酶)，以及水解肽和其它部分如糖之間鍵的酶(糖肽酶)。許多肽酶根據(jù)EC 3. 4表征，適合在本發(fā)明中使用并且通過引用并入本文。一些特定類型的蛋白酶包括半胱氨酸蛋白酶(包括胃蛋白酶，木瓜蛋白酶)和絲氨酸蛋白酶(包括糜蛋白酶，羧肽酶和金屬內(nèi)切蛋白酶)?！爸久浮卑ㄋ庵|(zhì)、脂肪酸和酰基甘油酯(包括磷酸甘油酯)、脂蛋白、二酰基甘油等等的酶。在植物中，脂質(zhì)被用作結構組分，來限制水損失和病原體感染。這些脂質(zhì)包括來自脂肪酸的蠟質(zhì)，以及角質(zhì)和木栓素(suberin)?！澳举|(zhì)酶”包括能夠水解或分解木質(zhì)素聚合物結構的酶。能夠分解木質(zhì)素的酶包括木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶、漆酶和阿魏酸酯酶，和在本領域中已知解聚或以其他方式分解木質(zhì)素聚合物的描述的其他酶。還包括在內(nèi)的是能夠水解在半纖維素糖(主要是阿拉伯糖)和木質(zhì)素之間形成的鍵的酶。木質(zhì)酶包括但不限于以下組的酶木質(zhì)素過氧化物酶(EC 1. 11. 1. 1)、錳過氧化物酶(EC 1. 11. 1. 13)、漆酶(EC 1. 10. 3. 2)和阿魏酸酯酶(EC 3. 1. 1. 73)?！凹禾腔D移酶”(2. 4. 1-)包括能夠轉移糖基更具體地己糖基的酶。除了將來自含糖基供體的糖基轉移至另一含糖基的化合物(受體)之外，酶也可以將糖基向作為受體的水轉移。該反應還被已知為水解反應而不是轉移反應?？梢栽诒景l(fā)明中使用的己糖基轉移酶的例子是葡聚糖基轉移酶。此類酶可以能夠催化(1，；3) (1,4)葡聚糖和/或纖維素和/或纖維素降解產(chǎn)物的降解?！捌咸侨┧崽擒彰浮卑ù呋咸侨┧彳?例如β -葡糖醛酸苷)水解得到醇的酶。許多葡糖醛酸糖苷酶已被表征，并可適合在本發(fā)明中使用，例如β-葡糖醛酸糖苷酶 (EC 3. 2. 1. 31)，透明質(zhì)酸酶葡糖醛酸糖苷酶(EC3. 2. 1. 36)，葡糖醛?；?二硫葡糖胺葡糖醛酸糖苷酶(3. 2. 1. 56)，甘草酸β -葡糖醛酸糖苷酶(3. 2. 1. 128)或α -D-葡糖醛酸糖苷酶(EC 3. 2. 1. 139)。本發(fā)明的組合物可包含擴展蛋白多肽或擴展蛋白樣多肽，如膨脹因子 (swollenin)(見 Salheimo et al.，Eur. J. Biohem. 269，4202-4211，2002)或膨脹因子樣多肽。擴展蛋白涉及植物細胞生長期間細胞壁結構的松弛。已經(jīng)提出擴展蛋白破壞纖維素和其他細胞壁多糖之間的氫鍵，但不具有水解活性。認為它們通過這種方式允許纖維素纖維的滑動和細胞壁的擴大。一種擴展蛋白樣多肽——膨脹因子，含有N端碳水化合物結合模塊家族1結構域(CBD)和C端擴展蛋白樣結構域。就本發(fā)明的目的而言，擴展蛋白樣多肽或膨脹因子樣多肽可包含此類結構域中的一種或兩種和/或可破壞細胞壁的結構(如破壞纖維素結構)，任選地不生產(chǎn)可檢測量的還原糖?？纱嬖诘膫溥x多肽有例如選自以下組的多肽過氧化氫酶、漆酶、酚氧化酶、氧化酶、氧化還原酶、纖維素酶、木聚糖酶、過氧化物酶、脂肪酶、水解酶、酯酶、角質(zhì)酶、蛋白酶和其他蛋白水解多肽、氨肽酶、羧肽酶、植酸酶、裂合酶、果膠酶和其他果膠分解酶、淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、葡糖苷酶、甘露糖苷酶、 異構酶、轉化酶、轉移酶、核糖核酸酶、幾丁質(zhì)酶、聚糖酶和脫氧核糖核酸酶。本發(fā)明還涉及包含根據(jù)本發(fā)明的多肽中的一種或多種的組合物。在一種實施方式中，本發(fā)明的多肽是半纖維素酶，并且本發(fā)明的組合物除了本發(fā)明的多肽之外還將典型地包含纖維素酶和/或果膠酶。在其他實施方式中，本發(fā)明的多肽是果膠酶，并且本發(fā)明的組合物除了本發(fā)明的多肽之外還將典型地包含纖維素酶和/或半纖維素酶。在其他實施方式中，本發(fā)明的多肽是纖維素酶，并且本發(fā)明的組合物除了本發(fā)明的多肽之外還將典型地包含半纖維素酶和/或果膠酶。在一種實施方式中，纖維素酶是CBH IXBH II、EG或BG中的一種或多種。多肽可以是單一的纖維素酶和/或半纖維素酶或果膠酶，或纖維素酶和/或半纖維素酶和/或果膠酶和/或其他多肽的混合物。在一種實施方式中，多肽是纖維素酶，所述纖維素酶是選自 CBH I, CBH II、EG或BG的兩種多肽的混合物。優(yōu)選地，纖維素酶是包含CBH IXBH II,EG和BG的混合物。本發(fā)明的組合物可包含一種、兩種或三種纖維素酶，例如內(nèi)切-1，4-β-葡聚糖酶(EG)、外切-纖維素二糖水解酶(CBH)和α，β-葡萄糖苷酶(BG)中的一種、兩種或所有。本發(fā)明的組合物可包含具有相同酶促活性的多肽，例如如由本發(fā)明的多肽提供的同一類型的纖維素酶、半纖維素酶和/或果膠酶活性本發(fā)明的組合物可包含下述多肽，所述多肽具有由本發(fā)明的多肽提供的不同類型的纖維素酶活性和/或半纖維素酶活性和/或果膠酶活性。例如，本發(fā)明的組合物可包括由本發(fā)明的多肽提供的一種類型的纖維素酶和/或半纖維素酶活性和/或果膠酶活性和由其他半纖維素酶/果膠酶提供的第二種類型的纖維素酶和/或半纖維素酶活性和/或果膠酶活性。本發(fā)明的組合物可包含纖維素整合多肽、支架多肽或支架樣多肽的多肽產(chǎn)物，例如分另 1J來自 Clostridium thermocellum或 Clostridium cellulolyticum 的 CipA 或 CipC。支架多肽和纖維素整合多肽是多功能整合亞基，其可將分解纖維素的亞基組合進多酶復合物中。這通過兩類互補的結構域(即支架多肽上的內(nèi)聚結構域(cohesion domain)和每個酶單元上的錨定結構域(dockerin domain))的相互作用完成。支架多肽亞基還帶有介導纖維體與其底物結合的纖維素結合模塊(CBM)。就本發(fā)明的目的而言，支架多肽或纖維素整合多肽可包含此類結構域中的一種或兩種。在一種實施方式中，多肽組合物可包含源自除Talaromyces之外的其他微生物的多月太，例如 Trichoderma CBHI> Trichoderma CBHII> Trichoderma BGfP/ 或 Trichoderma EG、β -D-葡萄糖苷葡糖水解酶、內(nèi)切半乳聚糖酶、膨脹因子、CipU Cip2、木聚糖酶III、 β -木糖苷酶XylA、乙?；揪厶酋ッ?、幾丁質(zhì)酶、β -甘露聚糖酶。本發(fā)明的組合物可包含纖維素誘導的多肽或調(diào)節(jié)多肽，例如由來自Trichoderma reesei/Hypocrea jacorina的cipl或cip2基因或類似基因所編碼的多肽(見Foreman et al.，J. Biol. Chem. 278 (34). 31988-31997，2003)。這些基因的多肽產(chǎn)物是雙模塊多肽，其含有纖維素結合模塊和其功能或活性不與已知的糖基水解酶家族相關的結構域。而纖維素結合模塊的存在和這些基因的表達與纖維素酶元件的共同調(diào)節(jié)表明在生物質(zhì)降解中具有潛在作用的先前未被認識的活性。本發(fā)明的組合物可由上文提到的多肽種類的任一成員、一個多肽種類的若干成員、或這些多肽種類的任何組合組成。在本發(fā)明的組合物可以由來自以下的多肽，例如酶組成⑴供應商；⑵克隆基因表達的多肽，例如酶；(3)復合發(fā)酵液(例如由培養(yǎng)基中微生物菌株的生長得到的，其中所述菌株向培養(yǎng)基中分泌多肽和酶)；(4)如(3)中生長的菌株的細胞裂解物；和/或(5) 植物材料表達的多肽，例如酶。本發(fā)明組合物中不同的多肽，例如酶可得自不同的來源。多肽的用途根據(jù)本發(fā)明的多肽和多肽組合物可被用在許多不同的應用中。例如，它們可被用來生產(chǎn)可發(fā)酵糖。在一種實施方式中，它們可被用在用于糖化木質(zhì)纖維素材料的方法中，其中任選地經(jīng)預處理的木質(zhì)纖維素材料與根據(jù)本發(fā)明的 Talaromyces轉化體或根據(jù)本發(fā)明的纖維素酶、半纖維素酶或果膠酶接觸，生產(chǎn)一種或多種糖。作為生物燃料工藝的一部分，可發(fā)酵糖然后可被轉化為沼氣或乙醇、丁醇、異丁醇、2-丁醇或其他合適的物質(zhì)。本發(fā)明因而涉及制備發(fā)酵產(chǎn)物例如乙醇的方法，其中用發(fā)酵微生物， 優(yōu)選地酵母發(fā)酵糖，以生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物。
或者，多肽和其組合物可在例如食品生產(chǎn)、洗滌劑組合物、造紙和制漿工業(yè)、抗菌配方、藥物產(chǎn)品例如潤喉片、牙膏、漱口水中被用作酶。所述用途的一些將在下文詳細闡釋。在下文所述的用途和方法中，上述組合物的組分可以共同(即本身作為單一組合物)或單獨或先后提供。本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的多肽和包含此類酶的組合物在工業(yè)方法中的用途。盡管關于這些方法獲得了長期的經(jīng)驗，但根據(jù)本發(fā)明的多肽相對于目前使用的酶可具有許多顯著的優(yōu)點。取決于具體應用，這些優(yōu)點可包括多個方面，例如更低的生產(chǎn)成本、對底物更高的特異性、降低的抗原性、更少的不期望的副活性、當在合適的微生物中生產(chǎn)時更高的產(chǎn)率；更合適的PH和溫度范圍、不被疏水的得自木質(zhì)素的產(chǎn)物抑制或更少的產(chǎn)物抑制或在食品工業(yè)的情況下更好的終產(chǎn)品的味道或質(zhì)地以及食品等級和潔凈的面貌 (kosher aspects)0原則上，本發(fā)明的多肽或組合物可以在任何需要處理包含多糖的材料的方法中使用。因此，本發(fā)明的多肽或組合物可以在多糖材料的處理中使用。本文中，多糖材料是下述材料，所述材料包含一種或更典型地多種多糖或者基本由一種或更典型地多種多糖組成。典型地，植物和得自它們的材料包含大量非淀粉的多糖材料。因此，本發(fā)明的多肽可以用于植物或真菌材料或源自它們的材料的處理。木質(zhì)纖維素多肽被有利地用來降解木質(zhì)纖維素材料。主要的多糖是纖維素(葡聚糖)、半纖維素(木聚糖、異木聚糖、木葡聚糖)。此外，一些半纖維素可在例如得自木材的原料中作為葡甘露聚糖存在。將這些多糖酶促水解為可溶糖，例如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、核糖、D-半乳糖醛酸和其他己糖和戊糖在共同作用的不同酶的作用下發(fā)生。另外，果膠和其他果膠物質(zhì)如阿拉伯聚糖(arabinans)可占來自非木本植物組織典型的細胞壁干物質(zhì)的可觀的比例(約四分之一到一半的干物質(zhì)可以是果膠)。纖維素是由通過β _1，4鍵連接的葡萄糖殘基組成的線性多糖。纖維素纖維的線性本質(zhì)以及化學計量的連接的葡萄糖(相對于α)產(chǎn)生比淀粉的高度枝化的α-連接的結構更傾向于鏈間(interstrand)氫鍵合的結構。因此，纖維素聚合物與淀粉中存在的纖維相比通常溶解度更小，并且形成更緊密結合的纖維。半纖維素是復合聚合物，并且其組成常常在生物之間、組織類型之間大幅變化。通常，半纖維素的主要成分是β_1，4-連接的木糖(一種五碳糖)。然而，所述木糖通常在木糖的0-3和/或0-2原子處被枝化，并且可以被與阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、葡糖醛酸、半乳糖醛酸形成的鍵取代，或者被對乙酸的酯化(和阿魏酸對阿拉伯糖的酯化)取代。半纖維素也可含有葡聚糖，所述葡聚糖是連接的六碳糖(如先前提到的β_(1，3)(1，4)葡聚糖和雜葡聚糖)和額外的葡甘露聚糖(其中葡萄糖和甘露糖均存在于線性主鏈中，彼此通過β-鍵連接)的總稱。果膠物質(zhì)包括果膠、阿拉伯聚糖、半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖。果膠是植物細胞壁中最復雜的多糖。它們沿著一定程度上散布著L-鼠李糖的α (1，4)_連接的D-半乳糖醛酸單元核心鏈周圍構建。在任何細胞壁中都存在符合所述描述的大量結構單元，并且通常認為在單個果膠分子中，不同結構單元的核心鏈彼此連續(xù)。
結構單元的主要類型是聚半乳糖醛酸(同聚半乳糖醛酸)，其可被甲醇在羧基上取代，被乙酸酯在0-2和0-3上取代；鼠李半乳糖醛酸聚糖I (RGI)，其中半乳糖醛酸單元與帶有(1，4)_連接的半乳聚糖和(1，5)_連接的阿拉伯聚糖側鏈的鼠李糖交替存在。阿拉伯聚糖側鏈可直接與鼠李糖結合，或者通過半乳聚糖鏈間接結合；木半乳糖醛酸聚糖， 在半乳糖醛酸的0-3上具有單個木糖基單元(與RGI緊密結合)；和鼠李半乳糖醛酸聚糖 II (RGII)，含有罕見糖例如芹糖的特別復雜的小型單元。RGII單元可含有兩個芹菜糖殘基， 所述芹菜糖殘基在合適的離子條件下能夠與硼酸鹽可逆地形成酯。與單子葉植物(monocots，即具有單個子葉或種子葉的植物，如玉米、小麥、水稻、 草、大麥)相比，雙子葉植物(dicot，即其種子具有兩片子葉或種子葉的植物，如利馬豆 (lima beans)、花生、杏仁、豌豆、四季豆)中半纖維素的組成、取代性質(zhì)和枝化程度差異很大。在雙子葉植物中，半纖維素主要由下述木葡聚糖組成，所述木葡聚糖是具有1，6- β -連接的木糖基側鏈的1，4-β-連接的葡萄糖鏈。在單子葉植物(包括大部分谷類作物)中， 半纖維素的主要組分是異木聚糖。這些主要由下述1，4-β-連接的木糖主鏈聚合物組成， 所述木糖主鏈聚合物與阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖和葡糖醛酸或4-0-甲基-葡糖醛酸以及由與酯連接的乙酸改性的木糖具有1，3-α連接。還存在由1，3_和1，4-β_連接的葡糖基鏈組成的β葡聚糖。在單子葉植物中，纖維素、異木聚糖和葡聚糖可以大致等量地存在，各自包含約15-25%的細胞壁干物質(zhì)。另外，不同的植物可包含不同量和不同組成的果膠物質(zhì)。例如，甜菜含有以干重為基礎約19%的果膠和約21%的阿拉伯聚糖。因此，本發(fā)明的組合物可根據(jù)要使用的具體原料(也稱為底物)來定制。也就是說，本發(fā)明組合物中的活性譜可根據(jù)所考慮的原料來變化。酶組合或物理處理可以并發(fā)或先后地施用。酶可以在微生物、酵母、真菌、細菌或植物中外源產(chǎn)生，然后分離并加入木質(zhì)纖維素原料中?；蛘?，酶可以被生產(chǎn)但不分離，并且將粗制細胞群發(fā)酵液或植物材料(如玉米稈)等等加入原料中?；蛘?，可以處理粗制細胞群或酶生產(chǎn)培養(yǎng)基或植物材料，以預防進一步的微生物生長(例如通過加熱或添加抗微生物劑)，然后添加至原料。這些粗制酶混合物可包含生產(chǎn)酶的生物?；蛘撸缚梢栽谙率霭l(fā)酵中生產(chǎn)，所述發(fā)酵使用原料(例如玉米稈)對生產(chǎn)酶的生物提供營養(yǎng)。通過這種方式，生產(chǎn)酶的植物可以發(fā)揮木質(zhì)纖維素原料的作用，并且被添加進木質(zhì)纖維素原料中。碳水化合物聚合物(纖維素和半纖維素)與木質(zhì)素通過氫鍵和共價鍵緊密結合。因此，本發(fā)明的多肽可以用于木質(zhì)纖維素材料的處理。本文中，木質(zhì)纖維素材料是包含木質(zhì)纖維素或基本由木質(zhì)纖維素組成的材料。因此，在用于處理非淀粉的多糖的本發(fā)明方法中，非淀粉的多糖可以是木質(zhì)纖維素材料/生物質(zhì)。因此，本發(fā)明提供了處理包含非淀粉多糖的底物的方法，其中所述處理包括纖維素和/或半纖維素和/或果膠物質(zhì)的降解和/或水解和/或改性。內(nèi)切1，4-β -葡聚糖酶(EG)和外切纖維二糖水解酶(CBH)催化不溶性纖維素水解成為纖維寡糖(纖維二糖作為主要產(chǎn)物)，而葡糖苷酶(BG)將寡糖(主要是纖維二糖和纖維三糖)轉化成葡萄糖。木聚糖酶與其他附屬酶例如α -L-阿拉伯呋喃糖酶、阿魏酸酯酶和乙酰木聚糖酯酶、葡糖醛酸糖苷酶和β -木糖苷酶一起，催化半纖維素的水解。果膠酶，例如內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶，果膠甲基酯酶，內(nèi)切-半乳聚糖酶，β -半乳糖苷酶，果膠乙?；ッ福瑑?nèi)切-果膠裂合酶，果膠酸裂合酶，α -鼠李糖苷酶，外切-半乳糖醛酸酶，外切多聚半乳糖醛酸酯裂合酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖水解酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖裂合酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖乙?；ッ?，鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳糖醛酸水解酶，木半乳糖醛酸酶，α-阿拉伯呋喃糖酶。降解在本文上下文中表示導致產(chǎn)生纖維素和/或半纖維素和/或果膠物質(zhì)的水解產(chǎn)物(即與類似的未經(jīng)處理的非淀粉多糖中存在的相比，由于處理而存在更短鏈的糖)的處理。因此，降解在本文上下文中可以導致寡糖和/或糖單體的釋放。所有植物和真菌都含有非淀粉的多糖，同樣，基本上所有得自植物的多糖材料也含有非淀粉的多糖。因此，在本發(fā)明的用于處理包含非淀粉多糖的底物的方法中，所述底物可以以植物或自植物的材料或包含植物或得自植物的材料的形式提供，例如以植物漿、植物提取物、食品或其成分、織物、紡織品或衣物。適合在本發(fā)明的方法中使用的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)包括下述生物質(zhì)，所述生物質(zhì)可包括原始生物質(zhì)(virgin biomass)和/或非原始生物質(zhì)如農(nóng)業(yè)生物質(zhì)，商業(yè)有機物，建筑和拆除碎片，市政固體廢棄物，廢紙和庭院廢棄物。常見的生物質(zhì)形式包括樹木，灌木叢(shrubs)和草，小麥，小麥秸，甘蔗渣，玉米，玉米殼，玉米芯(corn cobs)，玉米粒(包括來自玉米粒的纖維)，來自谷物如玉米、小麥和大麥研磨(包括濕磨和干磨)的通常稱作“麩或纖維”的產(chǎn)物和副產(chǎn)物，以及市政固體廢棄物，廢紙和庭院廢棄物。生物質(zhì)也可以是，但不限于草本材料，農(nóng)業(yè)殘余物，林業(yè)殘余物，市政固體廢棄物，廢紙，和紙漿和造紙廠殘余物。“農(nóng)業(yè)生物質(zhì)”包括樹枝，灌木(bushes)，藤蔓(canes)，玉米和玉米殼，能量作物， 森林，水果，鮮花，谷物，草，草本作物，樹葉，樹皮，針葉，原木，根，樹苗，短期輪種木本作物 (short-rotation woody crops)，灌木叢，柳枝稷，樹木，蔬菜，水果皮，蔓藤(vines)，甜菜漿，小麥麩皮(wheat midlings)，燕麥殼，和硬木材或軟木材(不包括帶有有害材料的木材)。另外，農(nóng)業(yè)生物質(zhì)包括由農(nóng)業(yè)加工產(chǎn)生的有機廢棄物材料，所述農(nóng)業(yè)加工包括農(nóng)業(yè)和林業(yè)活動，特定地包括林業(yè)木材廢棄物。農(nóng)業(yè)生物質(zhì)可以是前述任一或其任何組合或混合物。合適的生物質(zhì)的其他例子是果園底料，樹叢，磨坊廢棄物，城市木材廢棄物，市政廢棄物，伐木廢棄物，森林疏伐廢棄物，短期輪種木本作物，工業(yè)廢棄物，小麥秸，燕麥秸，水稻秸，大麥秸，黑麥秸，亞麻秸，大豆殼，稻殼，水稻秸，玉米麩飼料，燕麥殼，甘蔗，玉米秸稈，玉米桿，玉米芯，玉米殼，牧場草，磨擦禾，狐尾草；甜菜漿，柑橘果實漿，種子殼，纖維素動物糞便，草坪修剪廢棄物，棉花，海藻，樹木，灌木叢，草，小麥，小麥秸，甘蔗渣，玉米，玉米殼，玉米棒，玉米粒，來自玉米粒的纖維，來自谷物濕磨或干磨的產(chǎn)物和副產(chǎn)物，市政固體廢棄物， 廢紙，庭院廢棄物，草本材料，農(nóng)業(yè)殘余物，林業(yè)殘余物，市政固體廢棄物，廢紙，紙漿，造紙廠殘余物，樹枝，灌木，甘蔗，玉米，玉米殼，能源作物，森林，水果，鮮花，谷物，草，草本作物， 樹葉，樹皮，針葉，原木，根，樹苗，灌木叢，柳枝稷，樹木，蔬菜，水果皮，藤蔓，甜菜漿，小麥麩皮，燕麥殼，硬木材或軟木材，由農(nóng)業(yè)加工產(chǎn)生的有機廢棄物材料，林業(yè)木材廢棄物，或其中任意兩種或更多的組合。除了已經(jīng)在食物和飼料或造紙和制漿工業(yè)中加工的原始生物質(zhì)或原料以外，生物質(zhì)/原料可額外地用熱、機械和/或化學改性或此類方法的任何組合預處理，從而增強酶降解。預處理
在酶促處理之前，木質(zhì)纖維素材料可被預處理。預處理可包括將所述木質(zhì)纖維素材料暴露于酸，堿，溶劑，熱，過氧化物，臭氧，機械粉碎，碾磨，研磨或快速釋壓，或其中任兩種或更多的組合。所述化學預處理通常與熱預處理(例如在150-220°C之間1到30分鐘)
纟口口。預處理步驟之后，可以使用涉及用酶或酶混合物孵育的液化/水解或預糖化步驟。所述預處理步驟可以在許多不同的溫度下進行，在一種實施方式中，預處理在最適合要測試的酶混合物的溫度下，或針對要測試的酶的預期的酶最適度下進行。預處理溫度可以在從約10°c到約95°C，約20°C到約85°C，約30°C到約70°C，約40°C到約60°C，約37°C到約50 V，優(yōu)選地約37 V到約80 V，更優(yōu)選地約60-70 V，甚至更優(yōu)選地約65 V左右。預處理混合物的PH可以在從約2. 0到約10. 0，但是優(yōu)選地約3. 0到約7. 0，更優(yōu)選地約4. 0到約6. 0，甚至更優(yōu)選地約4. 0到約5. 0。另外，可調(diào)節(jié)pH以使酶活性最大化并可用添加酶調(diào)節(jié)。來自該測試的測驗結果的結果比較將允許人們修改方法以最適合正被測試的酶。液化/水解或預糖化步驟反應可以進行數(shù)分鐘到數(shù)小時，例如從約1小時到約120 小時，優(yōu)選地從約2小時到約48小時，更優(yōu)選地從約2小時到約M小時，最優(yōu)選地從約2 小時到約6小時。纖維素酶處理可進行數(shù)分鐘到數(shù)小時，例如從約6小時到約120小時，優(yōu)選地約12小時到約72小時，更優(yōu)選地約M小時到約48小時。糖化本發(fā)明提供了從木質(zhì)纖維素材料生產(chǎn)糖的方法，所述方法包括將本發(fā)明的多肽或本發(fā)明的組合物與木質(zhì)纖維素材料接觸。此類方法允許由木質(zhì)纖維素生物質(zhì)生產(chǎn)游離的糖(單體)和/或寡糖。這些方法涉及用本發(fā)明的多肽或組合物將木質(zhì)纖維素生物質(zhì)轉化成游離糖和小寡糖。將復合碳水化合物如木質(zhì)纖維素轉化為糖的方法優(yōu)選地允許轉化成可發(fā)酵的糖。 此類方法可以被稱作“糖化”。因此，本發(fā)明的方法可導致一種或多種己糖和/或戊糖(如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖、鼠李糖、核糖和果糖中的一種或多種)的釋放。因此，本發(fā)明的另外方面包括下述方法，所述方法與其它酶或物理處理(例如溫度和pH) —起利用上述的本發(fā)明的組合物的多肽，將木質(zhì)纖維素植物生物質(zhì)轉化成糖和寡糖。盡管組合物已作為單一混合物被討論，但是認為酶可以先后添加，其中溫度、pH 和其他條件可以被改變，以提高每種個體酶的活性?；蛘?，可以針對酶混合物測定最適PH 和溫度。酶在任何適當?shù)臈l件下與底物反應。例如，酶可以在約25°C，約30°C，約35°C， 約 37°C，約 40°C，約 45°C，約 50°C，約 55°C，約 60°C，約 65°C，約 70°C，約 75°C，約 80°C，約 85°C，約90°C或更高溫度下孵育。也就是說，它們可以在從約20°C到約95°C下，例如在低到中等離子強度的緩沖液中和/或從低到中性PH下孵育?！爸械入x子強度”表示對任何單個離子組分而言，緩沖液具有約200毫摩爾(mM)或更少的離子濃度。pH可在從約pH 2. 5，約 pH3. Oj^JpH 3. 5，約 pH 4.0，約 pH 4. 5，約 pH 5，約 pH 5. 5，約 pH 6，約 pH 6. 5，約 pH 7，約 pH 7. 5 J^JpH 8. 0，到約pH 8. 5的范圍內(nèi)。通常，pH范圍會從約pH 3. 0到約pH 7。對于乙醇生產(chǎn)，可使用酸性培養(yǎng)基，例如PH = 4，而對于沼氣生產(chǎn)，可使用中性pH，例如pH = 7。 在這些條件下對酶組合物孵育導致大量的糖從木質(zhì)纖維素中釋放或釋出。大量意指可利用糖的至少 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多。多肽，例如酶可以在微生物、酵母、真菌、細菌或植物中外源產(chǎn)生，然后分離并加入例如木質(zhì)纖維素原料中。或者，酶可以被生產(chǎn)但不分離，并可將粗制細胞群發(fā)酵液或植物材料(如玉米稈)等等加入例如原料中。或者，可以處理粗制細胞群或酶生產(chǎn)培養(yǎng)基或植物材料，以預防進一步的微生物生長(例如通過加熱或添加抗微生物劑)，然后添加至例如原料。這些粗制酶混合物可包含生產(chǎn)酶的生物?；蛘撸缚梢栽谑褂迷?例如玉米稈)對生產(chǎn)酶的生物提供營養(yǎng)的發(fā)酵中生產(chǎn)。通過這種方式，生產(chǎn)酶的植物自身可以充當木質(zhì)纖維素原料，并且被添加進木質(zhì)纖維素原料中。糖的發(fā)酵可發(fā)酵的糖可以被轉化成有用的增值的(value-added)發(fā)酵產(chǎn)物，其非限制性例子包括氨基酸、維生素、藥物、動物飼料補充劑、特種化學品(specialty chemicals)、化學原料、塑料、溶劑、燃料或其他有機聚合物、乳酸和乙醇，包括燃料乙醇。特別地，糖可被用作原料，用于發(fā)酵為化學品、塑料，例如琥珀酸和(生物)燃料(包括乙醇、甲醇、丁醇、合成液體燃料和沼氣)例如，在本發(fā)明的方法中，酶或酶的組合作用于發(fā)揮原料作用的木質(zhì)纖維素底物或植物生物質(zhì)上，從而將所述復合底物轉化成簡單的糖和寡糖，用于生產(chǎn)乙醇或其它有用的發(fā)酵產(chǎn)物。從生物質(zhì)釋放的糖可以被轉化成有用的發(fā)酵產(chǎn)物，例如包括但不限于以下之一 氨基酸、維生素、藥物、動物飼料補充劑、特種化學品、化學原料、塑料和乙醇(包括燃料乙醇)。因此，本發(fā)明提供了制備發(fā)酵產(chǎn)物的方法，所述方法包括a.使用本文所述的方法降解木質(zhì)纖維素；和b.發(fā)酵所得到的材料，從而制備發(fā)酵產(chǎn)物。發(fā)酵可在需氧或厭氧條件下進行。優(yōu)選地，所述方法在微需氧或氧受限的條件下進行。厭氧發(fā)酵方法在本文中被定義為在不存在氧時運行的，或者其中基本不消耗氧， 優(yōu)選地消耗約5或更少、約2. 5或更少或約lmmol/L/h或更少，并且其中有機分子既作為電子供體又作為電子受體的發(fā)酵方法。氧受限的發(fā)酵方法是其中氧消耗受到從氣體到液體的氧轉移限制的方法。氧限制程度由進入氣流的量和組成以及使用的發(fā)酵設備的實際混合/物料轉移性質(zhì)決定。優(yōu)選地，在氧受限條件下進行的方法中，氧消耗速率至少約為5. 5，更優(yōu)選地至少約為6，和甚至更優(yōu)選地至少約為7mmol/L/h。 用于制備發(fā)酵產(chǎn)物的方法可任選地包括發(fā)酵產(chǎn)物的回收。SSF還可以以同時糖化和發(fā)酵(SSF)模式實行發(fā)酵和糖化。該模式的一個優(yōu)勢是對酶促水解的糖抑制減小(對纖維素酶的糖抑制由Caminal B&B Vol XXVII Pp U82-1290描述)ο發(fā)酵產(chǎn)物
可以根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的發(fā)酵產(chǎn)物包括氨基酸、維生素、藥物、動物飼料補充劑、特種化學品、化學原料、塑料、溶劑、燃料或其他有機聚合物、乳酸和乙醇，包括燃料乙醇(術語“乙醇”被理解為包括乙醇或乙醇和水的混合物)?？梢酝ㄟ^本發(fā)明的方法生產(chǎn)的特定的增值產(chǎn)物包括但不限于生物燃料(包括乙醇和丁醇和沼氣)；乳酸；塑料；特種化學品；有機酸，包括檸檬酸、琥珀酸、富馬酸、衣康酸和馬來酸；3-羥基-丙酸，丙烯酸；乙酸；1，3-丙烷-二醇；乙烯；丙三醇；溶劑；動物飼料補充劑；藥物，如β -內(nèi)酰胺抗生素或頭孢菌素；維生素；氨基酸，如賴氨酸，甲硫氨酸，色氨酸，蘇氨酸和天冬氨酸；工業(yè)酶，如蛋白酶，纖維素酶，淀粉酶，葡聚糖酶，乳糖酶，脂肪酶，裂合酶，氧化還原酶，轉移酶或木聚糖酶；和化學原料。沼氣本發(fā)明還提供了本文描述的多肽或組合物在制備沼氣的方法中的用途。沼氣典型地指在無氧時通過有機物質(zhì)(例如含有非淀粉碳水化合物的材料)的生物分解產(chǎn)生的氣體。沼氣源自生物源的材料并且是生物燃料的一種類型。一種類型的沼氣通過可生物降解材料(例如生物質(zhì)、有機肥、青貯飼料或污水、市政廢物和能源作物)的厭氧消化或發(fā)酵產(chǎn)生的。該類型的沼氣主要包含甲烷和二氧化碳。氣態(tài)甲烷可用氧消耗或氧化?？諝夂?21%的氧。這種能量釋放允許沼氣被用作燃料。就任何加熱目的(例如烹飪)而言，沼氣可在任何國家被用作低成本燃料。其也可被用在現(xiàn)代廢物處理設施中，其中其可被用來運行任何類型的熱力發(fā)動機，以產(chǎn)生機械動力或電力。微生物沼氣生產(chǎn)中的第一個步驟在于酶促降解聚合物和復合底物(例如非淀粉碳水化合物)。因而，本發(fā)明提供了制備沼氣的方法，其中包含非淀粉碳水化合物的底物與本發(fā)明的多肽或組合物接觸，由此產(chǎn)生可通過生物例如微生物轉化為沼氣的可發(fā)酵材料。 在這種方法中，本發(fā)明的多肽可通過表達這種多肽的生物例如微生物提供。酶在食品中的用途本發(fā)明的多肽和組合物可被用在處理植物材料以降解或改性植物或真菌材料的細胞壁的纖維素或半纖維素或果膠物質(zhì)組分的方法中。此方法可被用在食品的制備中。因而，本發(fā)明提供了制備食品的方法，所述方法包括在食品的制備期間摻入本發(fā)明的多肽或組合物。本發(fā)明還提供了處理植物材料的方法，所述方法包括使植物材料與本發(fā)明的多肽或組合物接觸，以降解或改性(植物)材料中的纖維素。優(yōu)選地，植物材料是植物漿或植物提取物(例如汁液)。本發(fā)明還提供了降低植物提取物的粘度、澄清度和/或過濾性的方法，所述方法包括使植物提取物與有效量的本發(fā)明的多肽或組合物接觸，來降解植物提取物中含有的纖維素或半纖維素或果膠物質(zhì)。植物和含有纖維素/半纖維素/果膠物質(zhì)的材料(包括植物漿、植物的部分或植物提取物)。在本發(fā)明的上下文中，來自植物材料的提取物是可通過提取(機械和/或化學)、處理或通過其他分離技術從植物材料得到的任何物質(zhì)。提取物可以是汁液、花蜜、基質(zhì)(base)或由其制成的濃縮物。植物材料可包括或得自蔬菜，例如胡蘿卜、芹菜、洋蔥、豆莢或豆科植物(大豆、黃豆、豌豆)或水果，例如梨果或結籽水果(蘋果、梨、榲梓等等)、葡萄、番茄、柑橘(桔子、檸檬、萊蒙、柑桔)、瓜、梅干、櫻桃、黑醋栗、紅醋栗、木莓、草莓、蔓越橘、鳳梨和其他熱帶水果、樹木和樹木的部分(例如花粉，來自松樹)或谷物(燕麥、大麥、 小麥、玉蜀黍、稻谷)。(將被水解的)材料可以是農(nóng)業(yè)殘余物，例如甜菜漿、玉米芯、麥秸、 (磨碎的)果殼或可再利用的材料(例如(廢)紙)。本發(fā)明的多肽可因而被用來處理植物材料(包括植物漿和植物提取物)。它們也可被用來處理液體或固體食物或可食用食物成分，或可被用在咖啡、植物油、淀粉的提取中或在食品中作為增稠劑。典型地，本發(fā)明的多肽被用作如上所述的組合物/酶制劑。組合物通常會被添加至可通過例如機械處理(例如壓碎或研磨)植物材料獲得的植物漿。組合物與植物的孵育典型地進行從10分鐘至5小時，例如30分鐘至2小時，優(yōu)選地大約1小時的時間。處理溫度優(yōu)選地從大約10°C至約55°C，例如從約15°C至約25°C，最佳約20°C，并且對于每噸待處理的材料，可使用從約IOg至約300g，優(yōu)選地從約30g至約70g，最佳約50g的酶。所有使用的酶或其組合物可被連續(xù)或同時添加至植物漿。取決于酶制劑的組成， 植物材料可首先被浸軟(例如直到成泥狀物)或被液化。使用本發(fā)明的多肽，加工參數(shù)，例如提取產(chǎn)率、提取物的粘度和/或提取物的品質(zhì)可被改進。或者或除了上述之外，本發(fā)明的多肽可被添加至從壓制或液化的植物漿中獲得的原汁。原汁的處理將以在劑量、溫度和保持時間方面與植物漿的相似方式進行。再次，可包括其他酶，例如以上討論的那些。典型的孵育條件是如以上段落所述的條件。—旦原汁已與本發(fā)明的多肽孵育，汁液然后被離心或(超)濾以產(chǎn)生最終產(chǎn)物。用本發(fā)明的多肽處理之后，(終)產(chǎn)物可在使本發(fā)明的多肽部分或全部失活的情況下被熱處理，例如在約100°c下被熱處理約1分鐘至1小時的時間。含有本發(fā)明的多肽的組合物也可在水果或蔬菜泥的制備期間使用。本發(fā)明的多肽也可被用在釀造、制酒、蒸餾或烘焙中。其因而可用在醇飲料例如葡萄酒和啤酒的制備中。例如，其可改進例如啤酒、麥芽汁(例如含有大麥和/或高梁麥芽) 或葡萄酒的過濾性或澄清度。而且，本發(fā)明的多肽或組合物可被用于處理啤酒糟(即來自含有大麥或發(fā)芽大麥或其他谷物的啤酒麥芽汁生產(chǎn)的殘余物)，以改進殘余物用于例如動物飼料的利用。多肽可幫助從發(fā)酵液或培養(yǎng)基中去除溶解的有機物質(zhì)，例如其中來自有機來源的蒸餾廢物被生物轉化為微生物生物質(zhì)。本發(fā)明的多肽可改進葡萄糖漿的過濾性和/或降低葡萄糖漿的粘度，所述葡萄糖漿例如來自通過液化(例如用α-淀粉酶)產(chǎn)生的谷物。在烘焙中，多肽可改進面團結構，改進其粘性或軟性(suppleness)，改進團塊體積和/或碎屑結構或賦予更好的質(zhì)地特征，例如斷裂、延伸(shread)或碎屑品質(zhì)。本發(fā)明因而涉及制備面團或基于谷物的食品的方法，所述方法包括將本發(fā)明的多肽或組合物摻進面團。相對于其中未被摻進多肽的面團或基于谷物的食品，這可改進面團或從面團獲得的基于谷物的食品的一種或多種特性。根據(jù)本發(fā)明的基于谷物的食品的制備還可包括在本領域中已知的步驟，例如煮、 干燥、煎炸、蒸或烘焙獲得的面團。從煮的面團制得的產(chǎn)物有例如煮過的面條、水餃；從煎炸的面團制得的產(chǎn)物有例如油炸圈餅、帶餡煎餅、炒面；從蒸的面團制得的產(chǎn)物如饅頭和蒸面；從干燥的面團制得的產(chǎn)物子是意大利面條和干面條；從烘焙的面團制得的產(chǎn)品的例子有面包、曲奇、蛋糕。
術語“經(jīng)改進的特性”在本文中定義為面團和/或得自面團的制品(尤其是基于谷物的食品)的任何特性，所述特性相對于其中未摻入根據(jù)本發(fā)明的多肽的面團或產(chǎn)物而言被根據(jù)本發(fā)明的多肽的作用改進。經(jīng)改進的特性可包括但不限于提高的面團強度、提高的面團彈性、提高的面團穩(wěn)定性、改進的面團可加工性、改進的面團抗醒發(fā)性(proofing resistence)、降低的面團粘性、改進的面團延展性、提高的基于谷物的食品的體積、降低的基于谷物的食品起泡、改進的烘焙制品的碎屑結構、改進的基于谷物的食品的柔軟性、改進的基于谷物的食品的風味、改進的基于谷物的食品的抗走味性。涉及意大利面和面條類型的基于谷物的制品的改進的特性有例如改進的堅實性、降低的粘性、改進的粘著性和降低的烹飪損失。通過將添加和不添加本發(fā)明的多肽而制備的面團和/或基于谷物的食品進行比較，來測定經(jīng)改進的特性。感觀品質(zhì)可以使用烘焙工業(yè)中明確的流程來評價，并可包括例如使用一組受過訓練的口味測試人員(a panel of trained taste-testers)。術語“面團”在本文中被定義為谷物面粉和其它成分的混合物，所述混合物足夠堅硬到被揉捏或滾動。谷物的例子是小麥、黑麥、玉米、玉蜀黍、大麥、稻谷、米(groats)、蕎麥和燕麥。小麥在此和下文中意圖包括小麥屬的所有已知的物種，例如冬小麥、硬粒小麥和/ 或野小麥。合適的其他成分的例子是根據(jù)本發(fā)明的多肽、其他酶、化學添加劑和/或加工助劑。面團可以是新鮮的、冷凍的、預先制備的(pre-pared)或預先烘焙的。從上述成分制備面團是本領域熟知的，并且所述制備包括將所述成分和加工助劑混合和一個或多個制模步驟和任選地發(fā)酵步驟。冷凍面團的制備由KuIp和Lorenz在Frozen and Refrigerated Doughs and B atters 中^1 ^術語“基于谷物的食品”在本文中被定義為從面團制備的、具有軟或脆特征的任何制品?？捎欣赜杀景l(fā)明生產(chǎn)的基于谷物的食品(無論是白色、淺色或深色類型)的例子為面包(尤其是白面包、全麥面包或裸麥面包)，典型地以棍或卷(loaves or rolls) 的形式，法棍面包，意大利面，面條，油炸圈餅，硬面包圈、蛋糕、皮塔(pita)面包，玉米餅 (tortillas)，墨西哥玉米卷，餅(cakes)，煎餅，餅干，曲奇，餡餅皮(pie crust)，饅頭和脆面包(crisp bread)等等。術語“烘焙制品”在本文中被定義為通過烘焙面團制備的任何基于谷物的食品。非淀粉多糖(NSP)可提高食糜粘度，其反過來可減小養(yǎng)分利用性和動物生產(chǎn)性能 (animal performance)。使用本發(fā)明的多肽可改進在動物消化食糜期間的磷利用以及礦物離子和多肽利用。將特殊養(yǎng)分添加至飼料改進動物消化并因而降低飼料花費。目前正使用許多飼料添加劑并且新概念飼料被連續(xù)開發(fā)。使用特異性酶(比如非淀粉碳水化合物降解酶)可分解纖維，釋放能量并且當纖維素分解時多肽的更好的可達性，增加了多肽的可消化性。以這種方式，飼料花費可降下來并且飼料中的多肽水平可被降低。非淀粉多糖(NSPs)還存在于植物來源的幾乎所有飼料成分中。NSI^s被不良地利用并且當溶解時可對消化產(chǎn)生副作用。外源酶可有助于更好地利用這些NSI^s并因而降低任何抗營養(yǎng)作用。就該目的而言，本發(fā)明的非淀粉碳水化合物降解酶可被用在家禽和更小范圍地豬和其他物種的基于谷物的膳食中。本發(fā)明的非淀粉碳水化合物降解多肽/酶(包含本發(fā)明的多肽/酶的組合物)可被用在洗滌劑工業(yè)中，例如用于來自衣物的基于碳水化合物的污跡的去除。洗滌劑組合物可包含本發(fā)明的多肽/酶和另外一種或多種纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、蛋白酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、淀粉酶或糖酶。酶在洗滌劑組合物中的用途包含本發(fā)明的多肽或組合物的洗滌劑組合物可以是任何方便的形式例如糊、膠體、粉末或液體。液體洗滌劑可以是水性的，其典型地含有高至約70%的水和從約0至約 30%的有機溶劑或非水性材料。此類洗滌劑組合物可例如被配制成包括手洗或機洗衣物洗滌劑，包括適于污臟織物預處理的衣物洗滌添加劑組合物和漂洗添加織物柔軟劑組合物，或被配制成在一般家庭硬表面清潔操作中的洗滌劑組合物，或被配制用于針對手洗或機洗洗碗機操作。通常，酶的特性應與所選擇的洗滌劑(例如pH-最適度、與其他酶促和/或非酶促成分的相容性等等)相容并且酶應以有效量存在。洗滌劑組合物可包含表面活性劑(例如離子或非離子型表面活性劑)、洗滌增效助劑或絡合劑、一種或多種聚合物、漂白體系(例如H2O2源)或酶穩(wěn)定劑。洗滌劑組合物還可包含任何其他常規(guī)洗滌劑成分，例如調(diào)節(jié)劑(包括粘土)、泡沫促進劑、泡沫抑制劑 (sud suppressor) ^^1:4^0^^ ^ (soil-suspending agent) >^O (soil redeposition agent)、染料、殺菌劑、熒光增白劑、助水溶物、晦暗抑制劑或香料。酶在造紙和制漿處理中的用途本發(fā)明的多肽或組合物可被用在造紙和制漿工業(yè)中，尤其用在漂白處理中以增強漂白漿的亮度，借以降低在漂白階段中使用的氯的量，并增加再循環(huán)造紙工藝中的漿的游離度(Eriksson,K. E. L,Wood Science and Technology 24(1990) :79-101 ；Paice, et al., Biotechnol. and Bioeng. 32 (1988) :235-239 and Pommier et al. ,Tappi Journal (1989) 187-191)。而且，本發(fā)明的多肽或組合物可被用于處理木質(zhì)纖維素漿，以改進其可漂白性。 因而可降低獲得令人滿意的漿的漂白需要的氯的量。本發(fā)明的多肽或組合物可用在降低含纖維素的織物變粗糙的速率或降低含纖維素的織物的粗糙度的方法中，所述方法包括用如上所述的多肽或組合物處理含纖維素的織物。本發(fā)明還涉及提供有色的含纖維素的織物的顏色凈化(colour clarification)的方法，所述方法包括用如上所述的多肽或組合物處理有色的含纖維素的織物；并涉及在有色的含纖維素的織物的色彩中提供局部變化的方法，所述方法包括用如上所述的多肽或組合物處理有色的含纖維素的織物。本發(fā)明的方法可在洗滌期間通過處理含纖維素的織物來進行。但是，如果需要的話，織物的處理也可在浸泡或漂洗期間進行或簡單地通過將如上所述的多肽或組合物添加至織物浸于其中或?qū)⒁谄渲械乃衼磉M行。其他的酶用途此外，本發(fā)明的多肽或組合物還可被用在抗菌配方以及藥物產(chǎn)品例如潤喉片、牙膏和漱口水中。下述實施例闡釋本發(fā)明 實施例一般材料和方法
菌株本發(fā)明的Talaromyces emersonii 菌株得自 ATCC16479，以前是 Penicillium geosmithia emersonii。T. emersonii ATCC 16479 的其他命名是 CBS393. 64、IF031232 和 IMI116815。DNA 過稈除非另外指出，標準DNA過程如別處(Sambrook et al.，1989，Molecular cloning a laboratory manual, 2nd Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor，New York)所述的進行。限制性酶來自 Invitrogen 或 New England Biolabs。培養(yǎng)基和溶液=馬鈐薯右旋糖掠脂，PDA,(Fluka, Cat. No. 70139)
馬鈴薯提取物4 g/1 右旋糖20 g/1 Bacto 瓊脂15 g/1
pH5.4
水調(diào)至一升
滅菌在120°C下20分鐘Talaromyces原月旨培養(yǎng)基
鹽部分no.315 g
纖維素(3%)30 g
Bacto蛋白胨7.5 g
谷物面粉15 g
KH2PO45 g
CaCl2.2aqI g Bacto 瓊脂20 g
pH6.0
水調(diào)至一升
滅菌在120°C下20分鐘鹽部分組成鹽部分符合W098/37179，表I的公開。與該表的組成的差異是CaCl2. 2aq I. Og/ I、KClI. 8g/L、檸檬酸 Iaq O. 45g/L(螯合劑)。搖瓶培養(yǎng)基Talaromyces 培養(yǎng)基 I
權利要求
1.生產(chǎn)Talaromyces轉化體的方法，其包括下述步驟(a)提供一種或多種表達盒，其能生產(chǎn)一種或多種感興趣的多肽并且其包含編碼纖維素酶、半纖維素酶和/或果膠酶的感興趣的一個或多個多核苷酸和至少一個用于所述多核苷酸的表達的啟動子；(b)提供包含在(a)的所述表達盒中的選擇標記物或包含在專用選擇標記物多核苷酸中的選擇標記物；(c)用來自(a)的所述一種或多種表達盒和/或來自(b)的所述選擇標記物轉染 Talaromyces 宿主；(d)選擇含有編碼纖維素酶、半纖維素酶和/或果膠酶的一個或多個多核苷酸的 Talaromyces轉化體；以及(e)分離所述Talaromyces轉化體。
2.根據(jù)權利要求1能獲得的Talaromyces轉化體，其包含一個或多個重組基因，能在無纖維素酶誘導物時于葡萄糖培養(yǎng)基中生產(chǎn)纖維素酶，其在16倍或更多倍稀釋的上清液或發(fā)酵液中具有2WSU/ml或更大的纖維素酶活性。
3.根據(jù)權利要求2的Talaromyces轉化體，其在16倍或更多倍稀釋的上清液或發(fā)酵液中具有3WSU/ml或更大，或5WSU/ml或更大的纖維素酶活性。
4.根據(jù)權利要求2或3的任一項的Talaromyces轉化體，其具有50WBCU/ml或更大的內(nèi)切葡聚糖酶活性。
5.根據(jù)權利要求2至4的任一項的Talaromyces轉化體，其攜帶能表達纖維素酶的兩種或更多種基因。
6.根據(jù)權利要求5的Talaromyces轉化體，其中所述能表達纖維素酶的兩種或更多種基因包括纖維素二糖水解酶基因、內(nèi)切葡聚糖酶基因和/或β -葡萄糖苷酶基因。
7.根據(jù)權利要求6的Talaromyces轉化體，其中所述纖維二糖水解酶基因是纖維素二糖水解酶I和/或纖維素二糖水解酶II。
8.根據(jù)權利要求2至7的任一項的Talaromyces轉化體，其中一個或多個基因被整合進所述Talaromyces轉化體的基因組中。
9.根據(jù)權利要求2至8的任一項的Talaromyces轉化體，其中所述Talaromyces轉化體是無標記物的。
10.生產(chǎn)包含一種或多種纖維素酶、半纖維素酶和/或果膠酶的多肽組合物的方法，所述方法包括下述步驟(a)提供一種或多種表達盒，其能生產(chǎn)一種或多種感興趣的多肽并且其包含編碼纖維素酶、半纖維素酶和/或果膠酶的感興趣的一個或多個多核苷酸和用于所述多核苷酸的表達的至少一個啟動子；(b)提供包含在(a)的所述表達盒中的選擇標記物或包含在專用選擇標記物多核苷酸中的選擇標記物；(c)用來自(a)的所述一種或多種表達盒和/或來自(b)的所述選擇標記物轉染 Talaromyces 宿主；(d)選擇含有編碼纖維素酶、半纖維素酶和/或果膠酶的一個或多個多核苷酸的 Talaromyces 轉化體；(e)通過在其中基本上無纖維素酶誘導物的合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)Talaromyces轉化體來生產(chǎn)多肽組合物；以及(f)任選地回收所述多肽組合物；
11.根據(jù)權利要求10的方法，其中在步驟(a)中，提供了兩種或更多種表達盒、三種或更多種表達盒或四種或更多種表達盒。
12.根據(jù)權利要求10或11的方法，其中所述啟動子選自由下述組成的組任選地之前有上游激活序列的A.niger glaA啟動子和A. nidulans gpd啟動子或其功能部分。
13.根據(jù)權利要求12的方法，其中所述啟動子是任選地之前有上游激活序列的 A. nigerglaA的啟動子或其功能部分。
14.根據(jù)權利要求10至13的任一項的方法，其中所述選擇標記基因選自由下述組成的組amdS (乙酰胺酶)、hygB (潮霉素磷酸轉移酶)和ble (腐草霉素抗性)，優(yōu)選是ble。
15.多肽組合物，其由權利要求2至9的任一項的Talaromyces轉化體生產(chǎn)和/或通過根據(jù)權利要求10至14的任一項的方法生產(chǎn)。
16.根據(jù)權利要求15的多肽組合物，其包含CBHI, CBH II、EG和/或BG。
17.根據(jù)權利要求16的多肽組合物，其包含CBHI, CBH II、EG和BG。
18.根據(jù)權利要求15至17的任一項的多肽組合物，其包含選自下述組的多肽，所述組包括過氧化氫酶、漆酶、酚氧化酶、氧化酶、氧化還原酶、木聚糖酶、過氧化物酶、脂肪酶、水解酶、酯酶、角質(zhì)酶、蛋白酶和其他蛋白水解多肽、氨肽酶、羧肽酶、植酸酶、裂合酶和其他果膠分解酶、淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、甘露糖苷酶、異構酶、轉化酶、轉移酶、核糖核酸酶、幾丁質(zhì)酶、聚糖酶和脫氧核糖核酸酶。
19.用于糖化木質(zhì)纖維素材料的方法，其中將任選地經(jīng)預處理的木質(zhì)纖維素材料與根據(jù)權利要求2至9的任一項的Talaromyces轉化體、根據(jù)權利要求15至18的任一項的多肽組合物接觸，并且其中產(chǎn)生了一種或多種糖。
20.用于制備發(fā)酵產(chǎn)物的方法，所述發(fā)酵產(chǎn)物包括氨基酸、維生素、藥物、動物飼料補充劑、特種化學品、化學原料、塑料、溶劑、燃料或其他有機聚合物、乳酸、乙醇、燃料乙醇或化學品、塑料例如琥珀酸、和(生物)燃料，所述(生物)燃料包括乙醇、甲醇、丁醇、合成液體燃料和沼氣，其中用發(fā)酵微生物，優(yōu)選酵母，發(fā)酵根據(jù)權利要求19的方法生產(chǎn)的一種或多種糖，以生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物。
21.用于生產(chǎn)Talaromyces多次轉化體的方法，其中在根據(jù)權利要求1的第一次轉化中，在第一次轉化的步驟(e)中分離的經(jīng)分離的Talaromyces轉化體被用作Talaromyces 宿主，并根據(jù)權利要求1在第二次轉化中被轉化，并且在第二次轉化的步驟(e)中，分離 Talaromyces多次轉化體。
22.根據(jù)權利要求21的方法，其中在所述第一次轉化中，使用了與所述第二次轉化不同的選擇標記物。
23.Talaromyces轉化體，其具有如通過APEX測定的38%或更大、40%或更大、和/或 45%或更大的總纖維素酶含量。
全文摘要
本發(fā)明涉及Talaromyces轉化體，其包含一個或多個重組基因，能在無纖維素酶誘導物時于葡萄糖培養(yǎng)基中生產(chǎn)纖維素酶，在16倍或更多倍稀釋的上清液或發(fā)酵液中具有2WSU/ml或更多的纖維素酶活性。
文檔編號C12N1/14GK102597213SQ201080050276
公開日2012年7月18日 申請日期2010年11月4日 優(yōu)先權日2009年11月4日
發(fā)明者埃里克·皮特·洛斯, 布倫達·沃恩克, 瑪格特·伊麗莎白·弗蘭克希斯·休恩瓦爾德-貝格曼斯, 科尼利斯·瑪麗亞·雅各布斯·沙吉, 羅波圖斯·安東尼厄斯·戴維爾德, 阿德里安努斯·維爾赫穆斯·赫曼努斯·沃勒布里吉特, 馬可·亞歷山大·伯格·范德 申請人:帝斯曼知識產(chǎn)權資產(chǎn)管理有限公司