專利名稱：用于制備多肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于在基因修飾的酵母菌株中制備多肽的方法。
背景技術(shù)：
用適宜的包含編碼異源蛋白的DNA序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞后在酵母中表達(dá)所述蛋白已經(jīng)成功地用于多種多肽，例如胰島素前體、胰高血糖素、胰高血糖素樣肽和它們的功能類似物。然而，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)表達(dá)產(chǎn)物是各種期望的具有不同的氨基酸鏈長度的多肽前體的異質(zhì)混合物。這是因?yàn)榻湍府a(chǎn)生大量負(fù)責(zé)加工較大的前體分子以釋放成熟多肽的蛋白水解酶。包括/ 和iKZ/基因產(chǎn)物在內(nèi)的大量蛋白酶負(fù)責(zé)這樣的酵母蛋白降解。 使用他Z/破壞株用于重組體蛋白的表達(dá)早先已有描述。因此，EP341215和US6，103，515描述使用缺乏他Z/的酵母菌株用于產(chǎn)生不帶堿性C-末端氨基酸的肽，例如hANP、EGF、結(jié)締組織活化肽-III、水蛭素和水蛭素變體。大半已知的神經(jīng)肽和內(nèi)分泌肽是a -酰胺化的，且在大多數(shù)情況下，此結(jié)構(gòu)特征對(duì)受體識(shí)別、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和因此對(duì)生物學(xué)功能是必不可少的。a -酰胺化源自于C-末端甘氨酸，其被酶促轉(zhuǎn)變?yōu)轷０?。如果?xì)胞具有用于體內(nèi)a-酰胺化的必要機(jī)器(machinery)，那么可直接在生產(chǎn)細(xì)胞中生產(chǎn)a-酰胺化肽。然而，包括酵母在內(nèi)的一些有機(jī)體不能產(chǎn)生a-酰胺化，因?yàn)樗鼈儾槐磉_(dá)用于體內(nèi)a -酰胺化的必要酶，因此通過細(xì)胞生產(chǎn)的肽不得不通過隨后的體外步驟a-酰胺化。如果酵母被用作重組體生產(chǎn)細(xì)胞，一個(gè)解決方案是生產(chǎn)帶有C-末端甘氨酸的前體多肽，然后在隨后的體外過程中用a-酰胺化酶將其轉(zhuǎn)變?yōu)閍-酰胺化肽(D. J.Merkler (1994). C-Terminal amidated peptides: Production by the in vitroenzymatic amidation of glycine extended peptides and the importance of theamide to bioactivity (C_末端酰胺化肽通過甘氨酸延伸肽的體外酶促酰胺化進(jìn)行生產(chǎn)和酸胺對(duì)生物活性的重要性) Enzyme Microb. Technol. : 16(450-456)。然而，意想不到地，本發(fā)明的發(fā)明人等已發(fā)現(xiàn)C-末端甘氨酸被從釀酒酵母{Saccharomyces cerevisiae)表達(dá)的大量肽中切除,使得隨后轉(zhuǎn)化為a -酰胺化肽不可倉泛。本發(fā)明通過使用不切除C-末端甘氨酸殘基的基因修飾的酵母菌株提供一種針對(duì)該問題的解決方案。發(fā)明概沭
在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種在酵母中制備帶有C-末端Gly的多肽的方法，其中酵母菌株具有非功能性基因。可通過使用熟知的技術(shù)使於沈7基因無功能。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中簡單地缺失 基因，而在另一個(gè)實(shí)施方案中通過位點(diǎn)特異突變(例如通過同源重組)使他Z/基因無功能。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種在具有非功能性基因的酵母菌株中制備多肽的方法，其中所述多肽具有甘氨酸作為其C-末端氨基酸殘基，且其中所述方法包括以下步驟
a)將包含編碼多肽的DNA序列的酵母菌株在用于在酵母菌株中表達(dá)多肽的條件下培養(yǎng)，和
b)分離表達(dá)的多肽。表達(dá)的多肽可從細(xì)胞培養(yǎng)物或從酵母細(xì)胞中分離，這取決于表達(dá)的多肽是否從酵母細(xì)胞中分泌。
如果C-末端倒數(shù)第二個(gè)氨基酸是以下氨基酸殘基之一，那么C-末端甘氨酸特別不穩(wěn)定Tyr、Phe、Met、Leu、Trp、Ala、Ile和Arg。因此,在一個(gè)實(shí)施方案中，C-末端倒數(shù)第二個(gè)氨基酸為 Tyr> Phe、Met、Leu、Trp、Ala、lie 或 Arg。“C_末端倒數(shù)第二個(gè)氨基酸”意指與C-末端氨基酸殘基(在該情形中是甘氨酸殘基)的N-末端連接的氨基酸殘基。特別地，當(dāng)C-末端倒數(shù)第二個(gè)氨基酸是疏水氨基酸殘基且特別是芳族氨基酸殘基時(shí)，C-末端甘氨酸更不穩(wěn)定。因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，與C-末端Gly鄰接的氨基酸殘基是Tyr、Trp、Phe、Val、Leu、He或Met，和在另一個(gè)實(shí)施方案中，與C-末端Gly連接的氨基酸殘基是Val、Leu、Ile或Met，和在另一個(gè)實(shí)施方案中，與C-末端Gly連接的氨基酸殘基是Tyr、Phe或Trp。在又一個(gè)實(shí)施方案中，與C-末端Gly連接的氨基酸殘基是Tyr。除非功能性他Z/基因之外，酵母菌株可具有另外的非功能性蛋白酶基因。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，酵母菌株可具有至少一種選自PEP4、YPSU MKC7, YPS3、YPS5、YPS6、YPS7、PRB1、STE13和KEX2的另外的非功能性蛋白酶基因。所述多肽的大小也可能是相關(guān)的，在另一個(gè)實(shí)施方案中，多肽在主鏈中具有約25至約75個(gè)氨基酸殘基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多肽在主鏈中具有約25至約60個(gè)氨基酸殘基，和在又一個(gè)實(shí)施方案中，多肽在主鏈中具有約25至約45個(gè)氨基酸殘基。酵母菌株可以是任何能表達(dá)和分泌外源DNA的酵母菌株。然而，在一個(gè)實(shí)施方案中，酵母菌株是釀酒酵母菌株。本發(fā)明的方法可包括另外酶促轉(zhuǎn)變表達(dá)和分泌的多肽。因此，在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，通過在另外的體外步驟中用a -酰胺化酶進(jìn)行酶促轉(zhuǎn)變，將帶有C-末端Gly的表達(dá)和分泌的多肽轉(zhuǎn)變?yōu)轷０贰０l(fā)明詳述
如提到的，已證明在釀酒酵母菌株中帶有C-末端甘氨酸的肽的表達(dá)是成問題的，因?yàn)楦拾彼岜挥行谐?，特別是如果C-末端倒數(shù)第二個(gè)氨基酸是酪氨酸，如在PP (胰多肽)、PYY和淀粉狀蛋白毒素(amylin)中，根據(jù)本發(fā)明，已發(fā)現(xiàn)在酵母菌株中負(fù)責(zé)切割C-末端甘氨酸的蛋白酶是Kexlp蛋白酶?！癒exI ”或“Kexlp”意指優(yōu)先催化脫去C-末端賴氨酰和/或精氨酰殘基的絲氨酸羧妝酶(Shilton BH, Thomas DY, Cygler M 1997 Crystal structure of Kexl deltap, aprohormone-processing carboxypeptidase from Saccharomyces cerevisiae (酉良酒酵母的激素原加工羧肽酶Kexl Ap的晶體結(jié)構(gòu)) Biochemistry 36: 9002-9012)。Kexlp或羧肽酶yscci是膜相關(guān)外肽 酶，并在酵母中放毒者因子和交配因子的成熟中有重要作用。該酶對(duì)C-末端堿性氨基酸殘基(Arg和Lys)有高的特異性。KEXl酶的特異性由a. o. Heim等，Eur. J. Biochem 226: 341-353 (1994))使用脫硫水輕素(desulfato-hirudin)及其突變體作為模型底物進(jìn)一步研究。本發(fā)明描述了使用具有非功能性於沈7基因的酵母菌株表達(dá)具有C-末端甘氨酸氨基酸殘基的小肽。已顯示該甘氨酸對(duì)Kexlp的切割非常不穩(wěn)定，使得難以在酵母中有效表達(dá)這些肽。在該上下文中，“小肽”意指具有至多約75個(gè)氨基酸殘基的肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽具有至多約60個(gè)氨基酸殘基，在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽具有至多約50個(gè)氨基酸殘基。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽具有約25至約45個(gè)氨基酸殘基。本發(fā)明可生產(chǎn)的肽的說明性而非限制性實(shí)例是淀粉狀蛋白毒素、淀粉狀蛋白毒素類似物、PP和PP類似物、PYY和PYY類似物、GLP-I和GLP-I類似物、催產(chǎn)素、加壓素、降鈣素、胃泌素、NPY、FMRF酰胺、分泌素、GFHR、CRF、神經(jīng)激肽A、胃泌素釋放肽和a -MSH。在一個(gè)實(shí)施方案中，可生產(chǎn)的肽選自具有與甘氨酸殘基連接的芳族氨基酸殘基的肽。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽選自胃泌素、NPY、FMRF酰胺和淀粉狀蛋白毒素及其類似物。表述“多肽”意在涵蓋“肽”以及“蛋白”。本文使用的“類似物”意指具有形式上可通過缺失和/或交換天然存在的多肽中存在的至少一個(gè)氨基酸殘基從天然存在的多肽的結(jié)構(gòu)衍生的分子結(jié)構(gòu)的多肽。增加和/或交換的氨基酸殘基可為可編碼的氨基酸殘基或者是其它天然存在的殘基或者是完全合成的氨基酸殘基。蛋白酶的活性可通過破壞編碼蛋白酶的宿主基因來消除，從而產(chǎn)生丟失包括調(diào)節(jié)區(qū)和/或編碼區(qū)在內(nèi)的全部或部分蛋白酶基因的非回復(fù)型菌株，或備選地，活性可通過經(jīng)典誘變步驟或通過引入特異性位點(diǎn)突變來降低或消除。使用經(jīng)典技術(shù)破壞編碼Kexlp蛋白酶的基因依賴同源重組，其中兩個(gè)相似或相同鏈的DNA互換核苷酸序列。這允許將重組事件特異性地導(dǎo)向他Z/基因座，從而他’萬開放閱讀框與用于選擇正確缺失的標(biāo)記基因互換(Rothstein R. Targeting, disruption, replacement, and allele rescue:integrative DNA transformation in yeast (祀向、破壞、置換和等位基因搖救酵母中的整合DNA轉(zhuǎn)化) 1991. Methods Enzymol. 194:281-301)。在這樣的一個(gè)方式中，用由側(cè)翼為與他基因側(cè)翼DNA序列同源的DNA序列的標(biāo)記基因組成的線性DNA片段(來自質(zhì)?；蛲ㄟ^PCR產(chǎn)生)轉(zhuǎn)化酵母菌株。成功的整合將用可選擇的標(biāo)記基因代替基因。適宜的標(biāo)記是營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記例如URA3、HIS3、LEU2、TRPL或給予針對(duì)G418、潮霉素等的抗性的主要抗生素標(biāo)記?？蛇m用于下調(diào)蛋白酶活性的適宜的其它方法包括在酵母中引入反義構(gòu)建體和/ 或核酶構(gòu)建體，例如 Atkins 等(Antisense and Development 5: 295-305, 1995)和Nasr 等(Mol. Gen Genet 249: 51-57， 1995)。 Rothstein (Method in EnzymoI, 194:281-301，1991)描述了在酵母菌株中破壞他Z/基因的一個(gè)有用的方法。取決于期望的終產(chǎn)物，可對(duì)酵母宿主細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步基因操作。作為實(shí)例，可使一個(gè)或多個(gè)另外的蛋白酶基因無功能。這樣的蛋白酶基因的實(shí)例是、YPS3(YPS4)、YPS5、YPS6, YPS7、PRB1 ,STE13和KEX2。這對(duì)于避免表達(dá)的肽的額外降解可能是必要的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，酵母菌株被敲除KEXl基因和選自PEP4、YPSl、MKC7(YPS2)、YPS3(YPS4)、YPS5、YPS6、YPS7、PRB1、STE13 和 KEX2 的一個(gè)蛋白酶基因。在另一個(gè)實(shí)施方案中，酵母菌株被敲除KEXl基因和選自PEP4、YPS1、MKC7(YPS2)、YPS3(YPS4)、YPS5、YPS6、YPS7、PRB1、STE13 和 KEX2 的兩個(gè)蛋白酶基因。在另一個(gè)實(shí)施方案中，酵母菌株被敲除KEXl基因和選自PEP4、YPS1、MKC7(YPS2)、YPS3 (YPS4)、YPS5、YPS6、YPS7、PRB1、STE13 和 KEX2 的三個(gè)蛋白酶基因。在另一個(gè)實(shí)施方案中，酵母菌株被敲除KEXl基因和選自PEP4、YPS1、MKC7(YPS2)、YPS3 (YPS4)、YPS5、YPS6、YPS7、PRBl、STE13 和 KEX2 的四個(gè)蛋白酶基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，使iKZ/和/ 基因無功能。這樣的酵母菌株特別適宜用于表達(dá)帶有C-末端甘氨酸的淀粉狀蛋白毒素、PP和PYY及其類似物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，酵母菌株具有破壞的基因和破壞的酵母天冬氨酰蛋白酶3 (Yap3p)基因{YPS1)。破壞酵母天冬氨酰蛋白酶3 (Yap3p)基因在WO 95/23857中被描述用于生產(chǎn)重組人白蛋白(rHA)，和在描述生產(chǎn)短鏈多肽的US 6，110,703中有述。因此，本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案包括敲除了和YAP3IYPS1基因二者的酵母菌株。表述“敲除”意指該基因全部缺失或者如先前所述使其無功能。本發(fā)明的方法產(chǎn)生帶有完整C-末端的非降解肽。這有高的商業(yè)價(jià)值，因?yàn)樯a(chǎn)同質(zhì)產(chǎn)物將顯著減少純化成本。在再一方面，本發(fā)明涉及一種用于制備C-末端酰胺化肽的方法，所述方法包括以下步驟a)在用于在酵母菌株中表達(dá)多肽的條件下培養(yǎng)具有非功能性於沈7基因和包含編碼帶有C-末端Gly的多肽的DNA序列的酵母菌株，b)來自步驟a)的表達(dá)的多肽的體外a -酰胺化，和b) C-末端酰胺化肽的分離和純化。在另一方面，本發(fā)明提供一種具有非功能性KEXl基因的酵母細(xì)胞培養(yǎng)物，其包含編碼帶有C-末端Gly殘基的多肽的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列或DNA序列與編碼酵母啟動(dòng)子和前導(dǎo)序列(原序列(pro sequence)或前原序列(prepro sequence))的多核苷酸序列或DNA序列和/或酵母表達(dá)和分泌所述多肽所必要的其它多核苷酸序列或DNA序列有效連接。所述編碼多肽的DNA可與用于引入合適宿主的多種其它DNA序列相連。伴隨DNA取決于宿主的性質(zhì)、將DNA引入宿主的方式和是否期望在宿主染色體上維持或整合游離基因。通常，將DNA在用于表達(dá)的合適的取向和正確的閱讀框內(nèi)插入表達(dá)載體，例如質(zhì)粒。然后通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將載體引入宿主，通常，選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞是必要的。在載體中，多核苷酸序列或DNA序列與編碼酵母啟動(dòng)子和前導(dǎo)序列(原序列或前原序列)的多核苷酸序列或DNA序列和/或酵母表達(dá)和分泌所述多肽所必要的其它多核苷酸序列或DNA序列有效連接。如果期望整合，那么將DNA在用于表達(dá)的合適的取向和正確的閱讀框(其側(cè)翼為任何非必要酵母基因、轉(zhuǎn)座子序列或核糖體基因的同源序列)內(nèi)插入酵母整合質(zhì)粒載體，例如 PJJ215、pJJ250、pJJ236、pJJ248、pJJ242 (Jones & Prakash, Yeast 6: 363,1990)或pDP6 (Fleig等Gene 46:237，1986)。優(yōu)選地，側(cè)翼序列為酵母蛋白酶基因或用作選擇標(biāo)記的基因。然后通過發(fā)生在側(cè)翼序列中的同源重組將DNA整合在宿主染色體上，這通過使用 Rothstein (Method in EnzymoI, 194: 281-301，1991)和 Cregg 等(Bio/Technol.11:905-910, 1993)所示的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。然后將被本發(fā)明的重組DNA轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞在本領(lǐng)域技術(shù)人員考慮到本文公開的教導(dǎo)而知曉的適當(dāng)條件下培養(yǎng)同樣知曉的足夠時(shí)間，以使能夠表達(dá)和分泌待根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的多肽。有用的酵母質(zhì)粒載體包括POT (Kjeldsen等Gene 170: 107-112，1996)和YEp 13> YEp24 (Rose and Broach, Methods in EnzymoI. 185: 234-279，1990)和 pG 質(zhì)粒(Schena 等 Methods in EnzymoI. 194: 289-398， 1991)。用于轉(zhuǎn)化釀酒酵母的方法包括原生質(zhì)球轉(zhuǎn)化、醋酸鋰轉(zhuǎn)化和電穿孔，參照Methodsin EnzymoI.第194卷(1991)。優(yōu)選地,轉(zhuǎn)化如本文實(shí)施例中所述。用于釀酒酵母的合適啟動(dòng)子包括MFa I啟動(dòng)子、半乳糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(例如GALU GAL7和GALlO啟動(dòng)子)、糖酵解酶啟動(dòng)子(包括TPI和PGK啟動(dòng)子)、TRPl啟動(dòng)子、CYCI啟動(dòng)子、CUPl啟動(dòng)子、PH05啟動(dòng)子、ADHl啟動(dòng)子和HSP啟動(dòng)子。在畢赤酵母屬中適宜的啟動(dòng)子是AOXI (甲醇利用)啟動(dòng)子。 轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)優(yōu)選真核基因的3 ’側(cè)翼序列，其包含用于轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化的適當(dāng)信號(hào)。適宜的3’側(cè)翼序列可為例如與使用的表達(dá)控制序列(即相當(dāng)于啟動(dòng)子)天然連接的基因的序列。用于提供期望多肽的分泌表達(dá)的DNA構(gòu)建體包括包含通過酵母加工信號(hào)與多肽連接的前導(dǎo)序列的DNA序列。前導(dǎo)序列包含用于蛋白質(zhì)易位穿過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號(hào)肽(“前序列(pre-sequence)”)和任選包含另外的序列(“原序列”)，其在多肽被釋放到周圍培養(yǎng)基中之前在酵母細(xì)胞中可或可不被切割。有用的前導(dǎo)序列是小鼠a-淀粉酶信號(hào)肽、釀酒酵母MFa I、YAP3、BARI、HSP150和克魯弗酵母(5 kluyveri) MFa信號(hào)肽和釀酒酵母1^0 1、￥々 3、？1 (、邯？150和克魯弗酵母1^0的前原序列和在WO 92/11378、WO 90/10075和TO 95/34666中所述的合成前導(dǎo)序列。此外，根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的多肽可提供有如WO 95/35384所述的N-末端延伸。編碼期望肽的DNA序列可以是基因組來源或cDNA來源，例如通過制備基因組文庫或cDNA文庫并通過依照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(參見例如Sambrook, J, Fritsch, EF和Maniatis,T, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York, 1989)使用合成寡核苷酸探針雜交來篩選編碼全部或部分多肽的DNA序列。編碼多肽的DNA序列也可通過建立的標(biāo)準(zhǔn)方法合成制備，例如Beaucage和Caruthers,Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859-1869 所述的氨基亞憐酸酯方法或 Matthes 等，EMBO Journal 3 (1984)，801-805所述的方法。DNA序列也可通過使用特異性引物的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)制備，例如在US 4，683，202或Saiki等，Science 239 (1988)，487-491中所述。引入DNA序列或重組載體的酵母宿主細(xì)胞可以是任何能表達(dá)多肽的酵母細(xì)胞，包括酵母屬{Saccharomyces spp.)或裂殖酵母屬{Schizosaccharomyces spp.)，特別是釀酒酵母或克魯弗酵母{Saccharomyces kluyveri)菌株。適宜酵母細(xì)胞的另外實(shí)例是克魯維酵、母屬iJUuyveromyces)菌株，例如乳酸克魯維酵母Of. Iactis);漢遜酵母屬ijletnsGnula)菌株，例如多形漢遜酵母Qi poIymorpha);或畢赤酵母屬iPichia)菌株,例如巴斯德畢赤酵母(/* pas tor is)(參見 Gleeson 等，J. Gen. Microbiol. 132, 1986,第 3459-3465頁；US 4，882，279)。 用異源DNA轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞并從中生產(chǎn)異源多肽的方法描述于例如US 4，599，311、US 4，931，373、US 4，870，008、5，037，743 和 US 4,845,075。通過由選擇標(biāo)記決定的表型篩選轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，表型通常為藥物抗性或在特定養(yǎng)分例如亮氨酸不存在下生長的能力。在酵母中使用的優(yōu)選載體是在US 4，931，373中公開的POTl載體?！癙0T”是粟酒裂殖酵母{Schizosaccharomyces pombe)丙糖磷酸異構(gòu)酶基因，和“TPI1”是釀酒酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶基因。表述“可編碼的氨基酸”或“可編碼的氨基酸殘基”用于指可通過核苷酸的三聯(lián)體(“密碼子”)編碼的氨基酸或氨基酸殘基。在本上下文中，氨基酸的三字母或一字母標(biāo)志以其常規(guī)意思使用，如下表中所示。除非明確指出，本文提到的氨基酸是L-氨基酸。另外，除非另外規(guī)定，肽的氨基酸序列的左端和右端分別是N-末端和C-末端。在以下列實(shí)施例中進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明，實(shí)施例不以任何方式限制所要求保護(hù)的本發(fā)明范圍。附圖
意在被視為本發(fā)明的說明書和描述的必要組成部分。全部引用的參考文獻(xiàn)對(duì)于其中描述的所有內(nèi)容通過引用具體結(jié)合到本文中。本發(fā)明涵蓋下列實(shí)施方案
實(shí)施方案I :在具有非功能性KEXl基因的酵母菌株中制備多肽的方法，其中，多肽具有甘氨酸作為C-末端氨基酸殘基，且其中所述方法包括以下步驟
a)在用于在酵母菌株中表達(dá)多肽的條件下培養(yǎng)包含編碼多肽的DNA序列的酵母菌株，和
b)分離表達(dá)的多肽；
實(shí)施方案2 :實(shí)施方案I的方法，其中多肽從培養(yǎng)基中分離；
實(shí)施方案3 :實(shí)施方案1-2的方法，其中與C-末端Gly連接的氨基酸殘基選自Tyr、Phe、Met、Leu、Trp、Ala、He 和 Arg ；
實(shí)施方案4 實(shí)施方案3的方法，其中與C-末端Gly連接的氨基酸殘基是Tyr、Trp、Phe、Val、Leu、Ile 和 Met ；
實(shí)施方案5 :實(shí)施方案3的方法，其中與C-末端Gly連接的氨基酸殘基是Val、Leu、Ile和 Met ；
實(shí)施方案6 :實(shí)施方案3的方法，其中與C-末端Gly連接的氨基酸殘基是Tyr、Trp或
Phe ；
實(shí)施方案7 :實(shí)施方案6的方法，其中與C-末端Gly連接的氨基酸殘基是Tyr ；
實(shí)施方案8 :實(shí)施方案1-7中任一項(xiàng)的方法，其中酵母菌株具有選自YPS3、YPS5、YPS6、YPS7、PRBI、STE13和iKZ 的至少一種另外的非功能性蛋白酶基因；
實(shí)施方案9 :實(shí)施方案8的方法，其中酵母菌株具有選自PEP4、YPSl和遞17的另外的非功能性蛋白酶基因；
實(shí)施方案10 :實(shí)施方案8的方法，其中酵母菌株具有選自和YPS3的另外的非功能性蛋白酶基因； 實(shí)施方案11 :實(shí)施方案8的方法，其中酵母菌株具有選自和遞17的另外的非功能性蛋白酶基因；
實(shí)施方案12 :實(shí)施方案8的方法，其中酵母菌株具有選自/ 和YPSl的另外的非功能性蛋白酶基因；
實(shí)施方案13 :實(shí)施方案8的方法，其中酵母菌株具有選自/ 和YPS3的另外的非功能性蛋白酶基因；
實(shí)施方案14 :實(shí)施方案8的方法，其中酵母菌株具有選自/ 和遞17的另外的非功能性蛋白酶基因；
實(shí)施方案15 :實(shí)施方案8的方法，其中酵母菌株具有選自YPS3、YPS1和遞17的另外的非功能性蛋白酶基因；
實(shí)施方案16 :實(shí)施方案8的方法，其中酵母菌株具有選自和YPSl的另外的非功能性蛋白酶基因；
實(shí)施方案17 :實(shí)施方案的方法，其中酵母菌株具有選自和遞17的另外的非功能性蛋白酶基因；
實(shí)施方案18 :實(shí)施方案8的方法，其中酵母菌株具有選自/ 和YPS5的另外的非功能性蛋白酶基因；
實(shí)施方案19 :實(shí)施方案8的方法，其中酵母菌株具有選自/ 和YPS6的另外的非功能性蛋白酶基因；
實(shí)施方案20 :實(shí)施方案8的方法，其中酵母菌株具有選自/ 和YPS7的另外的非功能性蛋白酶基因；
實(shí)施方案21 :實(shí)施方案8的方法，其中酵母菌株具有選自/ 和的另外的非功能性蛋白酶基因；
實(shí)施方案22 :實(shí)施方案8的方法，其中酵母菌株具有選自/ 和的另外的非功能性蛋白酶基因；
實(shí)施方案23 :實(shí)施方案8的方法，其中酵母菌株具有選自/ 和iKZ 的另外的非功能性蛋白酶基因；
實(shí)施方案24 :實(shí)施方案8的方法，其中酵母菌株具有選自和YPS5的另外的非功能性蛋白酶基因；
實(shí)施方案25 :實(shí)施方案8的方法，其中酵母菌株具有選自和YPS6的另外的非功能性蛋白酶基因；
實(shí)施方案26 :實(shí)施方案8的方法，其中酵母菌株具有選自和YPS7的另外的非功能性蛋白酶基因；
實(shí)施方案27 :實(shí)施方案8的方法，其中酵母菌株具有選自YPS3諑PBRl的另外的非功能性蛋白酶基因；
實(shí)施方案28 :實(shí)施方案8的方法，其中酵母菌株具有選自YPS3和STE13的另外的非功能性蛋白酶基因；
實(shí)施方案29 :實(shí)施方案8的方法，其中酵母菌株具有選自和iKZ 的另外的非功能性蛋白酶基因；實(shí)施方案30 :實(shí)施方案8的方法，其中酵母菌株具有選自YPSl取PBRl的另外的非功能性蛋白酶基因；
實(shí)施方案31 :實(shí)施方案8的方法，其中酵母菌株具有選自YPSl和的另外的非功能性蛋白酶基因；
實(shí)施方案32 :實(shí)施方案8的方法，其中酵母菌株具有選自YPSl和iKZ 的另外的非功能性蛋白酶基因；
實(shí)施方案33 :實(shí)施方案I的方法，其中酵母菌株具有非功能性KEXl基因和非功能性/ 基因；
實(shí)施方案34 :實(shí)施方案I的方法，其中酵母菌株具有非功能性KEXl基因和非功能性YPSl基因； 實(shí)施方案35 :實(shí)施方案I的方法，其中酵母菌株具有非功能性KEXl基因和非功能性MC7基因；
實(shí)施方案36 :實(shí)施方案I的方法，其中酵母菌株具有非功能性KEXl基因和非功能性 基因；
實(shí)施方案37 :實(shí)施方案I的方法，其中酵母菌株具有非功能性KEXl基因和非功能性7/^5■基因；
實(shí)施方案38 :實(shí)施方案I的方法，其中酵母菌株具有非功能性KEXl基因和非功能性 基因；
實(shí)施方案39 :實(shí)施方案I的方法，其中酵母菌株具有非功能性KEXl基因和非功能性7/^7基因；
實(shí)施方案40 :實(shí)施方案I的方法，其中酵母菌株具有非功能性KEXl基因和非功能性PBRl基因；
實(shí)施方案41 :實(shí)施方案I的方法，其中酵母菌株具有非功能性KEXl基因和非功能性 基因；
實(shí)施方案42 :實(shí)施方案I的方法，其中酵母菌株具有非功能性KEXl基因和非功能性iKZ 基因；
實(shí)施方案43 :實(shí)施方案I的方法，其中酵母菌株敲除了 KEXl基因和選自PEP4、YPSl、MKC7(YPS2)、YPS3(YPS4)、YPS5、YPS6, YPS7、PRB1、STE13 和iKZ 的一個(gè)蛋白酶基因；
實(shí)施方案44 :實(shí)施方案I的方法，其中酵母菌株敲除了 KEXl基因和選自PEP4、YPSl、MKC7(YPS2)、YPS3(YPS4)、YPS5、YPS6, YPS7、PRB1、STE13 和的兩個(gè)蛋白酶基因；
實(shí)施方案45 :實(shí)施方案I的方法，其中酵母菌株敲除了 KEXl基因和選自PEP4、YPSl、MKC7(YPS2)、YPS3(YPS4)、YPS5、YPS6, YPS7、PRB1、STE13 和他Z 的三個(gè)蛋白酶基因；
實(shí)施方案46 :實(shí)施方案I的方法，其中酵母菌株敲除了 KEXl基因和選自PEP4、YPSl、MKC7(YPS2)、YPS3(YPS4)、YPS5、YPS6, YPS7、PRB1、STE13 和iKZ 的四個(gè)蛋白酶基因；
實(shí)施方案47 :前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的方法，其中已缺失他Z/基因；
實(shí)施方案48 :前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的方法，其中通過突變，例如通過同源重組使KEXl基因無功能；
實(shí)施方案49 :前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的方法，其中多肽在主鏈中具有25至約45個(gè)氨
基酸殘基；實(shí)施方案50 :前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的方法，其中多肽選自淀粉狀蛋白毒素、淀粉狀蛋白毒素類似物、PP和PP類似物、PYY和PYY類似物、GLP-I和GLP-I類似物、催產(chǎn)素、加壓素、降鈣素、胃泌素、NPY、FMRF酰胺、分泌素、GFHR、CRF、神經(jīng)激肽A、胃泌素釋放肽和a -MSH ； 實(shí)施方案51 :實(shí)施方案50的方法，其中多肽選自PP、PYY和淀粉狀蛋白毒素；
實(shí)施方案52 :實(shí)施方案50的方法，其中多肽是淀粉狀蛋白毒素；
實(shí)施方案53 :實(shí)施方案50的方法，其中多肽是PP ；
實(shí)施方案54 :實(shí)施方案50的方法，其中多肽是PYY ；
本發(fā)明涵蓋本文所描述的實(shí)施方案和方面的任何組合。
實(shí)施例一般步驟
所有表達(dá)質(zhì)粒是C-POT型，與在EP 171，142中所述那些相似。它們是基于2 U的表達(dá)載體，特征在于，含有用于在釀酒酵母中質(zhì)粒選擇和穩(wěn)定化目的的粟酒裂殖酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶基因(P0T)。質(zhì)粒也含有釀酒酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶啟動(dòng)子和終止子。這些序列與質(zhì)粒PKFN1003 (在WO 9010075中所述)中的對(duì)應(yīng)序列相似。為有利于克隆不同融合蛋白，改變編碼MF a I前原前導(dǎo)序列的DNA序列以摻入NcoI位點(diǎn)，且稱其為MF a I*前原前導(dǎo)序列。因此，將NcoI-XbaI片段簡單地替換為編碼目標(biāo)胰島素構(gòu)建體的NcoI-XbaI片段。這樣的NcoI-XbaI片段可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)使用合成寡核苷酸和PCR合成。除了 a-前導(dǎo)序列之夕卜，可使用其它前導(dǎo)序列。酵母轉(zhuǎn)化體及其衍生物通過轉(zhuǎn)化宿主菌株釀酒酵母菌株制備。將酵母菌株在YPGaL (1% Bacto酵母提取物、2% Bacto蛋白胨、2%半乳糖、1%乳糖)上培養(yǎng)至600 nm的O.D.為0.6。通過離心收獲100 ml培養(yǎng)物，用10 ml水洗滌，重離心和并重懸在10 ml包含I. 2 M山梨醇、25 mM Na2EDTA pH = 8. 0和6. 7 mg/ml 二硫蘇糖醇的溶液中。將懸液在30°C孵育15分鐘，離心，并將細(xì)胞重懸在10 ml包含I. 2 M山梨醇、10 mM Na2EDTA、0. I M檸檬酸鈉、pH 0 5. 8和2 mg NOVOZymC3234的溶液中。將懸液在30°C孵育30分鐘，通過離心收集細(xì)胞，在10 ml I. 2 M山梨醇和10 ml CAS (I. 2 M山梨醇、10 mM CaCl2UO mM TrisHCl (Tris =三(羥甲基)_氨基甲烷)pH = 7. 5)中洗滌，并重懸在2 ml CAS中。對(duì)于轉(zhuǎn)化，將I ml CAS懸浮細(xì)胞與大約0. I mg質(zhì)粒DNA混合，并在室溫下靜置15分鐘。加入I ml (20% 聚乙二醇 4000、10 mM CaCl2UO mM Tris HCUpH = 7. 5)，將混合物在室溫下進(jìn)一步靜置30分鐘。離心混合物，將沉淀重懸在0. I ml SOS (1.2 M山梨醇、33% v/v YPD、6. 7 mM CaCl2)中，在30°C孵育2小時(shí)。然后離心懸液，將沉淀重懸在0. 5 ml 1.2 M山梨酉享中。然后，在 52°C下加入上層瓊脂(Sherman 等(1982) Methods in Yeast Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory的SC培養(yǎng)基)包含I. 2 M山梨醇和2. 5%瓊脂)，將懸液傾倒在包含相同瓊脂固化的含山梨醇的培養(yǎng)基的平板上層。實(shí)施例I
Zl kexl:: TRPl-AFA 基因破壞 如下構(gòu)津trol-AFA缺失等位基因突變
通過使用合成寡核苷酸的 PCR (Horecka J, Jigami Y. (1999). The trpl-zi FAdesigner deletion for PCR—based gene functional analysis in Saccharomycescerevisiae (用于釀酒酵母中基于PCR的基因功能分析的trpl-立FA設(shè)計(jì)缺失).Yeast. : 15 (1769-74))和標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)合成編碼trpl-A FA等位基因的合成DNA片段。trpl-AFA片段由來自KEXl 5’ UTR區(qū)的476 bp片段直接與來自KEXl 3’ UTR區(qū)的525 bp片段融合組成，這樣避免同源DNA序列與用于在pFA6a-TRPl質(zhì)粒中作為選擇標(biāo)記的 TRP1-FA 盒重疊(Longtine, M. S. , McKenzie, A. , Demarini, D. , Shah, N. G.,ffach, A. , Brachat, A. , Philippsen, P. 和 Pringle, J. R. (1998). Additionalmodules for versatile and economical PCR—based gene deletion and modificationin Saccharomyces cerevisiae (釀酒酵母中多功能和經(jīng)濟(jì)的基于PCR的基因缺失和修飾的另外模塊) Yeast: 14. , (953-961))。按照制造商(Invitrogen)所述將 trpl-AFAPCR片段克隆到T0P0-CR2. I載體中以產(chǎn)生質(zhì)粒pFI379。trol-A FA缺失酵母菌株如下得到
用于選擇TRPl基因破壞的方法包括反選步驟，在包含5-氟鄰氨基苯甲酸的培養(yǎng)基上生長通過色氨酸生物合成途徑中的酶產(chǎn)生抗代謝作用。缺乏將鄰氨基苯甲酸轉(zhuǎn)化為色氨酸所需要的酶的酵母細(xì)胞對(duì)5-氟鄰氨基苯甲酸有抗性(Toyn，J. H., Gunyuzlu, P. L.,White, H.，Thompson, L. A.和 G. F. Hollis (2000). A counter select ion for thetryptophan pathway in yeast: 5-fluoroanthraniIic acid resistance (酵母中色氨酸途徑的反選5-氟鄰氨基苯甲酸抗性).Yeast: 16 (553-560))。用質(zhì)粒pSA281 轉(zhuǎn)化酵母宿主菌株 NNY574 (MATa ura3_D0 leu2_D0 his3_D0tpil: :URA3 ypsl: :HIS3 pep4: :LEU2)以建立yFI754，質(zhì)粒pSA281是用于淀粉狀蛋白毒素類似物前體EEAEK(SEQ ID NO: I)-淀粉狀蛋白毒素(1_37) _K1E、S28P、S29P、G38的分泌表達(dá)的酵母表達(dá)載體。PSA281的質(zhì)粒主鏈基于cPOT型載體，通過補(bǔ)充宿主菌株的A-tpil突變而有助于在包含葡萄糖作為唯一碳源的豐富培養(yǎng)基上生長。使用PFI379作為模板和合成寡核苷酸和標(biāo)準(zhǔn)方法，通過PCR擴(kuò)增trpl- A FA片段。通過LiAc方法(Gietz和Wood, 2002)將trpl-AFA PCR片段直接用于yFI754的轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后，將酵母細(xì)胞鋪板在YEH)瓊脂上，并在30 C孵育過夜，然后影印培養(yǎng)至包含5-氟鄰氨基苯甲酸的極限培養(yǎng)基上。通過使用5-氟鄰氨基苯甲酸針對(duì)TRPl基因的存在進(jìn)行反選(Toyn等，2000)，完成將trpl-A FA缺失等位基因整合到基因組中的酵母細(xì)胞的選擇，產(chǎn)生trpl-^_FA酵母菌株yFI810。A kexl: : TRPl-FA基因破壞等位基因如下構(gòu)津:
由518 bp的KEXl 5，UTR DNA序列、接著SphI限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)、接著Sbfl限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)、接著304 bp的KEXl 3’ UTR DNA序列組成的A kexl-DO等位基因的合成DNA片段，其通過商業(yè)來源的體外DNA合成而構(gòu)建和得到，并將其克隆到pMA載體中(Geneart AG, BioPark, Josef-Engert-Str. 11, D-93053 Regensburg, Germany)。將該質(zhì)粒命名為PFI472。包含側(cè)翼為SphI和Sbfl限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)的TRPl-FA盒的合 成DNA片段通過商業(yè)來源的體外DNA合成構(gòu)建和得到，并將其克隆到pMA-RQ載體(GeneArtag)中。將該質(zhì)粒命名為PFI468。通過連接以下兩個(gè)DNA片段來構(gòu)建包含A kexl:: TRPl-FA基因破壞等位基因的質(zhì)粒PFI473 :用SphI和Sbfl消化PFI472后得到的3163 bp片段以及用SphI和Sbfl消化pFI468后得到的872 bp片段。最后，用XhoI和HincII消化pFI473，分離包含A kexl: : TRPl-FA等位基因的1707 bp DNA片段并用于通過LiAc步驟轉(zhuǎn)化yFI810(Gietz, R. D.和 Wood, R. (2002). Transformation of yeast by lithium acetate /single-stranded carrier DNA / polyethylene glycol method (通過醋酸鋰/單鏈載體DNA/聚乙二醇方法轉(zhuǎn)化酵母) Methods in Enzymology: 350, (87 - 96))。轉(zhuǎn)化后，將酵母細(xì)胞鋪板在無色氨酸的極限培養(yǎng)基平板上，以選擇Akexl: : TRPl-FA缺失突變體。通過PCR表征TRP+轉(zhuǎn)化體，以證實(shí)將A kexl: : TRPl-FA等位基因正確整合到KEXl基因座中。分離酵母菌株yFI815作為 Akexl: :TRP1_FA缺失突變體(MATa ura3_D0 leu2_D0 his3_D0trpl-A-FA tpil: :URA3 ypsl: :HIS3 pep4: :LEU2 kexl: : TRPI-FA, pSA281)。實(shí)施例2 A kexl: : KanMX4 基因破壞
缺失 KEXl 基因并具有基因型 Mat a his3Dl leu2D0 lys2D0 ura3D0 kexlDO: :kanMX4的酵母菌株購自Euroscarf缺失菌株保藏中心(Euroscarf deletion strain collection)(保藏號(hào)Y14570)。在該酵母菌株中，編碼KEXl開放閱讀框的DNA片段由KanMX4顯性選擇標(biāo)記代替，該選擇標(biāo)記賦予對(duì)抗生素G418/遺傳霉素的抗性(Wach A.，Brachat, A.，Poelmann R. and Philippsen, P. (1994). New heterologous modules for classicalor PCR-based gene disruptions in Saccharomyces cerevisiae (用于釀酒酵母中經(jīng)典或基于PCR的基因破壞的新的異源模塊).Yeast: 10 (1793-808)。從Y14570分離基因組DNA，并在使用合成寡核苷酸oTKLH68(cccggaaccgaaaaacaatgtgga) (SEQ ID NO:2)和 oILLa482 (agttcagtagtgtgaattaaataaaacagtcagttcttgatggattgtaccctttaaag-aatttatctttatg) (SEQ ID NO:3)的標(biāo)準(zhǔn) PCR反應(yīng)中用作模板，以擴(kuò)增包含Akexl: :KANMX4缺失等位基因盒的合成DNA片段。該DNA片段直接用于通過LiAc方法轉(zhuǎn)化yFI650 (具有cPOT質(zhì)粒pSA082的宿主菌株NNY574)(Gietz, R. D.和 Wood, R. (2002). Transformation of yeast by lithium acetate /single-stranded carrier DNA / polyethylene glycol method (通過醋酸鋰 / 單鏈載體DNA/聚乙二醇方法轉(zhuǎn)化酵母).Methods in Enzymology: 350, (87 - 96))。轉(zhuǎn)化后，將酵母細(xì)胞鋪板在YEH)瓊脂上，在30 C孵育過夜，隨后影印培養(yǎng)到選擇性YEH)瓊脂+200 mg/L G418上。分離在30 C進(jìn)一步孵育3天后出現(xiàn)的酵母克隆并通過PCR表征，以證實(shí)將Akexl: :KanMX4等位基因正確整合到KEXl基因座中。分離酵母菌株yFI750作為A kexl: :KanMX4 缺失突變體(MAT a ura3~D0 leu2_D0 his3_D0 trpl-A-FA tpil: :URA3ypsl: :HIS3 pep4: :LEU2 kexl: :KanMX4, pSA082)。通過無葡萄糖選擇地培養(yǎng)多代來誘導(dǎo)從 yFI750 除去 cPOT 質(zhì)粒。將所得酵母菌株 yFI751 (MATa ura3_D0 leu2_D0 his3_D0trpl-A-FA tpil: :URA3 ypsl: :HIS3 pep4: :LEU2 kexl: :KanMX4)用作新的宿主菌株，以用cPOT型酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。實(shí)施例3
根據(jù)制造商推薦的設(shè)置，使用LC/MSD TOF儀器(Agilent)進(jìn)行LC-MS分析用于測定酵母上清液中的分泌肽的分子量。使用隨附的軟件進(jìn)行TIC色譜圖的去卷積。從去卷積譜圖得到全長和甘氨酸缺失物類的豐度，并用于估計(jì)全長肽對(duì)全長肽和甘氨酸缺失肽混合物的百分比(表I)。表I:
權(quán)利要求
1.用于在具有非功能性KEXl基因的酵母菌株中制備多肽的方法，其中，所述多肽具有甘氨酸作為其C-末端氨基酸殘基，且其中所述方法包括以下步驟 a)將包含編碼所述多肽的DNA序列的所述酵母菌株在用于在所述酵母菌株中表達(dá)所述多肽的條件下培養(yǎng)，和 b)分離表達(dá)的多肽。
2.權(quán)利要求I的方法，其中所述多肽從培養(yǎng)基中分離。
3.權(quán)利要求1-2的方法，其中與C-末端Gly連接的氨基酸殘基選自Tyr、Phe,Met、Leu、Trp> Ala、He 和 Arg0
4.權(quán)利要求3的方法，其中與C-末端Gly連接的氨基酸殘基是Val、Leu、Ile或Met。
5.權(quán)利要求3的方法，其中與C-末端Gly連接的氨基酸殘基是Tyr、Trp或Phe。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中所述酵母菌株具有選自PEP4、YPS1、MKC7、YPS3, YPS5、YPS6、YPS7、PRB1、STE13和的至少一種另外的非功能性蛋白酶基因。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述酵母菌株具有選自ΡΕΡ4和YPSl的另外的非功能性蛋白酶基因。
8.權(quán)利要求6的方法，其中所述酵母菌株具有選自ΡΕΡ4和YPS3的另外的非功能性蛋白酶基因。
9.權(quán)利要求6的方法，其中所述酵母菌株具有選自ΡΕΡ4和遞17的另外的非功能性蛋白酶基因。
10.權(quán)利要求6的方法，其中所述酵母菌株具有選自YPS3和YPSl的另外的非功能性蛋白酶基因。
11.權(quán)利要求6的方法，其中所述酵母菌株具有選自YPS3和遞17的另外的非功能性蛋白酶基因。
12.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中多肽選自淀粉狀蛋白毒素、淀粉狀蛋白毒素類似物、PP和PP類似物、PYY和PYY類似物、GLP-I和GLP-I類似物、催產(chǎn)素、加壓素、降鈣素、胃泌素、NPY、FMRF酰胺、分泌素、GFHR、CRF、神經(jīng)激肽Α、胃泌素釋放肽和a -MSH。
13.權(quán)利要求12的方法，其中多肽選自PP、PYY和淀粉狀蛋白毒素。
14.權(quán)利要求12的方法，其中多肽是淀粉狀蛋白毒素。
15.權(quán)利要求12的方法，其中多肽是ΡΡ。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于在特征為具有非功能性KEX1基因的酵母轉(zhuǎn)化體中生產(chǎn)帶有C-末端甘氨酸的多肽的改良方法。所述方法尤其相當(dāng)適合生產(chǎn)帶有與C-末端甘氨酸連接的芳族氨基酸殘基的多肽。所述酵母菌株可具有選自PEP4、YPS1、MKCl、YPS3、YPS5、YPS6、YPS7、PRB1、STE13和KEX2的另外的非功能性蛋白酶基因。
文檔編號(hào)C12N9/48GK102639559SQ201080053592
公開日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2010年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月25日
發(fā)明者A.S.安德森, I.勞特魯普-拉森, P.諾爾加爾德 申請(qǐng)人:諾沃—諾迪斯克有限公司