專利名稱：海藻細胞核基因組的同源組合的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子生物學，更具體的，涉及外源DNA元素在海藻細胞中的表達。相關技術的描述對一個細胞的DNA操作可以賦予這個細胞新的功能。比如，一個轉化細胞(也就是一個吸收了外源DNA的細胞)可以比野生型細胞更加強壯。對很多所謂的生物系統(tǒng)模型(即一些已被充分研究的生物體)而言，已經開發(fā)出了用于轉化它們的DNA元素。對于其他尚未充分了解的生物體，轉化是一個重要事件，是推進基因工程的必要前提。需要對這些生物體進行有效的、非隨機轉化使得這項挑戰(zhàn)變得更為復雜。因此，需要對海藻細胞核基因組進行同源重組的方法。發(fā)明概述本發(fā)明提供并例舉了將脫氧核糖核酸(DNA)導入海藻細胞細胞核的方法?？梢灾苽溥@樣一個轉化結構，該結構具有與相應第一細胞核DNA序列相似的第一 DNA序列，與相應第二細胞核DNA序列相似的第二 DNA序列，和在該轉化結構中第一和第二 DNA序列之間插入的感興趣的DNA序列。可對位于相應第一和第二細胞核DNA序列之間的目標DNA序列進行轉化，從而以感興趣的DNA序列取代目標DNA序列。在進一步的實施例中，感興趣的DNA序列可能包括抗生素抗性標記，啟動子序列和抗生素抗性標記，或者代謝物營養(yǎng)同化或者生物合成基因。該海藻細胞的表型特征可能被改變或者獲得新的特征。本發(fā)明提供并例舉了一種轉化結構，該轉化結構具有與相應第一海藻細胞核DNA序列相似的第一 DNA序列，與相應第二海藻細胞核DNA序列相似的第二 DNA序列，和在該轉化結構中第一和第二 DNA序列之間插入的感興趣的DNA序列。根據進一步的實施例，感興趣DNA序列可以包含削弱或者破壞代謝物營養(yǎng)同化或生物合成基因的野生型功能的DNA。


圖I顯示，根據實施例之一，如何用例舉的脫氧核糖核酸(DNA)序列向海藻細胞核導入DNA。圖2是一個流程圖，例舉一種海藻細胞核基因組同源重組的方法。
圖3顯示一例DNA序列()，該序列包括硝酸鹽還原酶基因的至少一部分。圖4顯示一例轉化結構(2)，其中包含硝酸鹽還原酶DNA序列作為轉化結構的兩側序列。圖5是顯示幾個轉化株分子遺傳學分析結果的凝膠照片。發(fā)明的詳細描述圖I顯示，根據實施例之一，如何用例舉的脫氧核糖核酸(DNA)序列向海藻細胞核導入DNA。圖I中顯示了一個轉化結構110，海藻細胞核DNA 120，和轉化了的轉化海藻細胞核 DNA 130。轉化結構110包含第一 DNA序列A’，其在長度和序列上與海藻細胞核 DNA 120中的第一海藻細胞核DNA序列A相似。轉化結構110包含第二 DNA序列C’，其在長度和序列上與海藻細胞核DNA 120中的第二海藻細胞核DNA序列C相似。轉化結構110還包含感興趣DNA序列X，其插在轉化結構110的第一 DNA序列A’和第二 DNA序列C’之間。在一例將DNA導入海藻細胞細胞核方法中，制備諸如示例性轉化結構110這樣的轉化結構。然后，可用轉化結構110來轉化位于細胞核DNA 120的第一序列A和第二序列C中間的目標DNA序列B，導致目標DNA序列B被感興趣DNA序列X所取代。在各種實施例中，分別與對應的細胞核DNA120中第一序列A和/或第二序列C相似的第一 DNA序列AIP /或第二 C’DNA序列可以是任意堿基對(bps)長度的，范圍從大約Obps到大約10，000bps，或者更長。另外，第一 DNA序列A’在堿基對長度上與第二 DNA序列C’可以相同也可以不同。各種實施例中，在細胞核DNA 120第一序列A和第二序列C之間的目標DNA序列B可以是任意堿基對(bps)長度的，范圍從大約Obps到大約10，000bps，或者更長。一些實施例中，感興趣DNA序列X可以把轉化結構110的第一序列A’和第二序列C’以小至約0bps、大至約10，OOObps的間距隔開。感興趣DNA序列X可以包含各種序列，比如調控序列或者啟動子序列(單向的或者雙向的)，抗生素抗性標記，或者可以包含啟動子序列和一個抗生素抗性標記。另一些實施例中，感興趣DNA序列X可以包含代謝物營養(yǎng)同化或生物合成基因。比如，感興趣DNA序列X可以包含編碼硝酸鹽還原酶或者亞硝酸鹽還原酶的基因。各種實施例中，感興趣DNA序列X可以而非必需編碼多肽的至少一部分。在一些例子中，感興趣DNA序列X可以只被轉錄，但是不被翻譯成多肽。在其他的實例中，感興趣DNA序列X編碼的肽添加到到第一細胞核DNA序列A或者第二細胞核DNA序列C所編碼的肽。感興趣DNA序列X也可以編碼非編碼的調控DNA序列。在各種實施例中，感興趣DNA序列X的長度可以與細胞核DNA 120的目標DNA序列B不相似。比如，感興趣DNA序列X可能長約Odps，造成目標DNA序列B的缺失或者近乎缺失，如同在轉化海藻細胞核DNA 130中那樣。一些實施例中，可用轉化結構110來轉化位于細胞核DNA 120的第一序列A和第二序列C之間的目標DNA序列B，導致目標DNA序列B被感興趣DNA序列X所取代。細胞核DNA 120可以是微擬球藻(Nannochloropsis)基因組的至少一部分。并且,所述微擬球藻的基因組可以是單倍體基因組。這里所述的轉化方法可以用來改變海藻細胞的表型特征來從而賦予其新的特征。比如，所述用感興趣DNA序列X取代的目標DNA序列B可以是至少部分取代，使得目標DNA序列的基因功能部分降低。另一些實施例中，感興趣DNA序列X包含削弱或者破壞目標基因B的野生型功能的DNA，所述野生型功能原本代謝物生物合成或營養(yǎng)同化作用所需。相反地，也可以用感興趣DNA序列X通過轉化把代謝物生物合成或者營養(yǎng)同化基因削弱了或者破壞了的野生型功能還原成野生型功能。比如，可以用感興趣DNA序列X轉化營養(yǎng)缺陷型海藻細胞，導致代謝物的生物合成或營養(yǎng)同化。這種轉化株可以通過在不含該代謝物的液體或者固體培養(yǎng)基中局限培養(yǎng)來挑選，即所述培養(yǎng)基不含轉化了的營養(yǎng)缺陷型海藻細胞生長所必需的的該代謝物。圖2是一個流程圖，顯示一例海藻細胞核基因組同源重組的方法。在210步驟中，制備一個轉化結構。在實施例之一中，轉化結構110 (圖I)包含第一 DNA序列A’，其與海藻細胞核DNA 120(圖I)中的第一海藻細胞核DNA序列A相似。轉化結構110還可以包含第二 DNA序列C’，其與海藻細胞核DNA 120中的第二海藻細胞核DNA序列C相似。轉化結構110可以包含感興趣DNA序列X，插入在轉化結構110 DNA的第一序列A’和第二序列C’之間。
在220步驟中，細胞核DNA的目標序列被轉化。各種實施方式中，可用轉化結構110來轉化細胞核DNA 120的第一序列A和第二序列C之間的目標序列，導致目標DNA序列B被感興趣DNA序列X所取代。在230步驟中，挑選轉化細胞。比如，可用感興趣DNA序列X轉化營養(yǎng)缺陷型海藻細胞，引起某代謝物的生物合成或營養(yǎng)同化作用。這種轉化株可以通過在不含該代謝物的液體或者固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)來挑選，即所述培養(yǎng)基不包含轉化了的營養(yǎng)缺陷型海藻細胞生長所必需的該代謝物。
實施例。為了檢測微擬球藻中同源重組的機率，發(fā)明者發(fā)明了一種轉化結構，該結構使用了選擇標記(博來霉素基因)，其左右兩側各有一個硝酸鹽還原酶DNA序列。圖3顯示一例DNA序列()，該序列至少包括硝酸鹽還原酶基因的一部分。圖3中，左側硝酸鹽還原酶DNA序列標記為310，右側硝酸鹽還原酶DNA序列標記為320。如下文所述，在310和320中間的內源硝酸鹽還原酶基因的DNA序列315將被轉化結構上的DNA序列所取代。圖4顯示一例轉化結構(2)，包含用來制造轉化結構兩側序列的硝酸鹽還原酶DNA序列。圖4顯示左側硝酸鹽還原酶DNA序列310’，選擇標記盒NT7 410，和右側硝酸鹽還原酶DNA序列320’。選擇標記盒NT7 410包含紫黃質一葉綠素結合蛋白(“Vcp”)3’UTR，博來霉素抗性序列，和Vcp啟動子序列。Vcp啟動子和Vcp 3’UTR DNA序列來自兩個不同的Vcp基因簇，參見2009年6月8日提交的標題為“海藻細胞轉化的基于VCP的載體”的第12/480，635號美國非臨時申請。包含Vcp啟動子、博來霉素抗性序列和Vcp 3’ UTR的NT7盒以反平行式插入到左側硝酸鹽還原酶310’和硝酸鹽還原酶320’之間。方案使用的引物。Vcp ble UTR與NR的同源重組，反向，一個外顯子部分缺失P311 NR 左側正向引物AGTCGTAGCAGCAGGAATCGACAA。
P311 NR左側反向引物GGCACACGAGATGGACAAGATCAGTGGAATAATGAGGCGGACAGGGAA。P313 NR右側正向引物GTGCCATCTTGTTCCGTCTTGCTTGCGCAAGCCTGAGTACATCATCAA。P314 NR 右側反向引物ATGACGGACAAATCCTTACGCTGC。P215 NT7 互補正向引物AAGCAAGACGGAACAAGATGGCAC。P119 PL38 3UTR 折返引物CTGATCTTGTCCATCTCGTGTGCC。用Takara Taq運行PCR來生成NR兩側序列和插入盒。用P311和P312從gNDA擴增左側序列LF(IkB)。用P313 和 P314 從 gNDA 擴增右側序列 RF (I. 04kB)。 (注兩側序列都包括來自312和313引物的與NT7的連接區(qū)域。)用P215 和 Pl 19 從 NT7 擴增插入結構 IC (I. 817kB)。所有的PCR產物都進行凝膠純化。LF，1C，RF片段用下面的PCR來連接。全部100 微升 PCR RXN170 納克 LF，170 納克 1C，與 P311 和 P215(2. 817kB)作融合 PCR，得 LF-IC。170 納克 RF，170 納克 1C，與 P119 和 Ρ314(2· 821kB)作融合 PCR，得 RF-IC。各片段用凝膠純化后直接用于最后的PCR。170 納克 LF-IC 與 170 納克 RF-IC，與 P311 和 P314 一起做 PCR。從凝膠中回收3. 8kB的DNA片段，直接用于轉化。轉化200納克DNA片段(見上文)用于此前描述的轉發(fā)方法。區(qū)別在于將細胞培養(yǎng)在包含氯化銨的F2培養(yǎng)基(用2mM氯化銨代替硝酸鹽)中。轉化后涂板前的恢復也用2mM氯化銨培養(yǎng)基進行。細胞涂在含2mM氯化銨(而不是2mM硝酸鹽(N03_))的F2 (包括吉歐霉素)的平板上。所有的培養(yǎng)基都有50%鹽度，與海水相當。挑選。選擇200個克隆，重新懸浮在100微升缺氮F2培養(yǎng)基中，并點樣在含有不同氮源的方形平板(F2培養(yǎng)基)上。沒有氮2mM 的 No2_2mM 的 N03-2mM 的 NH4C1絕大多數克隆不能在含硝酸鹽的培養(yǎng)基上生成(變黃指示氮缺乏；硝酸鹽還原酶敲除突變株不能在以硝酸鹽作為唯一氮源的培養(yǎng)基上生長)，但是所有克隆在亞硝酸鹽和氯化銨平板上生長同樣地良好。并且，在硝酸鹽平板上生長抑制的克隆在外觀上不能區(qū)別于氮缺乏(沒有氮)平板上的細胞(轉化的或者沒有轉化的)，表明轉化株在硝酸鹽平板上的生長阻滯是由于不能使用硝酸鹽作為氮源。野生株和硝酸鹽還原酶無關轉化突變株都從未出現在含硝酸鹽作為唯一氮源的瓊脂平板上的生長阻滯，表明克隆的硝酸鹽還原酶基因失活。結果。
圖5是顯示對幾個轉化株的分子遺傳學分析的凝膠照片。分析了 192個克隆。其中，目測篩出176個克隆明顯地具有硝酸鹽還原酶缺陷。還對克隆進行了 PCR分析。圖5中的凝膠照片顯示了幾個轉化株(標記為1，2，7，9，11和12)的分子遺傳學分析。克隆2和12已被認定能夠在以硝酸鹽為唯一氮源上生長，而克隆1，7，9和11則不能，表明硝酸鹽還原酶被破壞。用于PCR遺傳學分析的引物從野生型基因獲得一個較小的DNA片段，而從突變基因則獲得一個較大的DNA片段，所述突變基因包含插入的大挑選標記。1，7，9和11號泳道只顯示一個條帶，該條帶對應于與含有期望插入片段的硝酸鹽還原酶基因座。2號和12號泳道顯示兩個條帶一小條帶是內源硝酸鹽還原酶基因，大條帶則是轉化結構片段，該轉化結構片段被插入到基因組的其它位置，不在硝酸鹽還原酶基因座內。測序。用測序來檢驗重組后是否引入了錯誤。對6個克隆進行了 PCR分析，并且對包括兩側末端(左側5’末端和右側3’末端)在內的兩側序列進行了測序。沒有發(fā)現錯誤。還從轉化株(硝酸鹽還原酶內插入了 ble基因盒)中擴增出了整個基因座，并且成功用于對野生型進行重復轉化。發(fā)明人還成功地使用野生型硝酸鹽還原酶片段作為選擇標記通過同源重組修復了敲除突變野生型片段與硝酸鹽還原酶基因內的ble基因插入部位重合并置換了該基因。只有那些硝酸鹽還原酶基因被同源重組修復的克隆能夠在以硝酸鹽為唯一氮源的培養(yǎng)基上生長。盡管以上描述了多個實施方式，但應理解，它們僅是示例，并不構成限制。因此，優(yōu)選實施方式的范圍不應受任何以上所述示例性實施方式的限制。
權利要求
1.一種把脫氧核糖核酸(DNA)引入海藻細胞細胞核的轉化方法，該方法包括 制備轉化結構，該結構具有與相應第一細胞核DNA序列相似的第一 DNA序列，與相應第二細胞核DNA序列相似的第二 DNA序列，和在該轉化結構中第一和第二 DNA序列之間插入的感興趣的DNA序列，并且 轉化相應第一和第二細胞核DNA之間的目標DNA序列，使得目標DNA序列被感興趣的DNA序列所取代。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于，感興趣DNA序列把分別與相應第一和第二細胞核DNA序列相似的所述第一和第二 DNA序列隔開大約4. 5kb。
3.如權利要求I所述的方法，其特征在于，分別與相應第一或第二細胞核DNA序列相似的所述第一或第二 DNA序列包含大約1000堿基對(bps)。
4.如權利要求I所述的方法，其特征在于，分別與相應第一或第二細胞核DNA相似的所述第一或第二 DNA序列包含少于大約1000堿基對。
5.如權利要求I所述的方法，其特征在于，分別與相應第一或第二細胞核DNA序列相似的所述第一或第二 DNA序列包含多于大約1000堿基對。
6.如權利要求I所述的方法，其特征在于，分別與相應第一或第二細胞核DNA序列相似的所述第一或第二序列DNA包含多于大約10，000堿基對。
7.如權利要求I所述的方法，其特征在于，感興趣DNA序列還包含調控序列或啟動子序列。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述啟動子是單向的或雙向的。
9.如權利要求I所述的方法，其特征在于，感興趣DNA序列還包含抗生素抗性標記。
10.如權利要求I所述的方法，其特征在于，感興趣DNA序列還包含啟動子序列和抗生素抗性標記。
11.如權利要求I所述的方法，其特征在于，感興趣DNA序列還代謝物生物合成或營養(yǎng)同化基因。
12.如權利要求11所述的方法，其特征在于，所述基因編碼硝酸鹽還原酶或者亞硝酸鹽還原酶。
13.如權利要求I所述的方法，其特征在于，感興趣DNA序列大約0bps，使得目標DNA的缺失或者近乎缺失。
14.如權利要求I所述的方法，其特征在于，感興趣DNA序列編碼多肽。
15.如權利要求I所述的方法，其特征在于，感興趣DNA序列被轉錄，但是不編碼多肽。
16.如權利要求I所述的方法，其特征在于，感興趣DNA序列編碼肽，所編碼的肽添加到由第一或者第二細胞核DNA序列編碼的肽。
17.如權利要求I所述的方法，其特征在于，感興趣DNA序列編碼非編碼調控DNA序列。
18.如權利要求I所述的方法，其特征在于，目標DNA序列與感興趣DNA序列不相似。
19.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述海藻細胞是微擬球藻細胞。
20.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述海藻細胞是單倍體。
21.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述方法還包括改變所述海藻細胞的表型特征或者賦予所述海藻細胞新特征。
22.如權利要求I所述的方法，其特征在于，與相應第一細胞核DNA序列相似的第一DNA序列具有第一個堿基對長度，與相應第二細胞核DNA序列相似的第二 DNA序列具有第二個堿基對長度，兩者不相等。
23.如權利要求I所述的方法，其特征在于，目標DNA序列少于lkb。
24.如權利要求I所述的方法，其特征在于，目標DNA序列被感興趣DNA序列取代至少是部分取代，使得目標DNA序列的基因功能部分降低。
25.一種轉化結構，該結構具有與相應第一海藻細胞細胞核DNA序列相似的第一 DNA序列，與相應第二海藻細胞細胞核DNA序列相似的第二 DNA序列，和在該轉化結構中第一和第二DNA序列之間插入的感興趣的DNA序列。
26.如權利要求I所述的方法，其特征在于，分別與相應第一和第二細胞核DNA序列相似的所述第一和第二序列DNA各自包含大約1000堿基對(bps)。
27.如權利要求I所述的方法，其特征在于，分別與相應第一和第二細胞核DNA序列相似的所述第一和第二序列DNA各自包含少于大約1000堿基對。
28.如權利要求I所述的方法，其特征在于，分別與相應第一和第二細胞核DNA序列相似的所述第一和第二 DNA序列各自包含多于大約1000堿基對。
29.如權利要求I所述的方法，其特征在于，分別與相應第一和第二細胞核DNA序列相似的所述第一和第二 DNA序列各自包含多于大約10，000堿基對。
30.如權利要求I所述的方法，其特征在于，感興趣DNA序列還包含削弱或者破壞代謝物生物合成或營養(yǎng)同化基因的野生型功能的DNA。
31.如權利要求I所述的方法，其特征在于，感興趣DNA序列轉化營養(yǎng)缺陷型海藻細胞，引起代謝物的生物合成或者同化作用。
32.如權利要求31所述的方法，該方法還包括通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)來挑選被轉化的營養(yǎng)缺陷型海藻細胞，所述培養(yǎng)基不包含被轉化營養(yǎng)缺陷型海藻細胞生長所必需的代謝物。
33.如權利要求30所述的方法，其特征在于，所述基因編碼硝酸鹽還原酶或者亞硝酸鹽還原酶。
34.如權利要求30所述的方法，其特征在于，所述方法還包括將所述營養(yǎng)同化或生物合成基因被削弱或破壞的野生型功能轉化并還原成野生型功能。
35.如權利要求I所述的方法，其特征在于，感興趣DNA序列把分別與相應第一和第二細胞核DNA序列相似的所述第一和第二序列DNA隔開大約200bps。
36.如權利要求I所述的方法，其特征在于，感興趣DNA序列把分別與相應第一和第二序列細胞核DNA相似的所述第一和第二 DNA序列隔開大約10. Okb。
37.如權利要求I所述的方法，其特征在于，至少感興趣DNA序列的一部分編碼多肽。
38.如權利要求I所述的方法，其特征在于，分別與相應第一或第二細胞核DNA序列相似的所述第一或第二 DNA序列的堿基對長度約為I個堿基對到約10000堿基對。
39.如權利要求I所述的方法，其特征在于，感興趣DNA序列的堿基對長度約為I個堿基對到約10000堿基對。
40.如權利要求32所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基是固體或者液體。
全文摘要
本文提供對向海藻細胞細胞核轉入脫氧核糖核酸(DNA)的轉化方法?？梢灾苽溥@樣一個轉化結構，該結構有與相應第一細胞核DNA序列相似的第一DNA序列，與相應第二細胞核DNA序列相似的第二DNA序列，和在該轉化結構中第一和第二DNA序列之間插入的感興趣的DNA序列?？蓪ο鄳牡谝缓偷诙薉NA之間的目標DNA序列進行轉化，從而使得該目標DNA序列被感興趣的DNA序列所取代。本發(fā)明還提供一個示例性轉化結構，該轉化結構有與相應第一海藻細胞核DNA序列相似的第一DNA序列，與相應第二海藻細胞核DNA序列相似的第二DNA序列，和插入在該轉化結構中第一和第二DNA序列之間的感興趣的DNA序列。
文檔編號C12P19/34GK102858980SQ201080058106
公開日2013年1月2日 申請日期2010年10月19日 優(yōu)先權日2009年10月19日
發(fā)明者O·基利安, B·維克 申請人:奧羅拉藻類股份有限公司