專利名稱：細胞及其獲得方法
細胞及其獲得方法本發(fā)明涉及重編程體細胞、重編程方法、體細胞的重編程因子以及此類因子和細胞的用途。通過表達4種轉錄因子(Yamanaka因子)即0ct4、Sox2、c_Myc以及Klf4(l_3),可以將小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)重編程為多能狀態(tài)。之后應用同一組基因或其變體重編程小鼠(4-6)、大鼠和人(7-9)中的多種譜系的體細胞。將原代體細胞重編程為誘導性多能干細胞(iPS)是復雜且逐漸的過程，伴隨著遺傳和表觀遺傳變化(37，51)。因此，4種Yamanaka因子的轉基因表達所產(chǎn)生的小鼠iPS克隆經(jīng)常是異源的，為全部或部分重編程細胞的混合物(52)。iPS細胞自我更新和其他重要的胚胎干細胞(ES)樣特性有時需要外源因子的持續(xù)表達(51，11)。因此，在無強的選擇方案來鑒定完全重編程細胞的情況下，已經(jīng)證明，通過簡單連續(xù)傳代和亞克隆難以建立種系有活性的(germline-competent)小鼠iPS細胞系。盡管利用基于Yamanaka因子的各種平臺，產(chǎn)生了人類iPS細胞，但是可以合理地預測，這些細胞的性質(zhì)可能也是異源的。因為缺少可靠的報道基因，如連接于內(nèi)源多能基因 的熒光標記或藥物選擇標記，使得難以從利用可用的重編程因子所產(chǎn)生的人類iPS細胞異源群體中分離完全重編程細胞。目前來源于胚胎的人類ES細胞，在其形態(tài)、基因表達陌生以及集落生成上不同于小鼠ES細胞(53，44)。最明顯的差別是，小鼠ES細胞的多能性取決于Jak/Stat3途徑通過白血病抑制因子(LIF)的激活(54)或Mek/Erk途徑的抑制(40)。相比之下，人類ES細胞不響應LIF，并且僅能通過FGF和活化素維持(44)。最近利用人類ES細胞培養(yǎng)條件衍生了小鼠外胚層干細胞(EpiSC) (55，56)，這表明人類ES細胞在許多方面與小鼠EpiSC類似，而不是與真正的多能小鼠ES細胞類似。目前缺少小鼠ES細胞的真正的人類配對物，這使得難以證明操縱ES細胞多能性的常見范例是否在其他哺乳動物種類中起作用。此外，從應用的觀點看，等同于小鼠ES細胞的人類多能干細胞系的有效性，會使得將小鼠ES細胞自我更新、分化以及基因操作的知識財富直接應用于人類ES細胞成為現(xiàn)實。發(fā)明概述一方面，本發(fā)明提供了通過體細胞的核重編程制備誘導性多能干細胞的方法，所述方法包括使體細胞與核重編程因子[NRF]接觸的步驟，所述因子包括下述中的一種或多種(i)視黃酸受體(RAR/RXR)家族成員的基因產(chǎn)物，或其激動劑或拮抗劑；(ii)Lrhl家族成員的基因產(chǎn)物；或其激動劑；(iii)視黃酸或參與視黃酸的合成或代謝的基因產(chǎn)物；或其激動劑或拮抗劑；(iv)參與視黃酸家族成員轉運的基因產(chǎn)物；(V)編碼上文(i)-(iv)中任一基因產(chǎn)物的多核苷酸(polynucleic acid)。一方面，所述方法包括使用上文的(i)和(ii)兩者。一方面，本發(fā)明涉及將體細胞重編程為誘導多能細胞的方法，包括(a)使體細胞與NRF接觸，NRF包含或為下述中的ー種或多種(i)視黃酸受體(RAR/RXR)家族成員的基因產(chǎn)物，或其激動劑；
(ii)Lrhl家族成員的基因產(chǎn)物，或其激動劑；(iii)視黃酸或參與視黃酸家族成員的合成或代謝的基因產(chǎn)物；或其激動劑或拮抗劑；(iv)參與視黃酸家族成員轉運的基因產(chǎn)物；(V)編碼上文(i)-(iv)中任一基因產(chǎn)物的多核苷酸；以及(b)任選地檢查或確定所述體細胞是否已經(jīng)被重編程，以及(c)使步驟(a)的產(chǎn)物與RA或RAR/RXR家族成員的拮抗劑接觸，或消除與NRF的接觸，從而維持多能性。 一方面，本發(fā)明提供了 NRF，其包含下述中的ー種或多種(i)視黃酸受體(RAR/RXR)家族成員的基因產(chǎn)物，或其激動劑或拮抗劑；(ii)Lrhl家族成員的基因產(chǎn)物；或其拮抗劑；(iii)Lrhl家族成員的基因產(chǎn)物；(iv)視黃酸或參與視黃酸合的成或代謝的基因產(chǎn)物；或其激動劑或拮抗劑；(V)參與視黃酸家族成員轉運的基因產(chǎn)物；(vi)編碼上文(i)-(iv)中任一基因產(chǎn)物的多核苷酸；一方面，NRF用于將體細胞重編程為誘導多能細胞。一方面，本發(fā)明提供了包含或編碼來自RAR家族成員和Lrhl家族成員的基因產(chǎn)物的 NRF。另ー方面，本發(fā)明提供了包含或編碼來自RAR家族成員、Lrhl家族成員、Oct家族成員以及Myc家族成員的基因產(chǎn)物的NRF。在另一方面，本發(fā)明提供了包含或編碼來自RAR家族成員、Lrhl家族成員、Oct家族成員、Klf家族成員、Myc家族成員以及Sox家族成員的基因產(chǎn)物的NRF。在本發(fā)明的另一方面，所述NRF包含ー個或多個載體，所述載體包含編碼本文所述的ー種或多種核重編程因子的ー個核酸/多個核酸。在另一方面，本發(fā)明提供了諸如人類iPS的誘導性多能干細胞，其通過本文所述方法獲得或通過本文所述方法可以獲得。在另一方面，本發(fā)明涉及誘導性人類多能細胞，其特征為下述至少之一 表達一種或多種多能性標志物,如0ct4、Nanog、Rexl ； 不依賴FGF生長； 在傳代后保持正常核型，所述核型利用光譜核型分析進行測量； 當注射到小鼠中時，能形成畸胎瘤；· 0ct4、Nanog、Rexl中的一個或多個的啟動子區(qū)脫甲基化； 細胞可以解離為能形成次生集落的活單細胞； 在M15+hLIF培養(yǎng)基和/或2i+LIF培養(yǎng)基中增殖仍然在另一方面，本發(fā)明提供了誘導性多能干細胞(iPS)，其中所述iPS包含外源DNA序列。在另一方面，本發(fā)明提供了通過分化本發(fā)明的誘導性多能干細胞而衍生的體細胞。
在另一方面，本發(fā)明提供了這樣的細胞，其基因組已經(jīng)被修飾為允許調(diào)節(jié)編碼視黃酸受體(RAR/RXR)家族成員的核酸或Lrhl家族成員的基因產(chǎn)物的表達。在另一方面，本發(fā)明提供了組織、器官或非人類動物，其衍生自或包含通過分化本發(fā)明的誘導性多能干細胞而衍生的體細胞。在另一方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含與藥物可接受賦形劑組合的本文所述的核重編程因子、載體、細胞或組織。在另一方面，本發(fā)明提供了本文所述的核重編程因子或iPS細胞或衍生自iPS細胞的體細胞或組織或器官在醫(yī)藥中的用途和本文所述的核重編程因子或iPS細胞或衍生自iPS細胞的體細胞或組織或器官在制備用于治療有需要的患者的藥物中的用途。在另一方面，本發(fā)明提供了預防或治療有需要的患者的疾病的方法，所述方法包括將藥學可接受量的本發(fā)明的核重編程因子、iPS細胞、體細胞、組織或器官之一送遞給所述患者。


圖I.表示重編程中的RA信號傳導(signaling)。A.利用piggyBac(PB)轉座的重編程策略的示意圖。B-C.表達Rara或Rarg以及4種Yamanaka因子顯著促進重編程,而通過表達Rara-DN抑制RA信號傳導阻斷重編程。D.重編程短暫需要RA信號傳導。E-F.重編程細胞中多能性基因的表達(E)和在Nanog和Rexl基因座處的甲DNA基化(F)。G. Rarg激動劑⑶437改善iPSC質(zhì)量。圖2. Rarg(R)和Lrh-1 (L)協(xié)同促進重編程。A. Tet-On重編程策略的不意圖。B. 6種因子(TRE-0CKS和TRE-RL)的4天表達足以完全激活內(nèi)源0ct4表達用于獲得不依賴Dox的iPSC。C.轉染后6天的集落圖像。D.共表達Rarg和Lrh-I (RL)而不是單獨的Rarg或Lrh-I改善iPSC質(zhì)量。圖3.不依賴Dox的小鼠iPSC的表征。A.對iPS20_Al細胞免疫染色來檢測0ct4和Nanog0 B.小鼠iPSC、親代MEFs和野生型ES細胞中0ct4、Nanog和Rexl的qRT-PCR。
C.iPSC(iPS20-Al)中0ct4和Nanog的啟動子幾乎完全脫甲基化。D.衍生于iPSC的畸胎瘤含有所有3種胚層的細胞類型。E. iPSC對嵌合體中的種系的貢獻。圖4.在無血清、無飼養(yǎng)細胞的條件下,將MEF重編程為基態(tài)(ground state) iPSC。
A.用 PB-TRE-OCKS (4F)或 PB-TRE-OCKS 加 PB-TRE-RU6F)重編程的 AP+集落的數(shù)量。B.利用qRT-PCR分析iPSC的基因表達。C.用于Nanog和SSEA-1表達的iPSC的免疫染色(6F)。
D.免疫染色所檢測的iPSCs(6F)向代表3種胚層的細胞類型的體外分化。圖5.不依賴Dox的獨特的人類iPSC的產(chǎn)生和表征。A. RAREoct序列在幾種哺乳動物種類中保守。B.利用Tet-On 6因子平臺重編程HDFn細胞。C.典型的人類iPSC集落形態(tài)和AP染色。D.親代HDFn、人類iPSC以及HlhESC細胞中多能性基因的qRT-PCR分析。
E.用于ES細胞表面標志物和多能性因子的人類iPSC的免疫染色。F.人類iPSC的體外分化?？贵w。G.由人類iPSC分化的畸胎瘤。H.通過基因表達(qRT-PCR)所測量的人類iPSC的信號傳導依賴性。I.生長于不同條件下的人類iPSC的基因表達變化。圖6· A.攜帶轉錄因子cDNA的PB轉座子。B. 0ct4-IRES-Puro_Egfp敲入等位基因。C. 0ct4-IRES-Puro-Egfp MEF 細胞和 0ct4-IRES-Puro_Egfp 敲入 ES 細胞的流式細胞術分析。D.在轉染中増加攜帯Rarg的轉座子的量降低OCKS重編程效率。E.在2種嘌呤霉素濃度存活的重編程小鼠細胞的流式細胞術分析。圖7. Rarg和Lrh-I協(xié)同促進重編程。A.攜帶由編碼2A( ロ足病病毒2A自切割肽)的DNA所連接的多重cDNA的PB轉座子。B.典型的iPSC集落。C.轉染10天后iPSC集落的堿性磷酸酶染色.D.用于熒光素酶報道基因測定的DNA構建體圖。圖8.小鼠iPSC多能性的表征。A.免疫染色iPS20_Al細胞以檢測SSEAl和Nanog。B.小鼠iPSC中內(nèi)源多能性基因的強健(robust)表達。C.小鼠iPSC系中外源重編程因子表達的RT-PCR分析。圖9.在無飼養(yǎng)細胞和無血清的條件下MEF的重編程。A.轉染的MEF。B.蘇木素和曙紅使畸胎瘤的石蠟切片染色。圖10.用6因子平臺(CAG啟動子版本)產(chǎn)生獨特的人類iPSC細胞。A.形成于 M15加LIF培養(yǎng)基或2i/LIF培養(yǎng)基中的人類iPSC集落，其與常規(guī)小鼠ES細胞集落相似。
B.免疫染色所檢測的人類iPSC中內(nèi)源多能性蛋白質(zhì)的表達。C. RT-PCR所檢測的人類iPSC中多能性基因的表達。D.在畸胎瘤中人類iPSC向3種胚層細胞類型的分化。E.大量傳代(>20代)后，人類iPSC的正常核型。F.人類iPSC的Y染色體基因分型分析證實人類iPSC的HDFn來源。圖11.利用6因子Tet-On系統(tǒng)(不依賴Dox)所產(chǎn)生的獨特的人類iPSC的表征。
A.人類iPSC中基因表達的RT-PCR分析。B.人類iPSC的SSEA-4、Tra-l_60以及Tra_l_81表達的FACS分析。C.人類iPSC中重編程因子表達的RT-PCR分析表明無外源重編程因子表達。D.在長期體外培養(yǎng)后，人類iPSC具有正常的核型。E.基因捕獲PB轉座子插入HPRT基因座中。圖12. Rarg顯性失活(Dominant-negative)等位基因阻斷ES細胞分化。A.攜帶強CAG啟動子/增強子和ー對剪接受體的PB轉座子的示意圖。B. Rexl-Puro-IRES-Egfp敲入小鼠ES細胞系的圖。C. ES細胞中的遺傳學篩選策略，用于鑒定能阻斷視黃酸所誘導的ES細胞分化的突變體。D.遺傳學篩選中所鑒定的Rarg處的4個獨立突變。E. Rarg或Rara顯性形式的過表達阻斷RA誘導的ES細胞分化。F. Rarg或Rara特異性拮抗劑阻斷RA誘導的ES細胞分化。圖13. RA信號傳導在將小鼠MEF重編程為iPS細胞中發(fā)揮關鍵作用。A.更高質(zhì)量的iPS細胞與在更高濃度的嘌呤霉素存活關聯(lián)。B. Rarg-FL的過表達顯著增加重編程效率。c. iPS細胞培養(yǎng)平板表明Rarg增加重編程效率。細胞用結晶紫染色。D. Rarg-DN的過表達也改善iPS克隆的質(zhì)量，但是降低重編程效率。E. Rarg的劑量影響重編程效率。F. Rarg或Rara特異性激動劑增強重編程效率。G. Rarg特異性激動劑改善iPS細胞的質(zhì)量。圖14. Rarg和Lrhl協(xié)同作用促進重編程。A. Rarg特異性拮抗劑處理可以改善部分重編程iPS克隆的質(zhì)量。B. Lrhl的超表達促進重編程。C.如Puro抗性iPS細胞集落的非常早期表觀所示，6種因子對MEF的快速重編程?？焖賹崿F(xiàn)完全重編程的多能性需要Rarg和Lrhl的表達。E. Rarg和Lrhl表達的劑量對iPS細胞的質(zhì)量非常關鍵。圖15. 6種因子重編程的iPS細胞的高質(zhì)量。A.利用Rarg和Lrhl所產(chǎn)生的小鼠iPS細胞具有ES細胞多能性標志物的強健表達。B. 6因子誘導的小鼠iPS細胞可對畸胎瘤中的所有譜系有貢獻。
圖16.利用6種因子產(chǎn)生高質(zhì)量iPS細胞。A.在M15加hLIF培養(yǎng)基中所產(chǎn)生的人類iPS細胞集落(上幅)。人類iPS細胞集落在在2i加hLIF培養(yǎng)條件下擴增(底幅)。
B.人類iPS細胞表達高水平的0CT4和NANOG。C. RT-PCR分析證實，人類iPS細胞中多能性基因的高水平表達。4-1、4-2、4-3以及4-5是人類iPS細胞。ES :人類ES細胞對照。表表I.含有推斷的RAREoct元件的小鼠基因啟動子的列表。表2.含有推斷的RAREoct元件的人類基因啟動子的列表。表3.CDNA克隆所用的引物。表4. Splinkerette PCR 所用的引物。
表5. RT-PCR和DMR分析所用的引物。表6. Applied Bioscience為小鼠和人類基因的實時RT-PCR預設計的Taqman探針。表7.定制設計的人類QPCR探針。詳細描述在此我們報導了小鼠和人類體細胞的快速和高效的重編程。在小鼠中，將胚胎成纖維細胞(MEF)重編程。根據(jù)形態(tài)和分子生物學標準，所產(chǎn)生的iPS克隆是高度同質(zhì)的。當用同樣的6種因子重編程人類新生兒包皮真皮成纖維細胞(HDFn)時，我們鑒定了人類多能干細胞克隆。這些細胞還可以以單細胞密度在小鼠ES細胞培養(yǎng)條件下亞克隆，并擴增且無任何可識別的染色體異常。我們還證明，可以在這些人類iPS細胞中實現(xiàn)有效轉座，其效率與小鼠ES細胞相當。在一方面，本發(fā)明涉及體細胞的核重編程因子(NRF)。合適的是，NRF能促進由體細胞形成iPS。在一方面，核重編程因子包含視黃酸受體RAR/RXR家族成員(如Rar a、Rar Y、Rar^ ,RXRa、RXR0、RXR γ -在本文中也稱為 Rara、Rarg、Rarb、RXRa、RXRb、RXRg，其在一方面，具有小鼠或人類序列)的基因產(chǎn)物和/或視黃酸和/或Lrhl家族成員(如Lrhl、Sfl，或核受體/nR5a類固醇激素受體家族Ftz-Fl亞家族的其他成員)的基因產(chǎn)物和/或參與視黃酸家族成員轉運的基因產(chǎn)物。提到RAR家族，包括提到RXR家族，除非根據(jù)上下文具有明顯不同。在一方面，核重編程因子包含視黃酸受體RAR家族成員(如Rar a、Rar Y、Rar β )和Lrhl家族成員，例如全長Rarg和Lrhl。在一方面，提到RAR家族成員指RAR。在一方面，核重編程因子包含視黃酸，例如所有反式或RA或9-順式RA，合適的是其濃度為I(T8-K)-iqM,合適的是10_9M。本文提到家族成員和其基因產(chǎn)物，包括編碼所述基因產(chǎn)物的多核苷酸，如RAR家族成員和Lrhl家族成員，包括一物種中相同基因/蛋白質(zhì)家族的成員、不同物種的家族成員和其變體，如具有取代、缺失或添加的蛋白質(zhì)，合適的是，所述成員或其變體在功能上是等同的，因為它們単獨或與其他因子組合能促進由本文所述體細胞形成iPS，這可以合適地通過本申請所述方法評估。這類基因產(chǎn)物包括在氨基酸水平或核苷酸水平與本發(fā)明的NRF序列具有至少70%、優(yōu)選至少80%、90%或95%同源性或相同性的序列，所述序列能單獨或與其他因子組合促進由本文所述的體細胞形成iPS，這可以合適地通過本申請所述的方法評估。優(yōu)選地，RAR家族成員是人類全長野生型Rar Y或Rar α序列。優(yōu)選地,LRHl家族成員是人類全長野生型LRHl序列。在一方面，在本發(fā)明的任何方面提到蛋白質(zhì)或基因產(chǎn)物，指該蛋白質(zhì)或基因產(chǎn)物的人類全長野生型序列。在一方面，由體細胞形成iPS的促進通過0ct4基因表達的激活來評估，例如在ES細胞中所觀察到的水平，或通過具有本文所公開的任何特征的iPS細胞的形成來評估。在一方面，如本文所述，基因產(chǎn)物是具有人類或小鼠序列的蛋白質(zhì)，或是其變體。在NRF組分的上下文中，在本文中提到基因產(chǎn)物并非限于由多核苷酸的表達所制備的蛋白質(zhì)或多肽，而是包括例如可以直接合成的蛋白質(zhì)或其片段。提到基因產(chǎn)物還包括可以由基因產(chǎn)生的其他非蛋白質(zhì)物質(zhì)，例如由DNA向RNA的 轉錄而引起的多核苷酸片段。提到視黃酸受體(RAR/RXR)家族成員的基因產(chǎn)物，包括具有視黃酸受體(RAR/RXR)家族成員的基因產(chǎn)物的ー些活性的RAR/RXR家族成員突變體的基因產(chǎn)物。在一方面，本發(fā)明涉及體細胞的核重編程因子，其包含RAR/RXR家族成員和/或Lrhl家族成員的突變體所編碼的蛋白質(zhì)，所述突變體如蛋白質(zhì)功能降低或廢除的突變體或活性增強的突變體。如上文所討論的，具有親本蛋白質(zhì)的ー些活性的突變體，可以視為該蛋白質(zhì)的變體。在一方面，本發(fā)明涉及體細胞的核重編程因子，其包含RAR家族成員和/或Lrhl家族成員的顯性失活突變體所編碼的蛋白質(zhì)。合適的是，顯性失活突變體蛋白能阻斷視黃酸(RA)、合適地高濃度如I. O μ M的RA所誘導的ES細胞分化。在一方面，核重編程因子包含Rarg或Rara的顯性失活突變體所編碼的蛋白質(zhì)。在一方面，所述蛋白質(zhì)是C末端缺失部分的Rarg蛋白。在一方面，所述突變體是RARG的突變體，其對應于Rarg的最后內(nèi)含子(內(nèi)含子9)的氨基酸序列已經(jīng)缺失。在一方面，所述蛋白質(zhì)是Rara的顯性失活形式，合適地是 Rara-DN。野生型RARG 的序列(SEQ ID No. I)ATGGCCACCAATAAGGAGAGACTCTTTGCGCCCGGTGCCCTGGGGCCTGGATCTGGTTACCCAGGAGCAGGCTTCCCATTCGCCTTCCCAGGTGCACTCAGAGGGTCGCCACCATTTGAGATGCTGAGCCCTAGCTTCCGGGGCCTGGGCCAGCCTGACCTCCCCAAGGAGATGGCTTCTCTCTCGGTGGAGACACAGAGCACCAGCTCGGAGGAGATGGTACCCAGCTCTCCCTCACCCCCACCACCTCCTCGGGTCTATAAGCCATGCTTTGTATGCAATGACAAGTCTTCTGGCTACCACTATGGGGTCAGCTCCTGTGAAGGCTGCAAGGGCTTCTTCAGACGCAGCATTCAGAAAAACATGGTGTATACATGTCACCGTGACAAAAACTGTATCATCAACAAGGTCACCAGAAATCGATGCCAGTACTGCAGGCTACAAAAGTGTTTCGAAGTGGGCATGTCCAAGGAAGCTGTAAGGAACGATCGAAACAAGAAGAAAAAGGAGGTAAAAGAGGAGGGCTCGCCCGACAGCTATGAACTGAGTCCACAGTTAGAGGAACTCATCACCAAGGTCAGCAAAGCCCACCAGGAGACTTTTCCCTCACTCTGCCAGCTGGGCAAGTACACCACGAACTCCAGTGCAGATCACCGGGTGCAGCTGGACCTGGGGCTGTGGGACAAGTTCAGCGAGCTGGCCACCAAATGCATCATCAAGATTGTGGAGTTTGCGAAGCGGCTGCCTGGTTTTACAGGGCTCAGCATTGCCGACCAGATCACGCTGCTCAAGGCTGCTTGTCTGGACATCCTAATGCTGCGGATCTGTACAAGGTATACCCCAGAGCAGGACACTATGACATTCTCGGATGGGCTGACCCTGAACCGAACCCAGATGCACAATGCTGGCTTTGGGCCCCTTACAGACCTCGTCTTTGCCTTTGCCGGGCAGCTGCTGCCCCTGGAGATGGATGACACCGAGACTGGGCTACTTAGTGCTATCTGCCTCATCTGTGGAGACCGAATGGACCTGGAAGAGCCCGAGAAGGTGGACAAGCTGCAGGAGCCCCTGCTGGAAGCCCTGAGGCTCTATGCCCGGCGACGGAGACCCAGCCAACCCTACATGTTCCCAAGGATGCTGATGAAAA
TCACCGACCTCCGGGGCATCAGCACTAAGGGAGCAGAAAGGGCTATAACCCTGAAGATGGAGATTCCAGGCCCGATG
CCACCCCTGATCCGAGAGATGCTGGAGAACCCGGAGATGTTTGAGGACGACTCCTCGAAGCCTGGCCCCCACCCCAA
GGCTTCCAGTGAGGACGAAGCTCCAGGGGGCCAGGGCAAAAGGGGCCAAAGTCCCCAACCTGACCAGGGGCCCTGA突變的Rarg 的序列(SEQ ID No. 2)ATGGCCACCAATAAGGAGAGACTCTTTGCGCCCGGTGCCCTGGGGCCTGGATCTGGTTACCCAGGAGCAGGCTTCCCATTCGCCTTCCCAGGTGCACTCAGAGGGTCGCCACCATTTGAGATGCTGAGCCCTAGCTTCCGGGGCCTGGGCCAGCCTGACCTCCCCAAGGAGATGGCTTCTCTCTCGGTGGAGACACAGAGCACCAGCTCGGAGGAGATGGTACCCAGCTCTCCCTCACCCCCACCACCTCCTCGGGTCTATAAGCCATGCTTTGTATGCAATGACAAGTCTTCTGGCTAC CACTATGGGGTCAGCTCCTGTGAAGGCTGCAAGGGCTTCTTCAGACGCAGCATTCAGAAAAACATGGTGTATACATGTCACCGTGACAAAAACTGTATCATCAACAAGGTCACCAGAAATCGATGCCAGTACTGCAGGCTACAAAAGTGTTTCGAAGTGGGCATGTCCAAGGAAGCTGTAAGGAACGATCGAAACAAGAAGAAAAAGGAGGTAAAAGAGGAGGGCTCGCCCGACAGCTATGAACTGAGTCCACAGTTAGAGGAACTCATCACCAAGGTCAGCAAAGCCCACCAGGAGACTTTTCCCTCACTCTGCCAGCTGGGCAAGTACACCACGAACTCCAGTGCAGATCACCGGGTGCAGCTGGACCTGGGGCTGTGGGACAAGTTCAGCGAGCTGGCCACCAAATGCATCATCAAGATTGTGGAGTTTGCGAAGCGGCTGCCTGGTTTTACAGGGCTCAGCATTGCCGACCAGATCACGCTGCTCAAGGCTGCTTGTCTGGACATCCTAATGCTGCGGATCTGTACAAGGTATACCCCAGAGCAGGACACTATGACATTCTCGGATGGGCTGACCCTGAACCGAACCCAGATGCACAATGCTGGCTTTGGGCCCCTTACAGACCTCGTCTTTGCCTTTGCCGGGCAGCTGCTGCCCCTGGAGATGGATGACACCGAGACTGGGCTACTTAGTGCTATCTGCCTCATCTGTGGAGACCGAATGGACCTGGAAGAGCCCGAGAAGGTGGACAAGCTGCAGGAGCCCCTGCTGGAAGCCCTGAGGCTCTATGCCCGGCGACGGAGACCCAGCCAACCCTACATGTTCCCAAGGATGCTGATGAAAATCACCGACCTCCGGGGCATCAGCACTAAGGGATGATGATGA在一方面，本發(fā)明涉及RAR/RXR的拮抗劑和/或Lrhl家族成員的拮抗劑，以及所述拮抗劑在制備和維持IPS細胞中的用途。一種合適的Rarg拮抗劑是⑶2665。一種合適的Rara拮抗劑是R0-41-5253。在另一方面，所述拮抗劑與DNA甲基化抑制劑如5-氮胞苷和5-氮雜-2’ -脫氧胞苷組合使用。在一方面，重編程因子包含RAR和/或Lrhl家族成員的激動劑，例如Rara的激動齊[J，如AM580，或Rarg的激動劑，其為CD437。在一方面，核重編程因子包含上文所述RAR家族成員、Lrhl家族成員、視黃酸、它們的激動劑和它們的突變體和/或變體中的一種或多種的組合，例如RAR(全長)和Lrhl (全長)家族成員的組合，例如Rarg和Lrhl的組合。合適的是，Rarg和Lrhl的作用是協(xié)同的，因為，例如，如本文所述，對于所獲得的iPS細胞的數(shù)量和/或質(zhì)量，所觀察到其對iPS重編程的作用大于相加。合適的是，通過監(jiān)測本文所述的0ct4表達水平和/或產(chǎn)生具有本文所列的iPS細胞的一種或多種特征的iPS的能力來評估iPS重編程。核重編程因子還可以包括其他附加組分。合適的是，NRF能將體細胞重編程形成iPS細胞，并且合適地頻率比單獨的Yamanaka因子更高。Yamanaka因子公開于EP1970446中，其教導通過援引并入本文。NRF可以包含ー種或多種Yamanaka因子或編碼它們的核酸。在一方面，核重編程因子包含諸如C-MYC的MYC蛋白，或編碼它的核酸。在一方面，核重編程因子包含諸如KLF4的KLF蛋白或編碼它的核酸。在一方面，核重編程因子包含諸如S0X2的SOX基因，或編碼它的核酸。在一方面，核重編程因子包含0ct4或編碼它的核酸。在一方面，核重編程因子包含 C-MYC、KLF-4、0ct4 和 S0X2 或編碼 C-MYC、KLF-4、0ct4 和 S0X2 的核酸。在本文中提到任何基因或蛋白質(zhì)，如C-MYC、0ct4KLF-4和S0X2，包括與上文所述C-MYC.KLF-4.0ct 4和S0X2家族成員享有相同性的基因或蛋白質(zhì)，合適地編碼至少在某種程度上與全長野生型序列具有共同的重編程活性的蛋白質(zhì)。包括在本發(fā)明的NRF中的蛋白質(zhì)包括諸如添加、缺失或取代突變體的變體，所述變體合適地在至少某種程度上與全長野生型序列具有共同的重編程活性。已經(jīng)鑒定了可以取代Yamanaka因子的組分的各種因子。當將本發(fā)明描述為利用ー種或多種Yamanaka因子時,應當理解到,本發(fā)明還考慮了包括Yamanaka因子姆種因子的替換。例如，通過孤兒核受體Nr5a2的過表達,該受體能取代oct4,已經(jīng)報道了不依賴0ct4的重編程。據(jù)報道，另ー孤兒核受體Esrrb能取代Klf4。因此，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的核重編程因子和Nr5a2或Esrrb組合的NRF或包含編碼核重編程因子和Nr5a2或Esrrb的核 酸的NRF。在一方面，核重編程因子包含下述的組合(i)選自下述中任ー種或多種的基因產(chǎn)物或編碼它們的核酸上述RAR/RXR家族成員、Lrhl家族成員、它們的激動劑、它們的拮抗劑、以及它們的突變體和變體，優(yōu)選RAR和Lrhl家族成員、視黃酸以及調(diào)節(jié)RA信號途徑或被RA信號途徑調(diào)節(jié)的因子。(ii)能將多能性賦予給分化的細胞或將成體細胞轉化成多能細胞的因子的基因產(chǎn)物或編碼所述因子的多核苷酸，所述因子優(yōu)選為下述中的ー種或多種0ct家族基因、Klf家族基因、以及Myc家族基因和Sox家族基因，或其功能等同物。在一方面,Klf-4的功能等同物是Esrrb。在一方面,0ct4的功能等同物是Nr5a2。在一方面，NRF包含RAR家族成員、Lrhl家族成員、Oct家族成員和Myc家族成員的基因產(chǎn)物或編碼所述基因產(chǎn)物的一或多種多核苷酸。在一方面，NRF包含RAR家族成員、Lrhl家族成員、KLF-4以及S0X2的基因產(chǎn)物，但不包含C-MYC和Oct 4。優(yōu)選地，在利用這類NRF將人類體細胞重編程為IPS細胞的本發(fā)明方法中，在重編程體細胞的過程中實現(xiàn)KLF-4和S0X2表達，但是所產(chǎn)生的人類IPS細胞系在染色體中不具有KLF-4和/或S0X2插入。在一方面，KLF-4和/或S0X2沒有整合于待重編程的細胞中，例如編碼這類因子的轉座子沒有整合于本發(fā)明的人類iPSC系中。在一方面，NRF包含或編碼0CT4、CMYC, LRHl以及RARG，且在另一方面，不包含其他2種Yamanaka因子中的任何一種因子。在一方面，NRF包括至少Oct家族基因、Klf家族基因和Myc家族基因或它們的基因產(chǎn)物。合適的家族成員包括Oct 3/4、Klf4、c-Myc家族基因和Sox2的基因產(chǎn)物或編碼它們的多核苷酸。在一方面，本發(fā)明的NRF包含或編碼所有4種Yamanaka因子，即Oct家族基因產(chǎn)物、Klf家族基因產(chǎn)物、Myc家族基因產(chǎn)物以及Sox家族基因產(chǎn)物，或這些基因產(chǎn)物的能促進將體細胞重編程為iPS細胞的功能等同物。在一方面，核重編程因子還包含或編碼下述中的ー種或多種
細胞因子，其和Myc家族基因的基因產(chǎn)物一起，或可選地代替Myc家族基因的基因產(chǎn)物。作為更優(yōu)選的實施方案，提供了上文所述的因子，其中所述細胞因子是堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和/或干細胞因子(SCF)。除了 Oct家族基因、Klf家族基因、Myc家族基因以及Sox家族基因中各自的基因產(chǎn)物外的TERT基因的基因產(chǎn)物；除了 Oct家族基因、Klf家族基因、Myc家族基因、Sox家族基因以及TERT基因中各自的基因廣物外，選自下述基因的一種或多種類型的基因的一種或多種基因廣物SV40大 T 抗原、HPV16E6、HPV16E7 以及 Bmil ；一種或多種選自下述的基因的一種或多種基因產(chǎn)物Fbxl5、Nanog、ERas >ECAT15-2, Tcll以及β-連環(huán)蛋白；一種或多種選自下述的基因的ー種或多種基因產(chǎn)物ECATl、Esgl、Dnmt3L 、ECAT8、Gdf3, Soxl5、ECAT15-1、Fthll7、Sall4、RexUUTFU Stella、Stat3 以及 Grb2。優(yōu)選的NRF包含或編碼可合適地送遞到體細胞中并且可以在所述細胞內(nèi)表達的全長 Oct 3/4、Klf4、c-Myc 家族基因和 Sox2、Lrhl 和 Rarg。在一方面，上文所述的NRF還包含或編碼RXR，如RXR α、β或γ。在本發(fā)明的另一方面，NRF包含RA信號途徑的能促進本文所述的體細胞重編程的組分。這類組分可以是RA的下游效應物、RARG或LRHl的上游或下游的調(diào)節(jié)劑或影響RA產(chǎn)生的分子。本申請所公開的測定，允許鑒定所述途徑的合適組分(即能將體細胞重編程從而形成本文所述iPS細胞的那些組分)，并允許確定實現(xiàn)重編程的那些組分的合適濃度。本發(fā)明的NRF還包括內(nèi)源基因或內(nèi)源基因產(chǎn)物的調(diào)節(jié)劑，如RAR/RXR家族成員和Lrhl家族成員的基因或基因產(chǎn)物的調(diào)節(jié)劑。例如，可以增強LRHl和/或RARG的內(nèi)源表達。通過插入或操作驅動表達的啟動子，可以實現(xiàn)宿主基因表達的操作，從而提供必須的增強的重編程效果。這類啟動子可以包括MSCV(逆轉錄病毒)的LTS、CAG以及誘導型啟動子Tet-Οη。這類NRF可以用于本發(fā)明的所有所述方面。作為實例,包含或表達4種Yamanaka因子或其功能等同物和Lrhl的核重編程因子可以與內(nèi)源Rarg表達得到增強或可以通過用細胞外因子處理細胞而得以增強的細胞聯(lián)合使用。這類細胞外因子可以是例如化學制品或環(huán)境條件的變化。因此，本發(fā)明還涉及這樣的細胞，其基因組已經(jīng)得到修飾，從而允許內(nèi)源(RAR/RXR)家族成員和/或Lrhl家族成員的表達響應于細胞外因子而得到增強或受到調(diào)節(jié)。NRF可以與其他化合物或藥物聯(lián)合使用，所述其他化合物或藥物可以是促進重編程或實際上改善NRF的送遞效率的化合物或藥物。NRF可以包含本文所述的基因產(chǎn)物如蛋白質(zhì)，為單獨表達的或融合蛋白形式。在一方面，NRF可以包含或組成為編碼上文所述的重編程因子的組分的多核苷酸，所述多核苷酸可以送遞到體細胞。因此，可以理解的是，重編程因子可以包含蛋白質(zhì)成分(composition),或經(jīng)設計允許合適的蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)表達的核酸成分,或實際上多核苷酸和蛋白質(zhì)的組合。合成的或純化的化學品也可以是本發(fā)明NRF的一部分。例如，如果使用蛋白質(zhì)的激動劑或拮抗劑，則如果合適，NRF可以包含經(jīng)設計而激活或抑制蛋白質(zhì)功能的化學品。如果使用多核苷酸，且如果多個基因產(chǎn)物形成NRF，則這些可以編碼于相同或不同的多核苷酸片段上。例如，一方面，Rarg和Lrhl基因產(chǎn)物可以編于一 DNA構建體上，且I、
2、3或4種Yamanaka因子可以編碼于單獨的多核苷酸片段上。編碼NRF的蛋白質(zhì)組分的多核苷酸可以是裸DNA或與送遞試劑復合的DNA或采用適合送遞到體細胞中的諸如質(zhì)?；蜣D座子或病毒載體的載體形式。為了完整，在這個意義上，本發(fā)明還涉及編碼所述NRF的組分的多核苷酸，則本發(fā)明還涉及編碼所述NRF組分的的變體的多核苷酸，所述組分能単獨或組合地促進由體細胞形成iPS。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多核苷酸和載體的細胞，但不限于體細胞，并包括例如適合產(chǎn)生用于轉化或轉染的核酸的諸如細菌細胞的細胞。NRF的各種組分可以單獨或組合地在調(diào)節(jié)系統(tǒng)的控制下表達。在一方面，一種或多 種組分，例如4種Yamanaka因子(或其等同物)的任何組分,Rarg或Lrhl,單獨或組合,可以在Tci-Ollii系統(tǒng)(Clonetech)的控制下表達。因此,在一方面,控制例如Lrhl或Rarg表達的啟動子，受到啟動子內(nèi)響應四環(huán)素的存在或不存在的元件的控制。本發(fā)明的重編程因子，可以與其他重編程技術如低氧聯(lián)合使用。作為實例，本發(fā)明的NRF可以包含下述(作為蛋白質(zhì)，或編碼所述蛋白質(zhì)的DNA或RNA，或多核苷酸和蛋白質(zhì)的混合物)# Rarg 和 Lrhl# Rarg、Lrhl、0ct4 和 cMyc· Rarg、Lrhl、Sox2 和 Klf4# Rarg、Lrhl、0ct4、cMyc、Sox2 和 Klf4.為了避免懷疑，NRF可以包含單組分蛋白質(zhì)，或包含編碼單個蛋白質(zhì)的核酸，或編碼本文所述的單個激動劑或拮抗劑。諸如Rarg的某些蛋白質(zhì)的表達水平，影響重編程效率。因此，本發(fā)明還涉及確定合適的NRF重編程水平的方法，所述方法包括改變NRF或其組分的濃度，并直接或例如通過監(jiān)測0ct4的表達并選擇用于重編程的NRF的合適濃度來監(jiān)測iPS細胞的產(chǎn)生。本發(fā)明還包括用于本文所公開的重編程的方法，其中用上文所評估的適當量的NRF來實現(xiàn)重編程。本文所公開的各種元件的合適濃度包括例如Ro-41_5253RARa拮抗劑I μ Μ、CD2665RARg 拮抗劑 I μ M、AM580RARa 激動劑 10nM、CD437RARg 激動劑 ΙΟΟηΜ、約 1Χ1(Γ9Μ 的所有的反式RA和9-順式RA。本發(fā)明的NRF可以包含載體，諸如質(zhì)粒、活病毒載體或轉座子，載體具有編碼本文所公開的NRF組分。特別是，載體可以是包含編碼本文所述核重編程因子組分的核酸的載體。本發(fā)明的載體通常適合將編碼NRF的組分的核酸送遞到體細胞中，并且還可以含有允許或促進所述核酸所編碼的蛋白質(zhì)表達的必需序列。載體可以表達來自染色體外基因座的NRF的組分，或可以被設計為整合到染色體中，并從染色體內(nèi)表達。諸如PiggyBac的轉座子可以適合將核酸送遞到體細胞中的用途，并且還可以適合將外源DNA送遞到本發(fā)明的iPS細胞中的用途。本發(fā)明還涉及通過體細胞的核重編程制備誘導性多能干細胞的方法，所述方法包括使本文所述的核重編程因子與體細胞接觸的步驟。所述方法可以任選地包括例如通過選擇或篩選具有本文所述特性的細胞而選擇或篩選iPS細胞的另ー步驟。使NRF與體細胞接觸可以以多種方式發(fā)生。例如，可以將核重編程因子添加于體細胞的培養(yǎng)物或將編碼核重編程因子的組分的載體引入體細胞。載體例如可以是質(zhì)?；蜣D座子或病毒載體。如果NRF包含蛋白質(zhì)，則合適的是，將NRF暴露于培養(yǎng)的體細胞，例如持續(xù)3、4、5、
6、7、8、9 或 10 天。在一方面，不超過 8、9、10、11、12、13、14 或 15 天。體細胞可以是任何合適的細胞，且待編程的體細胞的類型并無特別限制。例如，可以使用成熟的體細胞或祖細胞以及胚胎期的體細胞。當誘導性多能干細胞用于疾病的治療 性治療時，使用分離自待治療的患者的體細胞是合適的。例如，可以使用與疾病有關的體細胞、參與疾病的治療性治療的體細胞等。體細胞可以是任何合適的哺乳動物細胞，如，作為實例，人類、小鼠、大鼠、豬、綿羊或牛。在一方面，一旦體細胞被重編程，則與所述體細胞接觸的外源重編程因子(也稱為外源因子或外源NRFs)的表達被關閉。這可以通過使用諸如Tet-On的誘導型啟動子實現(xiàn)，所述啟動子通過從培養(yǎng)基中移除Dox而使得待關閉的外源重編程因子表達。合適的是，在使體細胞與NRF接觸約4天后關閉外源重編程因子的表達，在該階段已經(jīng)將體細胞重編程并足以能轉化為iPS細胞而無需來自外源重編程因子的其他輸入。合適的是，在用NRF處理細胞后的10天內(nèi)，如在3、4、5、6、7、8或9天內(nèi)，并且合適的是，在處理2天后，鑒定并選擇iPS細胞，例如，這可以通過本文所述的Oct 4表達來評估，。根據(jù)本發(fā)明的方法，用于選擇出現(xiàn)于培養(yǎng)基中的誘導性多能干細胞的方法并無特別限制，且合適的是，可以使用任何熟知的方式，例如利用藥物抗性作為指數(shù)，可以利用藥物抗性基因等作為標志物基因來分離誘導性多能干細胞。含有未分化狀態(tài)和多能性的ES細胞的各種培養(yǎng)基以及不能維持這類特性的各種培養(yǎng)基在本領域中是已知的，且利用合適培養(yǎng)基的組合可以有效分離誘導性多能干細胞。本領域技術人員利用廣泛應用于ES細胞的證實方式可以容易地證實分離的誘導性多能干細胞的分化和増殖能力。在另一方面，本發(fā)明涉及維持多能性的合適量的RA激動劑或拮抗劑(優(yōu)選RA拮抗劑)在任何細胞系(如人類或小鼠的任何細胞系)的ES細胞或iPS細胞培養(yǎng)基中的用途。本發(fā)明還涉及包含RA激動劑或拮抗劑的細胞培養(yǎng)基。一方面，本發(fā)明提供了通過短暫加強RA信號傳導將細胞重編程為誘導性多能細胞的方法。在一方面，加強RA信號傳導可以包括使體細胞與下述中的一種或種接觸i視黃酸受體(RAR/RXR)家族成員的基因產(chǎn)物或，該基因產(chǎn)物的激動劑；ii Lrhl家族成員的基因產(chǎn)物；或該基因產(chǎn)物的激動劑；iii視黃酸或參與視黃酸家族成員的合成或代謝的基因產(chǎn)物；或該基因產(chǎn)物的激動劑；iv參與視黃酸家族成員轉運的基因產(chǎn)物；V編碼(i)-(iv)中任一的多核苷酸。合適的是，將RA信號傳導加強3、4、5、6、7或8天。在一方面,不超過8天。
本領域技術人員可以容易地確定基因產(chǎn)物的合適劑量，從而優(yōu)化iPS產(chǎn)生。諸如上文所列家族成員的諸如蛋白質(zhì)的基因產(chǎn)物或其片段或變體可以直接添加于細胞，或可以例如通過插入表達期望的基因產(chǎn)物的表達載體在所操作的細胞內(nèi)表達，或可以通過啟動子插入或操作而操作宿主基因表達。因此，本發(fā)明還涉及體細胞，其中一種或多種下述基因產(chǎn)物的表達水平已經(jīng)通過宿主細胞基因組的轉染或基因操作(例如通過靶向插入事件)而得到修飾i視黃酸受體(RAR/RXR)家族成員的基因產(chǎn)物，或該基因產(chǎn)物的激動劑；ii Lrhl家族成員的基因產(chǎn)物，或該基因產(chǎn)物的激動劑；iii參與視黃酸家族成員的合成或代謝的基因產(chǎn)物；或該基因產(chǎn)物的激動劑；iv參與視黃酸家族成員轉運的基因產(chǎn)物。 本發(fā)明還涉及通過本文所述方法獲得的或可獲得的誘導性多能干細胞。iPS可以來自任何物種，但是合適的是，獲得自作為初始材料的小鼠或人體細胞。體細胞可以是任何合適的細胞，例如成纖維細胞。特別是本發(fā)明涉及通過本文所述方法獲得的或可獲得的誘導性人類多能干細胞。本發(fā)明合適地具有下述特性中的ー種或多種iPS細胞合適地是未分化的多能細胞。多能性可以利用下述方式評估，例如檢測諸如0ct4、Nanog、Rexl的一種或多種多能性標志物的表達,或使0ct4、Nanog、Rexl中的一種或多種的啟動子區(qū)脫甲基化。在本申請的語境中，Oct 4的表達表示與報道ES細胞系(其中IRES-Puro-Egfp盒靶向0ct4基因座)中的表達水平相當?shù)谋磉_,如下文實施例所述和圖2a和圖7所示。這些報道ES細胞對2. O μ g/ml的嘌呤霉素是抗性的。合適的是，iPS細胞可以解離成能在適當?shù)呐囵B(yǎng)基中進行細胞分裂的活單細胞。iPS細胞可以合適地生長于M15+hLIF培養(yǎng)基(對于600ml M15, 500或504ml (82%)GIBC0 敲除 D-MEM(Invitrogen,目錄號:10829018) ,90ml (15%)胎牛血清(所測試的ES細胞)、6ml (1%)青霉素-鏈霉素-谷氨酰胺(100X)、液體(Invitrogen,目錄號10378-016),4. 3ul β-巰基こ醇(Sigma,目錄號M 7522) LIF (IXlO6 單位)中。iPS細胞可以合適地生長于2i+LIF培養(yǎng)基中。(2i+LIF培養(yǎng)基是2i補充了 lu/mL人重組LIF的2i培養(yǎng)基。2i培養(yǎng)基是補充了 IuM PD0325901和3 μ MCHIR99021的Ν2Β27。Ν2Β27培養(yǎng)基是DMEM/F12和Neurobasal培養(yǎng)基的I: I的混合物，DMEM/F12補充了修飾的Ν2(胰島素25 μ g/mL、apo_轉鐵蛋白100 μ g/mL、黃體酮6ng/mL、腐胺16 μ g/mL、亞硒酸鈉30nM、牛血清白蛋白組分 V 50 μ g/mL), Neurobasal 培養(yǎng)基(Neurobasal medium)補充了B27。DMEM/F12、Neurobasal 培養(yǎng)基以及 B27 均來自 Gibco)。本發(fā)明的iPS細胞合適地能在合適的細胞培養(yǎng)條件下分化成體細胞。合適的是，本發(fā)明的iPS細胞可以用于在胚泡注射后產(chǎn)生嵌合體，從而證明種系傳遞。當注射到小鼠中吋，iPS細胞合適地能形成畸胎瘤。在一方面，iPS細胞生長合適地不依賴人類ES細胞通常所需的FGF?？梢詫⒃鷌PS細胞合適地解離成單細胞，隨后所述單細胞在諸如M15+LIF的合適培養(yǎng)基中能形成次級集落和穩(wěn)定的細胞系。
本發(fā)明的iPS細胞合適地在形態(tài)上不同于在相同的條件下僅利用4種Yamanaka因子oct4、cmyc、sox2和Klf4制備的那些細胞。在一方面，iPS在預失活的狀態(tài)下包含2個X染色體。小鼠雌性基態(tài)ES細胞中的2個X染色體是預失活的，而小鼠EpiSC已經(jīng)經(jīng)歷了 X失活。用6F) Yamanaka因子LRHl和RARG)所產(chǎn)生的雌性iPSC具有2個活性X染色體。iPS細胞的基因組完整性可以利用光譜核型分析證實。即使在體外培養(yǎng)后，細胞仍然保持正常的核型，這一事實表示遺傳穩(wěn)定性/基因組完整性。合適的是，在傳代后(例如在至少2、3、4、5、6、7、8、9或10、15或20代后)，iPS細胞具有正常的核型。因此，在一方面，本發(fā)明涉及特征為下述至少之一的誘導性人類多能細胞 表達一種或多種多能性標志物，如0ct4、Nanog、Rexl等； 不依賴FGF而生長； 在傳代后保持正常的核型，所述核型利用光譜核型分析進行測量； 當注射到小鼠中時能形成畸胎瘤；· 0ct4、Nanog、Rexl中的一種或多種的啟動子區(qū)脫甲基化； 細胞可以解離成能形成次級集落的活單細胞； 在M15+hLIF培養(yǎng)基和/或2i+LIF培養(yǎng)基中增值； 外源重編程因子(例如，LRHU Rarg、0ct4、Sox2、Klf4以及c_Myc中的ー種或多種或其等同物)表達不存在或不顯著；在一方面，本發(fā)明的iPS細胞不表達外源重編程因子。如說明書到處所討論的，這可以利用諸如Tet-On的誘導型啟動子來實現(xiàn)，Tet-On允許通過從培養(yǎng)基中除去Dox而關閉外源重編程因子的表達。這還可以通過以下方式實現(xiàn)防止外源重編程因子整合到iPS細胞的染色體中或從基因組中除去任何整合的外源重編程因子，從而使得iPS細胞不含任何外源重編程因子。在一些情況下，用諸如Tet-On的啟動子關閉外源重編程因子的表達，可以允許可通過RT-PCR檢測但在生物學上無關緊要的外源因子的ー些表達。在一方面，本發(fā)明的人類iPS細胞在FGF培養(yǎng)基中生長不好并且不保持多能性。在一方面，iPS產(chǎn)生可以通過構建含有本文所述的oct4-IRES-puro_egfp敲入的體細胞來評估。含有所述構建體的細胞被視為哺乳動物(如小鼠或人類)iPS細胞，其合適地對濃度為2ug/ml或更高的嘌呤霉素具有抗性，且優(yōu)選地還是GFP陽性的，這可以合適地通過流式細胞術檢測。在另一方面，本發(fā)明涉及通過分化本文所述的誘導性多能干細胞而衍生的體細胞，以及涉及包含通過分化本文所述誘導性多能干細胞而衍生的一個或多個體細胞的組織、器官或非人類動物。利用本領域技術人員已知的各種因子、化合物或因子和化合物的組合，可以在體外實現(xiàn)分化?？赏ㄟ^分化本發(fā)明的iPS細胞而獲得的細胞(例如心肌細胞、胰島素產(chǎn)生細胞、ネ申經(jīng)細胞等)潛在地特別有用，這是因為它們可以用于多種疾病的干細胞移植療法，所述疾病例如心功能不全、胰島素依賴性糖尿病、帕金森氏病、癌癥以及脊髓損傷，由此可以避免移植后有關使用人類胚胎和排斥的倫理問題。由本文所公開的iPS體外/離體產(chǎn)生的細胞、組織以及器官，在評價諸如藥物的化合物的功能或毒性方面是有價值的。因此，本發(fā)明還涉及iPS細胞和由此類iPS細胞衍生的組織、器官以及非人類動物在分析化合物或醫(yī)藥治療的效果中的用途。人類iPS細胞可以用于與感染性物質(zhì)有關的高通量篩選讀取。一方面，遺傳學修飾的或遺傳學突變的(包括純合突變體)(主要是喪失功能突變)人類iPS細胞或由iPS細胞分化的體細胞可以被病原體感染，從而鑒定抑制或增強感染的因子。本發(fā)明還提供了利用誘導通過上述方法所獲得的誘導性多能干細胞分化而獲得的各種細胞，評估化合物、藥物、毒物等的生物功能或毒性的方法。本發(fā)明還涉及藥物組合物，其包含本文所述的核重編程因子或細胞或組織以及藥物可接受賦形劑。合適的賦形劑尤其包括，藥物可接受緩沖液、載體和水。在一方面，本發(fā)明的組織或器官或動物并非衍生于人類iPS細胞。在可選的方法，所述組織或器官衍生于人類iPS細胞。在一方面，本發(fā)明不延伸至人類胚胎或成體，但可以延伸至人類器官或組織或在胚胎狀態(tài)確定前衍生自單個iPS細胞的人類細胞群。 在一方面，iPS細胞是單個人類細胞。本發(fā)明的iPS細胞的基因組例如通過轉座子進行合適的遺傳操作。我們已經(jīng)證明，可以用高效轉座到染色體中的轉座子轉染人類iPS細胞。因此本發(fā)明涉及對iPS細胞進行遺傳修飾的方法，所述方法包括將外源多核苷酸序列送遞到宿主染色體中，合適的是，送遞轉座子或基因捕獲構建體或基因靶向構建體。然而，可以將任何合適的構建體送遞到本發(fā)明的iPS細胞中。在一方面，本發(fā)明的iPS細胞易于進行同源重組和/或靶向，從而合適地允許校正遺傳突變，并易于潛在地在患者細胞中引入新的有利遺傳變化。本發(fā)明還涉及iPS細胞，其基因組包含外源DNA序列。本發(fā)明還涉及醫(yī)藥治療方法以及本發(fā)明在醫(yī)藥中的用途。本文公開的iPS細胞或由其產(chǎn)生的體細胞可以在治療中用作藥物。此外，由人類體細胞產(chǎn)生患者特異性人類iPS系的能力使得校正iPS細胞中患者特異性遺傳異常并產(chǎn)生用于基因療法的無突變細胞成為可能。由本文所述iPS產(chǎn)生的組織或器官也可以用于醫(yī)藥中。NRF也可以用作藥物，其中它們被送遞且在體內(nèi)直接發(fā)揮作用，以及它們在產(chǎn)生iPS中的用途。因此，本發(fā)明涉及合適地如本文所述的核重編程因子或iPS細胞或由其衍生的細胞、組織或器官在醫(yī)藥中的用途。本發(fā)明還涉及治療有需要的患者的方法，所述方法包括合適地如本文所述，送遞藥物可接受量的重編程因子或iPS細胞或由其衍生的細胞，或送遞由本文所述的iPS細胞衍生的組織或器官。本發(fā)明還涉及合適地如本文所述的核重編程因子或iPS細胞或由其衍生的細胞在制備用于治療有需要的患者的藥物中的用途。如果體細胞分離自身體并且重編程為iPS細胞，則合適的是，所述細胞來自意圖得到治療的患者。本發(fā)明還涉及促進分化的方法，其利用本發(fā)明的細胞或NRF，例如，產(chǎn)生起始iPS細胞或細胞群，由所述iPS細胞或細胞群產(chǎn)生分化的細胞。一方面，RAR家族成員如Rarg、Rara的激動劑或拮抗劑或LRHl的激動劑或拮抗劑可以用于促進患者的細胞分化。本發(fā)明的可選方法涉及促進細胞的分化而不是重編程。如本文所公開的，全長Rarg和Rara的過表達增強RA所誘導的分化。本發(fā)明因此還涉及改善細胞的分化能力和/或生長能力的方法，所述方法包括使體細胞與如諸如Rarg或Rara的全長RAR并聯(lián)合RA以適合引發(fā)分化的濃度和持續(xù)時間進行接觸。任何合適的靶細胞都可以用于本發(fā)明中。用于通過本發(fā)明的NRF治療的合適的細胞包括肝細胞、胃細胞、皮膚細胞以及單核細胞。在一方面，用于治療的靶細胞表達LRHl/RARG，或具有低水平的本文所述的C0UP-TFI/II和其他負效應物，或兩者。本發(fā)明還涉及例如COUP-TFI、COUP-TFII, GCNF和G9a以及為多能基因的調(diào)節(jié)劑并與RA受體和LRHl家族成員相互作用的其他因子的miRNA和siRNA，所述miRNA和siRNA可以改善iPS細胞質(zhì)量和產(chǎn)生效率。本發(fā)明還涉及利用野生型或突變形式的C0UP-TFI、COUP-TFII, GCNF和G9a以及多能基因的其他調(diào)節(jié)劑改善iPS細胞質(zhì)量和產(chǎn)生效率。本發(fā)明一方面涉及能増加iPS細胞的數(shù)量和/或質(zhì)量的某些蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)的組合，例如RARct、Rarg和Lrhl。在本文中提到蛋白質(zhì)或多肽應當認為包括所述蛋白質(zhì)或多肽的能引發(fā)相同的或基本上相似的生物活性的功能等同物。相似的活性可以是，刺 激iPS細胞產(chǎn)生和/或iPS質(zhì)量的能力，這可以合適地利用本文所公開的方法評估。作為非限制性實例，已知全長RARa增強iPS產(chǎn)生，該蛋白質(zhì)的功能等同物也增強iPS產(chǎn)生，合適地以利用RARa所觀察到的水平的至少20、30、40、50%或更多增強iPS產(chǎn)生。功能等同物可以包括來自同一物種或不同物種的蛋白質(zhì)家族的其他成員，或諸如取代、添加或缺失突變體的蛋白質(zhì)變體。同樣，在本發(fā)明涉及例如編碼本文所公開的蛋白質(zhì)或多肽或其功能等同物的多核苷酸方面，本發(fā)明涉及編碼所述序列的任何多核苷酸，例如天然存在的序列或所述天然存在的序列的簡并等同物。本發(fā)明包括這樣的多核苷酸，其一條鏈與編碼與本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽在功能上等同的蛋白質(zhì)或多肽的多核苷酸合適地在嚴格性雜交條件下雜交。嚴格性條件可以包括例如將約45° C的6XNaCl/檸檬酸鈉(SSC)應用于雜交步驟，隨后50° C下用2XSSC洗滌，或例如，可選地于42° C下5XSSC、20mM NaP04pH6. 8、50%甲酰胺下雜交并于42° C、0. 2XSSC中洗滌。本領域技術人員理解，基于待雜交的序列的長度和GC核苷酸堿基含量，需要依據(jù)經(jīng)驗改變這些條件，并且存在用于確定此類改變的公式(參閱例如bambrook et al, Molecular Cloning:A Laboratory Manual , Second Edition, pages9.47-9. 51, Cold Spring Harbor, N. Y. : Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))。應當理解到，以說明而非限制本發(fā)明的方式顯示了本文所述的具體實施方案。在不偏離本發(fā)明范圍的情況下，本發(fā)明的主要特征可以用于各種實施方案。本領域技術人員利用僅僅常規(guī)研究會意識到或能查明本文所述具體規(guī)程的許多等同規(guī)程。這類等同規(guī)程視為位于本發(fā)明的范圍內(nèi)，并為權利要求涵蓋。說明書所提到的所有出版物和專利申請表示本發(fā)明所述領域技術人員的技術水平。將所有出版物和專利申請通過援引并入本文，其并入的程度如同特別和単獨地表示將每ー単獨的出版物或專利申請通過援引并入。當與權利要求和/或說明書中的術語“包含”共同使用時，詞語〃a( —)〃或"an( —)〃的使用可以表示〃 一 〃，但是還與“一或多”、“至少一”和“一或多于一”的涵義一致。在權利要求中使用術語“或”用來表示"和/或〃，除非清楚地指出僅僅指可選項或可選項相互排斥，盡管所公開的內(nèi)容支持僅指可選項和“和/或”的定義。在本申請中，術語"約"用來表示，值包括裝置、用來確定值的方法的誤差的固有變動，或存在于研究主題中的變動。
如本說明書和權利要求書所用，措詞〃包含(comprising) 〃(和包含的任何形式，如〃包含(comprise) 〃和〃包含(comprises) 〃)、〃具有(having) 〃 (和具有的任何形式，如〃具有(have) 〃和〃具有(has) 〃)、〃包括(including) 〃 (和包括的任何形式，如〃包括(includes) 〃和〃包括(include) 〃)或〃含有(containing) 〃 (和含有的任何形式,如〃含有(contains)〃和〃含有(contain)")是包括在內(nèi)的或開放式的，并且不排除其他未提及的要素或方法步驟。在一方面，這類開放式的術語還包含其范圍內(nèi)的限制或封閉式定義，例如“基本上由......組成(consisting essentially of)”或“由......組成(consisting of)，，。本文所用術語〃或其組合(or combinations thereof)"指該術語之前的所列項目的所有排列和組合。例如，〃A、B、C或其組合意圖包括下述至少之一 A、B、C、AB、AC、BC或ABC,如果順序在具體環(huán)境中重要，還有BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。以該實例繼續(xù)，清楚地包括含有ー個或多個項目或術語的重復，如BB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA,CABABB等。技術人員應當理解，通常不以任何組合限制項目或術語的數(shù)目，除非根據(jù)上下文顯而易見。根據(jù)本發(fā)明公開的內(nèi)容，在無需過度實驗的情況下，可以制備并實施本文所公開和請求保護的所有組合物和/或方法。盡管已經(jīng)根據(jù)優(yōu)選的實施方案描述了本發(fā)明的組合 物和方法，但是對本領域技術人員顯而易見的是，在不偏離本發(fā)明的概念、實質(zhì)和范圍的情況下，可以改變本文所述的組合物和/或方法和步驟或步驟順序。所有此類替代和修飾對本領域技術人員是顯而易見的，并視為位于所附權利要求所限定的本發(fā)明的實質(zhì)、范圍和概念內(nèi)。通過援弓I將本文提到的所有文獻并入，至可準許的最充分程度。除非根據(jù)本申請的上下文顯而易見，否則本公開內(nèi)容的任何要素清楚地考慮了與本公開內(nèi)容的任何其他要素的組合。參考下述實施例，進ー步描述本發(fā)明，但并非限制本發(fā)明。實施例I表達視黃酸受體Y (RARG)和肝受體同系物I (LRH-I)以及4種Yamanaka因子將小鼠和人類體細胞重編程為基態(tài)iPSC。摘要干細胞具有自我更新的能力和分化成不同細胞類型的潛力?？梢酝ㄟ^表達4種轉錄因子將體細胞重編程為誘導性多能干細胞(iPSCs)，但是機制仍然不明。在此我們報導了，調(diào)節(jié)視黃酸(RA)信號傳導強烈促進重編程。此外，Rarg(視黃酸受體Y)和Lrh-I(肝受體同系物I)與4種因子的共表達，導致將小鼠胚胎成纖維細胞(MEFs)在化學限定2i培養(yǎng)基中直接快速重編程為基態(tài)或天然iPSC。RA信號傳導與RARG和LRH-I在重編程中的關鍵功能在進化上是保守的，這是因為因子的這種組合將人類成纖維細胞重編程為iPSC，其在生長特性、基因表達、信號傳導依賴性以及對遺傳修飾的感受性方面與天然小鼠ES細胞相似。可以通過表達4種Yamanaka因子即0ct4、Sox2、c_Myc和Klf4,將小鼠胚胎成纖維細胞(MEFs)重編程為iPSC(l-3)。這些因子也能重編程小鼠(4-6)和人類(7_9)中的各種體細胞譜系的細胞。已經(jīng)描述了最初重編程方案的許多改善，其包括替換0ct4(10)、使用化學化合物(11-14)、調(diào)節(jié)諸如Wnt信號傳導的信號轉導途徑(15)、擾亂諸如p53的細胞周期調(diào)節(jié)劑(16，17)以及增強小鼠iPSC的種系能力(18)。重要的是，通過在四倍體互補測定中產(chǎn)生足月成體小鼠，小鼠iPSC已經(jīng)通過最嚴格的多能性測試(19-21)。盡管在iPSC領域有了巨大進展，但是仍然存在技術挑戰(zhàn)，并且有關重編程機制知之甚少。例如，在小鼠中，重編程MEF花費2-3周，且僅少量重編程細胞是真正的iPSC(22，23)。在人類中，由原代細胞重編程的iPSC與常規(guī)人類ES細胞相似，其被認為具有更多的小鼠Epi干細胞(EpiStemcell)特征(24)。結果重編程需要RA信號傳導在脊椎動物發(fā)育過程中，視黃酸信號傳導具有復雜和多效性功能(25)。延長對高濃度RA的暴露誘導小鼠胚胎干(ES)細胞和胚胎性癌(EC)細胞的分化。然而，生化研究表明，在存在低濃度的RA的情況下，RA受體(RARs)能通過結合RAREoct的RAR = RXR異源ニ聚體正調(diào)節(jié)0ct4表達(28，29)，RAREoct是位于0ct4基因座啟動子中的復合的RA響應元 件(26-28)。此外，高水平的異源ニ聚體有效地從結合RAREoct競爭掉諸如COUP-TF的阻遏物(28)。為了研究RA信號傳導在重編程中的作用，我們將0ct4、Sox2、Klf4、cMyc、Rara以及Rarg的cDNA克隆到PB-MSCV載體中，其中cDNA的表達受MSCV LTR控制(圖6A)。盡管外源c-Myc并非重編程必須的，但是省略它會降低重編程效率并且延遲該過程(23，30)。將個體PB-MSCV-cDNA與PB轉座酶質(zhì)粒共轉染到MEF中(圖1A)。PB轉座促進PB轉座子有效整合到基因組中，從而確保cDNA的穩(wěn)定表達(31)。ES細胞的多能性需要適當水平的0ct4(Pou5fl)表達(32)，且已知0ct4的激活是重編程中的關鍵事件(3)。為了監(jiān)測重編程中內(nèi)源0ct4基因組的激活并允許公正地評估iPSC質(zhì)量，我們制備0ct4報道小鼠系，其中將IRES-Puro-GFP盒靶向0ct4基因座的3’ UTR(圖6B)。靶向的ES細胞對2. O μ g/ml嘌呤霉素(Puro)選擇具有抗性。這些細胞在熒光顯微鏡下并非可見的綠色，但是可以通過流式細胞術區(qū)分(圖6C)。將Puio-GFP盒插入0ct4基因座，看起來不影響ES細胞多能性，這是因為種系有活性的嵌合體來源于這些ES細胞。因此將來自0ct4報道小鼠的MEF用于所有MEF重編程實驗中，因此，可通過iPSC中的Puro抗性或GFP表達，方便地監(jiān)測重編程和iPSC質(zhì)量。由ES細胞樣細胞組成的集落在轉染后3三周開始出現(xiàn)，且截至到第30天，Rara和Rarg的表達分別使AP+ES細胞樣集落的數(shù)量増加一和ニ個數(shù)量級(圖1B-C)。相比之下，在大多數(shù)實驗中，表達Rara顯性失活(DN)形式(33)完全阻斷重編程(圖1B)，并且少數(shù)生長中的集落不能擴增成穩(wěn)定的系。因此，這些結果表明RA信號傳導在將MEF重編程為iPSC中的關鍵作用。接下來，我們利用RA的對Rarg具有特異性的合成激動劑CD437 (34)檢查了 RA信號傳導在重編程中的特異性和短暫需要。以推薦的濃度向培養(yǎng)基添加CD437達4或8天大幅增加將MEF重編程為iPSC(圖1D)。然而，轉染后用⑶437處理MEF超過8天(圖1D)，或轉染增加量的PB-MSCV-Rarg質(zhì)粒DNA，降低了重編程效率(圖6D)，這反映了 RA信號傳導在重編程中的時間依賴方式和劑量依賴性方式。內(nèi)源0ct4的表達，在4種Yamanaka因子重編程的iPSC中是不穩(wěn)定的(11)。我們還發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)iPSC樣集落(PB轉染后第30天)，無論是由4種因子単獨重編程還是由4種因子加Rarg重編程的，僅存活于I. O μ g/mlPuro選擇，且GFP表達不可檢測(圖6E)，這表明在這些細胞中0ct4表達水平低。進ー步的分析證實了它們的部分重編程狀態(tài)低水平的內(nèi)源多能性基因表達(圖1E)，在Nanog和Rexl啟動子的差異甲基化的區(qū)域(DMR)中，保留了大量DNA甲基化(圖1F)。另ー方面，獲得了小量這樣的集落其對2. O μ g/ml Pirn)具有抗性，且在多能性基因表達、Nanog和Rexl啟動子中的脫甲基化以及GFP表達方面與ES細胞相似(圖IE-F和圖6E)。令人驚訝的是，通過⑶437 (1-4天)處理所獲得的大多數(shù)集落表達GFP (圖1G)并且存活于2. O μ g/ml Puix)選擇。因此，調(diào)節(jié)RA信號傳導不僅極大增強重編程效率，而且還改善穩(wěn)定的0ct4表達所定義的iPSC質(zhì)量。在隨后的實驗中，我們使用對2. O μ g/ml Puro的抗性或GFP表達作為由0ct4-Puro-GFP MEF重編程的小鼠原代iPSC多能性質(zhì)量的替代標準。。 通過共表達Rarg和Lrh-I進行快速重編程SF-I (Nr5aI)和LRH_1 (Nr5a2)是Nr5a類固醇激素家族的2個成員。通過形成結合于RAREoct的異源ニ聚體，Sf-I和Rarg協(xié)同促進和維持0ct4在EC細胞中的表達(29)。然而，Lrh-I而非Sf-I在ES細胞中表達，并且，在胚胎發(fā)育的移植后階段是必須的(35)。我們因此構建了兩種PB載體PB-CAG-OCKS和PB-CAG-RL，其中4種Yamanaka因子(OCKS)、Rarg和Lrh-I (RL)分別通過T2A連接(圖7A)。這些因子的表達受CAG啟動子的控制。將這兩種PB載體共轉染或單獨轉染到0ct4報道MEF中，用于重編程。共轉染OCKS和RL 4天后，立即出現(xiàn)2. O μ g/ml Purolr顯微ES樣集落。這些Purolr集落繼續(xù)生長成大ES樣集落，并且通常從第7天到第10挑取它們用于擴增和進ー步表征(圖7B)。在轉染后第10天，與僅表達OCKS的對照相比，存在高達20多倍的由6種因子重編程的AP+集落(圖7C)。単獨的RL轉染在10天后不產(chǎn)生任何集落。以前利用基于病毒的強カ霉素誘導型載體進行的研究表明，外源因子誘導的重編程是具有明確的中間步驟的逐漸過程，其中不同的細胞群可能變成iPSC(36，37)。在細胞進入自我維持多能性狀態(tài)之前，經(jīng)常需要表達Yamanaka因子至少10-16天的時間(36，37)。為了確定在重編程中短暫需要6中外源因子，我們將CAG啟動子轉換為四環(huán)素應答元件(TRE)，以便這些因子的表達可以被強カ霉素(Dox)誘導(圖7A)。將兩種PB載體即PB-TRE-0CKS和PB-TRE-RL，以及表達反向四環(huán)素反式激活劑的PB_CAG_rtTA(圖7A)轉染到0ct4報道MEF中。將Dox添加到培養(yǎng)基中，并隨后在幾個時間點除去(圖2A)。4天的Dox處理足以獲得存活于獲得2. O μ g/ml嘌呤霉素的重編程細胞，其在缺少Dox的情況下繼續(xù)生長成iPSC集落(圖2B-C)。相比之下，如果僅表達Yamanaka因子，則獲得2. O μ g/ml嘌呤霉素細胞需要至少12天(PB-TRE-OCKS)(圖2B)。因此，共表達Rarg/Lrh_l使重編程顯著加速。重要的是，根據(jù)它們對2. O μ g/ml Puix)的抗性和GFP表達，用這6種因子所產(chǎn)生的大多數(shù)iPSC的質(zhì)量很高(圖2D)。相比之下，Rarg或Lrh-I單獨和OCKS表達不顯著影響重編程動力學和iPSC質(zhì)量(圖2D)。除了 0ct4報道系以外，我們還制備了 Rexl-GFP小鼠系，其中將GFP-IRES-Puro盒插入Rexl基因座中，使用這些Rexl-GFP MEF并利用Dox誘導型因子進行重編程實驗。Rex-I僅在ES細胞中表達，而不在EpiSC中表達(Brons et al. , 2007; Tesar et al.，2007)，因此代表完全重編程細胞的理想標志物。利用4種Yamanaka因子、Lrhl和Rarg進行4天Dox處理后，不依賴Dox的GFP陽性集落再次出現(xiàn)。多能性基因如0ct4的完全激活是重編程以及體細胞克隆中的關鍵事件(38)。因此，在報道基因測定中，我們利用連接于0ct4啟動子的熒光素酶表達盒研究了 Rarg和Lrh-I的表達是否的確能快速激活0ct4表達(圖7D)。將攜帶各種cDNA的PB-CAG轉座子與報道質(zhì)粒共轉染到MEF中，在2天后收獲MEF。OCKS或單獨的Rarg或Lrh-I的表達對熒光素酶報道基因表達不具有實質(zhì)影響(圖2E)。然而，Rarg和Lrh-I在ES細胞中的共表達，將報道基因表達增加了 4-5倍(圖2E)，這與以前的生化發(fā)現(xiàn)相似，即Rarg和Sf-I協(xié)調(diào)激活0ct4在EC細胞中的表達(29)。因此，Rarg和Lrh-I的表達在6因子重編程系統(tǒng)中主要負責快速激活0ct4基因座，而OCKS可能在相對晚的階段參與重編程。進一步表征來自MEF的用6種因子重編程的不依賴Dox的iPSC。這些iPSC表達通過免疫染色和qRT-PCR分析所檢測的適當水平的多能性基因，并且在0ct4和Nanog的啟動子區(qū)域具有DNA脫甲基化(圖3A-C和圖8A-B)。此外，當注射到Fl雜種小鼠中時，這些細胞在畸胎瘤中能分化成代表所有3個胚層的體細胞類型(圖3D)。最后，一旦注射到胚泡 中，這些iPSC高效地有助于嵌合體中的種系(圖3E)。重要的是，大多數(shù)iPSC系不表達可檢測的外源因子(圖8C)，并且嵌合體不發(fā)展腫瘤(12個月，n=7)。因此，對2.0yg/ml Puro的抗性和GFP表達，是評價來自0ct4報道MEF的原代iPSC的合適標準。因為大多數(shù)利用我們的6因子系統(tǒng)重編程的iPSC集落得到完全重編程，因此對于常規(guī)重編程而言不需要報道MEF。我們能容易地由野生型C57B6J MEF產(chǎn)生iPSC。此外，攜帶所有6種因子的cDNA的單獨的TO轉座子(OCKSRL)也有效地重編程MEF。在2i培養(yǎng)基中將MEF直接重編程為基態(tài)iPSC重編程MEF通常在含有血清或血清替代品的標準小鼠ES細胞培養(yǎng)基中進行。這些培養(yǎng)基的復雜屬性不允許準確確定單個化合物或生長因子在重編程中的功能。在化學限定培養(yǎng)基中直接重編程體細胞，還會促進治療性iPSC產(chǎn)生。因此，我們試圖在化學限定培養(yǎng)基N2B27-LIF中進行重編程，N2B27-LIF能維持小鼠ES細胞的多能性(39)。用單獨的PB-TRE-OCKS或與PB-TRE-RL —起轉染MEF，并將其在明膠化平板中在具有Dox的N2B27-LIF培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)高達17天。早在表達6種因子后的第5天，便出現(xiàn)ES細胞樣集落，在第14-17天挑選所述集落，用于在添加兩種抑制劑即ro(ERKl/2抑制劑Η)0325901)和CH(GSK3抑制劑CHIR99021)的N2B27-LIF(2i/LIF培養(yǎng)基)中擴增。在N2B27培養(yǎng)基中添加2i可選擇并維持基態(tài)小鼠和大鼠ES細胞(40，41)。在每次轉染中通過表達OCKS和RL，我們獲得平均50個iPSC集落，其中大多數(shù)集落(83%)能在2i/LIF中擴增成系(圖4A)。相比之下，AP+集落直到轉染PB-TRE-0CKS后至少12天才出現(xiàn)，并且僅有少量AP+集落(28%)能擴增成穩(wěn)定的系。接下來，我們試圖在2i/LIF培養(yǎng)基中將MEF直接重編程為iPSC。通過表達OCKS加RL而不是單獨的0CKS，基態(tài)iPSC在培養(yǎng)時顯著地快速出現(xiàn)(圖9A)，這表明，一些MEF，在表達6種因子后不久，就已處于重編程階段，它們在2i/LIF培養(yǎng)基中，被進一步促向基態(tài)多能性(11，36，37)。接下來，我們檢查了在2i/LIF中重編程的iPSC的質(zhì)量。這些iPSC表達適當水平的多能性基因(圖4B-C)，并且在體外(圖4D)和在畸胎瘤(圖9B)中分化成所有3個胚層的體細胞類型。因此，通過表達Rarg和Lrh-I調(diào)節(jié)視黃酸信號傳導，將MEF快速重編程為基態(tài)或天然iPSC。
OCKS和RL能產(chǎn)生具有獨特特性的人類iPSCOCKS加上RL通過有效誘導內(nèi)源0ct4表達將MEF迅速重編程為高質(zhì)量的iPSC的能力促使我們探討這些因子是否也在重編程人類體細胞中發(fā)揮相似的作用。計算機分析確定，0ct4基因座處的RAREoct在幾種哺乳動物基因組中是高度保守的(圖5A)。實驗證據(jù)也支持RAREoct在調(diào)節(jié)0ct4在人類細胞中表達的可能作用(42)。有意思的是，在小鼠基因組和人類基因組中，在約30-40個基因座中鑒定了 RAREoct樣元件(表SI和S2)，但是0ct4基因座是唯一一個在兩個基因組中發(fā)現(xiàn)含有RAREoct位點的基因座，這表明了該元件在0ct4基因組中的功能意義。因此，我們探討了產(chǎn)生與小鼠ES細胞相似人類iPSC的可能性。首先通過利用CAG啟動子連續(xù)表達6種因子，我們產(chǎn)生了人類iPSC。通過共表達PB轉座酶，將攜帶OCKS和
RL cDNA的PB-CAG轉座子轉座到人類新生兒包皮真皮成纖維細胞(HDFn)中。早在轉染后10天，便在小鼠ES細胞培養(yǎng)基中形成集落(M15-LIF)，有一些集落在形態(tài)上與小鼠ES細胞集落相似(例如，緊湊性提高的集落、高核質(zhì)比以及顯著的核仁)(圖10A)。在12-14天，挑選這些集落，并隨后利用標準小鼠ES細胞方案進行培養(yǎng)(圖10A)。一旦用胰蛋白酶解離成單細胞懸浮液并接種于STO飼養(yǎng)細胞上，便有效形成次級集落，再接種效率高達70%。我們能由許多原代集落建立穩(wěn)定的系，其能在M15-LIF培養(yǎng)基中在飼養(yǎng)細胞上維持至少50代。在僅利用OCKS的對照中，原代集落在形態(tài)上不同于用OCKS加上RL所產(chǎn)生的那些集落(圖10A)。與以前的報道一致(7)，我們從來未能由這些OCKS集落在M15-LIF培養(yǎng)基中建立穩(wěn)定的系。除了它們能在常規(guī)小鼠ES細胞培養(yǎng)基中增值以外，這些人類iPSC還表達關鍵的多能性基因(圖10B-C)，并且還能維持在2i/LIF培養(yǎng)基中，這證實了它們與基態(tài)小鼠ES細胞的相似性(40)(圖10A)。為了確定這些人類iPSC的分化潛力，我們將其皮下注射到免疫低下的NSG小鼠(43)中。盡管利用CAG啟動子連續(xù)表達外源因子，但是這些細胞形成具有代表所有3個胚層的細胞類型的畸胎瘤(圖10D)。此外，即使在長期的體外培養(yǎng)后，這些iPSC保持了正常的核型(圖10E)。利用Y染色體多態(tài)性標志物，我們還證實了 iPSC的HDFn來源(圖10F)。為了獲得不依賴外源因子表達的人類iPSC，我們使用了 Tet-On系統(tǒng)，其中將6種因子的人類cDNA克隆到PB-TRE質(zhì)粒中。將這些PB_TRE_cDNA質(zhì)粒與BP轉座酶和rtTA質(zhì)粒共轉染到HDFn細胞中。添加Dox，誘導外源因子表達(圖5B)。轉染后10-15天，出現(xiàn)含有ES細胞樣細胞的集落。將這些集落進行胰蛋白酶處理，并再次接種到飼養(yǎng)平板中的無Dox的M15-LIF培養(yǎng)基中。隨后將不依賴Dox的次級集落在飼養(yǎng)細胞上在添加兩種抑制劑PD和CH的KSR-LIF培養(yǎng)基(KSR_2i_LIF)中擴增成系(40，41)。根據(jù)一實驗，我們建立了維持在KSR-2i-LIF培養(yǎng)基中的5個不依賴Dox的iPSC系(圖5C)。與小鼠ES細胞相似，這些人類iPSC易于擴增，并且以I至4的拆分比，每隔3-4天進行傳代。為了確定這些不依賴Dox的iPSC的多能性，我們檢查了關鍵多能性基因的表達。它們以可與人類ES細胞相當?shù)乃奖磉_內(nèi)源0ct4、Sox2和Nanog (圖和圖11A)，并且對于人類ES細胞表面標志物為陽性染色(圖5E和圖11B)。重要的是，即使在RT-PCR分析中，外源因子的表達也是不可檢測的(圖11C)。最后，可以將不依賴Dox的人類iPSC容易地在體外和體內(nèi)分化為3個胚層的細胞(圖5F-G)。與在小鼠ES細胞中維持多能性依賴Lif/Jak/Stat途徑相反，將衍生于胚胎的常規(guī)人類ES細胞培養(yǎng)于含有FGF2(堿性FGF)的培養(yǎng)基中，單獨的LIF不足以維持多能性(44，45)。不依賴Dox的人類iPSC并不需要培養(yǎng)基中的FGF。實際上，它們生長的很好，并且即使在存在FGF受體抑制劑SU54021的情況下，也在KSR_2i_LIF培養(yǎng)基中保持多能性基因表達(圖5H)。常規(guī)的ES細胞對JAK抑制劑(JAKi)具有抗性，但是在存在BMP4的情況下分化。相比之下，我們的人類iPSC在存在BMP4的情況下增殖良好，但是如果將阻斷Stat3磷酸化的JAK添加到KSR-2i-LIF培養(yǎng)基中，它們喪失0CT4和NANOG的表達，并且快速分化(圖5H)。最后，與人類ES細胞相比，我們的人類iPSC在KSR-2i-LIF培養(yǎng)基中表達較低水平的譜系特異性基因，如PAX6、GATA6和S0X17 (圖5H)。為了確定不依賴Dox的人類iPSC是否具有變成FGF依賴性的潛力，我們將培養(yǎng)基變成KSR-FGF2。與生長于KSR-2i-LIF培養(yǎng)基相比，在傳代3次后，這些細胞仍然生長良好，并且不表現(xiàn)出明顯的分化。它們在形態(tài)上與人類ES細胞相似，并且表達適當水平的多能性基因，如0CT4和NANOG (圖51)。然而，一旦將培養(yǎng)基變回KSR_2i_LIF，這些iPSC便變成分化的并且表達高水平的S0X17和S0X1，伴隨著0CT4和NANOG表達的喪失(圖51)，這與人 類ES細胞的行為相似(44)。因此這些數(shù)據(jù)表明，生長于KSR-2i-LIF培養(yǎng)基中的人類iPSC具有轉變成與常規(guī)人類ES細胞相似的細胞的潛力，但是反之不是這樣。因此，基于它們的生長特性、信號傳導依賴性以及基因表達，利用我們的6因子平臺所產(chǎn)生的不依賴Dox的人類iPSC，比常規(guī)人類ES細胞更不成熟，并且與基態(tài)小鼠ES細胞相似(40，41)。因此，我們將這些人類iPSC稱為桑格人類iPSC (Sanger Human iPSC)或SH-iPSC。SH-iPSC與小鼠ES細胞相似的事實表明，它們可能可用于遺傳研究。在利用這些細胞進行大量體外操作之前，我們利用光譜核型分析檢查了 SH-iPSC的基因組完整性。即使在大量的體外培養(yǎng)(20代)后，這些細胞仍然保持正常的核型(圖11D)，這表明，它們在遺傳上是穩(wěn)定的。因此我們進行PB轉座，從而通過將PB-PGK-Neo轉座子和Pbase質(zhì)粒共轉染到SH-iPSC中將外源DNA引入這些細胞。由一次電穿孔，我們獲得約500，000個6418^集落，其占存活于電穿孔的細胞的約10%，轉座效率與利用小鼠ES細胞相當(31)。在SH-iPSC中的有效PB轉座，為進行基因組范圍的誘變篩選提供了機會。為了開始探討這種可能性，我們將PB-SA-β geo基因捕獲轉座子和PB轉座酶質(zhì)粒轉染到SH-iPSC中。SA-β geo盒整合到表達基因座中，能使β geo表達和捕獲事件評分為G418抗性。由一次電穿孔，我們回收了 22，000個64181^集落，其代表O. 3%的電穿孔幸存細胞。因為我們的人類iPSC系衍生于包皮成纖維細胞并且因此是XY，因此我們利用喪失HPRT活性的細胞中的6TG抗性，研究了 X染色體上HPRT基因座處的突變效率。在22，000個6418抗性集落中，我們獲得了 I個6-TG集落。該克隆的分子分析表明，PB插入內(nèi)含子2中并且干擾HPRT轉錄和剪接(圖11E)。因此，SH-iPSC適合基因操作和篩選?？梢詫⑽覀?因子重編程系統(tǒng)的獨特能力歸因于RA信號傳代和相關因子LRH-I在多能干細胞中的作用。與視黃酸的充分表征的促進分化活性相比，RA信號傳導可以通過RAREoct正調(diào)節(jié)0ct4表達。高水平的RAR: RXR異源二聚體特異性結合RAREoct，其克服了 COUP-TF的抑制(28)。通過RA信號傳導調(diào)節(jié)0ct4表達的可選途徑是通過RAREoct內(nèi)的SF-I結合位點。RARG/LRH-1異源二聚體結合RAREoct，并且通過有效競爭掉阻遏物協(xié)同激活0ct4表達(29)。這些類固醇激素受體二聚體隨后將共激活劑如CBP/p300、P/CAF和SRC1/TIF2(25，46)募集到0ct4基因座，從而促進進一步的染色質(zhì)改造。因此，體細胞重編程中最關鍵的障礙之一，即內(nèi)源0ct4基因座的激活(47)，在外源因子表達之后即易于克月艮。有意思的是，注意到已經(jīng)證明，表達高水平LRH-I和低水平COUP-TF的細胞，如小鼠肝細胞(48)，具有較高的重編程效率(5)。我們的數(shù)據(jù)清楚地表明，激活0ct4基因座是早期重編程事件并且是關鍵的事件。已知通過表達4種Yamanaka因子激活0ct4基因座是不穩(wěn)定的，這在常規(guī)ES細胞培養(yǎng)基中導致許多部分重編程的集落(11)。利用0ct4報道MEF進行重編程，允許直接觀察0ct4基因座激活。當僅表達4種因子時，小量細胞在流式細胞術中是GFP+，這表明這些細胞中Oct4激活。然而，在接下來的8天中，GFP+細胞數(shù)量并未實質(zhì)改變，這與4種因子介導的長期重編程過程一致。相比之下，在表達6種因子的MEF中，從轉染后第3天起，GFP+以指數(shù)方式增加。而且，小量MEF在表達6種因子后(24小時)幾乎立即獲得高水平的0ct4表達。然而，這種快速的0ct4激活并不能維持,并且在Yamanka因子未持續(xù)表達更多天的情況下,其可能失敗，這是因為僅在Dox誘導實驗中在外源因子表達3-4天后才獲得自我維持的iPSC集落(圖2)。 Lrhl不足的ES細胞未表現(xiàn)出嚴重的多能性缺陷，因此其不是多能性線路(pluripotency circuit)的主要必須組分(35)。然而,其在ES細胞分化中對于0ct4表達的維持是必須的(35)。最近的證據(jù)還表明，Lrhl在典型的Wnt信號傳導的下游發(fā)揮作用，并且除了 0ct4外還調(diào)節(jié)其他多能性因子,如Nanog和Tbx3 (64)。Lrhl的這些關鍵功能,可能在其能在重編程中替代0ct4中發(fā)揮重要作用(10)。然而，我們的數(shù)據(jù)表明，這種替代可能是環(huán)境依賴性的，這是因為單獨的Lrhl以及4種Yamanaka因子的表達，在iPSC質(zhì)量或動力學方面，并不顯著改善重編程。僅Rarg和Lrhl之間的協(xié)同相互作用深刻影響快速產(chǎn)生基態(tài)小鼠iPSC的重編程，并且能產(chǎn)生與基態(tài)小鼠ES細胞密切相似的人類iPSC。有意思的是，盡管Rarg在包括MEF在內(nèi)的許多細胞類型中表達，但是其最高表達見于ES細胞中，MEF或人類成纖維細胞中的內(nèi)源Rarg看起來并不足以與外源誘導的Lrhl合作來促進快速且有效的重編程。最近的報告表明，通過重編程的次級成纖維細胞(iPSC-衍生的)獲得的人類iPSC可以保持在添加有毛喉素的2i/LIF培養(yǎng)基中(49)。這些細胞看起來與基態(tài)小鼠ES細胞相似(40)，因此提供了基態(tài)或天然多能性存在于人類中的獨立性證據(jù)。盡管他們的人類iPSC可以變成不依賴Dox的，但是它們生長緩慢，并且不能維持超過15-20代。另一最近的研究也描述了仍然依賴于外源因子表達的小鼠ES樣人類iPCS(50)，其在某種程度上看起來與利用PB-CAG-cDNA獲得的PB-CAG人類iPSC相似(圖10)。與這些報告相比，SH-iPSC直接由人類原代成纖維細胞重編程，不依賴表達外源重編程因子，并且可以在含有2i/LIF的培養(yǎng)基中維持超過50代。此外，它們不依賴FGF，但是依賴LIF-JAK-STAT途徑。因此SH-iPSC與預想的基態(tài)人類多能干細胞相似，并且對于人類基因組的功能研究應該是有用的。材料和方法質(zhì)粒載體的構建為了制備 PB-TRE、PB-MSCV 和 PB-CAG 載體，由 pTight (Clontech)擴增 Tet 應答元件(TRE)，由 pMSCV-Neo (Clontech)擴增 MSCV LTR，并由 pBluescript-CAG 載體擴增 CAGG啟動子(未發(fā)表的數(shù)據(jù))，并將其克隆到PB-bpA載體中(未發(fā)表的數(shù)據(jù))。由最初的逆轉錄病毒載體(Addgene)擴增(引物位于補充表3中)4種小鼠和人類Yamanaka因子的cDNA，并分別將其克隆到PB-TRE、PB-MSCV和PB-CAG轉座子載體中。由IMAGE克隆(Geneservice)擴增小鼠和人類Rarg、Lrhl以及Sf 1，并將其克隆到轉座子載體中。小鼠和人類ES和iPSC培養(yǎng)通常將小鼠ES細胞和iPSC培養(yǎng)于M15培養(yǎng)基中敲除DMEM、15%胎牛血清(FBS, Hyclone)、IX谷氨酰胺-青霉素-鏈霉素(GPS, Invitrogen)、IX非必需氨基酸(NEAA, Invitrogen) >0. ImM β -疏基乙醇(3-ME, Sigma)以及 106U/ml LIF (Millipore)。將通過PB-CAG載體重編程的人類iPSC培養(yǎng)于具有106U/ml人類重組LIF的M15培養(yǎng)基中。將通過PB-TRE載體重編程的人類iPSC維持DMEM/F12中，其具有IXGPS(Invitrogen)、20% 敲除血清替代品(Invitrogen)、IX NEAA、O. ImM β-疏基乙醇(β -ME, Sigma)以及兩種抑制劑 CHIR99021 (5 μ Μ)和 PD0325901 (I μ Μ)。
將人類ES 細胞系 BG01V/h0G (來自 Invitrogen)和 Hl (來自 WiCell)培養(yǎng)于 hESC培養(yǎng)基中具有Glutamax (Invitrogen)的DMEM/F 12、20%敲除血清替代品(Invitrogen)、IX NEAA>O. ImM β -疏基乙醇(β -ME, Sigma)以及 4. Ong/ml FGF2 (Invitrogen)。用于重編程的MEF細胞和HDFn細胞的制備由12. 5d. p. c. 0ct4-IRES-Puro_Egfp胚胎制備MEF。為了減低胚胎與胚胎之間的差異，將來自具有相同基因型的幾個胚胎的MEF混合在一起，用于在MlO培養(yǎng)基中擴增。在對MEF進行計數(shù)、等分以及凍干之前，使其傳代一次。在電穿孔之前，將IXlO6個MEF接種到一個明膠化的15-cm組織培養(yǎng)板中。當MEF匯合70-80%時，將它們用胰蛋白酶處理并收集用于電穿孔。MlO :敲除DMEM、10%胎牛血清(FBS, Hyclone)、1XGPS、IX非必需氨基酸(NEAA, Invitrogen)。HDFn細胞購自Invitrogen,并維持在補充了低血清生長補充物(Invitrogen)的Media 106中。在計數(shù)、等分以及冷凍之前，使原代HDFn培養(yǎng)物傳代一次。在電穿孔之前，將5X105個HDFn細胞接種于3個T75組織培養(yǎng)瓶中。當HDFn細胞融合70-80%時，將它們進行胰蛋白酶處理并收集用于電穿孔。轉染和細胞培養(yǎng)利用Amaxa機器(Lonza)根據(jù)制造商的方案(程序A-023)進行MEF轉染。在電穿孔后，將MEF接種于添加LIF的M15中的STO飼養(yǎng)細胞上。對于Tet-On實驗，轉染后24小小時，添加含有強力霉素(l.Oyg/ml)的M15，并每隔一天替換。在第7-第10天，將iPSC集落挑選到96孔板中，并根據(jù)標準小鼠ES細胞培養(yǎng)條件擴增細胞。利用Amaxa機器根據(jù)制造商的方案(程序U-020)實現(xiàn)HDFn細胞的轉染。電穿孔后，將HDFn細胞接種于添加了 hLIF的M15中的STO飼養(yǎng)細胞上。對于Tet-On實驗，轉染后24小時，添加含有強力霉素(2.0yg/ml)的M15，并每隔一天替換。通常在第10天挑選通過PB-CAG載體重編程的人類iPSC集落，并在接種成24孔模式前用胰蛋白酶解離成單細胞懸浮液。通常在第30天(再接種后10天)挑選通過PB-TRE載體重編程的人類iPSC集落，并在接種于24孔板之前，用胰蛋白酶解離成單細胞懸浮液。由次級集落建立穩(wěn)定的系，并根據(jù)標準小鼠ES細胞培養(yǎng)條件來維持。使用白細胞堿性磷酸酶試劑盒(Sigma)，通過堿性磷酸酶染色，觀察小鼠和人類iPSC集落。
亞硫酸氫鹽基因組測序利用EpiTect亞硫酸氫鹽試劑盒(Qiagen),根據(jù)制造商的推薦,進行亞硫酸氫鹽處理。PCR引物列于補充表5中。將擴增產(chǎn)物克隆到pGEM-T-easy (Promega)中。用針對各自啟動子的M13正向引物和M13反向引物，對隨機選擇的克隆進行測序。RT - PCR利用Rneasy微型試劑盒(Qiagen),分離RNA。隨后定量樣品，并用gDNA WipeOut處理。利用QuantiTect反向轉錄試劑盒(Qiagen),制備cDNA的第一鏈。對于每個RT-PCR反應，我們使用了 50 - IOOng cDNA和補充表5所列的引物5。標準的PCR條件為94° C30s,60° C 30s,68° C30s ；X 30個循環(huán)。對于實時PCR，我們使用了 Taqman基因表達測定。Taqman 探針也購自 Applied Biosciences (補充表 Table 6)。在 9700HT 快速實時 PCR相同(Applied Biosciences)中，進行所有定量PCR。利用Δ Ct方法,相對于小鼠Gadph,測定小鼠基因表達。利用ACt方法，相對于人類GADPH基因，測定人類基因表達。 免疫染色和流式細胞術將生長于12孔飼養(yǎng)板中的iPSC用PBS洗滌，于4%PFA/PBS中在室溫下固定lOmin，用O. 3%Triton X-100在PBS中滲透lOmin，在5%驢血清中封閉lh，并添加一抗，于4° C過夜。Nanog(l:150，Abcam)、SSEA-3、SSEA-4、TRA-l-60、TRA-l-81(l:10，由 Peter ff. Andrews博士惠贈)。將細胞在PBS中洗滌，并添加二抗(Alexa488IgG或IgM，1:1000 ；Alexa594IgG,I 1000)，并在室溫下孵育I小時。將生長于96孔飼養(yǎng)板中的小鼠iPSC進行胰蛋白酶處理，并重懸浮于M15中。將iPSC I, OOOrpm離心3分鐘，通過將板在組織上倒置，除去培養(yǎng)基。將iPSC重懸浮于PBS中，并通過 Cytomics FC-500 (Beckman Coulter)進行分析。將生長于6孔板中的人類iPSC進行胰蛋白酶處理，并重懸浮于M15中。將iPSC 用 PBS 洗滌一次、離心，并與 SSEA-4-FITC、TRA-1-60-PE 或 TRA-1-81-FITC 抗體(BDBioscience) 一起孵育I小時。隨后洗漆iPSC,并將其重懸浮于PBS中，并通過CytomicsFC-500 (Beckman Coulter)進行分析?；チ鲂纬蓪⑿∈骾PSC懸浮于MlO中，并將IXlO6個細胞皮下注射到Fl (129S5/C57B6)雜種小鼠的兩側背側面。切開畸胎瘤，在磷酸鹽緩沖的福爾馬林中固定過夜，并在切片之前包埋于石蠟中。將人類 iPSCs(lX106)皮下注射到 NSG 小鼠(NOD. Cg-Prkdcscid I12rgtmlffjl/SzJ. The Jackson Laboratory)的兩側背側面。注射后8周，收獲畸胎瘤,用于固定和切片。用蘇木精和曙紅使切片染色。根據(jù)UK’ s 1986Animals Scientific Procedure Act (動物科學步驟法案)和當?shù)氐膫惱淼赖挛瘑T會規(guī)章(local institute ethics committeeregulations)進行所有動物實驗。Splinkerette PCR按以前所述，進行Splinkerette PCR，來確定PB基因組整合位點。用M13正向引物和反向引物，在兩個末端，對TA克隆的PCR產(chǎn)物進行測序。利用BLAST確定PB插入位點。利用補充表4所述的引物，進行除去外源因子的iPS系的基因組DNA PCR0統(tǒng)計分析將數(shù)據(jù)顯示為平均值和標準偏差。用Excel 2008 (Microsoft)或Prism(Graphpad)進行所有的統(tǒng)計分析。實施例2在這里，我們報導，表達兩種新的關鍵轉錄因子Rarg和Lrhl,以及4種Yamanaka因子，在少至3天內(nèi)快速激活內(nèi)源0ct4基因座，并且允許快速且有效地重編程小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)。所產(chǎn)生的iPS克隆，基于形態(tài)和分析分析，具有高質(zhì)量，并且能在體內(nèi)包括種系中分化成各種細胞類型。當應用相同的策略重編程人類新生兒包皮真皮成纖維細胞(HDFn)時，我們輕易獲得了依賴LIF但是不依賴FGF的人類iPS細胞。此外，人類iPS細胞增殖充分，并使其以單細胞密度在常規(guī)小鼠ES細胞培養(yǎng)條件下亞克隆，并在無任何可辨別的染色體異常的情況下進行大量擴增。因此，我們的新的iPS細胞平臺為在兩個哺乳動物物種中實現(xiàn)全部的多能性提供了新的高效方法。對于探討人類基因組功能，所產(chǎn)生的人類iPS細胞具有極好的資源。Rarg顯性失活等位基因阻斷ES細胞分化 為了鑒定在基因突變時能夠阻斷ES細胞分化的基因，我們利用攜帶強CAG啟動子/增強子和一對剪接受體的PiggyBac DNA轉座子(PB)，在小鼠ES細胞中進行基因篩選(Fig 12a)。將該轉座子插入到小鼠基因組中，可以上調(diào)插入位點附近的基因或者干擾它們，這取決于插入等位基因的結構。為了有效排除培養(yǎng)物中的分化的ES細胞，我們將Puro-IRES-Egfp盒靶向Rexl基因座(Fig 12b)。因此，未分化的ES細胞在流式細胞術中對嘌呤霉素(Puro)選擇會具有抗性并且是GFP+，而由于在分化后快速喪失Rexl表達，分化的細胞會被Puro選擇殺死并變成GFP_。用I. O μ M所有反式視黃酸(RA)將突變ES細胞的文庫分化4天，并隨后用嘌呤霉素進行選擇(圖12c)。由獨立的突變ES細胞庫,鑒定了幾個PurolrES細胞克隆。SplinkrettePCR分析在編碼Rarg、Pparg以及Gclc的基因中鑒定了 PB整合位點。對于Pparg，PB插入使全部的蛋白質(zhì)編碼序列過表達。相比之下，Rarg基因座具有4個獨立的PB插入，所有的插入都發(fā)現(xiàn)于內(nèi)含子9 (最后一個內(nèi)含子)中(圖12d)。這些PB插入截短了 Rarg，其失去外顯子10所編碼的氨基酸。過表達這種截短的Rarg證實了其阻斷RA所誘導的ES細胞分化的能力(圖12e)。這種截短的Rarg可能發(fā)揮野生型Rarg的顯性失活形式(Rarg-DN)的功能。全長形式的Rarg和Rara (Rarg-FL和Rara-FL)的過表達增強了 RA所誘導的分化，然而所報道的Rara的顯性失活形式(Rara-DN) (20)，即使在高濃度RA的情況下，也能阻斷ES細胞分化。Rarg和Rara特異性拮抗劑⑶2665和Ro_41_5253也能阻斷ES細胞分化(圖12f)。因此這些數(shù)據(jù)證明了 Rarg和Rara在ES細胞分化中的關鍵作用。通過Rarg的信號傳導增強了重編程效率我們接下來測試在我們的篩選中所鑒定的基因是否在iPS細胞產(chǎn)生中發(fā)揮作用。為了直接評價iPS細胞的質(zhì)量，我們將IRES-Puro-Egfp盒靶向ES細胞中0ct4基因座的3’UTR，用于制備MEF細胞(圖6a) (57)。這些細胞在流式細胞術中是綠色的，并且在2 μ g/mL Puro中增殖良好(圖6b，且數(shù)據(jù)未顯示)。我們將4種Yamanaka因子單獨克隆到PB轉座子中，其中每一 cDNA的表達受MSCV的LTR(PB-MSCV-cDNAs，圖6c)的控制。隨后將這些4種轉座子和PB轉座酶(PBase)質(zhì)粒轉移到0ct4-IRES-Puro-Egfp MEF中。在3周內(nèi)，出現(xiàn)了與常規(guī)ES細胞的集落相似的iPS細胞集落。大多數(shù)iPS集落存活于1.0或1.5118/1111 Puro，但是很少數(shù)能生長于2. Oyg/ml Puro中。此外，大多數(shù)iPS集落是GFP陰性的，這表明，這些細胞中的內(nèi)源0ct4基因座不表達至ES細胞中的水平。然而，生長于2. O μ g/mL中的這些少數(shù)iPS集落的細胞，大部分是GFP陽性的，其熒光強度與親代0ct4-IRES-Puro-Egfp敲入ES細胞中的熒光強度相當(圖13A)。RT-PCR和DMR測序證實，生長于2. O μ g/mL Puro中的這些iPS克隆，在多能性基因表達和這些基因的啟動子處的DNA甲基化方面，比I. O或I. 5 μ g/mL Puro所選擇的克隆，與常規(guī)ES細胞更相似(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結果表證明了許多以前的研究并與之一致，即4種Yamanaka因子所誘導的大多數(shù)iPS細胞僅是部分重編程的，并且內(nèi)源0ct4基因座并未完全激活。因此我們使用2. O μ g/mL或更高濃度的PuiO，聯(lián)合流式細胞術，來在隨后實驗中定量評估iPS細胞質(zhì)量。接下來我們將全長形式的Rarg、Rara> Pparg以及Gclc,以及顯性失活的Rarg和Rara克隆到PB-MSCV轉座子中，以便研究它們對Yamanaka因子所介導的重編程的影響。Pparg和Gclc的過表達看起來不影響Yamanaka因子介導的MEF的重編程(數(shù)據(jù)未顯示)。送遞Rarg-DN以及4種Yamanaka因子,產(chǎn)生了比對照稍微多的iPS集落(圖13B)。然而，顯著的是，Rarg全長cDNA的表達使iPS集落的數(shù)量增加約100倍(圖13B和13C)。表達Rara-FL也顯著增強重編程效率，盡管程度比Rarg-FL低。相比之下，Rara-DN完全阻斷了 Yamanaka因子所誘導的重編程(圖13B)。這些數(shù)據(jù)清楚地表明重編程過程中的視黃酸信 號傳導。與單獨的4種Yamanaka因子所誘導的低質(zhì)量iPS相似,添加Rarg-FL或Rara-FL過表達不明顯改善iPS細胞質(zhì)量，這是因為大多數(shù)集落是GFP陰性的，并且僅少數(shù)集落存活于2. O μ g/mL Puro選擇。另一方面,來自過表達Rarg-DN的iPS克隆,在整個重編程過程中即使無任何選擇的情況下，具有與用2. O μ g/mL Puro所選擇的iPS克隆相當?shù)南嗨频腉FP陽性細胞百分比(圖13D)。表達Rarg-DN改善iPS細胞質(zhì)量，而Rara-DN過表達完全阻斷iPS過程，這一事實表明，RA信號傳導水平是重要的。因此我們測試了 Rarg的表達水平是否影響重編程效率。重編程效率的顯著降低與PB-MSCV-Rarg-FL DNA量的增加相關(圖13E)。而且利用較強的CAG啟動子表達Rarg-FL將重編程效率降低至對照的水平，對照僅表達Yamanaka因子(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結果證實，Rarg過表達對重編程的影響是劑量敏感性的。為了進一步研究Rarg在iPS細胞中的作用，我們在MEF重編程中，聯(lián)合4種Yamanaka因子，測試了合成的Rarg特異性激動劑⑶437。添加IOOnM的⑶437高達8天顯著增加iPS細胞集落的數(shù)量。此外，iPS細胞的質(zhì)量，如FACS所測量的，獲得顯著改善(圖13E)。然而，利用CD437處理細胞超過8天(第1_12天)大量降低iPS集落的數(shù)量。當給予8天時Rara特異性激動劑也可以改善重編程效率，但是對iPS克隆的質(zhì)量影響很小(圖13E)。這些結果表明，Rarg信號傳導在初始階段或早期階段促進重編程，但是過度的Rarg信號傳導在后期階段對iPS細胞具有負面影響。盡管表達Rarg-FL或Rara-FL或利用它們的激動劑改善重編程效率，但是它們看起來不縮短重編程時間，這是因為iPS集落的形成仍然需要約3周的時間。Rarg和Lrhl協(xié)同促進重編程為了探討Rarg信號傳導的下調(diào)是否是Rarg-DN iPS克隆更好質(zhì)量的主要原因，在具有或不具有5-Aza的情況下，我們用Rarg特異性拮抗劑⑶2665處理獨立地部分重編程的克隆。我們注意到，10 μ M⑶2665顯著改善部分重編程的克隆的質(zhì)量，但是當與5-Aza —起使用時，其作用更明顯(圖14A)。然而，在處理4天后，該克隆仍然主要是GFP陰性的。這促使我們認為，Rarg信號傳導的下調(diào)可能僅是Rarg-DN iPS細胞具有好得多的質(zhì)量的部分原因。在小鼠胚胎瘤細胞中(EC)，Rarg與孤兒受體Sfl (Nr5al)形成復合體，所述孤兒受體特異性結合0ct4啟動子中的關鍵應答元件RAREoct，并協(xié)同上調(diào)0ct4表達(59)。因為表達Rarg極大地促進iPS細胞產(chǎn)生，因此我們決定檢查Sfl是否也發(fā)揮相似的作用。因為ESfl通常不在小鼠ES細胞或早期小鼠胚胎中表達，因此我們還在實驗中包括了其亞家族成員Lrhl (Nr5a2)，該成員在ES細胞和早期胚胎中都表達(62)。因此，我們將Sfl和LrhlcDNA分別克隆到PB-MSCV轉座子中，并與Yamanaka因子一起共轉染到MEF中。如圖14B所示，表達Lrhl顯著改善了重編程效率，但是其程度不如Rarg改善的程度。表達Sfl也增加iPS集落的數(shù)量，然而許多集落看起來是分化的(數(shù)據(jù)未顯示)。共表達Lrhl和Rarg不進一步增加iPS集落的數(shù)量。另人驚訝的是，許多iPS在 早至轉染后10天而不是通常3周出現(xiàn)，其形態(tài)與野生型小鼠ES細胞幾乎不能區(qū)分(數(shù)據(jù)未顯不)O為了促進在將來切除PB轉座子所攜帶的外源因子，我們制備了 PB-CAG_0ct4-2A-cMyc-2A-Klf4-2A-Sox (PB-CAG-0CKS)轉座子，其中 4 種 Yamanaka 因子用 T2A 肽序列連接，并由單個CAG啟動子表達。PB-CAG-0CKS所誘導的一些iPS集落，在轉染后4_5天內(nèi)，在顯微鏡下可見。然而，這些集落中的細胞后來在形態(tài)上變成異質(zhì)的(圖7B)，并且顯然仍然不是完全重編程的，因為在第10天挑選的大部分集落(90%)對2 μ g/mL是敏感的，并且含有低百分比的GFP陽性細胞(圖2D)。這與以前的出版物一致，即如果僅使用Yamanaka因子，則iPS變成完全重編程的需要許多傳代。接下來，我們制備了 PB-CAG-Rarg-2A-LrhI (PB-CAG-RL)轉座子，來由單個啟動子共表達Rarg和Lrhl。將PB-CAG-0CKS和PB-CAG-RL共轉染到MEF中4天后，在轉染后的4-5天內(nèi)，在顯微鏡下可見很小的ES樣集落。這些集落看起來在形態(tài)上是同質(zhì)的，并且在生長方面與常規(guī)小鼠ES細胞非常相似(圖7B)。此外，與僅轉染了 PB-CAG-0CKS的對照相t匕，有大致多于7倍的iPS細胞集落。有意思的是，在第4-6天之間，我們經(jīng)常觀察到彼此并排形成的相同大小的2個、4個甚至8個很小的集落，在第8天時，其合并成I個或2個大集落，這反映了可能同時重編程來自一個親代MEF細胞的子細胞。有趣的是，幾乎所有這些集落對2 μ g/mL Puro選擇都具有抗性，并且由高百分比的GFP陽性細胞組成(圖2D)，這表明由內(nèi)源0ct4基因座的強0ct4表達。為了研究能以多快激活內(nèi)源0ct4基因座，我們在轉染后的幾個時間點，對MEF進行Puro選擇。早至用PB-CAG-0CKS和PB-CAG-RL轉染后3天，選擇出Puro抗性iPS細胞集落(圖14C)，由此證實在該條件下0ct4基因座的快速激活。在僅用PB-CAG-0CKS轉染的對照MEF中，則僅在Puio選擇在第8天或以后開始時出現(xiàn)Puio抗性集落。即使對于這些PuiO抗性集落而言，我們經(jīng)常在原代集落以及亞克隆過程中觀察到大部分細胞被殺死，這表明這些部分重編程的克隆的異質(zhì)性。為了確定建立完全重編程iPS克隆是否需要外源因子的持續(xù)表達，我們制備了 PB-TRE-0ct4-2A-cMyc-2A-Klf4-2A-Sox2(PB-TRE-0CKS)和PB-TRE-Rarg-2A-LrhI (PB-TRE-RL)構建體，其中通過強力霉素(DOX)誘導了重編程因子的表達。將兩種PB轉座子構建體，以及PB-CAG-rtTA載體和Pbase質(zhì)粒，共轉染到MEF中。轉染后6、8或10天，立即應用DOX誘導，我們在第10天應用2 μ g/mL Puro選擇。在用DOX誘導僅6天的MEF中，獲得Pim)抗性集落(圖14D)，這表明這6種因子表達6天就足以將內(nèi)源0ct4基因座激活到高水平。相比之下，在僅用PB-TRE-0CKS和PB-CAG-rtTA轉染的MEF中，在相同的DOX誘導方案下，回收了非Puro抗性集落。因此，僅4種Yamanaka因子表達高達10天，不足以完全激活內(nèi)源0ct4基因座。為了進一步證明內(nèi)源0ct4基因座的的快速激活，我們重復了 6因子Tet/On實驗，但是僅在轉染后4天用DOX處理MEF。DOX除去后，立即應用Puro選擇來選擇具有內(nèi)源0ct4激活的細胞。出現(xiàn)了幾個Puro抗性集落，當擴增時，其表現(xiàn)出優(yōu)異的ES細胞形態(tài)。這些結果清楚地表明，表達6種轉錄因子導致內(nèi)源0ct4基因座的快速激活，并且導致高質(zhì)量iPS細胞的產(chǎn)生。為了研究iPS細胞需要多少Rarg和Lrhl，我們將PB-CAG-OCKS以及攜帶由MSCV或CAG啟動子驅動的Rarg-FL、Rarg-DN、Lrhl或Rarg_2A_Lrhl的PB轉座子轉染到MEF中。
iPS質(zhì)量直接與所用的啟動子相關是顯然的，這是因為PB-MSCV-RL不顯著改善iPS質(zhì)量(Fig 14E)。單獨的Rarg或Lrhl，不管使用哪個啟動子，都對iPS質(zhì)量無任何影響。然而，當由MSCV啟動子驅動時，Rarg-DN能顯著改善iPS質(zhì)量。接下來我們制備了PB-CAG-0ct4-2A-cMyc-2A-Rarg-2A-Lrhl-Klf4-2A-Sox2 (PB-TRE-0CRLKS)，來由單個啟動子表達所有6種轉錄因子。在相似的時間窗內(nèi)，這種構建體從MEF產(chǎn)生相似數(shù)量的高質(zhì)量iPS細胞。因此我們將MCl-tk盒克隆到PB-CAG-0CRLKS中，從而形成PB-CAG-OCRLKS-MCl-tk轉座子。與利用PB-CAG-0CRLKS相似，許多iPS細胞集落在轉染到通常在第8天挑選的MEF中4-5天后是可見的。擴增的iPS細胞對更昔洛韋(Ganc)敏感，這表明MCl-tk盒是功能性的。PB轉座子通過Pbase切自整合位點，并且在原處不留下足跡。因此我們通過用PL623轉染iPS細胞暫時表達Pbase，并且使所述細胞經(jīng)受Ganc選擇。通常，單次轉染通常獲得數(shù)百個Ganc抗性集落。這些Ganc抗性細胞的表征證實消除了這些細胞的PB轉座子，因此，這些細胞不含外源轉錄因子。6種因子所誘導的iPS細胞是多能性的為了進一步表征最初通過表達6種因子所產(chǎn)生的但是不含外源因子的iPS細胞，我們進行RT-PCR來檢測這些細胞中多能基因的表達。iPS細胞以與親代0ct4-IRES-Puro-Egfp ES細胞表達水平相似的水平強烈表達小鼠ES細胞多能性標志物(圖15A)。我們還檢測了關鍵多能性基因0ct4、Nanog以及Rexl的啟動子中的DNA甲基化模式。如圖3C所示，啟動子在這些細胞中完全脫甲基化。將6因子誘導的iPS細胞皮下注射到129/C57B6雜種Fl小鼠中，來檢測它們的體內(nèi)分化潛力。所有小鼠在2周的時間內(nèi)發(fā)展了畸胎瘤，并且在一個月后處死小鼠，用于腫瘤取樣。在顯微鏡下，在畸胎瘤中發(fā)現(xiàn)了代表所有3個胚層的細胞類型(圖15B)。此外，利用胚泡注射，很容易地獲得了高質(zhì)量嵌合體。當將嵌合小鼠與白化病C57B6野生型小鼠回交時，鑒定了攜帶刺豚鼠毛色的種系傳遞幼鼠，這表明注射的iPS細胞的有效種系貢獻(圖3E)。利用6種因子產(chǎn)生高質(zhì)量人類iPS細胞通過有效誘導內(nèi)源0ct4表達快速重編程小鼠成纖維細胞，促使我們探討RARG和LRHl是否也能在人類中改善重編程效率和質(zhì)量。通過比較人類、小鼠和大鼠基因組序列，我們確定，RAR-SFl結合位點即RAREoct在所有3個物種中是高度保守的(圖5A)，這表明RARG-LRH1可能在人類細胞中調(diào)節(jié)0ct4激活。我們構建了攜帶6種人類因子cDNA的PB-CAG轉座子。與使用小鼠cDNA相比，這些PB轉座子能由MEF快速產(chǎn)生高質(zhì)量小鼠iPS細胞(數(shù)據(jù)未顯示)。接下來我們將含有6種人類cDNA的I3B-CAG轉座子與PBase質(zhì)粒共轉染到人類新生兒包皮真皮成纖維細胞(HDFn)中。然后將這些人類成纖維細胞培養(yǎng)于補充了 bFGF的常規(guī)人類ES培養(yǎng)基中或補充了人類白血病抑制因子(hLIF)的常規(guī)小鼠ES細胞培養(yǎng)基(M15)中。我們在補充了 bFGF的人類ES培養(yǎng)基中鑒定了人類ES細胞樣集落。令人驚訝的是，小鼠ES樣集落出現(xiàn)于添加了 hLIF的M15培養(yǎng)基(圖16A)中。因此，我們利用標準小鼠ES方案處理了這些集落。通過胰蛋白酶處理，將人類iPS集落解離成單細胞懸浮液，并再次接種到STO飼養(yǎng)細胞上。能形成穩(wěn)定系的次級集落易于在M15+hLIF中從一半在第10天挑選的原代集落建立。在僅使用了 4種Yamanaka因子的對照組中，原代集落在形態(tài)上不同于用6種因子所產(chǎn)生的集落(圖16A)，我們從未能由在第10天挑選的集落建立穩(wěn)定的系。 ERK激酶和GSK3信號傳導級聯(lián)(2i)的抑制劑支持天然多能干細胞的體外生長(40)，但是不引發(fā)如同EpiSC—樣的多能干細胞(57)。已經(jīng)成功地用2i培養(yǎng)基來從困難小鼠株系(40)和從大鼠胚泡(14，58)衍生ES細胞。因此我們測試了我們的人類iPS細胞是否能存活于2i+hLIF培養(yǎng)基并且在2i+hLIF培養(yǎng)基中增殖。如圖16A所示，人類iPS細胞在2i+hLIF培養(yǎng)基中增殖良好，并且能由STO飼養(yǎng)細胞上的單細胞形成ES樣集落。為了測定人類iPS細胞的亞克隆效率，利用胰蛋白酶解離來自一個克隆的細胞并計數(shù)。將100或1000個細胞接種到M15+hLIF、20%KSR(敲除血清替代品)+hLIF或2i+hLIF培養(yǎng)條件。在這些條件下高達60%的細胞能再次形成集落(克隆效率)。盡管在2i+hLIF中所形成的集落通常更小，但是并未在這3種不同培養(yǎng)條件下的集落數(shù)量方面發(fā)現(xiàn)明顯差異(圖16A)。我們挑選了次級集落，并在M15+hLIF或2i+hLIF中擴增它們。擴增的克隆生長正常并且在兩種培養(yǎng)條件下保持未分化。當解離并稀釋成單細胞密度時，它們能形成三代集落，這表明它們大量體外操作的強健性。我們的人類iPS細胞在常規(guī)小鼠ES細胞培養(yǎng)基中健壯生長，這一事實表明，人類iPS細胞被與小鼠ES細胞中相同的核心分子調(diào)節(jié)機制調(diào)節(jié)。即使在大量培養(yǎng)后，iPS細胞的基因組仍然保持完整，這可通過FISH分析確定(圖10E)。我們還通過檢查關鍵ES細胞特異性基因的表達，進一步評價了人類iPS細胞。如圖16B和16C所示，這些基因以高水平表達，并且DNA甲基化分析證實，關鍵的人類多能性基因的啟動子未甲基化。人類iPS細胞的行為與小鼠ES細胞相似，并且因此對于人類基因組的基因操作極具潛力。為了探討這種可能性，我們首先測試了將外源DNA引入這些細胞中的PB轉座。我們將PB-SB-PGK-Neo轉座子與Pbase質(zhì)粒一起共轉染到人類iPS細胞中(31)。由一次電穿孔，我們可以獲得約520，000個G418抗性集落，其由5%的幸存細胞組成。這種轉座效率與在小鼠ES細胞中觀察到的效率相當(31)。我們隨后將PB-SB-SA-β geo捕獲轉座子和Pbase質(zhì)粒轉染到人類iPS細胞中。SA-β geo盒允許在人類iPS細胞中進行基因捕獲，因此能在基因組的插入位點中斷基因表達。利用一次電穿孔，我們收獲了 9，OOO個G418抗性集落，其代表存活于電穿孔的O. 09%的細胞。我們的人類iPS細胞系衍生于包皮成纖維細胞，因此都是雄性的。因為HPRT活性的喪失能通過6TG抗性評分，我們因此研究了 HPRT基因座處PB-SB-SA-β geo轉座的突變效率。在9，000個G418抗性集落中，回收了 I個6-TG集落。討論有效激活內(nèi)源0ct4是體細胞重編程(3)和成功的核轉移(38)的最重要的已知條件之一。在胚胎發(fā)育過程中，0ct4基因座逐步被幾層抑制沉默，其包括轉錄阻遏物的結合、組蛋白甲基化和脫甲基化以及DNA重新甲基化(47)。因此，將體細胞重編程為多能狀態(tài)需要除去這些0ct4表達抑制層中的每一個。已知2種Yamanaka因子即Klf4和cMyc除了其他功能外還參與染色質(zhì)改造(59)。以通過小分子抑制劑來進行組蛋白去乙?；⒔M蛋白甲基化或DNA甲基化為目標的嘗試，也在一定程度上改善了重編程效率(51，35，13)。然而，并未研究如何促使轉錄阻抑物復合體如COUP-TF和GCNF與0ct4啟動子分離并同時將轉錄激活劑結合于0ct4啟動子。因此，利用目前的平臺的iPS細胞中0ct4表達并不能總是得到 適當?shù)幕謴?60)。生物化學證據(jù)已經(jīng)表明，視黃酸信號傳導通過0ct4啟動子中的RA應答元件(RARE)即RAREoct正調(diào)節(jié)0ct4表達(26)。RAR: RXR異源二聚體特異性結合RAREoct，并且在存在低濃度RA的情況下，部分負責激活0ct4轉錄(28)。在分化過程中，高濃度RA具有高得多的RAREoct親和性，其所誘導的孤兒受體ARP-1/C0UP-TFII和EAR-3/C0UP-TFI，從RAREoct取代RAR: RXR，并通過募集共阻遏物主動沉默0ct4啟動子(28)。RAR = RXR異源二聚體的過表達能克服COUP-TF對0ct4的抑制(28)。RAREoct含有與RAR識別位點重疊的SFl結合位點，這為RAR激活0ct4提供了另一機制。SFl和RAR可以形成特異性結合RAREoct的復合體并協(xié)同激活0ct4 (29)。有意思的是，RAR-SFl復合體的形成和其對0ct4的激活都不需要RA (29)。此外，已經(jīng)證明，SFl與COUP-TFI在幾個其他基因中競爭相同的順式作用元件(61，62)。因此，RAR和SF1/LRH1復合體可能通過在結合RAREoct中拮抗COUP-TF而發(fā)揮0ct4表達的正調(diào)節(jié)劑的作用。綜合這些出版的生物化學數(shù)據(jù)和我們的觀察結果，我們提出了 Rarg和Lrhl在體細胞重編程中的工作模式。當單獨表達Rarg時，因為Lrhl和Sfl通常不在MEF中表達，因此該機制主要募集RXR來結合RAREoct并激活內(nèi)源0ct4轉錄。然而，RAR: RXR異源二聚體與RAREoct相對低的結合親和性使得其難以與諸如COUP-TF和GCNF的阻遏物進行競爭。因此，0ct4要么并未完全被激活，要么激活并非是穩(wěn)定的。這解釋了 Rarg過表達增強重編程效率，但是并未改善iPS細胞質(zhì)量。共表達Rarg和Lrhl允許Rarg-Lrhl復合體解除阻遏物結合RAREoct并有效激活0ct4轉錄。隨后已知與RAR相互作用的共激活劑，如CBP/p300、P/CAF以及SRC1/TIF2(36)被募集到0ct4基因座，來促進染色質(zhì)進一步重塑。因此，Rarg-Lrhl復合體穩(wěn)定地占據(jù)0ct4啟動子中的關鍵元件不僅上調(diào)內(nèi)源0ct4的轉錄水平,還促進0ct4啟動子染色質(zhì)結構的重塑。因此，體細胞重編程中最關鍵的障礙即內(nèi)源0ct4激活(47)，在重編程的早期階段得到克服，這顯著地加速了重編程過程并改善iPS細胞質(zhì)量。小鼠ES細胞系由預移植胚泡的內(nèi)細胞群(ICM)建立，并能對成體小鼠組織的所有譜系做貢獻。另一方面，小鼠EpiSC分離自移植后胚胎，即使當將它們注射到免疫缺陷小鼠中時能產(chǎn)生畸胎瘤，它們也不能定殖胚泡的ICM。EpiSC可能代表不同的多能細胞類型，其存在于小鼠胚胎發(fā)生的不同階段、位于不同的微環(huán)境中，并且因此響應來自ES細胞的不同外來信號出3)。因為小鼠EpiSC是利用人ES細胞培養(yǎng)基衍生，現(xiàn)有的人類ES和iPS細胞系可能代表干細胞層級更低級的另一引發(fā)的多能狀態(tài)出3)。引人注目的是，本文所報道的人類iPS細胞系在小鼠ES培養(yǎng)條件下生長強健并且行為與小鼠ES細胞相似，這表示小鼠和人類中天然多能干細胞的共同調(diào)節(jié)。綜述，我們在此報道了在激活0ct4基因座中Rarg和Lrhl的協(xié)同相互作用導致小鼠和人類體細胞的快速和有效重編程。所產(chǎn)生的小鼠和人類iPS細胞質(zhì)量卓越，同時人類iPS細胞與常規(guī)小鼠ES細胞高度相似，但是不同于現(xiàn)有人類ES細胞和iPS細胞。這些人類iPS細胞生長強健，擴增這些細胞和對其進行基因操作，會使得它們對于探討基因座功能和產(chǎn)生患者特異性、無突變且無外源因子的人類iPS細胞而言有吸引力。材料和方法質(zhì)粒載體構建
為了制備 PB-TRE、PB-MSCV 和 PB-CAG 載體，由 pTight (Clontech)擴增 Tet 應答元件(TRE)，由 pMSCV-Neo (Clontech)擴增 MSCV LTR，并由 pBluescript-CAG 載體擴增 CAGG啟動子(未發(fā)表的數(shù)據(jù))并將其克隆到PB-bpA載體中(未發(fā)表的數(shù)據(jù))。由最初的逆轉錄病毒載體(Addgene)擴增4種小鼠和人類Yamanaka因子,并將其分別克隆到PB-TRE、PB-MSCV以及PB-CAG轉座子載體中。由IMAGE克隆(Geneservice)擴增小鼠和人類Rarg、Lrhl以及Sf I，并將其克隆到轉座子載體中。MEF 制備將12. 5d. p. c. 0ct4-IRES-Puro_Egfp胚胎斷頭、去內(nèi)臟、用O. 25%胰蛋白酶解離并接種于MlO (敲除DMEM，10%胎牛血清(FBS)、青霉素鏈霉素和以及glutamax和非必須氨基酸(NEAA))中。HEFn購自Invitrogen并維持在補充了低血清補充物的Media106 (Invitrogen)中。轉染和細胞培養(yǎng)電穿孔后，將MEF接種于STO飼養(yǎng)板中的添加了小鼠LIF的Ml5 (敲除DMEM、15%FBS、青霉素-鏈霉素、glutamax、β-巰基乙醇(β ME)、ΝΕΑΑ)中。轉染后24h添加含有強力霉素(lug/mL)的M15，并每日更換。在第10日以96孔模式挑選iPS集落，并根據(jù)標準小鼠ES細胞培養(yǎng)條件進行維持。以相似的方式進行HDFn轉染，除了將成纖維細胞接種于添加了人類的M15中。轉染后24h添加含有強力霉素(2 μ g/mL)的M15，并在第10天以24孔模式挑選集落。擴增產(chǎn)生次級集落的克隆，并根據(jù)標準小鼠ES細胞培養(yǎng)條件進行維持。Splinkerette PCR如所述，進行確定PB基因組整合位點的Splinkerette PCR。用M13正向和反向引物對TA克隆的PCR產(chǎn)物進行雙向測序。利用BLAST，確定PB插入基因座。利用所述引物，對除去因子的PBiPS系的基因組進行PCR。RT-PCRRNA利用Reasy微型試劑盒(Qiagen)來分離、定量，并用gDNAWipeOut處理，用QuantiTect反向轉錄試劑盒(Qiagen)制備cDNA。對于每一 RT-PCR反應，我們利用50 - IOOng 所列的 cDNA 和引物。標準的 PCR 條件為94° C 30s、58_62。C 30s,72° C15 - 30s ；X 30 - 35 循環(huán)。免疫染色和流式細胞術使細胞生長于12飼養(yǎng)板。用PBS洗滌細胞、于25° C在4%PFA/PBS中固定lOmin、用O. 3%Triton X-IOO在PBS中于25。C滲透IOmin并在5%驢血清中封閉lh，并于4° C添加一抗過夜。在PBS中洗滌樣品，并于25° C添加二抗lh(cy3IgG，l:l，000;Alexa488IgGor IgM, 1:400;Alexa594IgG, 1:200)。體外分化測定解離人類PB-iPS系，并用于通過在AggreWell 400平板(StemCellTechnologies)中的無hLIF的M15中聚集產(chǎn)生擬胚體。生長14天后，將擬胚體接種 于Matrigel包被的蓋玻片或4室載玻片上。在再培養(yǎng)10天后，進行免疫組織化學?；チ鲂纬蓪⒓毎祽腋∮诤?0%FBS的DMEM中，并將100ml (IXlO6個細胞)皮下注射到用異氟烷麻醉的裸鼠(CByJ. Cg-Foxnlnu/J)兩側背側面。注射6周后，將畸胎瘤解剖、在10%的磷酸鹽緩沖的福爾馬林中固定過夜并包埋在石蠟中。切片用蘇木精和曙紅染色。圖例圖I.重編程中的RA信號傳導。A.通過piggyBac (PB)轉座進行重編程的策略的示意圖。用PB-MSCV-cDNA轉座子和轉座酶質(zhì)粒轉染0ct4報道MEFt，并將其直接接種于STO飼養(yǎng)細胞上。通常在3周內(nèi)出現(xiàn)ES樣集落。MlO和M15分別是MEF和ES細胞的培養(yǎng)基。B-C.表達Rara或Rarg以及4種Yamanaka因子顯著促進重編程，同時通過表達Rara-DN抑制RA信號傳導阻斷重編程。iPSC通過堿性磷酸酶染色觀察集落。重編程對照為 PB-PGK-Neo 加 Yamanaka 因子。** P<0. 005 ；*** P<0. 0005。FL :全長 cDNA ；DN :顯性失活形式。D.在重編程中短暫需要RA信號傳導。在重編程的各種階段添加Rarg的激動劑(⑶437)。第1-4天轉染后從第I天到第4天添加激動劑。DMSO為⑶437的溶劑，將其添加于對照平板中。E-F.多能性基因的表達(E)和重編程細胞中Nanog和Rexl基因座處的DNA甲基化(F)。僅對2. O μ g/ml Puro選擇具有抗性的細胞是完全重編程的iPSC，而僅對I. O μ g/ml Puro具有抗性的細胞是部分重編程的。ES 0ct4-IRES-Puro-Egfp敲入ES細胞；MEF 0ct4-IRES-Puro-Egfp 報道 MEF 細胞。G.通過 Rarg 激動劑 CD437 改善 iPSC 質(zhì)量。利用流式細胞術，通過0ct4基因座表達GFP分析iPSC (第1-4天的⑶437)的質(zhì)量。 在圖I (D)的柱狀圖中，第一長方塊表示第1-4天，第二個長方塊表示第1-8天，第三個長方塊表示第I - 12天，第4個長方塊表示第4-8天且第5個長方塊表示第4-12天。圖2. Rarg(R)和Lrh-1 (L)協(xié)同促進重編程。A. Tet-Οη重編程策略的不意圖。用PB-TRE-cDNA轉座子、PB-CAG-rtTA以及PB轉座酶質(zhì)粒轉染MEF，立即將其接種于STO飼養(yǎng)細胞上。轉染后24小時，添加Dox (I. O μ g/ml)。轉染后4、6、8以及10天，從培養(yǎng)基中除去Dox，同時立即應用嘌呤霉素選擇(2. O μ g/ml)來選擇0ct4基因座完全激活的細胞。嘌呤霉素在24小時內(nèi)殺死MEF和ES細胞。B. 6種因子(TRE-0CKS和TRE-RL)表達4天足以完全激活內(nèi)源0ct4表達,用于獲得不依賴Dox的iPSC。相比之下,4種Yamanaka因子(TRE-OCKS)直到表達至少12天，才出現(xiàn)PurcZiPSC集落。C.轉染后6天的集落的圖像。比例尺10. O μ m。D.共表達Rarg和Lrh-I (RL)而不是單獨表達Rarg或Lrh-I改善了 iPSC質(zhì)量。在轉染后第10天，挑選單個iPSC集落，并使其生長于96孔板中，用于在流式細胞術中表達GFP。_:ρ〈0.0005。E.在熒光素酶報道基因測定中Rarg和Lrh-I的協(xié)同相互作用激活0ct4啟動子。將連接于0ct4啟動子的熒光素酶報道基因轉染到MEF中。48小時后測量熒光素酶活性。針對在轉染中使用PB-Neo質(zhì)粒的陰性對照，使熒光素酶表達標準化。誤差條(bar)為平均值土 SD。圖3.不依賴Dox的小鼠iPSC的表征。A_B.多能性基因在小鼠iPSC中的強健表達。A.檢測0ct4和Nanog的iPS20_Al細胞的免疫染色。B.小鼠iPSC、親代MEF和野生型ES細胞中的0ct4、Nanog和Rexl的qRT-PCR。表達相對于Gapdh,并且針對親代0ct4報道小鼠ES細胞中的基因表達而標準化。Dox誘導6種因子(0CKS+RL)4天(Al)、6天(BI)或8天(Cl)產(chǎn)生所示的iPSC系。MEF 0ct4-IRES-Puro-Egfp報道MEF細胞；ES細胞0ct4-IRES-Puro-Egfp 敲入 ES 細胞。C. iPSC (iPS20_Al)中 0ct4 和 Nanog 的啟動子激活完全脫甲基化。D.衍生自iPSC的畸胎瘤含有所有3個胚層的細胞類型。圖版表示軟骨細胞(上部左側)、角質(zhì)細胞(上部右側)、腸樣上皮細胞(底部左側)以及神經(jīng)細胞(底部右側)。所有的照片均在相同的放大率下拍攝(x200)。E. iPSC對嵌合體中種系的貢獻。使嵌合體與野生型野生型C57BL6雌性(白化病者)雜交。種系傳遞幼鼠為刺鼠。 在圖3 (B)中的每一柱狀圖中，第一個長方塊表不mESC,第二個長方塊表不MiPS20-Al，第三個長方塊表示MiPS20-B2，以及第四個長方塊表示MiPS20_Cl。Fig 4.在無血清、無飼養(yǎng)細胞的條件下，將MEF重編程為基態(tài)iPSC。A.用PB-TRE-OCKS(4F)或PB-TRE-OCKS加PB-TRE-RU6F)重編程的AP+集落的數(shù)量。將轉染后的MEF接種于明膠化的6孔板(2xl05個/孔)的M15/LIF/Dox中，達I天，轉到N2B27/LIF/Dox中高達17天。B.利用qRT-PCR進行的基因表達分析。表達相對于Gapdh，并且針對野生型ES細胞而標準化。誤差條表示平均值土SD。C.用于Nanog和SSEA-I表達的iPSC(6F)的免疫染色。D. iPS(^6F)向代表3個胚層的細胞類型的體外分化，這可以通過免疫染色來檢測。抗體Tuj、神經(jīng)元特異性III型微管蛋白；SMA，平滑肌α-肌動蛋白；AFP，α-胎蛋白。在圖4(B)中的每一柱狀圖中，第一個長方塊表不ES,第二個長方塊表不4FiPS,第三個長方塊表示6F-iPS，且第四個長方塊表示MEF。圖5.不依賴Dox的獨特的人類iPSC的產(chǎn)生和表征。A. RAREoct序列在幾種哺乳動物中的保守性。B.利用Tet-0n6因子平臺重編程HDFn細胞。將PB_TRE_cDNA轉座子、PB-CAG-rtTA和轉座酶質(zhì)粒轉染到HDF中，將HDF接種于STO飼養(yǎng)細胞上。轉染后24小時，添加Dox (2. O μ g/ml)。Dox誘導通常持續(xù)15_20天。在轉染后高達30天,挑選集落用于擴增。或者，一旦除去Dox，立即將集落用胰蛋白酶進行處理，并再次接種至新的飼養(yǎng)板，用于次級集落的形成。C.典型的人類iPSC集落形態(tài)和AP染色。比例尺10.0μπι。D.親代HDFn、人類iPSC以及HlhESC細胞中的多能性基因的qRT-PCR分析。HiPS15_5和-10是由一次轉染產(chǎn)生的不依賴Dox的iPSC系。E.針對ES細胞表面標志物和多能性因子的人類iPSC的免疫染色。F.人類iPSC的體外分化?？贵wTuj、神經(jīng)元特異性III型β -微管蛋白；SMA，平滑肌α -肌動蛋白；AFP，α -胎蛋白。G.由人類iPSC分化的畸胎瘤。左側圖版軟骨(中胚層)；中部圖版神經(jīng)組織(外胚層)；有纖毛的腺上皮(內(nèi)胚層)。所有照片均在相同的放大率下拍攝(x200)。H.通過基因表達(qRT-PCR)所測量的人類iPSC的信號傳導依賴性。在存在FGF受體抑制劑(FGFRi)但是沒有添加JAK抑制劑(JAKi)的情況下，多能性基因的強健表達。用生長于KSR-FGF2(bFGF)或KSR_2i_LIF培養(yǎng)基(2i/LIF)中的HlhESC細胞作為對照。I.生長于不同條件下的人類iPSC的基因表達變化。如果再次培養(yǎng)于2i/LIF培養(yǎng)基中，則適應FGF的iPSC快速分化。這些細胞喪失0CT4和NANOG的表達，伴隨S0X17和SOXl的表達。相對于GADPH進行基因表達的定量分析。用生長于FGF2中的HlhESC細胞的表達作為對照。誤差條為平均值土SD。在圖5(D)中的前3個柱狀圖中，第一個長方塊表不HihESC,第二個長方塊表不HiPS15-5，且第三個長方塊表示HiPS15-10。在圖5(D)中第4個柱狀圖中，第一個長方塊表示HDFn，第二個長方塊表示HihESC，第三個長方塊表示HiPS15_5，且第四個長方塊表示HiPS15-10。在圖5(H)中的每一柱狀圖中，如果存在，則第一個長方塊表示HlhESC細胞中的FGF2，第二個長方塊表示HiPS15-10中的2i/LIF，第三個長方塊表示HiPS15_10細胞中的2i/LIF至FGF2，第四個長方塊表示HiPS15_10細胞中的FGF2至2i/LIF。在圖5(1)中的每一柱狀圖中，如果存在，則第一個長方塊表示HlhESC細胞中的 FGF2，第二個長方塊表示HlhESC細胞中的2i/LIF，第三個長方塊表示HiPS15_10中的2i/LIF，第四個長方塊表示HiPS15-10細胞中的2i/LIF/BMP4，第五個長方塊表示HiPS15-10細胞中的2i/LIF/JAKi，以及第六個長方塊表示HiPS15-10細胞中的2i/LIF/FGFRi。圖6. A.攜帶轉錄因子cDNA的PB轉座子。PB piggyBac轉座子；TR PB的末端重復；MSCV :小鼠干細胞病毒的LTR ；CAG CAG啟動子；TRE :四環(huán)素應答元件；pA :聚腺苷酸化信號傳導序列。B. The 0ct4-IRES-Puro_Egfp敲入等位基因。將IRES-Puro-Egfp盒革巴向0ct4基因座的3’ UTR來監(jiān)測并選擇該基因座的激活。C. 0ct4-IRES-Puro-Egfp MEF細胞0ct4-IRES-Puro-Egfp敲入ES細胞的流式細胞術分析。在分析中僅靶向的ES細胞是綠色的。D.在轉染中攜帶Rarg的轉座子DNA量的增加降低OCKS的重編程效率。對照無任何PB-MSCV-Rarg的單獨的OCKS。E.存活于兩種嘌呤霉素濃度的重編程小鼠細胞的流式細胞術分析。大多數(shù)I. O μ g/ml Puror集落不表達GFP。另一方面，存活于2. O μ g/ml嘌呤霉素選擇的重編程細胞都是GFP+。利用生長于96孔板的細胞直接進行流式細胞術分析。圖7. Rarg和Lrh-I協(xié)調(diào)促進重編程。A. PB轉座子攜帶多個被編碼2A的DNA鏈接的cDNA，2A即口蹄疫病毒2A自切割肽。CAG :CAG啟動子；pA :聚腺苷酸化信號傳導序列；rtTA:反向四環(huán)素應答轉錄激活劑(rtTA) ;TRE :四環(huán)素應答元件。B.利用單獨的PB-CAG-0CKS (上部的2幅)或與PB-CAG-RL —起(底部的2幅)重編程的典型iPSC集落。轉染后10天采集圖像。C.轉染后10天的iPSC集落的堿性磷酸酶染色。6種因子(CAG-0CKS和CAG-RL)比僅利用4種Yamanaka因子(CAG-OCKS)多產(chǎn)生高達20多倍的集落(右幅)。D.用于熒光素酶報道基因的DNA構建體的圖。460-bp的0ct4啟動子DNA片段位于RAREoct位點的側翼，將其克隆于luc2編碼序列之前。圖8.小鼠iPSC多能性的表征。A.檢測SSEAl和Nanog的iPS20_Al細胞的免疫染色。B.內(nèi)源多能性基因在小鼠iPSC中的強健表達。用α-肌動蛋白作為PCR對照，利用RT-PCR檢測表達。iPS20-Al、Bl以及Cl是DOX誘導6種因子(0CKS+RL)4天(Al)、6 天(BI)或 8 天(Cl)所產(chǎn)生的 3 種 iPS 細胞系。MEF 0ct4-IRES-Puro-Egfp 敲入MEF;ES :0ct4-IRES-Puro-Egfp敲入ES細胞。C.外源重編程因子在小鼠iPSC系中的表達的RT-PCR分析。對照在誘導外源因子表達的DOX存在的情況下生長的小鼠iPSC ；ES,親代 0ct4-IRES-Puro-Egfp 敲入 ES 細胞。0ct4_cMyc-外源的、cMyc_Klf4_ 外源的、Klf4-Sox2-外源的，是檢測PB-TRE-OCKS構建體中cDNA中連接片段的3個引物對。Rarg-Lrh-I-外源的是檢測PB-TRE-RL構建體的側翼序列的引物對。在大多數(shù)iPSC系中，外源因子的表達是不可檢測的。圖9. MEF在無飼養(yǎng)細胞無血清的條件下的重編程。A. MEFh用PB-TRE-OCKS (4_因子)或PB-TRE-OCKS加PB-CAG-RL (6-因子)轉染，并接種于N2B27加具有DOX的LIF的培養(yǎng)基中，達所示天數(shù)。一旦挑選集落就將它們培養(yǎng)于2i/LIF培養(yǎng)基中。通過表達4因子同時用DOX處理8天，沒有獲得集落。在另一實驗中，用2i/LIF培養(yǎng)基直接培養(yǎng)新鮮轉染的MEF0添加Dox高達17天，以便通過表達OCKS出現(xiàn)任何集落。然而，僅當使用6種外源因子時獲得集落。B.蘇木色素和曙紅染色的畸胎瘤石蠟切片含有所有3個胚層的衍生物。上皮分化(伴隨角蛋白Perl的形成)和神經(jīng)分化(伴隨花飾狀物和神經(jīng)管的形成)顯示于上排圖中。內(nèi)胚層衍生物(箭頭所示)以沿杯狀細胞、腸上皮樣細胞以及潘氏細胞排列的 顆粒狀結構表示。內(nèi)胚層衍生物由軟骨、免疫脂肪組織和肌肉組成。所有照片均在相同的放大率下拍攝(200x)。圖10.用6因子平臺(CAG啟動子版本)產(chǎn)生獨特的人類iPSC細胞。A.在M15加LIF培養(yǎng)基或在2i/LIF培養(yǎng)基中形成的人類iPSC集落，其與常規(guī)小鼠ES細胞集落相似。上部左幅用4種Yamanaka因子重編程的典型集落；上部右幅利用6種因子重編程的iPSC集落。在轉染后10天采集圖像。底部左幅將原代iPSC集落之后的次級集落解離并再接種于飼養(yǎng)細胞上；底部右幅以單細胞密度亞克隆后的典型人類iPSC集落。B.免疫染色所檢測的內(nèi)源多能性蛋白質(zhì)在人類iPSC中的表達。C. RT-PCR所檢測的多能性基因在人類iPSC中的表達。HiPSl-3和4、HiPS6-4和16是4種獨立的iPSC系。HDF :人類真皮成纖維細胞；hESC:人類ES細胞。D.在畸胎瘤中人類iPSC向3個胚層的細胞類型的分化。上部左幅具有偶然的花飾品狀物(箭頭)的神經(jīng)組織；上部右幅纖維肌性纖維(箭頭)；底部左幅寬松的間質(zhì)(箭頭)；底部右幅有纖毛的顆粒狀上皮(箭頭)。所有照片均以相同的放大率拍攝(x200)。E.大量傳代(>20代)后人類iPSC的正常核型。上部圖DAPI ;底部圖MFISH。F.人類iPSC的Y染色體基因分型證實了人類iPSC的HDFn來源。用16種人類Y染色體標志物進行基因分型。圖11.利用6因子Tet-On系統(tǒng)(不依賴Dox)所產(chǎn)生的獨特的人類iPSC的表征。A.用人類GADPH作為對照，人類iPSC中基因表達的RT-PCR分析。HDF :人類真皮成纖維細胞；hESC H1 人類 ES 細胞。B.人類 iPSC 的 SSEA-4、Tra-1-60 以及 Tra_l_81 表達的 FACS分析。左幅HDF對照，其不表達SSEA-4、TRA-l-60或TRA-1-81。C.人類iPSC中外源因子表達的RT-PCR分析。對照生長于誘導外源因子表達的DOX中的iPSC ；hESC H1人類ES細胞。PCR擴增后，2種系不具有明顯的外源0CT4、S0X2和MYC、KLF4表達。D.在大量的體外培養(yǎng)(>20代)后，人類iPSC具有正常的核型。上部圖DAPI ;底部圖MFISH。E.將基因捕獲PB轉座子轉座子插入HPRT基因座，破壞了人類iPSC中的HPRT活性。在HPRT基因座的內(nèi)含子2中發(fā)現(xiàn)了基因捕獲PB轉座子整合。底部圖PB轉座子和HPRT基因座DNA連接的序列。圖12. Rarg顯性失活等位基因阻斷ES細胞分化A.攜帶強CAG啟動子/增強子和一對剪接受體的PB轉座子的示意圖。
B. Rexl-Puro-IRES-Egfp 敲入小鼠 ES 細胞系的圖。C.小鼠ES細胞基因篩選的策略，來鑒定能夠阻斷視黃酸所誘導的ES細胞分化的突變體。D.基因篩選中所鑒定的Rarg基因座處的4個獨立的突變。E. RA誘導Rarg或Rara顯性形式的過表達所阻斷的ES細胞分化。F. RA誘導Rarg或Rara特異性拮抗劑所阻斷的ES細胞分化。在圖12(E)中每一柱狀圖中，如果存在，則第一個長方塊表示PB-MSCV-Rara-DN，第二個長方塊表示PB-MSCV-Rarg-DN，第三個長方塊表示PB-PGK-Neo，第四個長方塊表示PB-MSCV-Rara-FL，以及第五個長方塊表示 PB-MSCV-Rarg-FL。在圖12(F)中的每一柱狀圖中，如果存在，則第一個長方塊表示單獨的RA，第二個長方塊表示RA+Ro-41-5253以及第三個長方塊表示RA+CD2665。圖13. RA信號傳導在將小鼠MEF重編程為iPS細胞中發(fā)揮關鍵作用。A. iPS細胞的較高質(zhì)量與存活于更高濃度的嘌呤霉素相關。B.過表達Rarg-FL顯著增加重編程效率。C. iPS細胞培養(yǎng)板顯示Rarg增強重編程效率。細胞用結晶紫染色。D. Rarg-DN的過表達也改善iPS克隆的質(zhì)量但是降低重編程效率。E. Rarg的劑量影響重編程效率。F. Rarg或Rara特異性激動劑增強重編程效率。G. Rarg特異性激動劑改善iPS細胞的質(zhì)量。在圖13(F)的柱狀圖中，第一個長方塊表示第1-4天，第二個長方塊表示第1_8天，第三個長方塊表示第1-12天，第四個長方塊表示第4-8天，第五個長方塊表示第4-12天，以及第六個長方塊表示第8-12天。圖14. Rarg和Lrhl協(xié)同作用促進重編程A. Rarg特異性拮抗劑處理能改善部分重編程的iPS克隆的質(zhì)量。B. Lrhl的過表達促進重編程。C. Puro抗性iPS細胞集落非常早的出現(xiàn)顯示通過6種因子的MEF快速重編程。D.快速實現(xiàn)完全的重編程多能性需要Rarg和Lrhl的表達。E. Rarg和Lrhl表達的劑量對于iPS細胞很關鍵。在圖14(A)的柱狀圖中，在圖13(F)的柱狀圖中，第一個長方塊表示第I天，第二個長方塊表示第2天，第三個長方塊表示第3天，以及第四個長方塊表示第4天。圖15. 6種因子重編程的iPS細胞的高質(zhì)量A.利用Rarg和Lrhl所產(chǎn)生的小鼠iPS細胞具有ES細胞多能性標志物的強健表達。B. 6因子所誘導的小鼠iPS細胞能對畸胎瘤中的所有譜系有貢獻。圖16.利用6種因子產(chǎn)生高質(zhì)量人類iPS細胞A.在M15加hLIF培養(yǎng)基中所產(chǎn)生的人類iPS細胞集落(上部圖)。在2i加hLIF培養(yǎng)條件下擴增的人類iPS細胞集落(底部圖)。B.人類iPS細胞表達高水平的0CT4和NANOG。C. RT-PCR分析證實了人類iPS細胞種多能性基因的高水平表達。4_1、4_2、4_3以及4-5是人類iPS細胞。ES :人類ES細胞對照。參考文獻I. K. Takahashij S. Yamanakaj Cel1126，663 (Aug 25，2006).2. K. Okitaj T. Ichisakaj S. Yamanakaj Nature448，313 (Jul 19，2007) ·3. M. Wernig et al·，Nature 448, 318 (Jul 19, 2007).4. J. Hanna et al.，Cel1133，250 (Apr 18,2008).5. T. Aoi et al.，Science 321，699 (Aug I, 2008).6. M. Wernig et al. , Nat Biotechnol26，916 (Aug，2008) ·
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權利要求
1.一種通過體細胞的核重編程制備誘導性多能干細胞的方法，所述方法包括使所述體細胞與核重編程因子NRF接觸的步驟，所述因子包含下述中的ー種或多種 (i)視黃酸受體(RAR/RXR)家族成員的基因產(chǎn)物，或其激動劑或拮抗劑； (ii)Lrhl家族成員的基因產(chǎn)物；或其激動劑； (iii)視黃酸或參與視黃酸的合成或代謝的基因產(chǎn)物；或其激動劑或拮抗劑； (iv)參與視黃酸家族成員轉運的基因產(chǎn)物； (V)編碼上文(i)-(iv)中任一基因產(chǎn)物的多核苷酸。
2.權利要求I的方法，其中所述NRF包含視黃酸受體RAR家族成員的基因產(chǎn)物或編碼視黃酸受體RAR家族成員的基因產(chǎn)物的多核苷酸和Lrhl家族成員的基因產(chǎn)物或編碼Lrhl家族成員的基因產(chǎn)物的多核苷酸。
3.權利要求I或2的方法，其中所述NRF包含Rarg和Lrhl基因產(chǎn)物和編碼此類基因產(chǎn)物的多核苷酸。
4.權利要求I的方法，包含具有C末端截短的Rarg蛋白。
5.前述權利要求中任ー項的方法，其中所述NRF包含Oct家族基因和Myc家族基因的基因產(chǎn)物或編碼Oct家族基因和Myc家族基因的基因產(chǎn)物的多核苷酸或它們的等同物或替代物。
6.權利要求5的方法，其中所述NRF還包含Klf家族基因的基因產(chǎn)物或編碼Klf家族基因的基因產(chǎn)物的多核苷酸。
7.權利要求5或6的方法，其中所述NRF還包括Sox家族的基因產(chǎn)物或編碼Sox家族的基因產(chǎn)物的多核苷酸。
8.前述權利要求中任ー項的方法，包括 (a)使體細胞與NRF接觸，所述NRF為下述中的ー種或多種 (i)視黃酸受體(RAR/RXR)家族成員的基因產(chǎn)物，或其激動劑； (ii)Lrhl家族成員的基因產(chǎn)物；或其激動劑； (iii)視黃酸或參與視黃酸家族成員的合成或代謝的基因產(chǎn)物；或其激動劑或拮抗劑； (iv)參與視黃酸家族成員轉運的基因產(chǎn)物； (v)編碼上文(i)-(iv)中任一基因產(chǎn)物的多核苷酸；以及然后 (b)任選地檢查從而確定所述體細胞是否已經(jīng)被重編程，以及 (c)使步驟(a)的產(chǎn)物與RA或RAR/RXR家族成員的拮抗劑接觸，或消除與所述NRF的接觸，從而維持多能性。
9.NRF，包括下述中的ー種或多種 (i)視黃酸受體RAR/RXR家族成員的基因產(chǎn)物，或其激動劑或拮抗劑； (ii)Lrhl家族成員的基因產(chǎn)物；或其激動劑或拮抗劑； (iii)Lrhl家族成員的基因產(chǎn)物； (iv)視黃酸或參與視黃酸的合成或代謝的基因產(chǎn)物；或其激動劑； (v)參與視黃酸家族成員轉運的基因產(chǎn)物； (vi)編碼上文⑴至(iv)中任一基因產(chǎn)物的多核苷酸。
10.權利要求9的NRF，其用于將體細胞重編程為誘導性多能細胞。
11.權利要求9或10的NRF，其包含或編碼至少兩種基因產(chǎn)物。
12.權利要求11的NRF，其包含或編碼RAR家族成員和Lrhl家族成員的基因產(chǎn)物。
13.權利要求12的NRF，其包含或編碼RARG和Lrhl的基因產(chǎn)物。
14.權利要求9-13的NRF，其還包含或編碼Oct家族基因和Myc家族基因的基因產(chǎn)物。
15.權利要求14的NRF，其還包含或編碼Klf家族基因的基因產(chǎn)物。
16.權利要求14或15的NRF，其還包含或編碼Sox家族的基因產(chǎn)物。
17.通過權利要求1-8所述的方法獲得的或可獲得的誘導性多能干細胞。
18.誘導性人類多能細胞，其特征為下述中的至少ー種 表達ー種或多種多能性標志物，如0ct4、Nanog、Rexl ； 不依賴FGF生長； 籲在傳代后保持正常的核型，所述核型利用光譜核型分析進行測量； 當注射到小鼠中時能形成畸胎瘤；oct4、nanog或rexl中的一個或多個的啟動子區(qū)脫甲基化； 細胞可以解離成能形成次級集落的活單細胞； 在M15+hLIF培養(yǎng)基和/或2i+LIF培養(yǎng)基中增殖； 外源重編程因子表達不存在或不顯著。
19.權利要求17或18的誘導性多能干細胞，其中所述iPS細胞包含外源DNA序列。
20.權利要求19的誘導性多能干細胞，其中當所述外源DNA序列為外源重編程因子的序列吋，所述外源序列不表達。
21.權利要求17或18的誘導性多能干細胞，其中所述iPS細胞不包含外源重編程因子。
22.權利要求17或18的誘導性多能干細胞，其利用權利要求15或權利要求16的NRF產(chǎn)生，其中所產(chǎn)生的iPS細胞在染色體中不具有KLF-4和/或S0X2插入。
23.通過分化權利要求17-22中任ー項的誘導性多能干細胞而衍生的體細胞。
24.組織、器官或非人類動物，其包含通過分化權利要求17-22中任ー項的誘導性多能干細胞而衍生的體細胞。
25.藥物組合物，其包含權利要求9-16的核重編程因子或權利要求17-24的iPS細胞或其衍生的細胞或組織或器官以及藥學可接受賦形劑。
26.權利要求9-16的核重編程因子或權利要求17-24所述的iPS細胞或其衍生的細胞或組織或器官在醫(yī)藥中的用途。
27.在有需要的患者中預防疾病或治療疾病的方法，所述方法包括將藥學可接受量的下述之ー送遞給所述患者權利要求9-16的核重編程因子、權利要求17-23的細胞或權利要求24的組織或器官，任選地是以權利要求25的藥物組合物的形式。
28.權利要求9-16的核重編程因子、權利要求17-23的細胞或權利要求24的組織或器官，任選地以權利要求25的藥物組合物的形式，在制備用于治療有需要的患者的藥物中的用途。
29.權利要求27或權利要求28的體細胞的方法或用途，其中所述用于重編程的體細胞獲得自意圖得到治療的患者。
全文摘要
描述了重編程的體細胞、用于重編程的方法、用于體細胞的重編程因子以及治療因子和細胞的用途。所述的核重編程因子[NRF]包含下述中的一種或多種視黃酸受體(RAR/RXR)家族成員的基因產(chǎn)物或編碼視黃酸受體(RAR/RXR)家族成員的基因產(chǎn)物的多核苷酸，或其激動劑或拮抗劑；Lrh1家族成員的基因產(chǎn)物或其激動劑；視黃酸或參與視黃酸的合成或代謝的基因產(chǎn)物，或其激動劑或拮抗劑；或參與視黃酸家族成員轉運的基因產(chǎn)物。
文檔編號C12N5/074GK102822345SQ201080050341
公開日2012年12月12日 申請日期2010年9月7日 優(yōu)先權日2009年9月7日
發(fā)明者P·劉, W·王, J·楊 申請人:基因組研究有限公司