專利名稱：生產(chǎn)l-半胱氨酸的細(xì)菌以及生產(chǎn)l-半胱氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)L-半胱氨酸或其相關(guān)物質(zhì)的方法。更具體地，本發(fā)明涉及適于生產(chǎn)L-半胱氨酸或其相關(guān)物質(zhì)的細(xì)菌、以及使用該細(xì)菌生產(chǎn)L-半胱氨酸或其相關(guān)物質(zhì)的方法。L-半胱氨酸及其相關(guān)物質(zhì)可以在藥物、化妝品以及食品領(lǐng)域中使用。
背景技術(shù)：
L-半胱氨酸通常通過從例如毛發(fā)、角和羽毛等含有角蛋白質(zhì)的物質(zhì)中提取而獲得，或者使用微生物酶轉(zhuǎn)化前體DL-2-氨基噻唑啉-4-羧酸通過而獲得。此外，還計劃使用新型酶通過固定化酶方法大規(guī)模生產(chǎn)L-半胱氨酸。此外，還嘗試通過使用微生物的發(fā)酵來生產(chǎn)L-半胱氨酸。
作為具有生產(chǎn)L-半胱氨酸能力的微生物，已知有例如胞內(nèi)絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶活性增加的棒狀桿菌型細(xì)菌(專利文獻(xiàn)I)。還已知一種通過并入削弱了 L-半胱氨酸反饋抑制的突變型絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶增加L-半胱氨酸生產(chǎn)能力的技術(shù)(專利文獻(xiàn)2至4)。此外，作為通過抑制起分解L-半胱氨酸作用的系統(tǒng)來提高L-半胱氨酸生產(chǎn)能力的微生物，已知削弱或缺失了胱硫醚-β-裂合酶(專利文獻(xiàn)2)、色氨酸酶(專利文獻(xiàn)5)或O-乙酰絲氨酸硫化氫解酶B (專利文獻(xiàn)6)的活性的棒狀桿菌型細(xì)菌或埃希氏菌屬(Escherichia)細(xì)菌。此外，已知編碼YdeD蛋白的ydeD基因參與了 L-半胱氨酸途徑代謝產(chǎn)物的分泌(非專利文獻(xiàn)I)。此外，還已知通過增加mar基因座、emr基因座、acr基因座、cmr基因座、mex 基因、bmr 基因或 qacA 基因(專利文獻(xiàn) 7),或 emrAB、emrKY、yo jIH、acrEF、bcr 或 cusA基因的表達(dá)來提高L-半胱氨酸生產(chǎn)能力(專利文獻(xiàn)8)的技術(shù)，這些基因座/基因編碼適于從細(xì)胞分泌細(xì)胞毒性物質(zhì)的蛋白質(zhì)。此外，作為L-半胱氨酸生產(chǎn)細(xì)菌，還已知cysB基因編碼的半胱氨酸調(diào)節(jié)子的正向轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的活性增加的大腸桿菌(Escherichia coli)(專利文獻(xiàn)9).此外，還已知削弱了絲氨酸反饋抑制的編碼3-磷酸甘油酸脫氫酶的突變型serA，并且提出通過將該突變型serA用于通過大腸桿菌進(jìn)行的L-半胱氨酸生產(chǎn)(專利文獻(xiàn)10和 11)。盡管yciW作為編碼預(yù)測的氧化還原酶的基因登錄入數(shù)據(jù)庫EcoCyc (非專利文獻(xiàn)2)，但是其實際功能是未知的，并且其與L-半胱氨酸生產(chǎn)的關(guān)系也未知曉。此外，盡管已經(jīng)報道了通過消除硫源(非專利文獻(xiàn)3)、糠醛(非專利文獻(xiàn)4)和氧化性應(yīng)激(非專利文獻(xiàn)5)來上調(diào)yciW基因，但是在所有這些文獻(xiàn)中僅將其作為在微陣列實驗中顯示出表達(dá)變化的大量基因中的一員，并且尚未提示其與L-半胱氨酸生產(chǎn)的關(guān)系。現(xiàn)有技術(shù)參考專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)I :日本特開2002-233384號公報專利文獻(xiàn)2 :日本特開平11-155571號公報
專利文獻(xiàn)3 :美國專利申請公開20050112731專利文獻(xiàn)4 :美國專利6，218，168專利文獻(xiàn)5 :日本特開2003-169668號公報專利文獻(xiàn)6 :日本特開2005-245311號公報專利文獻(xiàn)7 :美國專利5，972，663專利文獻(xiàn)8 :日本特開2005-287333號公報專利文獻(xiàn)9 :國際專利公開W001/27307專利文獻(xiàn)10 :美國專利5，856，148專利文獻(xiàn)11 :美國專利申請公開20050009162非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)I :Dabler 等，Mol. Microbiol. ,36，1101-1112(2000)非專利文獻(xiàn)2 BioCyc 主頁，Escherichia coli K-12-substr. MG1655 Gene yciff[2009 年 10 月 14 日檢索]，網(wǎng)絡(luò)超鏈接〈http //biocyc. org/ECOLI/NEff-IMAGE type=GENE&object=G6640>非專利文獻(xiàn)3 Gyaneshwar, P.等，J. Bacteriol. , 187 1074-1090 (2005)非專利文獻(xiàn)4 :Elliot N. , Miller, E. N.,等，Appl. Envir. Microbiol.，10. 1128-/AEM. 01187-09(2009)非專利文獻(xiàn)5 :Wang, S.，等，Appl. Envir. Microbiol.，10. 1128/AEM. 00914-09(2009)

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的問題本發(fā)明的目的是通過開發(fā)提高細(xì)菌的L-半胱氨酸生產(chǎn)能力的新型技術(shù)，提供一種生產(chǎn)L-半胱氨酸的細(xì)菌以及一種生產(chǎn)L-半胱氨酸、L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物或上述物質(zhì)的混合物的方法。解決問題的手段本發(fā)明的發(fā)明人為了解決上述問題進(jìn)行了各種研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過修飾細(xì)菌從而降低yciW基因編碼的蛋白質(zhì)的活性可以提高細(xì)菌的L-半胱氨酸生產(chǎn)能力，從而完成了本發(fā)明。SP，本發(fā)明可以如下實施。(I) 一種屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的細(xì)菌,其具有L-半胱氨酸生產(chǎn)能力，并且經(jīng)過修飾從而降低了 yciW基因編碼的蛋白質(zhì)的活性。(2)如上所述的細(xì)菌，其中所述蛋白質(zhì)的活性是通過降低yciW基因的表達(dá)量或通過破壞所述基因而降低的。(3)如上所述的細(xì)菌，其中所述蛋白質(zhì)為下述㈧或⑶中限定的蛋白質(zhì)
0037](A)具有SEQ ID NO 2中所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)，(B)具有SEQ ID NO 2中所示氨基酸序列但包含一個或數(shù)個氨基酸殘基的取代、缺失、插入或添加，并且在所述細(xì)菌中的活性降低時導(dǎo)致L-半胱氨酸生產(chǎn)能力改善的蛋白質(zhì)。
(4)如上所述的細(xì)菌，其中所述yciW基因為下述(a)或(b)中限定的DNA (a)包含核苷酸序列SEQ ID NO :I中第301至1428位的核苷酸序列的DNA，(b)能夠與核苷酸序列SEQ ID NO 1中第301至1428位的核苷酸序列的互補(bǔ)序列或由所述核苷酸序列制備的探針在嚴(yán)格條件下雜交，并且編碼在所述細(xì)菌中的活性降低時導(dǎo)致L-半胱氨酸生產(chǎn)能力改善的蛋白質(zhì)的DNA。(5)如上所述的細(xì)菌，其還具有下述特性中的至少一種i)經(jīng)過修飾從而提高了絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，ii)經(jīng)過修飾從而提高了 ydeD基因的表達(dá)，iii)經(jīng)過修飾從而提高了 3-磷酸甘油酸脫氫酶活性。(6)如上所述的細(xì)菌,其為埃希氏菌屬(Escherichia)的細(xì)菌。(7)如上所述的細(xì)菌,其為大腸桿菌(Escherichia coli)。(8) 一種L-半胱氨酸、L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物、或上述物質(zhì)的混合物的生產(chǎn)方法，該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述細(xì)菌，并從所述培養(yǎng)基中收集L-半胱氨酸、L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物或上述物質(zhì)的混合物。(9)如上所述的方法，其中所述L-半胱氨酸的衍生物為噻唑烷衍生物。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明可以提高細(xì)菌的L-半胱氨酸生產(chǎn)能力。此外，根據(jù)本發(fā)明可以高效地制備L-半胱氨酸、L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物或上述物質(zhì)的混合物。本發(fā)明的
具體實施例方式〈1>本發(fā)明的細(xì)菌本發(fā)明的細(xì)菌為屬于腸桿菌科的細(xì)菌，其具有L-半胱氨酸生產(chǎn)能力，并且經(jīng)過了修飾從而降低了 yciW基因編碼的蛋白質(zhì)的活性。L-半胱氨酸生產(chǎn)能力在本文中是指，當(dāng)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的細(xì)菌時，該細(xì)菌在培養(yǎng)基中或細(xì)菌的細(xì)胞中生成L-半胱氨酸，并且積累達(dá)到可以從該培養(yǎng)基中或者該細(xì)胞中回收的量的能力。具有L-半胱氨酸生產(chǎn)能力的細(xì)菌是指，與野生株或者親本株相比可以在培養(yǎng)基中生產(chǎn)并積累更大量的L-半胱氨酸的細(xì)菌，優(yōu)選可以在培養(yǎng)基中能夠生產(chǎn)并積累O. 05g/L以上、更優(yōu)選O. lg/L以上、特別優(yōu)選O. 2g/L以上的量的L-半胱氨酸的細(xì)菌。通過所述細(xì)菌生產(chǎn)的一部分L-半胱氨酸可以通過二硫鍵(disulfide bond)的形成在培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化成L-胱氨酸。此外，S-磺基半胱氨酸可以如下文所述通過培養(yǎng)基中所含的L-半胱氨酸與硫代硫酸鹽的反應(yīng)生成(Szczepkowski T. ff. , Nature, vol. 182(1958))。此外，在細(xì)菌細(xì)胞中生成的L-半胱氨酸可以與存在于細(xì)胞中的酮或醛如丙酮酸縮合，從而經(jīng)由作為中間體的硫代半縮醛(hemithioketal)生成噻唑烷衍生物(參見日本特許第2992010號)。這些噻唑烷衍生物和硫代半縮醛可以作為平衡的混合物存在。因此，L-半胱氨酸生產(chǎn)能力并不局限于在培養(yǎng)基或細(xì)胞中僅積累L-半胱氨酸的能力，而是也包括在培養(yǎng)基中積累除了 L-半胱氨酸之外的L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物如S-磺基半胱氨酸、噻唑烷衍生物或硫代半縮醛或前述物質(zhì)的混合物的能力。此外，L-半胱氨酸用作Y -谷氨酰半胱氨酸、谷胱甘肽、胱硫醚、高半胱氨酸、甲硫氨酸、S-腺苷甲硫氨酸等的生物合成中的 起始原料。因此，通過使用除了具有生產(chǎn)L-半胱氨酸的能力之外還具有生產(chǎn)任何上述化合物的能力的細(xì)菌可以制備這些化合物。因此，L-半胱氨酸生產(chǎn)能力還包括經(jīng)由L-半胱氨酸積累待生產(chǎn)的其他化合物的能力。具有L-半胱氨酸生產(chǎn)能力的細(xì)菌可以本來具有L-半胱氨酸生產(chǎn)能力，或者其可以通過用誘變或重組DNA技術(shù)修飾細(xì)菌，如下文所述的細(xì)菌，從而使該細(xì)菌獲得L-半胱氨酸生產(chǎn)能力而獲得。在本發(fā)明中，如果沒有具體說明，術(shù)語L-半胱氨酸可用于指還原型L-半胱氨酸、L-胱氨酸、或者上述那樣的衍生物、或者前述物質(zhì)的混合物。對本發(fā)明中使用的細(xì)菌沒有特殊限制，只要是屬于如埃希氏菌屬、腸桿菌屬(Enterobacter)、泛菌屬(Pantoea)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、歐文氏菌屬(Erwinia)、沙門氏菌屬(Salmonella)和摩根氏菌屬(Morganella)等的腸桿菌科，并且具有生產(chǎn)L-氨基酸的能力的細(xì)菌即可。具體地，可以使用按照NCBI (美國國家生物技術(shù)信息中心，National Center forBiotechnologyInformation)數(shù)據(jù)庫中使用的分類歸入腸桿菌科的細(xì)菌(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax. cgi id=91347)。作為用于修飾的屬于腸桿菌科的親本株，期望使用特別是埃希氏菌屬細(xì)菌、腸桿菌屬細(xì)菌、泛菌屬細(xì)菌、歐文氏菌屬細(xì)菌、腸桿菌屬細(xì)菌、或克雷伯氏菌屬細(xì)菌。盡管對于埃希氏菌屬細(xì)菌沒有特別限制，但是具體而言，可以使用Neidhardt等的著作(Backmann, B. J. 1996. Derivations and Genotypes of somemutant derivativesof Escherichia coli K-12, p. 2460-2488. Table I. In F. D. Neidhardt(ed. ), Escherichiacoli and Salmonella Cellular and MoIecularBiology/Second Edition, AmericanSociety for Microbiology Press, Washington, D. C.)中記載的細(xì)菌。在這些細(xì)菌中，例如可使用大腸桿菌。大腸桿菌的具體實例包括源自原型野生型K12菌株的大腸桿菌W3110(ATCC 27325)和大腸桿菌 MG1655 (ATCC 47076)等。 這些菌株可從例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(地址12301 ParklawnDrive, Rockville, Maryland 20852 P.O.Box 1549, Manassas, VA 20108, UnitedStates of America)獲得。即，對每種菌株都給予了登錄號，并且可以使用這些登錄號訂購菌株(參考http://WWW. atcc. org/)。美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中列出了各菌株的登錄號。腸桿菌屬細(xì)菌的實例可以包括成團(tuán)腸桿菌(Enterobacter agglomerans)和產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)等,泛菌屬細(xì)菌的實例包括Pantoeaananatis。近年來，一些成團(tuán)腸桿菌根據(jù)其16S rRNA的核苷酸序列的分析等重新分類為成團(tuán)泛菌(Pantoeaagglomerans)、Pantoea ananatis 或斯氏泛菌(Pantoea stewartii)。在本發(fā)明中，只要是被分類為腸桿菌科的細(xì)菌，無論是屬于腸桿菌屬或者泛菌屬中任一屬的細(xì)菌均可使用。特別地，泛菌屬細(xì)菌、歐文氏菌屬細(xì)菌和腸桿菌屬細(xì)菌是分類為Y-變形細(xì)菌(Y -proteobacteria)的細(xì)菌，它們在分類學(xué)上的彼此非常接近(J Gen ApplMicrobiol1997 Dec ;43 (6)355-361、International Journal of SystematicBacteriology,Oct. 1997, pl061-1067)。近年來，依據(jù)DNA-DNA雜交實驗等，一些屬于腸桿菌屬的細(xì)菌被重新分類為成團(tuán)泛菌(Pantoea agglomerans)或 Pantoea dispersa 等(InternationalJournal of Systematic Bacteriology, Julyl989 ；39 (3). p. 337-345) 此外，一些屬于歐文氏菌屬的細(xì)菌被重新分類為菠蘿泛菌(Pantoea ananas)或斯氏泛菌(Pantoeastewartii)(參考 InternationalJournal of Systematic Bacteriology, Jan 1993 ；43(1). p. 162-173)。
腸桿菌屬細(xì)菌的實例包括成團(tuán)腸桿菌(Enterobacter agglomerans)和產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)等。具體地,可以使用歐州專利申請公開952221號說明書示例的菌株。典型的腸桿菌屬的菌株包括成團(tuán)腸桿菌ATCC12287株。典型的泛菌屬細(xì)菌的菌株包括Pantoea ananatis、斯氏泛菌(Pantoeastewartii)、成團(tuán)泛菌、朽1 樣泛菌(Pantoea citrea)。Pantoea ananatis 的具體實例包括Pantoea ananatis AJ13355 株、SC17 株。SC17株是以作為低PH下能夠在含L-谷氨酸和碳源的培養(yǎng)基中增殖的菌株從靜網(wǎng)縣磐田市的土壤中分離出來的菌株AJ13355(FERM BP-6614)為起始，作為粘液質(zhì)低生產(chǎn)突變株選擇出來的菌株(美國專利第6，596，517號)。Pantoea ananatis AJ13355株已于平成10年(1998年)2月19日保藏于通產(chǎn)省工 業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(現(xiàn)名稱為產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心，地址郵政編碼305-8566茨城縣筑波市東I 丁目I番地I中央第6)，保藏號為FERM P-16644，并于平成11年(1999年)I月11日轉(zhuǎn)為基于布達(dá)佩斯條約的國際保藏，并給予保藏號FERMBP-6614。而且,該菌株在分離時被鑒定為成團(tuán)腸桿菌(Enterobacter agglomerans),并當(dāng)作成團(tuán)腸桿菌AJ13355進(jìn)行了保藏。但是，近年來，基于16S rRNA核苷酸序列分析等，其被重新分類為 Pantoea ananatis Pantoea ananatis SC17株已于平成21年(2009年)2月4日保藏于產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(地址郵政編碼305-8566茨城縣筑波市東I 丁目I番地I中央第6)，并給予保藏號FERM ABP-11091。歐文氏菌屬細(xì)菌的實例包括解淀粉歐文氏菌(Erwinia amyIovora)、胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovora);克雷伯氏菌屬細(xì)菌的實例包括植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)。下面，對于給屬于腸桿菌科的細(xì)菌賦予L-半胱氨酸生產(chǎn)能力的方法，或增強(qiáng)這些細(xì)菌的L-半胱氨酸生產(chǎn)能力的方法進(jìn)行描述。為了向細(xì)菌賦予L-半胱氨酸生產(chǎn)能力，可以使用在棒狀桿菌型細(xì)菌或埃希氏菌屬細(xì)菌等的選育中常規(guī)使用的方法。這些方法包括獲取營養(yǎng)缺陷型突變株、類似物抗性菌株或代謝調(diào)節(jié)突變株，或創(chuàng)建L-半胱氨酸生物合成系統(tǒng)酶過表達(dá)的重組菌株等等(參見《7 ^ 7酸発酵》，(株)學(xué)會出版中心，1986年5月30日第一版發(fā)行，第77-100頁)。這里，在L-半胱氨酸生產(chǎn)細(xì)菌的選育中，可以賦予上述性質(zhì)例如營養(yǎng)缺陷性、類似物抗性和代謝調(diào)節(jié)突變中的一種、兩種或者三種以上。此外，表達(dá)被增強(qiáng)的L-半胱氨酸生物合成系統(tǒng)酶可以是單獨一種，也可以是兩種或三種以上。另外，可以將例如營養(yǎng)缺陷性、類似物抗性和代謝調(diào)節(jié)突變等性質(zhì)的賦予與生物合成系統(tǒng)酶的增強(qiáng)組合進(jìn)行。具有L-半胱氨酸生產(chǎn)能力的營養(yǎng)缺陷突變體菌株、L-半胱氨酸類似物抗性菌株或代謝調(diào)節(jié)突變株可如下獲得對親本菌株或野生型菌株施以常規(guī)誘變處理，例如暴露于X-射線或UV照射或用誘變劑例如N-甲基-N’ -硝基-N-亞硝基胍(NTG)或者甲磺酸乙酯(EMS)等處理；其后，從所得的突變株中選擇顯示營養(yǎng)缺陷性、類似物抗性或代謝調(diào)節(jié)突變并且還具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的菌株。通過增強(qiáng)L-半胱氨酸生物合成途徑的酶，或，與生成如L-絲氨酸等作為該途徑的底物的化合物相關(guān)的酶，例如，3-磷酸甘油酸脫氫酶或絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶等的活性，可以提高細(xì)菌的L-半胱氨酸生產(chǎn)能力。因為3-磷酸甘油酸脫氫酶受到絲氨酸的反饋抑制，所以通過使細(xì)菌攜帶有編碼該反饋抑制被削弱或消除了的突變型3-磷酸甘油酸脫氫酶的突變型serA基因，可以增強(qiáng)該酶的酶活性。此外，絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶受到L-半胱氨酸的反饋抑制。因此，通過使細(xì)菌攜帶有編碼該反饋抑制被削弱或消除了的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的突變型cysE基因，可以增強(qiáng)該酶的酶活性。L-半胱氨酸生產(chǎn)能力還可以通過提高編碼YdeD蛋白的ydeD基因(Dabler 等，Mol. Microbiol.，36，1101-1112(2000))或者編碼 YfiK 蛋白的 yfiK 基因(JapanesePatent Laid-open (公開)Νο· 2004-49237)的表達(dá)而增強(qiáng)。本發(fā)明的一個實施方案為具有以下特性中的至少一種i)經(jīng)修飾從而提高了絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，ii)經(jīng)修飾從而提高了 ydeD基因的表達(dá)，iii)經(jīng)修飾從而提高了 3-磷酸甘油酸脫氫酶活性。此外，通過增強(qiáng)硫酸鹽/硫代硫酸鹽輸送系統(tǒng)的活性，也可以提高L-半胱氨酸的生產(chǎn)能力。硫酸鹽/硫代硫酸鹽輸送系統(tǒng)的蛋白質(zhì)由cysPTWAM基因簇編碼(特開2005-137369 號公報，EP1528108 號說明書)。通過提聞yeaS基因的表達(dá),也可以提聞細(xì)囷的L-半胱;氣酸生廣能力(歐洲專利申請公開第1016710號說明書)。L-半胱氨酸生產(chǎn)細(xì)菌的實例可以列舉出、但不限于下述屬于埃希氏菌屬的菌株，如用編碼反饋抑制抗性的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(SAT)的多種cysE等位基因轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM15菌株(美國專利第6，218，168號)；具有編碼適于分泌細(xì)胞毒性物質(zhì)的蛋白質(zhì)的過表達(dá)基因的大腸桿菌W3110菌株(美國專利第5，972，663號)；半胱氨酸脫巰基酶(cysteinedesulfohydrase)活性減少的大腸桿菌菌株(日本特開平11-155571號公報)；和由cysB基因編碼的半胱氨酸調(diào)節(jié)子的正向轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子活性增加的大腸桿菌W3110菌株(W001/27307);含ydeD基因，突變型cysE基因和突變型serA5基因的具有質(zhì)粒pACYC_DES的大腸桿菌(日本特開2005-137369號公報(美國專利公開申請20050124049 (Al)、歐洲專利公開1528108(A1)))等。pACYC_DES為通過將上述三種基因插入pACYC184所得到的質(zhì)粒，每個基因的表達(dá)通過PompA啟動子調(diào)控。作為具有大腸桿菌的半胱氨酸脫巰基酶活性的蛋白質(zhì)，已知胱硫醚-裂合酶(metC 產(chǎn)物，日本特開平 11-155571 號公報，Chandra 等，Biochemistry, 21 (1982) 3064-3069)、色氨酸酶(tnaA 產(chǎn)物，日本特開 2003-169668 號公報，Austin Newton 等,J. Biol.Chem·，240(1965) 1211-1218))、O-乙酰絲氨酸硫化氫解酶B(cysM基因產(chǎn)物，日本特開2005-245311號公報)和maH基因產(chǎn)物(日本特開2005-245311)。通過降低這些蛋白質(zhì)的活性提高了 L-半胱氨酸生產(chǎn)能力。在本發(fā)明中，L-半胱氨酸生產(chǎn)細(xì)菌優(yōu)選具有對反饋抑制有抗性的突變型SAT。作為衍生自大腸桿菌的且對反饋抑制有抗性的突變型SAT，具體已知用谷氨酸殘基取代第256位的甲硫氨酸的突變型SAT(日本特開平11-155571號公報)、用異亮氨酸殘基取代第256位的甲硫氨酸殘基的突變型SAT (Denk, D. and Boeck, A. , J. generalMicrobiol.，133，515-525 (1987))、在第97位氨基酸殘基至第273位氨基酸殘基的區(qū)域具有突變或者缺失從第227位的氨基酸殘基開始的C端區(qū)域的突變型SAT(國際專利公開TO97/15673，美國專利6，218，168)、對應(yīng)于野生型SAT第89至96位的氨基酸序列含有一個或多個突變并且對L-半胱氨酸的反饋抑制脫敏的突變型SAT(美國專利公開申請20050112731 (Al))、SAT第95和96位的Val殘基和Asp殘基分別用Arg殘基和Pro殘基取代的突變型SAT (突變型基因的名稱CysE5，W02005/007841)、在第167位的蘇氨酸殘基用丙氨酸殘基取代的突變(美國專利公開6，218，168，美國專利公開申請20050112731 (Al))，
坐坐寸寸οSAT基因不限于大腸桿菌的基因，而是可以使用編碼具有SAT活性的蛋白質(zhì)的任何基因。已知對L-半胱氨酸的反饋抑制脫敏的擬南芥(Arabidopsisthaliana)的SAT同工酶不敏感，也可以使用編碼該同工酶的基因(FEMS Microbiol.Lett.，179，453-459(1999))。如果將編碼突變型SAT的基因引入細(xì)菌中，則賦予了 L-半胱氨酸生產(chǎn)能力。為了將基因引入細(xì)菌中，可以使用各種用于常見蛋白表達(dá)的載體。這種載體的實例包括 pUC 19、pUC 18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、RSFIOIO、pBR322、pACYC 184、pMW219 等。為了將重組載體引入細(xì)菌中，可以使用常用于細(xì)菌轉(zhuǎn)化的方法，如D.A.Morrison的方法(Methods in Enzymology, 68，326 (1979)),用氯化I丐處理受體細(xì)胞以增加細(xì)胞對DNA 的滲透性的方法(MandeI, M. and Higa, A.，J. Mol. Biol.，53，159 (1970))，和基于電穿孔的方法。此外，蛋白質(zhì)如SAT的活性還可以通過增加編碼該蛋白質(zhì)的基因的拷貝數(shù)來增力口?；虻目截悢?shù)可以通過使用如上所述的載體將該基因引入細(xì)菌中來增加，或者通過將該基因的多個拷貝引入細(xì)菌的染色體DNA中來增加。通過同源重組使用在染色體DNA上以多個拷貝數(shù)存在的序列作為靶標(biāo)引入基因的多個拷貝。在轉(zhuǎn)座子末端存在的重復(fù)DNA或倒置的重復(fù)可以用作染色體DNA上以多個拷貝數(shù)存在的序列。或者，如在特開平2-109985號公報中記載的，可以通過將多個拷貝的基因納入轉(zhuǎn)座子并將其轉(zhuǎn)移而引入染色體DNA中。生產(chǎn)從L-半胱氨酸作為起始材料生物合成的化合物如Y -谷氨酰半胱氨酸、谷胱甘肽、胱硫醚、高半胱氨酸、甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸的能力，還可以通過提高目標(biāo)化合物的生物合成途徑的酶的活性或者通過減少從目標(biāo)化合物的生物合成途徑分支出的途徑的酶或分解目標(biāo)化合物的酶的活性而賦予或得到提高。例如，通過提高Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶活性和/或通過降低谷胱甘肽合成酶活性可以提高生產(chǎn)Y-谷氨酰半胱氨酸的能力。此外，可以通過提高Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性和/或谷胱甘肽合成酶活性來賦予或提高生產(chǎn)谷胱甘肽的能力。此外，通過使用對谷胱甘肽的反饋抑制有抗性的突變型Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶，可以提高生產(chǎn)Y -谷氨酰半胱氨酸或谷胱甘肽的能力。在Li等(Yin Li, Gongyuan Wei, Jian Chen, Appl.Microbiol. Biotechnol. ,66 :233-242(2004))的綜述中詳細(xì)記載了谷胱甘肽的生產(chǎn)。 生產(chǎn)L-甲硫氨酸的能力可以通過賦予L-蘇氨酸營養(yǎng)缺陷性或正亮氨酸抗性而賦予或提高(日本特開2000-139471號)。在大腸桿菌中，L-蘇氨酸的生物合成中涉及的酶的基因作為蘇氨酸操縱子(thrABC)存在，并且喪失了 L-高絲氨酸生物和下述化合物合成能力的L-蘇氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株可以通過例如缺失thrBC部分而獲得。在正亮氨酸抗性菌株中，削弱了 S-腺苷甲硫氨酸合成酶活性，并且賦予或提高了生產(chǎn)L-甲硫氨酸的能力。在大腸桿菌中，S-腺苷甲硫氨酸合成酶是由metK基因編碼的。生產(chǎn)L-甲硫氨酸的能力還可以通過缺失甲硫氨酸阻抑物或通過提高L-甲硫氨酸生物合成中涉及的酶如高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀?；浮㈦琢蛎裏-合成酶和天冬氨酸激酶-高絲氨酸脫氫酶II的活性而賦予或提高(特開2000-139471)。在大腸桿菌中，甲硫氨酸阻抑物是由metj基因編碼的，高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀?；甘怯蒻etA基因編碼的，胱硫醚Y -合成酶是由metB基因編碼的，天冬氨酸激酶-高絲氨酸脫氫酶II是由metL基因編碼的。此外，通過使用對L-甲硫氨酸的反饋抑制有抗性的突變型高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀?；福€可以賦予或提高生產(chǎn)L-甲硫氨酸的能力(特開2000-139471號、US20090029424)。由于經(jīng)由L-半胱氨酸作為中間體生物合成L-甲硫氨酸，生產(chǎn)L-甲硫氨酸的能力還可以通過提高生產(chǎn)L-半胱氨酸的能力得以提高(特開2000-139471號，US20080311632)。因此，對于賦予或提高生產(chǎn)L-甲硫氨酸的能力，賦予或增強(qiáng)生產(chǎn)L-半胱氨酸的能力也是有效的。L-甲硫氨酸生產(chǎn)菌和用于構(gòu)建它們的親本株的具體實例包括如下的大腸桿菌，如AJl1539(NRRL B-12399),AJl1540(NRRL B-12400),AJl1541(NRRL B-I240I),AJl1542(NRRLB-12402)(英國專利2075055)，對作為L-甲硫氨酸類似物的正亮氨酸有抗性的218菌株(VKPM B-8125，俄羅斯專利 2209248)，和 73 菌株(VKPM B-8126，俄羅斯專利 2215782)。此外，作為L-甲硫氨酸生產(chǎn)菌或用于構(gòu)建該菌的親本株，也可以使用源自大腸桿菌 W3110 的 AJ13425(FERM P-16808，特開 2000-139471 號)。AJ13425 是一種 L-蘇氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株，其中缺失了甲硫氨酸阻抑物，削弱了胞內(nèi)S-腺苷甲硫氨酸合成酶活性，且提高了胞內(nèi)高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀?；富钚?、胱硫醚Y-合成酶活性和天冬氨酸激酶-高絲氨酸脫氫酶II活性。AJ13425已于1998年5月14日保藏于通產(chǎn)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(現(xiàn)名產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心，地址郵政編碼305-8566茨城縣筑波市東I 丁目I番地I中央第6，日本)，并給予保藏號FERM P-16808。由于胱硫醚和高半胱氨酸是L-甲硫氨酸生物合成途徑的中間體，部分使用上述用于提高生產(chǎn)L-甲硫氨酸能力的方法用于提高生產(chǎn)這些物質(zhì)的能力是有效的。作為具體的提高生產(chǎn)胱硫醚能力的方法，已知有使用甲硫氨酸-營養(yǎng)缺陷型菌株(日本特愿2003-010654)的方法和將半胱氨酸(或用于其生物合成的原料)和/或高絲氨酸(或用于其生物合成的原料)添加至發(fā)酵培養(yǎng)物的方法(日本特開2005-168422)。由于通過使用胱硫醚作為前體生產(chǎn)了高半胱氨酸，因此上述用于提高生產(chǎn)胱硫醚能力的方法對于提高生產(chǎn)高半胱氨酸的能力也是有效的。由于L-甲硫氨酸是S-腺苷甲硫氨酸的前體，對于提高生產(chǎn)L-腺苷甲硫氨酸的能力，部分使用上述用于提高生產(chǎn)L-甲硫氨酸的能力的方法是有效的。例如，生產(chǎn)L-腺苷甲硫氨酸的能力可以通過提高甲硫氨酸腺苷基轉(zhuǎn)移酶(歐洲專利公開0647712和1457569)或者通過提高分泌因子MdfA (美國專利7，410，789)而賦予或提高。本發(fā)明的細(xì)菌可以通過修飾這種如上所述的屬于腸桿菌科并具有L-半胱氨酸生 產(chǎn)能力的細(xì)菌從而降低yciW基因編碼的蛋白質(zhì)(下文也稱為“YciW”)的活性而得到?；蛘撸谛揎椉?xì)菌以降低YciW蛋白的活性后，可以賦予L-半胱氨酸生產(chǎn)能力。術(shù)語yciW基因與ECK1282和JW5200同義。表述“降低yciW基因編碼的蛋白質(zhì)的活性”表示yciW基因編碼的YciW蛋白的活性與未經(jīng)修飾的菌株如野生型菌株或親本株的活性相比是降低的，并且包括活性完全喪失的情形這種降低YciW蛋白的活性的修飾通過例如降低yciW基因的表達(dá)而實現(xiàn)。具體地，例如，蛋白質(zhì)的胞內(nèi)活性可以通過缺失染色體上部分或全部的yciW基因的編碼區(qū)而降低。YciW蛋白的活性還可以通過經(jīng)由修飾表達(dá)調(diào)控序列如yciW基因的啟動子和Shine-Dalgarno (SD)序列等來降低yciW基因的表達(dá)而降低。此外,基因的表達(dá)量還可以通過修飾除表達(dá)調(diào)控序列之外的非翻譯區(qū)來降低。此外，可以缺失包括在染色體上所述基因兩側(cè)的序列的整個基因。此外，這還可以通過在染色體上yciW基因的編碼區(qū)中弓I入氨基酸取代(錯義突變)、終止密碼子(無義突變)或添加或缺失一個或兩個核苷酸的移碼突變來實現(xiàn)(Journal of Biological Chemistry, 272 :8611-8617 (1997) ；Proceedings of theNational Academy of Sciences, USA, 955511-5515(1998) ；Journal ofBiological Chemistry, 266，20833-20839 (1991))。此外，基因的表達(dá)還可以通過操作涉及表達(dá)調(diào)控的因子來減少(涉及轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)控的低分子(誘導(dǎo)劑、抑制劑等)、蛋白質(zhì)(轉(zhuǎn)錄因子等)、核酸(sRNA 等)，等)。此外，該修飾可以為通過基于X射線或紫外照射或使用如N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍等誘變劑的常規(guī)誘變所引起的修飾，只要其為降低YciW蛋白活性的修飾即可。表達(dá)調(diào)控序列的修飾是對優(yōu)選一個或多個核苷酸、更優(yōu)選兩個或更多個核苷酸、特別優(yōu)選三個或更多個核苷酸進(jìn)行的。當(dāng)編碼區(qū)域缺失時，待缺失的區(qū)域可以為N端區(qū)域、內(nèi)部區(qū)域或C端區(qū)域中的任意區(qū)域，或者甚至可以為整個編碼區(qū)，只要降低或缺失了 YciW蛋白的功能即可。較長區(qū)域的缺失通?？梢愿哟_定地失活基因。此外，優(yōu)選待缺失區(qū)域的上游或下游的讀碼框不相同。此外，降低YciW蛋白活性的修飾還可以通過將另一序列插入yciW基因的編碼區(qū)來實現(xiàn)。當(dāng)將另一序列插入yciW基因的編碼區(qū)中時，該序列可以插入該基因的任何區(qū)域，并且插入較長的序列可以更確定地失活該基因。優(yōu)選的是插入位點的上游或下游的讀碼框不相同。對另一序列沒有特別限定，只要選擇其插入會降低或缺失YciW蛋白的功能的序列即可，并且實例包括攜帶抗生素抗性基因的轉(zhuǎn)座子或用于生產(chǎn)L-半胱氨酸的基因，等等。染色體上的yciW基因可以如上文所述進(jìn)行修飾，通過例如制備缺失型基因，在該缺失型基因中缺失了基因的部分序列，使得該缺失型基因不生產(chǎn)正常發(fā)揮功能的YciW蛋白，并且用含有該缺失型基因的DNA轉(zhuǎn)化細(xì)菌以引起該缺失型基因和染色體上的基因之間的同源重組，并由此用該缺失型基因取代染色體上的基因。由缺失型基因編碼的YciW蛋白即使得到了生產(chǎn)也具有不同于野生型蛋白質(zhì)的構(gòu)型，并由此降低或缺失了該功能。這種基于使用同源重組的基因取代的基因破壞已經(jīng)確立，并存在稱為“Red-driven整合”的方法(Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97 :6640-6645 (2000))、使用線性DNA的方法如使用Red driven整合并結(jié)合衍生自λ噬菌體的切除系統(tǒng)的方法(Cho, Ε. H. , Gumport, R. I. , Gardner, J. F. , J. Bacteriol. , 184 :5200-5203 (2002))(參見W02005/010175)、使用含溫度敏感復(fù)制起點的質(zhì)粒的方法、使用能夠接合轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒的方法、使用在宿主中不具有復(fù)制起點的自殺載體的方法(美國專利6，303，383，日本特開平05-007491 號)，等等。
yciW基因的轉(zhuǎn)錄量的降低可以通過比較該基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的量與在野生型菌株或未經(jīng)修飾的菌株中觀察到的量得到確認(rèn)。評估m(xù)RNA量的方法的實例包括Northern雜交、RT-PCR(Molecular Cloning, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold SpringHarbor, USA, 2001),等等。YciW蛋白量的降低可以通過使用抗體的Western印跡得到確認(rèn)(Molecularcloning, Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor, USA, 2001)。大腸桿菌K12菌株的yciW基因?qū)?yīng)于在NCBI數(shù)據(jù)庫中作為GenBank登錄號NC_000913(版本 NC_000913. 2 GI :49175990)登記的基因組序列中第 1347004 至 1348131位序列的互補(bǔ)序列。同樣地，YciW蛋白作為GenBank登錄號NP_415803 (版本NP_415803. 2GI :90111242,基因座標(biāo)簽(l0Cus_tag) =〃bl287〃)登記。含yciW基因的核苷酸序列及其上游區(qū)和下游區(qū)的300bp和由該基因編碼的氨基酸序列分別顯示為SEQ ID NOS :1和2。由于yciW基因的核苷酸序列會由于細(xì)菌所屬的屬、種或菌株而不同，所以待修飾的yciW基因可以為SEQ ID NO 1的核苷酸序列中第301至1428的核苷酸序列的變體。yciW基因的變體可以通過使用BLAST (http //blast. genome, jp/)等參照SEQ ID NO :1的核苷酸序列進(jìn)行檢索。此外，yciW基因的變體包括該基因的同源物，例如，可以使用例如微生物如屬于腸桿菌科的細(xì)菌和棒狀桿菌型細(xì)菌的染色體作為模板和基于SEQ ID N0:1的核苷酸序列制備的合成寡核苷酸通過PCR擴(kuò)增的基因。除了大腸桿菌外的細(xì)菌的yciW基因同源物的實例包括下列細(xì)菌的yciW基因。在表I中，同一性(%)表示由BLAST確定的大腸桿菌K12菌株的YciW蛋白和各細(xì)菌同源物之間的同一性。登錄號為NCBI數(shù)據(jù)庫的登錄號。表I
權(quán)利要求
1.一種屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的細(xì)菌,其具有L-半胱氨酸生產(chǎn)能力，并且經(jīng)過修飾從而降低了 yciW基因編碼的蛋白質(zhì)的活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的細(xì)菌，其中所述蛋白質(zhì)的活性是通過降低yciW基因的表達(dá)量或通過破壞所述基因而降低的。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的細(xì)菌，其中所述蛋白質(zhì)為下述(A)或(B)中限定的蛋白質(zhì) (A)具有SEQID NO 2中所不氣基酸序列的蛋白質(zhì)， (B)具有SEQID NO :2中所示氨基酸序列但包含一個或數(shù)個氨基酸殘基的取代、缺失、插入或添加，并且在所述細(xì)菌中的活性降低時導(dǎo)致L-半胱氨酸生產(chǎn)能力改善的蛋白質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任一項所述的細(xì)菌，其中所述yciW基因為下述(a)或(b)中限定的DNA (a)包含核苷酸序列SEQID NO : I中第301至1428位的核苷酸序列的DNA， (b)能夠與核苷酸序列SEQID NO :1中第301至1428位的核苷酸序列的互補(bǔ)序列或由所述核苷酸序列制備的探針在嚴(yán)格條件下雜交，并且在所述細(xì)菌中的活性降低時導(dǎo)致L-半胱氨酸生產(chǎn)能力改善的DNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至4中任一項所述的細(xì)菌，其還具有下述特性中的至少ー種 i)經(jīng)過修飾從而提高了絲氨酸こ酰轉(zhuǎn)移酶活性， ii)經(jīng)過修飾從而提高了ydeD基因的表達(dá)， iii)經(jīng)過修飾從而提高了3-磷酸甘油酸脫氫酶活性。
6.根據(jù)權(quán)利要求I至5中任一項所述的細(xì)菌,其為埃希氏菌屬(Escherichia)的細(xì)菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的細(xì)菌,其為大腸桿菌(Escherichiacoli)。
8.—種L-半胱氨酸、L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物、或上述物質(zhì)的混合物的生產(chǎn)方法，該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求I至7中任一項所述的細(xì)菌，并從所述培養(yǎng)基中收集L-半胱氨酸、L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物或上述物質(zhì)的混合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述L-半胱氨酸的衍生物為噻唑烷衍生物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種生產(chǎn)L-半胱氨酸的細(xì)菌以及一種使用所述細(xì)菌生產(chǎn)L-半胱氨酸等的方法，通過開發(fā)新的技術(shù)用于改善細(xì)菌的L-半胱氨酸生產(chǎn)能力。通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)屬于腸桿菌科的細(xì)菌，所述細(xì)菌具有L-半胱氨酸生產(chǎn)能力并且經(jīng)過修飾從而使得由yciW基因編碼的蛋白質(zhì)如以下(A)或(B)定義的蛋白質(zhì)的活性降低，并且從所述培養(yǎng)基中收集L-半胱氨酸、L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物或上述物質(zhì)的混合物，生產(chǎn)出這些化合物(A)具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)，(B)具有SEQ ID NO2中所示氨基酸序列但包含一個或數(shù)個氨基酸殘基的取代、缺失、插入或添加，并且在所述細(xì)菌中的活性降低時導(dǎo)致L-半胱氨酸生產(chǎn)能力改善的蛋白質(zhì)。
文檔編號C12N15/09GK102639691SQ20108005419
公開日2012年8月15日 申請日期2010年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月30日
發(fā)明者野中源 申請人:味之素株式會社