專(zhuān)利名稱(chēng)：多能細(xì)胞的誘導(dǎo)的制作方法
多能細(xì)胞的誘導(dǎo)對(duì)相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)根據(jù)35U. S. C. § I. 119(e)要求2009年10月16日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/252，548的權(quán)益，該美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)的內(nèi)容通過(guò)弓I用整體并入。
背景技術(shù)：
產(chǎn)生人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)的最新進(jìn)展(Takahashi, K.等，Cell 131,861-72(2007) ；Yu, J.等，Science 318，1917-20 (2007) ;Muller，L. U. W.，等，Mol. Ther. 17，947-53(2009))，已經(jīng)喚起了它們?cè)谏镝t(yī)學(xué)研究和臨床應(yīng)用中實(shí)用的希望。但是，iPSC產(chǎn)生仍然是非常慢的(約4周)且低效的(<0.01% (Takahashi, K.等，Cell 131，861-72(2007) ；Yu, J.等，Science 318,1917-20(2007))過(guò)程，該過(guò)程產(chǎn)生異質(zhì)細(xì)胞群體。從這樣的混合物中鑒別出完全重編程序的(repTOgrammecOiPSC是使人厭煩的，且需要在人多能細(xì)胞培養(yǎng)方面的專(zhuān)門(mén)技能。盡管正在克服外源性重編程序因子的基因組插入的危險(xiǎn)，但是重編程序的低效率和緩慢動(dòng)力學(xué)繼續(xù)代表著人iPSC的最終應(yīng)用的難克服的問(wèn)題。例如，在重編程序過(guò)程中，可能發(fā)生遺傳的或后生的異常的增加，其中腫瘤抑制因子可能被抑制，致癌途徑可能被激活。盡管最近的研究已經(jīng)報(bào)道，除了最初的4種因子以外，通過(guò)遺傳操作來(lái)提高重編程序的效率(Feng，B.等，Cell Stem Cell 4，301-12 (2009))，但是這樣的操作通常使得該過(guò)程甚至更復(fù)雜，并會(huì)增加遺傳改變和致瘤性的風(fēng)險(xiǎn)。因而，仍然存在對(duì)更安全的、更容易的且更有效的人iPSC生產(chǎn)以及促進(jìn)對(duì)重編程序的基本機(jī)理的鑒定和表征的方法的巨大需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了混合物(例如，可用于誘導(dǎo)iPSC)。在一些實(shí)施方案中，所述混合物包含哺乳動(dòng)物細(xì)胞；TGF P 受體 /ALK5 抑制劑；MEK抑制劑；和Rho GTP酶/ROCK途徑抑制劑。在一些實(shí)施方案中，至少99%的細(xì)胞是非多能細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所有或基本上所有的細(xì)胞是非多能細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是人細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述TGFP受體/ALK5抑制劑是SB431542。在一些實(shí)施方案中，所述MEK抑制劑是ro0325901。在一些實(shí)施方案中，所述ROCK抑制劑是具有下式的化合物權(quán)利要求
1.一種混合物，其包含 哺乳動(dòng)物細(xì)胞； TGF ^受體/ALK5抑制劑； MEK抑制劑；和 ROCK抑制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的混合物，其中至少99%的細(xì)胞是非多能細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的混合物，其中基本上所有的細(xì)胞是非多能細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的混合物，其中所述細(xì)胞是人細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的混合物，其中所述TGFP受體/ALK5抑制劑是SB431542。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的混合物，其中所述MEK抑制劑是PD0325901。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的混合物，其中所述ROCK抑制劑是具有下式的化合物
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的混合物，其中所述ROCK抑制劑具有下式
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的混合物，其中所述ROCK抑制劑具有下式
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的混合物，其中所述ROCK抑制劑是
11.根據(jù)權(quán)利要求I所述的混合物，其中當(dāng)使所述混合物處于足以誘導(dǎo)所述混合物中的非多能細(xì)胞轉(zhuǎn)化成誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的條件下時(shí)，所述抑制劑的濃度足以使將所述細(xì)胞誘導(dǎo)成誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的效率提高至少10%。
12.根據(jù)權(quán)利要求I所述的混合物，其中所述混合物另外包含GSK3抑制劑。
13.一種將非多能哺乳動(dòng)物細(xì)胞誘導(dǎo)成誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，所述方法包括 在足以誘導(dǎo)至少一些細(xì)胞變成多能干細(xì)胞的條件下，使非多能細(xì)胞接觸TGF ^受體/ALK5抑制劑； MEK抑制劑；和 ROCK抑制劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述條件包括將至少一種外源性轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入所述非多能細(xì)胞中。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述至少一種外源性轉(zhuǎn)錄因子是Oct多肽，且所述細(xì)胞進(jìn)一步接觸組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄因子選自由以下組成的組0ct多肽、Klf多肽、Myc多肽和Sox多肽。
17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，所述方法包括將至少2、3或4種外源性轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入所述非多能細(xì)胞中，其中所述轉(zhuǎn)錄因子選自由以下組成的組=Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽和Sox多肽。
18.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中通過(guò)將多核苷酸導(dǎo)入所述非多能細(xì)胞中來(lái)導(dǎo)入所述至少一種轉(zhuǎn)錄因子，其中所述多核苷酸編碼所述至少一種外源性轉(zhuǎn)錄因子，從而在所述細(xì)胞中表達(dá)一種或多種所述轉(zhuǎn)錄因子。
19.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中通過(guò)使外源性多肽接觸所述非多能細(xì)胞來(lái)導(dǎo)入所述至少一種轉(zhuǎn)錄因子，其中所述多肽包含所述轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列，其中在將所述多肽導(dǎo)入所述細(xì)胞的條件下進(jìn)行所述導(dǎo)入。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述多肽包含增強(qiáng)跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的氨基酸序列。
21.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述細(xì)胞是人細(xì)胞。
22. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述TGFP受體/ALK5抑制劑是SB431542。
23.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述MEK抑制劑是TO0325901。
24.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述ROCK抑制劑是具有下式的化合物
25.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述ROCK抑制劑是具有下式的化合物
26.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述ROCK抑制劑是具有下式的化合物
27.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述ROCK抑制劑是
28.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中當(dāng)使所述混合物處于足以誘導(dǎo)所述混合物中的非多能細(xì)胞轉(zhuǎn)化成誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的條件下時(shí)，所述抑制劑的濃度足以使將所述細(xì)胞誘導(dǎo)成誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的效率提高至少10%。
29.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述混合物另外包含GSK3抑制劑。
30.一種用于誘導(dǎo)非多能哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的多能性的試劑盒，所述試劑盒包含 TGF ^受體/ALK5抑制劑； MEK抑制劑；和 ROCK抑制劑。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的試劑盒，其中所述TGFP受體/ALK5抑制劑是SB431542。
32.根據(jù)權(quán)利要求30所述的試劑盒，其中所述MEK抑制劑是H)0325901。
33.根據(jù)權(quán)利要求30所述的試劑盒，其中所述ROCK抑制劑是具有下式的化合物
34.根據(jù)權(quán)利要求30所述的試劑盒，其中所述ROCK抑制劑是具有下式的化合物
35.根據(jù)權(quán)利要求30所述的試劑盒，其中所述ROCK抑制劑是具有下式的化合物
36.根據(jù)權(quán)利要求30所述的試劑盒，其中所述ROCK抑制劑是
37.根據(jù)權(quán)利要求30所述的試劑盒，其中所述試劑盒另外包含GSK3抑制劑和/或組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑。
全文摘要
用于產(chǎn)生人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)的重編程序方法的緩慢動(dòng)力學(xué)和低效率對(duì)它們?cè)谏镝t(yī)學(xué)應(yīng)用中的實(shí)用性產(chǎn)生重大限制。我們?cè)谶@里描述了一種化學(xué)方法，其在處理7天內(nèi)，顯著提高(＞200倍)從人成纖維細(xì)胞產(chǎn)生iPSC的效率。這將為開(kāi)發(fā)更安全的、更有效的、非病毒性的對(duì)人的體細(xì)胞重編程序的方法提供基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N5/00GK102741394SQ201080056597
公開(kāi)日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2010年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月16日
發(fā)明者丁生, 林通翔 申請(qǐng)人:斯克里普斯研究所