專利名稱：β-氨基酸的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及應(yīng)用乙內(nèi)酰脲酶和/或二氫嘧啶酶從任選取代的二氫尿嘧啶生物催化生產(chǎn)3 -氨基酸前體的方法、從所述前體生產(chǎn)3 -氨基酸的方法、乙內(nèi)酰脲酶及其在所述生物催化生產(chǎn)￠-氨基酸前體或￠-氨基酸的方法中的用途、以及獲得所述乙內(nèi)酰脲酶的方法。
背景技術(shù)：
對映體純的￠-氨基酸是用于具有很廣泛的生物活性的新治療劑的有價值的構(gòu)建模塊。盡管已經(jīng)開發(fā)了制備它們的許多生物催化途徑，但尚未出現(xiàn)是可普遍適用的一種方法。類似地，幾乎沒有開發(fā)￠-氨基酸的化學(xué)催化途徑，多數(shù)需要化學(xué)計算量的手性助劑。
二氫嘧啶酶和乙內(nèi)酰脲酶是生物催化合成氨基酸或它們前體的可能候選物。Gaebler和Keltch在20世紀20年代首次報道了乙內(nèi)酰脲酶裂解活性(Gaebler，0. H.；Keltch, A. K. On the metabolism of hydantoins and hydantoic acid, 1926 ;Vol. 70)。Eadie等在20世紀50年代首次提出微生物乙內(nèi)酰脲酶與動物二氫嘧啶酶是同一的(Eadie,G. ；Bernheim,F. ；Bernheim,M. Journal of Biological Chemistry 181:449-458,1949)。分離自小牛肝臟和植物的二氫嘧啶酶催化二氫尿嘧啶和二氫胸腺嘧啶分別水解為N-氨基甲?；?￠-丙氨酸和N-氨基甲酰基-2-甲基-￠-丙氨酸。這些酶還將(R)-5-單取代的乙內(nèi)酰脲裂解為(R)-N-氨基甲酰基-氨基酸。最近的文獻一般提議來自微生物來源的D-乙內(nèi)酰脲酶可被認為是動物二氫嘧啶酶的對應(yīng)物，其中Nonaka及其同事提出了這兩種酶之間的進化關(guān)系(Hamajima, N. ；Matsuda, K. ；Sakata, S. ；Tamaki, N. ；Sasaki, M.；Nonaka, M. Genel80 :157-163，1996)。Syldatk等推斷二氫嘧啶酶和乙內(nèi)酰脲酶并不必然是相同的酶(Syldatk, C. ；May, 0. ；Altenbuchner, J. ；Mattes, R. ；Siemann, M. AppliedMicrobiology and Biotechnology 51:293-309,1999)。根據(jù)它們的特異性，通常使用乙內(nèi)酰脲酶不同的立體選擇性將它們分類為D-、L-或非特異性的(Ogawa, J. ；Shimizu,S. Journal of Molecular Catalysis B Enzymatic 2:163-176,1997)。術(shù)語經(jīng)常替換使用(尤其是在較早期的雜志中)的這一事實使得由乙內(nèi)酰脲酶和二氫嘧啶酶命名系統(tǒng)所產(chǎn)生的問題進一步惡化。酰胺水解酶也稱為環(huán)酰胺酶[E. C. 3. 5. 2]，其為超過14種酶的一組酶，它們均作用于環(huán)酰胺環(huán)上，并含有許多高度保守區(qū)域和不變氨基酸區(qū)域(Kim, G. J. ；Cheon, Y. H. ；Kim, H. S. Biotechnology and Bioengineering 1998,61，1-13)。這一組包含了羧甲基乙內(nèi)酰脲酶[E. C. 3. 5. 2. 4]、尿囊素酶[E. C. 3. 5. 2. 5]、
I-甲基乙內(nèi)酰脲酶[E. C. 3. 5. 2. 14]和羧乙基-乙內(nèi)酰脲酶，所有的這些在技術(shù)上都是乙內(nèi)酰脲酶，因為它們的底物是天然存在的乙內(nèi)酰脲衍生物。落入更寬的環(huán)酰胺酶組的其他酶包括二氫乳清酸酶[E. C. 3. 5. 2. 3]和二氫嘧啶酶[E. C. 3. 5. 2. 2]，后者通常稱為D-乙內(nèi)酰脲酶，因為其能夠水解(R)-5-單取代的乙內(nèi)酰脲衍生物。當N-氨基甲酰基-氨基酸被假設(shè)為前生命肽的原始合成元時，這一蛋白超家族最可能是在史前地球上進化的。乙內(nèi)酰脲酶用于將5-取代的乙內(nèi)酰脲(R)-I和⑶-I的外消旋混合物對映選擇性地水解為它們相應(yīng)的N-氨基甲酰基衍生物(R)-2和(S)-2的用途已得到了確立(參考以下流程 I)，并描述在文獻中(Morin, Enzyme Microb. Technol. 15 :208-214,1993 ；Fan 和Lee,Biochemical Engineering J. 8 157-164,2001 ;Arcuri等，J.Molecular Catalysis B21 :107-111,2003 ;Arcuri 等，Amino Acids 19:477-482,2000)。其已發(fā)展至這樣的階段，其中商業(yè)方法已應(yīng)用這一技術(shù)規(guī)模地運行用于生產(chǎn)特定D-(R)-氨基酸(R)-3。這些方法的關(guān)鍵方面是未反應(yīng)的對映體(S)-I的原位外消旋與(R)-2的氨甲酰水解酶催化水解，其導(dǎo)致了動態(tài)動力學(xué)拆分(DKR)反應(yīng)。流程I
權(quán)利要求
1.生物催化生產(chǎn)3-氨基酸前體的方法，其包括使至少一種通式(I)的底物在至少一種催化乙內(nèi)酰脲和/或二氫嘧啶環(huán)水解裂解的酶的存在下反應(yīng)，
2.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其還包括將所述式(II)的￠-氨基酸前體轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的式(III)的氨基酸
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述3-氨基酸前體的轉(zhuǎn)化在酸性pH下進行，或在氨甲酰水解酶存在下進行。
4.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的方法，其中所述至少一種乙內(nèi)酰脲酶和/或二氫P密唳酶是可從土壤桿菌屬(Agrobacterium)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和紅豆屬(Vigna)的生物體尤其是赤豆(Vigna angular is)獲得的酶。
5.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的方法，其中R1是H且R2是任選取代的芳基。
6.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的方法，其中所述反應(yīng)在Tris-緩沖的或硼酸鹽緩沖的反應(yīng)混合物中進行，優(yōu)選在Tri S-緩沖的反應(yīng)混合物中進行。
7.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的方法，其中所述反應(yīng)在約7.0至約11. 0的pH下、優(yōu)選在約7. 5至約10. 0的pH下、以及尤其優(yōu)選在約7. 5至約8. 0的pH下進行。
8.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的方法，其中所述反應(yīng)在約1%至約20%二甲基亞砜存在下、優(yōu)選在約10% 二甲基亞砜存在下進行。
9.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的方法，其中所述反應(yīng)在約30°C至約60°C、優(yōu)選約30°C至約50°C、以及尤其約40°C至50°C范圍內(nèi)的溫度下進行。
10.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的方法，其中所述反應(yīng)進行約I小時至約25小時、優(yōu)選約3小時至約10小時、以及尤其約4小時至約5小時。
11.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的方法，其中所述至少一種底物選自在5-位或在6-位單取代的二氫尿嘧啶，尤其是6-苯基二氫尿嘧啶、4-氟-6苯基-二氫尿嘧啶、3-溴-6-苯基-二氫尿嘧啶、5-甲基二氫尿嘧啶和6-甲基二氫尿嘧啶。
12.可通過權(quán)利要求1-10任一項獲得的P-氨基酸前體或P -氨基酸，或可通過根據(jù)權(quán)利要求2-10任一項的方法獲得的P -氨基酸用于生產(chǎn)水解穩(wěn)定的肽、藥物活性劑，尤其是抗生素、抗癌劑、抗血栓形成劑、抗真菌殺蟲劑、驅(qū)蟲劑、非肽整聯(lián)蛋白拮抗劑、生物堿和/或細胞毒劑的用途。
13.乙內(nèi)酰脲酶，其含有至少一個以下的部分序列 ITGPEGQRLAGP(SEQ ID NO :7)EEIARARKSGQRVIGEPVAS (SEQ ID NO :5)
14.乙內(nèi)酰脲酶，其通過從生物體制備細胞材料的粗提取物，并使所述粗提取物進行以下相繼的純化步驟而獲得 a)離子交換色譜 b)疏水色譜 c)凝膠過濾 d)親和色譜 e)陰離子交換 f)凝膠過濾。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14的乙內(nèi)酰脲酶,其從土壤桿菌屬(Agrobacterium)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和紅豆屬(Vigna)的生物體尤其是赤豆(Vigna angular is)獲得。
16.根據(jù)權(quán)利要求13-15中任一項的乙內(nèi)酰脲酶用于根據(jù)權(quán)利要求1-11任一項的方法的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及應(yīng)用乙內(nèi)酰脲酶和/或二氫嘧啶酶從任選取代的二氫尿嘧啶生物催化、對映選擇性生產(chǎn)β-氨基酸前體的方法，從所述前體生產(chǎn)β-氨基酸的方法，乙內(nèi)酰脲酶及其在所述生物催化生產(chǎn)β-氨基酸前體或β-氨基酸的方法中的用途，以及獲得所述乙內(nèi)酰脲酶的方法。
文檔編號C12N9/86GK102782128SQ201080051363
公開日2012年11月14日 申請日期2010年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月15日
發(fā)明者B·豪爾, K·迪特里希, M·奧尼爾, N·施耐德, N·特納 申請人:巴斯夫歐洲公司