專(zhuān)利名稱(chēng)：提高同步糖化發(fā)酵反應(yīng)效率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明整體涉及提高同步糖化發(fā)酵反應(yīng)產(chǎn)物產(chǎn)量的方法和組合物。
3.背景技術(shù) 在二十世紀(jì)七十年代，由于OPEC減少石油輸出，發(fā)生了石油危機(jī)，自那時(shí)起研究人員便一直高度關(guān)注可再生木質(zhì)纖維素生物質(zhì)向可發(fā)酵糖的生物轉(zhuǎn)化，可發(fā)酵糖隨后發(fā)酵產(chǎn)生能夠作為液體燃料替代物的醇(如こ醇或“生物こ醇”)(Bungay,^Energy: the biomassoptions” (能源生物質(zhì)選擇)，NY ffiley, 1981 ;01sson 和 Hahn-Hagerdal, 1996, EnzymeMicrob. Technol.(酶微生物技術(shù))18 :312-31 ；Zaldivar 等人，2001, Appl. Microbiol.Biotechnol.(微生物學(xué)和生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用)56 17-34 ；Galbe 和 Zacchi, 2002, Appl.Microbiol. Biotechnol.(微生物學(xué)和生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用)59 :618_28)。最近二十年，こ醇在美國(guó)廣泛用作汽油的10%共混物，或者在巴西作為車(chē)輛的単一燃料。隨著石油價(jià)格的暴漲及其來(lái)源的逐漸枯竭，燃料生物こ醇將變得愈發(fā)重要。預(yù)計(jì)木質(zhì)纖維素生物質(zhì)是廉價(jià)的可再生資源，能夠支持以足夠大的規(guī)模進(jìn)行生物燃料(如生物こ醇)的可持續(xù)生產(chǎn)，可充分應(yīng)對(duì)世界旺盛的能源需求。木質(zhì)纖維素材料包括但不限于玉米秸桿(除去籽粒和根的玉米植株)、林業(yè)廢棄物(例如鋸屑和紙材)、來(lái)自市政固體垃圾的庭院垃圾、草本植物(例如柳枝稷)以及木本植物(例如楊樹(shù))。木質(zhì)纖維素生物質(zhì)有三種主要成分半纖維素、纖維素和木質(zhì)素。半纖維素是非晶態(tài)支鏈聚合物，通常主要由五種糖(阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和木糖)組成。纖維素是葡萄糖分子的直鏈大聚合物，通常由于平行鏈之間氫鍵的作用而連接在一起形成高結(jié)晶性結(jié)構(gòu)。木質(zhì)素是苯基-丙烷的復(fù)雜聚合物。木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的生物處理包括使用纖維素酶和半纖維素酶分別使半纖維素和纖維素發(fā)生通常的水解反應(yīng)而從中釋放出糖。然后將所得的糖使用合適的發(fā)酵微生物發(fā)酵得到生物燃料例如生物こ醇。當(dāng)纖維素被纖維素酶分解時(shí)釋放的葡萄糖通常是此類(lèi)酶的有效抑制劑。要減少纖維素分解(或者在本文中稱(chēng)為“糖化”)期間葡萄糖的累積，可在糖化釋放出糖的同時(shí)，加入發(fā)酵微生物，從而將釋放的糖轉(zhuǎn)化為生物こ醇。此配置稱(chēng)為同步糖化發(fā)酵(“SSF”)。一般來(lái)講，SSF與分步水解發(fā)酵(“SHF”)配置相比，所產(chǎn)こ醇的速率、產(chǎn)量和濃度更好/更高，盡管運(yùn)行的溫度低于大多數(shù)參與這些發(fā)酵過(guò)程的酶的最適溫度。然而，典型的SSF反應(yīng)是非常漫長(zhǎng)、持久的，例如幾天，以達(dá)到適度的こ醇濃度(參見(jiàn),例如Kadam等人，2004，Biotechnol. Progr.(生物技術(shù)進(jìn)展)20 (3) :705)。因此，在本領(lǐng)域中需要開(kāi)發(fā)與此相關(guān)的方法和組合物，以提高SSF反應(yīng)的效率，并且增加生物燃料例如生物こ醇的產(chǎn)量。
4.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于這樣的發(fā)現(xiàn)同步糖化發(fā)酵(“SSF”)反應(yīng)中存在某些木糖苷酶會(huì)使烷基-β -吡喃木糖苷副產(chǎn)物快速累積。具體地講，據(jù)發(fā)現(xiàn)具有保持作用機(jī)制的某些β -木糖苷酶在用于SSF反應(yīng)時(shí)，能使烷基-β -吡喃木糖苷副產(chǎn)物快速累積，從而會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量減少。本發(fā)明還基于這樣的發(fā)現(xiàn)=SSF反應(yīng)中存在具有翻轉(zhuǎn)作用機(jī)制的某些其他β_木糖苷酶會(huì)降低或最大程度減少烷基-β_吡喃木糖苷副產(chǎn)物累積。已發(fā)現(xiàn)，在SSF反應(yīng)中加入具有翻轉(zhuǎn)作用機(jī)制的β -木糖苷酶會(huì)提高發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量。對(duì)于本發(fā)明的目的來(lái)說(shuō)，具有翻轉(zhuǎn)作用機(jī)制的β -木糖苷酶也稱(chēng)為“具有翻轉(zhuǎn)型β -木糖苷酶活性的酶”、“翻轉(zhuǎn)型β -木糖苷酶”或“翻轉(zhuǎn)型β -木糖苷酶多肽”。相反，具有 保持作用機(jī)制的β-木糖苷酶也稱(chēng)為“具有保持型β-木糖苷酶活性的酶”、“保持型β-木糖苷酶”或“保持型β-木糖苷酶多肽”。因此，本文提供實(shí)行SSF反應(yīng)而需要減少保持型β -木糖苷酶量的改進(jìn)方法。本文還提供實(shí)行SSF反應(yīng)而需要増加翻轉(zhuǎn)型β_木糖苷酶量的改進(jìn)方法。本文還提供實(shí)行SSF反應(yīng)而需要減少保持型β_木糖苷酶量，并且增加翻轉(zhuǎn)型β_木糖苷酶量的改進(jìn)方法。還可設(shè)想與上述改進(jìn)方法及本文所述的其他方法相關(guān)的組合物。在某些方面，本發(fā)明提供的SSF方法包括在適于發(fā)酵產(chǎn)物形成的條件下培養(yǎng)完全發(fā)酵培養(yǎng)基一段時(shí)間，所述完全發(fā)酵培養(yǎng)基包含至少ー種發(fā)酵微生物、至少ー種含木聚糖生物質(zhì)、至少ー種纖維素酶、至少ー種半纖維素酶和至少ー種具有翻轉(zhuǎn)型β -木糖苷酶活性的酶。在本發(fā)明中，與缺乏所述具有翻轉(zhuǎn)型β -木糖苷酶活性的一種或多種酶的對(duì)照發(fā)酵培養(yǎng)基相比，具有翻轉(zhuǎn)型β_木糖苷酶活性的ー種或多種酶(在本文中作為另外ー種選擇且可互換地稱(chēng)為“至少ー種酶”)在所述完全發(fā)酵培養(yǎng)基中的含量能夠有效減少短鏈烷基-β-吡喃木糖苷(“ΑΧΡ”)(如甲基-β_吡喃木糖苷(“ΜΧΡ”)、こ基-β-吡喃木糖苷(1父？”)、丙基鄰-吡喃木糖苷(“ΡΧΡ”)或丁基-β-吡喃木糖苷(“ΒΧΡ”))的形成。例如，與缺乏所述具有翻轉(zhuǎn)型β -木糖苷酶活性的一種或多種酶的對(duì)照發(fā)酵培養(yǎng)基相比，此類(lèi)酶的含量會(huì)有效(a)減少AXP的形成量至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%或至少80%和/或(b)增加發(fā)酵產(chǎn)物(如醇，例如但不限于甲醇、こ醇、丙醇、丙烷-1，3- ニ醇或丁醇)的產(chǎn)量(例如至少O. 1%、至少O. 5%、至少O. 7%、至少1%、至少2%、至少3%、至少5%、至少7. 5%、或至少10%)。在某些實(shí)施例中，與缺乏所述具有翻轉(zhuǎn)型β -木糖苷酶活性的一種或多種酶的對(duì)照發(fā)酵培養(yǎng)基相比，此類(lèi)酶的含量會(huì)將AXP形成量有效減少到一定水平，該水平高于反應(yīng)平衡時(shí)AXP水平的不超過(guò)50%、不超過(guò)40%、不超過(guò)30%、不超過(guò)20%、或不超過(guò)10%。在某些方面，發(fā)酵微生物能夠從至少ー個(gè)可發(fā)酵碳源產(chǎn)生醇，例如甲醇、こ醇、丙醇、丙烷-1，3- ニ醇或丁醇。在某些方面，發(fā)酵微生物是細(xì)菌例如運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)或真菌例如酵母或絲狀真菌。在某些方面，所述至少一種翻轉(zhuǎn)型木糖苷酶是GH43家族酶。在某些實(shí)施例中，翻轉(zhuǎn)型 β -木糖苷酶選自 Fv43D，Pf43A, Fv43E, Fv43B, Af43A, Fo43A, Gz43A,或 XynB3 多肽。具體地講，F(xiàn)v43D多肽(如果存在于完全發(fā)酵培養(yǎng)基中的話(huà))是與SEQ ID N0:2或SEQID NO:2的第21至350位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列同一性的多肽。Pf43A多肽(如果存在于完全發(fā)酵培養(yǎng)基中的話(huà))是與SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:8的第21至445位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列同一性的多肽。Fv43E多肽(如果存在于完全發(fā)酵培養(yǎng)基中的話(huà))是與SEQ IDNO: 10或SEQ ID NO: 10的第19至530位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至 少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列同一性的多肽。Fv43B多肽(如果存在于完全發(fā)酵培養(yǎng)基中的話(huà))是與SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 12的第17至574位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列同一性的多肽。Af43A多肽(如果存在于完全發(fā)酵培養(yǎng)基中的話(huà))是與SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 14的第15至558位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列同一性的多肽。Fo43A多肽(如果存在于完全發(fā)酵培養(yǎng)基中的話(huà))是與SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:24的第21至348位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列同一性的多肽。Gz43A多肽(如果存在于完全發(fā)酵培養(yǎng)基中的話(huà))是與SEQ ID NO: 22或SEQ ID NO: 22的第19至340位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列同一性的多肽。XynB3多肽(如果存在于完全發(fā)酵培養(yǎng)基中的話(huà))是與SEQ ID NO:25對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列同一性的多肽。在某些方面，所述完全培養(yǎng)基中翻轉(zhuǎn)型木糖苷酶多肽的量為所述含木聚糖生物質(zhì)中姆克木聚糖至少約O. 2mg、至少約O. 3mg、至少約O. 4mg、至少約O. 5mg、至少約O. 7mg、至少約lmg、至少約2mg或至少約3mg,所述含木聚糖的生物質(zhì)也是完全發(fā)酵培養(yǎng)基的組分。在其他方面，翻轉(zhuǎn)型木糖苷酶多肽的量為所述含木聚糖生物質(zhì)中每克木聚糖約3mg或更少、約2mg或更少、約I. 5mg或更少、約I. Omg或更少、約O. 7mg或更少、約O. 5mg或更少、約O. 4mg或更少、約O. 3mg或更少、或約O. 2mg或更少。在某些方面，所述完全培養(yǎng)基中翻轉(zhuǎn)型木糖苷酶多肽的量在例如所述含木聚糖生物質(zhì)中每克木聚糖(a)0. 4mg至10mg、(b) O. 5mg 至 2mg、(c) O. 4mg 至 5mg、(d) 0. 5mg 至 I. 5mg、(e) lmg 至 2mg、(f) 0. 3mg 至 3mg、(g)0. 2mg至5mg、(h)0. 3mg至5mg或(i)0. 3mg至IOmg的范圍內(nèi)，或所述量在這樣的范圍內(nèi)其上限和下限各自獨(dú)立地選自前述值。在某些方面，所述完全發(fā)酵培養(yǎng)基中翻轉(zhuǎn)型木糖苷酶多肽的量基于摩爾計(jì)、基于分子量計(jì)或同時(shí)基于摩爾和分子量計(jì)超過(guò)了保持型β_木糖苷酶多肽的量。在具體實(shí)施例中，翻轉(zhuǎn)型木糖苷酶多肽與保持型木糖苷酶多肽的比率基于摩爾計(jì)、基于分子量計(jì)或同時(shí)基于摩爾和分子量計(jì)為至少2: I、至少3: I、至少4: I、至少5: I、至少10: I、或至少50:1。在具體實(shí)施例中，完全發(fā)酵培養(yǎng)基中不存在或未檢測(cè)到具有保持型木糖苷酶活性的酶。在某些實(shí)施例中，完全發(fā)酵培養(yǎng)基中未檢測(cè)到保持型木糖苷酶活性。根據(jù)本文所述的方法，完全發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)在連續(xù)、分批或分批補(bǔ)料條件下進(jìn)行。例如，本發(fā)明的完全發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)是連續(xù)SSF反應(yīng)、分批型SSF反應(yīng)或分批補(bǔ)料型SSF反應(yīng)。在某些方面，本發(fā)明的方法還涵蓋培養(yǎng)步驟前完全發(fā)酵培養(yǎng)基的形成。例如，完全發(fā)酵培養(yǎng)基能夠通過(guò)將(a)至少ー種發(fā)酵微生物、(b)至少ー種含木聚糖生物質(zhì)、(C)至少一種纖維素酶、(d)至少ー種半纖維素酶、(e)至少ー種翻轉(zhuǎn)型木糖苷酶以及(f)缺乏 (a)至(e)中一種或多種組分的培養(yǎng)基混合而形成。在具體實(shí)施例中，所述至少一種纖維素酶能夠以纖維素酶制品的形式存在。例如纖維素酶制品能夠是全纖維素酶制品，該制品還能夠任選地包含所述至少ー種半纖維素酶。在具體實(shí)施例中，纖維素酶制品是得自絲狀真菌培養(yǎng)物的培養(yǎng)液，例如使用里氏木霉(T.reesei)細(xì)胞制備的里氏木霉培養(yǎng)物。在某些方面，里氏木霉細(xì)胞經(jīng)工程改造，使得天然木糖苷酶基因失活或缺失。應(yīng)當(dāng)指出的是，“經(jīng)工程改造，使得天然β -木糖苷酶基因失活或缺失的里氏木霉細(xì)胞”不僅包括原代或親代細(xì)胞(其中失活首次發(fā)生)，而且包括子代細(xì)胞(其中天然木糖苷酶基因是失活或缺失的)。在某些方面，本發(fā)明的方法涉及培養(yǎng)包含至少ー種含木聚糖生物質(zhì)的發(fā)酵液。在某些方面，含木聚糖生物質(zhì)為例如玉米秸桿、蔗渣、高粱、蘆竹、象草、芒草、日本柳杉、小麥秸桿、柳枝稷、闊葉木漿或針葉木漿。例如，含木聚糖生物質(zhì)能夠合適地以漿液的形式加入SSF反應(yīng)。例如，含木聚糖生物質(zhì)能夠以固體的形式加入SSF反應(yīng)。因此，含木聚糖生物質(zhì)能夠合適地以液體形式(該液體形式能夠是例如溶液、懸浮液或固體和液體的混合物)或以固體形式加入SSF反應(yīng)。在某些實(shí)施例中，含木聚糖生物質(zhì)已經(jīng)過(guò)預(yù)處理。在SSF反應(yīng)發(fā)生后，任選地至完成后，能夠接著進(jìn)行回收步驟，其中發(fā)酵產(chǎn)物(例如こ醇、甲醇、丙醇、丙烷-1，3- ニ醇或丁醇)被回收。本發(fā)明還提供適用于本發(fā)明方法的完全發(fā)酵培養(yǎng)基，例如上文和下文關(guān)于纖維素酶、半纖維素酶、木糖苷酶和發(fā)酵微生物組分的描述。本發(fā)明還提供經(jīng)工程改造，使得天然木糖苷酶基因失活或缺失的里氏木霉細(xì)胞。里氏木霉細(xì)胞能夠經(jīng)工程改造而重組表達(dá)GH43家族酶，GH43家族酶例如選自Fv43D，Pf43A, Fv43E, Fv43B, Af43A, Fo43A, Gz43A,或 XynB3 多肽的酶。例如，F(xiàn)v43D 多肽與 SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:2的第21至350位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列同一性。Pf43A多肽與SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO:8的第21至445位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列同一性。Fv43E多肽與SEQ ID NO: 10或SEQ IDNO: 10的第19至530位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列同一性。Fv43B多肽與SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 12的第17至574位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少 99%、或 100% 序列同一性。Af43A 多肽與 SEQ ID NO: 14 或 SEQ ID NO: 14 的第 15 至 558位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列同一性。Fo43A多肽與SEQ ID NO:24或SEQ ID NO: 24的第21至348位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列同一性。Gz43A多肽與SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:22的第19至340位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列同一性。XynB3多肽與SEQ ID NO: 25對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列同一性。
本發(fā)明還提供產(chǎn)生纖維素酶多肽的方法，該方法包括(a)在允許產(chǎn)生一種或多種纖維素酶多肽的條件下培養(yǎng)此類(lèi)里氏木霉細(xì)胞，例如上文所述和/或下文所述的細(xì)胞，以及(b)回收纖維素酶多肽，例如通過(guò)回收包含纖維素酶多肽的培養(yǎng)液進(jìn)行。本發(fā)明還提供由里氏木霉細(xì)胞制備的培養(yǎng)液，及其在糖化反應(yīng)(包括例如SSF反應(yīng))中的使用。在某些方面，本發(fā)明提供完全發(fā)酵培養(yǎng)基組合物，該組合物包含至少ー種翻轉(zhuǎn)型β -木糖苷酶、至少一種發(fā)酵微生物、至少ー種含木聚糖生物質(zhì)、至少ー種纖維素酶、至少一種半纖維素酶和發(fā)酵培養(yǎng)基。翻轉(zhuǎn)型木糖苷酶為例如GH43家族酶。在某些方面，翻轉(zhuǎn)型 β -木糖苷酶為選自 Fv43D，Pf43A, Fv43E, Fv43B, Af43A, Fo43A, Gz43A,或 XynB3 多肽的酶。發(fā)酵微生物為合適地能夠?qū)⒑线m的碳源(例如含木聚糖生物質(zhì))或糖(例如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖或低聚糖)直接或間接發(fā)酵為所需發(fā)酵產(chǎn)物的微生物，所述產(chǎn)物包括，例如甲醇(“MeOH”)、こ醇(“已切!1”)、丙醇、丙烷-1，3-ニ醇或丁醇。發(fā)酵微生物能夠選自真菌例如酵母或絲狀真菌、細(xì)菌例如運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌或熱纖梭菌(Clostridiumthermocellum)。合適的碳源或底物包括例如含木聚糖生物質(zhì)底物，該底物選自例如木質(zhì)纖維素底物或其他含碳水化合物原料。某些木質(zhì)纖維素底物能夠包括例如纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素。纖維素酶為例如葡萄糖苷酶、內(nèi)切葡聚糖酶或纖維ニ糖水解酶多肽。在本文中酶以它們的命名或它們所屬的酶家族(如GH43家族酶；或根據(jù)EC 3. 2. I. 91歸類(lèi)的酶)稱(chēng)呼；當(dāng)它們以命名稱(chēng)呼時(shí)，也能夠可互換地稱(chēng)為“[命名]多肽”(如β -葡萄糖苷酶也能夠可互換地稱(chēng)為β_葡萄糖苷酶多肽)。纖維素酶也能夠是例如全纖維素酶制品的形式。半纖維素酶是例如木聚糖酶、β_木糖苷酶、L-α-阿拉伯呋喃糖苷酶或輔助蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施例中，全纖維素酶制品能夠包含一種或多種半纖維素酶多肽。發(fā)酵培養(yǎng)基能夠是得自部分糖化過(guò)程的培養(yǎng)基，或包含一定量糖化產(chǎn)物的培養(yǎng)基。此類(lèi)組合物能夠合適地在允許產(chǎn)生所關(guān)注發(fā)酵產(chǎn)物的條件下用于糖化反應(yīng)，包括例如SSF反應(yīng)。在某些方面，ー種或多種纖維素酶和/或ー種或多種半纖維素酶由經(jīng)基因工程改造的微生物制備，其中編碼ー種或多種(如果存在多于ー種的天然β -木糖苷酶)天然β-木糖苷酶的基因是缺失的，或未檢測(cè)到天然β-木糖苷酶活性。在某些實(shí)施例中，經(jīng)工程改造產(chǎn)生ー種或多種纖維素酶和/或一種或多種半纖維素酶的微生物不包含保持型β -木糖苷酶，或未檢測(cè)到保持型β -木糖苷酶活性。在ー些方面，本發(fā)明涉及對(duì)含木聚糖生物質(zhì)實(shí)行SSF反應(yīng)以獲得生物こ醇發(fā)酵產(chǎn)物的改進(jìn)方法，其中所述方法包括培養(yǎng)包含至少ー種纖維素酶、至少ー種半纖維素酶和至少ー種發(fā)酵微生物的發(fā)酵培養(yǎng)基，其中所述改進(jìn)包括使用具有翻轉(zhuǎn)型β_木糖苷酶活性的酶。在相關(guān)方面，本發(fā)明還提供提高烷基-吡喃木糖苷產(chǎn)量的方法，該方法已知在許多行業(yè)應(yīng)用中在需要此類(lèi)產(chǎn)量的情況下具有用途和價(jià)值。例如，烷基-β -吡喃木糖苷在烷基-葡糖苷的合成中能夠合適地用作化學(xué)中間體，烷基-葡糖苷用作可生物降解的表面活性劑和乳化劑(參見(jiàn)，例如 K. Schmid 和 H. Tesmann, 2001, Alkyl Polyglucosides,Detergency of Specialty Surfactants, Surfactant science series (每基多匍糖苷，特異性表面活性劑的去污力，表面活性劑系列)，第98卷；(F. E. Fried編輯);馬克德克有限公 司(Marcel Dekker Inc. ), NY,第1_70頁(yè))。這些化合物自身也是誘導(dǎo)劑,或能夠用于在許多微生物中制備誘導(dǎo)木聚糖酶產(chǎn)生的誘導(dǎo)劑(參見(jiàn)，例如M. Marui等人,1985, Agric. Biol.Chem.(農(nóng)業(yè)與生物化學(xué))49 (12) :3399-3407 ;H. Shinoyama 等人，1988, Agric. Biol. Chem.(農(nóng)業(yè)與生物化學(xué))52 (9) :2197-2202)。此外，各種烷基-吡喃糖苷能夠用作硫酸軟骨素的引物，以及蛋白聚糖生物合成的刺激物(參見(jiàn)，例如H. Shinoyama等人，1988, Agric. Biol.Chem. 52 (9) :2197_2202)。在本發(fā)明另一方面，SSF反應(yīng)中加入具有保持作用機(jī)制的β-木糖苷酶或増加其產(chǎn)量能夠用于提高這些有用的烷基-β -吡喃木糖苷的產(chǎn)量。因此，在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的方法包括増加保持型β_木糖苷酶的量。本文還提供實(shí)行SSF反應(yīng)而需要増加保持型β_木糖苷酶量的改進(jìn)方法。在其他實(shí)例中，設(shè)想了實(shí)行SSF反應(yīng)而需要增加保持型β -木糖苷酶量同時(shí)減少翻轉(zhuǎn)型β -木糖苷酶量的改進(jìn)方法。在其他方面，本發(fā)明提供的SSF方法包括在適于烷基-β -吡喃木糖苷形成的條件下培養(yǎng)完全發(fā)酵培養(yǎng)基一段時(shí)間，所述完全發(fā)酵培養(yǎng)基包含至少ー種發(fā)酵微生物、至少ー種含木聚糖生物質(zhì)、至少ー種纖維素酶、至少ー種半纖維素酶和至少ー種具有保持型β -木糖苷酶活性的酶，所述烷基-β -吡喃木糖苷例如甲基-β -吡喃木糖苷(“ΜΧΡ”)、こ基-β-吡喃木糖苷(1父？”)、丙基鄰-吡喃木糖苷(“ΡΧΡ”)或丁基-β_吡喃木糖苷(“ΒΧΡ”)。在某些方面，與缺乏或具有更少量所述具有保持型β -木糖苷酶活性的酶的對(duì)照發(fā)酵培養(yǎng)基相比，所述至少ー種具有保持型β -木糖苷酶活性的酶在所述完全發(fā)酵培養(yǎng)基中的含量能夠有效増加短鏈烷基-β-吡喃木糖苷(“ΑΧΡ”)(如甲基-β-吡喃木糖苷(“ΜΧΡ”)、こ基-β -吡喃木糖苷(“ΕΧΡ”)、丙基-β -吡喃木糖苷(“ΡΧΡ”)或丁基-β -吡喃木糖苷(“ΒΧΡ”))的形成。例如，與缺乏或具有更少量所述具有保持型β_木糖苷酶活性的一種或多種酶的對(duì)照發(fā)酵培養(yǎng)基相比，此類(lèi)酶的含量會(huì)有效增加AXP的形成量至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、或至少80%。在某些方面，發(fā)酵微生物能夠產(chǎn)生許多短鏈烷基-吡喃木糖苷(“ΑΧΡ”)化合物，包括但不限于甲基-β-吡喃木糖苷(“ΜΧΡ”)、こ基-β-吡喃木糖苷(“ΕΧΡ”)、丙基-β-吡喃木糖苷(“ΡΧΡ”)或丁基-β-吡喃木糖苷(“ΒΧΡ”)化合物。在ー些方面，發(fā)酵微生物是細(xì)菌例如運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌或真菌例如酵母或絲狀真菌。在某些方面，所述至少ー種保持型β -木糖苷酶是GH3、GH30、GH31、GH39、GH52、GH54或GH116家族酶。在某些實(shí)施例中，保持型β -木糖苷酶選自XlnD，F(xiàn)v30A，F(xiàn)v30B，F(xiàn)v39A, Fv39B, XynB, XylA或Xyll多肽。具體地講，XlnD多肽(如果存在于完全發(fā)酵培養(yǎng)基中的話(huà))是與SEQID NO:40或SEQ ID NO:40的第18至804位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列同一性的多肽。Fv30A多肽(如果存在于完全發(fā)酵培養(yǎng)基中的話(huà))是與SEQ ID N0:42或SEQ ID NO:42的第20至537位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列同一性的多肽。Fv30B多肽(如果存在于完全發(fā)酵培養(yǎng)基中的話(huà))是與SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:44的第25至485位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列同一性的多肽。Fv39A多肽(如果存在 于完全發(fā)酵培養(yǎng)基中的話(huà))是與SEQ ID N0:46或SEQ ID NO:46的第20至439位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列同一性的多肽。Fv39B多肽(如果存在于完全發(fā)酵培養(yǎng)基中的話(huà))是與SEQ ID N0:48或SEQ ID NO:48的第19至456位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列同一性的多肽。XynB多肽(如果存在于完全發(fā)酵培養(yǎng)基中的話(huà))是與SEQ ID NO:50對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列同一性的多肽。XylA (如果存在于完全發(fā)酵培養(yǎng)基中的話(huà))是與SEQ ID NO: 52對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列同一性的多肽。Xyll多肽(如果存在于完全發(fā)酵培養(yǎng)基中的話(huà))是與SEQ ID N0:54或SEQID NO:54的第22至500位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列同一'丨生的多肽。在某些方面，所述完全培養(yǎng)基中保持型β -木糖苷酶多肽的量為所述含木聚糖生物質(zhì)中姆克木聚糖至少約O. 2mg、至少約O. 5mg、至少約O. 7mg、至少約lmg、至少約2mg、或至少約5mg，所述含木聚糖的生物質(zhì)也是完全發(fā)酵培養(yǎng)基的組分。在其他方面，翻轉(zhuǎn)型β-木糖苷酶多肽的量為所述含木聚糖生物質(zhì)中姆克木聚糖約IOmg或更少、約5mg或更少、約2mg或更少、約Img或更少、約O. 7mg或更少、約O. 5mg或更少、或約O. 2mg或更少。在某些方面，所述完全培養(yǎng)基中保持型β-木糖苷酶多肽的量在例如所述含木聚糖生物質(zhì)中每克木聚糖(a) O. 2mg 至 10mg、(b) O. 2mg 至 5mg、(c) O. 5mg 至 5mg、(d) lmg 至 10mg、(e) 2mg 至 10mg、(f)0. 2mg至5mg、(g)0. 2mg至2mg、或(h)0. 5mg至IOmg的范圍內(nèi)，或所述量在這樣的范圍內(nèi)其上限和下限各自獨(dú)立地選自前述值。在某些方面，所述完全發(fā)酵培養(yǎng)基中保持型木糖苷酶多肽的量基于摩爾計(jì)、基于分子量計(jì)或同時(shí)基于摩爾和分子量計(jì)超過(guò)了翻轉(zhuǎn)型β-木糖苷酶多肽的量。在具體實(shí)施例中，保持型β-木糖苷酶多肽與翻轉(zhuǎn)型β-木糖苷酶多肽的比率基于摩爾計(jì)、基于分子量計(jì)或同時(shí)基于摩爾和分子量計(jì)為至少2: I、至少3: I、至少4: I、至少5: I、至少10: I、或至少50:1。在具體實(shí)施例中，完全發(fā)酵培養(yǎng)基中不存在或未檢測(cè)到具有翻轉(zhuǎn)型木糖苷酶活性的酶。在某些實(shí)施例中，完全發(fā)酵培養(yǎng)基中未檢測(cè)到翻轉(zhuǎn)型木糖苷酶活性。根據(jù)本文所述的方法，完全發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)在連續(xù)、分批或分批補(bǔ)料條件下進(jìn)行。例如，本發(fā)明的完全發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)是連續(xù)SSF反應(yīng)、分批型SSF反應(yīng)或分批補(bǔ)料型SSF反應(yīng)。在某些方面，本發(fā)明的方法還涵蓋培養(yǎng)步驟前完全發(fā)酵培養(yǎng)基的形成。例如，完全 發(fā)酵培養(yǎng)基能夠通過(guò)將(a)至少ー種發(fā)酵微生物、(b)至少ー種含木聚糖生物質(zhì)、(C)至少一種纖維素酶、(d)至少ー種半纖維素酶、(e)至少ー種保持型木糖苷酶以及(f)缺乏(a)至(e)中一種或多種組分的培養(yǎng)基混合而形成。在具體實(shí)施例中，所述至少一種纖維素酶能夠以纖維素酶制品的形式存在。例如纖維素酶制品能夠是全纖維素酶制品，該制品還能夠任選地包含所述至少ー種半纖維素酶。在具體實(shí)施例中，纖維素酶制品是得自絲狀真菌培養(yǎng)物的培養(yǎng)液，例如使用里氏木霉細(xì)胞制備的里氏木霉培養(yǎng)物。在某些方面，里氏木霉細(xì)胞經(jīng)工程改造，使得天然保持型β-木糖苷酶基因過(guò)表達(dá)，或引入外源保持型β-木糖苷酶基因并且在其中表達(dá)。應(yīng)當(dāng)指出的是，“經(jīng)工程改造，使得天然保持型木糖苷酶基因過(guò)表達(dá)或引入外源保持型β_木糖苷酶基因并且在其中表達(dá)的里氏木霉細(xì)胞”不僅包括原代或親代細(xì)胞(其中失活首次發(fā)生)，而且包括子代細(xì)胞。在某些方面，本發(fā)明的方法涉及培養(yǎng)包含至少ー種含木聚糖生物質(zhì)的發(fā)酵液。在某些方面，含木聚糖生物質(zhì)為例如玉米秸桿、蔗渣、高粱、蘆竹、象草、芒草、日本柳杉、小麥秸桿、柳枝稷、闊葉木漿或針葉木漿。例如，含木聚糖生物質(zhì)能夠合適地以漿液的形式加入SSF反應(yīng)。例如，含木聚糖生物質(zhì)能夠以固體的形式加入SSF反應(yīng)。因此，含木聚糖生物質(zhì)能夠合適地以液體形式(該液體形式能夠是例如溶液、懸浮液或固體和液體的混合物)或以固體形式加入SSF反應(yīng)。在某些實(shí)施例中，含木聚糖生物質(zhì)已經(jīng)過(guò)預(yù)處理。在SSF反應(yīng)發(fā)生后，任選地在完成后，能夠接著進(jìn)行回收步驟，其中AXP產(chǎn)物(如MXP、EXP、PXP 或 BXP)被回收。本發(fā)明還提供適用于本發(fā)明方法的完全發(fā)酵培養(yǎng)基，例如上文和下文關(guān)于纖維素酶、半纖維素酶、木糖苷酶和發(fā)酵微生物組分的描述。本發(fā)明還提供經(jīng)工程改造，使得天然保持型β -木糖苷酶基因過(guò)表達(dá)，或外源保持型木糖苷酶基因在其中表達(dá)的里氏木霉細(xì)胞。里氏木霉細(xì)胞能夠經(jīng)工程改造以重組表達(dá) GH3、GH30、GH31、GH39、GH52、GH54_GH116 家族酶，所述酶例如選自 XlnD, Fv30A, Fv308，卩￥39八，卩￥398，父71^，父71八或父711多肽的酶。例如，XlnD多肽與SEQ ID N0:40或SEQ IDNO: 40的第18至804位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列同一性。Fv30A多肽與SEQ ID NO: 42或SEQ ID NO: 42的第20至537位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少 99%、或 100% 序列同一性。Fv30B 多肽與 SEQ ID N0:44 或 SEQ ID NO:44 的第 25 至 485位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列同一性。Fv39A多肽與SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:46的第20至439位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列同一性。Fv39B多肽與SEQ ID N0:48或SEQ ID N0:48的第19至456位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列同一性。XynB多肽與SEQ ID NO:50對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列同一性。XylA多肽與SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:52的第19至705位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列同一性。Xyll多肽與SEQ ID NO:54或SEQ ID NO :54的第22至500位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列同一1注。本發(fā)明還提供產(chǎn)生纖維素酶多肽的方法，該方法包括(a)在允許產(chǎn)生一種或多種纖維素酶多肽的條件下培養(yǎng)此類(lèi)里氏木霉細(xì)胞，例如上文所述和/或下文所述的細(xì)胞，以及(b)回收纖維素酶多肽，例如通過(guò)回收包含纖維素酶多肽的培養(yǎng)液進(jìn)行。本發(fā)明還提供由里氏木霉細(xì)胞制備的培養(yǎng)液，及其在糖化反應(yīng)(包括例如SSF反應(yīng))中的使用。在某些方面，本發(fā)明提供完全發(fā)酵培養(yǎng)基組合物，該組合物包含至少ー種保持型β -木糖苷酶、至少一種發(fā)酵微生物、至少ー種含木聚糖生物質(zhì)、至少ー種纖維素酶、至少一種半纖維素酶和發(fā)酵培養(yǎng)基。保持型木糖苷酶是例如過(guò)表達(dá)的天然保持型木糖苷酶，或引入合適宿主細(xì)胞的外源β-木糖苷酶。保持型β-木糖苷酶是例如GH3、GH30、GH31、GH39、GH52、GH54或GH 116家族酶。在某些方面，保持型β _木糖苷酶為選自XlnD，F(xiàn)v30A，F(xiàn)v30B, Fv39A, Fv39B, XynB, XylA或XylI多肽的酶。發(fā)酵微生物為合適地能夠?qū)⒑线m的碳源(例如含木聚糖生物質(zhì))或糖(例如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖或低聚糖)直接或間接發(fā)酵為所需發(fā)酵產(chǎn)物的微生物，所述產(chǎn)物包括，例如甲醇、こ醇、丙醇、丙烷-1，3-ニ醇或丁醇。發(fā)酵微生物能夠?yàn)檎婢缃湍富蚪z狀真菌，或細(xì)菌例如運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌或熱纖梭菌。合適的碳源或底物能夠是例如含木聚糖生物質(zhì)底物，該底物選自例如木質(zhì)纖維素底物或其他含碳水化合物原料。某些木質(zhì)纖維素底物能夠包括例如纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素。纖維素酶為例如葡萄糖苷酶、內(nèi)切葡聚糖酶或纖維ニ糖水解酶多肽。纖維素酶也能夠是例如全纖維素酶制品的形式。半纖維素酶是例如木聚糖酶、β_木糖苷酶、L- α -阿拉伯呋喃糖苷酶或輔助蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施例中，全纖維素酶制品能夠包含ー種或多種半纖維素酶多肽。發(fā)酵培養(yǎng)基能夠是得自部分糖化過(guò)程的培養(yǎng)基，或包含一定量糖化產(chǎn)物的培養(yǎng)基。此類(lèi)組合物能夠合適地在允許產(chǎn)生AXP化合物(包括例如ΜΧΡ、ΕΧΡ、ΡΧΡ或BXP)的條件下用于糖化反應(yīng)(包括例如SSF反應(yīng))。在某些方面，一種或多種纖維素酶或ー種或多種半纖維素酶由經(jīng)基因工程改造的微生物制備，其中編碼ー種或多種(如果存在多于ー種的天然木糖苷酶)天然木糖苷酶的基因是過(guò)表達(dá)的，或編碼外源β_木糖苷酶的基因已引入和/或表達(dá)。在某些實(shí)施例中，與未經(jīng)過(guò)相同基因工程改造的對(duì)照微生物相比，經(jīng)工程改造產(chǎn)生ー種或多種纖維素酶和/或一種或多種半纖維素酶的微生物，其保持型β_木糖苷酶活性的表達(dá)增加。在某些實(shí)施例中，經(jīng)工程改造產(chǎn)生ー種或多種纖維素酶和/或一種或多種半纖維素酶的微生物不包含翻轉(zhuǎn)型木糖苷酶，或未檢測(cè)到翻轉(zhuǎn)型木糖苷酶活性。在某些相關(guān)方面，本發(fā)明涉及對(duì)含木聚糖生物質(zhì)實(shí)行SSF反應(yīng)以獲得AXP產(chǎn)物的改進(jìn)方法，其中所述方法包括培養(yǎng)包含至少ー種纖維素酶、至少一種半纖維素酶和至少一種發(fā)酵微生物的發(fā)酵培養(yǎng)基，其中所述改進(jìn)包括使用由里氏木霉細(xì)胞制成的纖維素酶制品，里氏木霉細(xì)胞經(jīng)工程改造而過(guò)表達(dá)天然木糖苷酶基因，或表達(dá)外源木糖苷酶。在一些實(shí)施例中，過(guò)表達(dá)的天然β_木糖苷酶基因，或表達(dá)的外源β_木糖苷酶基因是編碼 保持型木糖苷酶的基因。本文引用的所有出版物、專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)、GenBank序列和ATCC保藏號(hào)據(jù)此出于所有目的明確地以引用方式并入。5.附圖和附表說(shuō)明表I :利用重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌在SSF條件下從玉米芯和葡萄糖/木糖形成EXP的情況。表2 :使用各種類(lèi)型生物質(zhì)底物形成EXP的情況。表3 :在 46°CMultifect 木聚糖酶(“MF”，560 μ g/mL)和純化的 Fv43D(36 μ g/mL)或Fv3A(54y g/mL)的存在下，從溶于50mM檸檬酸鈉(pH 4. 7)加上O. 9M EtOH的木ニ糖(20mg/mL)形成EXP和/或木糖的時(shí)間進(jìn)程(以RI峰面積表示，與mg/mL成比例)。表4 :構(gòu)建bxll缺失盒的引物序列。表5 :構(gòu)建輪枝錸孢菌(F. verticillioides) β _木糖苷酶Fv43D表達(dá)盒的引物序列。表6 :提供某些用于SSF反應(yīng)的酶的序列標(biāo)識(shí)匯總。圖I :在不含醇、各含O. 72M的こ醇(“EtOH”)、甲醇(“MeOH” )或正丙醇(“n-PrOH”)的情況下將溶于50mM檸檬酸鈉(pH 4. 6)、Multifect'R.木聚糖酶(I. 35mg/mL)的木糖(lOmg/mL)在46°C下溫育48小時(shí)后采集的樣品的HPLC色譜圖。HPLC條件HPX-87H色譜柱，60°C，0. 60mL/min 0. OlN H2SO4, RI 檢測(cè)器。圖2 :在與圖I實(shí)驗(yàn)中描述相同的條件下出現(xiàn)/形成烷基-吡喃木糖苷(“AXP”)后的時(shí)間進(jìn)程。發(fā)酵產(chǎn)物的形成量以產(chǎn)物峰面積相對(duì)于木糖峰面積的比率表示。圖3 =NMR波譜指示こ基-β -吡喃木糖苷的存在情況。圖4 :在SSF條件下使用酵母和野生型運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌時(shí)的EXP形成情況。圖5 :在酵母SSF條件下加入和不加入里氏木霉Bxll時(shí)的EXP形成情況。圖6 :在重組發(fā)酵單胞菌屬SSF條件下，向整合型里氏木霉菌株#229產(chǎn)生的酶復(fù)合物中加入里氏木霉Bxll后，EXP的劑量響應(yīng)情況。圖7 :利用如下糖化用的酶配置/混合物進(jìn)行SSF反應(yīng)期間的EXP形成情況Accellerase 1500 ( “A1500”)+ .Multifect” 木聚糖酶、Accellerase 1500( “Α1500”)+Χ1ηΑ以及整合型里氏木霉菌株#229產(chǎn)生的酶復(fù)合物并加有半纖維素酶(Fv3A,、Fv51A,或 Bxll)。圖8 :使用糖化用的各種純化纖維素酶和XynB3進(jìn)行SSF反應(yīng)期間的EXP形成情況。圖9 :使用整合型里氏木霉菌株#229產(chǎn)生的酶復(fù)合物，在里氏木霉Bxll的存在下，或在某些其他GH43家族β -木糖苷酶的存在下進(jìn)行SSF反應(yīng)期間的EXP形成情況。

圖10 :在重組發(fā)酵單胞菌屬SSF條件下加入Fv43D后，觀察到EXP形成減少。
圖11 :在酵母SSF條件下加入Fv43D后，觀察到EXP形成減少。圖12 :向 Accellerase 1500+jVIu]tifect!< 木聚糖酶中、Accellerase 1500+XlnA中以及整合型里氏木霉菌株#229產(chǎn)生的酶復(fù)合物中加入Fv43D后，在重組發(fā)酵單胞菌屬SSF條件下觀察到EXP形成減少。圖13 向純化的纖維素酶和XynB3中加入Fv43D后觀察到EXP形成減少。圖14A至14B:圖14A示出了在重組發(fā)酵單胞菌屬SSF條件下，向里氏木霉整合型菌株#229+里氏木霉Bxll產(chǎn)生的酶組合物或共混物中加入Fv43D后，EXP減少的劑量響應(yīng)情況。圖14B示出了在重組發(fā)酵單胞菌屬SSF條件下，向整合型里氏木霉菌株#229+里氏木霉Bxll產(chǎn)生的酶復(fù)合物加入Fo43A或Gz43A后，EXP的減少情況。圖15 :在 46°CMultifectx木聚糖酶(560 μ g/mL)和純化的 Fv43D(36 μ g/mL)和Fv3A(54 μ g/mL)的存在下,從溶于50mM朽1檬酸鈉(pH 4. 7)加上O. 9Mこ醇的木ニ糖(20mg/mL)形成木糖和EXP的時(shí)間進(jìn)程(以RI峰面積表示，與mg/mL成比例)。圖16:在 46 °C Multifects 木聚糖酶(560 μ g/mL)、Fv43D (36 μ g/mL)和Fv3A(54 μ g/mL)的存在下,從溶于50mM朽1檬酸鈉(pH 4. 7)加上O. 9Mこ醇的木ニ糖(20mg/mL，左)或木糖低聚物(20mg/mL，右)形成木糖和EXP的時(shí)間進(jìn)程。結(jié)果以EXP形成量與木糖形成量的比率表示。圖17 :pCR_Blunt II-TOPO、bxll 缺失、hph-loxP 的質(zhì)粒圖譜。圖I8 T0P0 Blunt/Pegll-F 的質(zhì)粒圖譜 v43D。圖19A 至 19B :圖 19A Fv43D 核苷酸序列(SEQ ID NO: I) 圖 19B Fv43D 氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。SEQ ID NO:2 是未成熟的 Fv43D 序列。Fv43D 具有對(duì)應(yīng)于 SEQ ID NO:2第I至20位殘基(標(biāo)有下劃線(xiàn))的預(yù)測(cè)信號(hào)序列；信號(hào)序列的剪切預(yù)計(jì)會(huì)產(chǎn)生成熟蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:2第21至350位殘基的序列。信號(hào)序列預(yù)測(cè)使用SignalP算法(訪(fǎng)問(wèn)地址http://www. cbs. dtu. dk)進(jìn)行。預(yù)測(cè)保守域殘基以黑體表示。域預(yù)測(cè)基于Pfam、SMART或NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行。圖20A至20B :圖20A :里氏木霉Bxll核苷酸序列(SEQ ID NO: 3)。圖20B :里氏木霉Bxll氨基酸序列(SEQ ID N0:4)。信號(hào)序列標(biāo)有下劃線(xiàn)。預(yù)測(cè)保守域殘基以黑體表示。域預(yù)測(cè)基于Pfam、SMART或NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行。圖21A至21B :圖21A :Fv3A核苷酸序列(SEQ ID NO: 5)。圖21B :Fv3A氨基酸序列(SEQ ID NO:6) ο SEQ ID NO:6 是未成熟的 Fv3A 序列。Fv3A 具有對(duì)應(yīng)于 SEQ ID N0:6 第 I至23位殘基(標(biāo)有下劃線(xiàn))的預(yù)測(cè)信號(hào)序列；信號(hào)序列的剪切預(yù)計(jì)會(huì)產(chǎn)生成熟蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:6第24至766位殘基的序列。信號(hào)序列預(yù)測(cè)使用SignalP算法(訪(fǎng)問(wèn)地址http://www. cbs. dtu. dk)進(jìn)行。預(yù)測(cè)保守域殘基以黑體表示。域預(yù)測(cè)基于Pfam、SMART或NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行。圖22k 至 22B :圖 22k Pf43A 核苷酸序列(SEQ ID NO: 7) 圖 22B Pf43A 氨基酸序列(SEQ ID NO:8)。SEQ ID NO:8 是未成熟的 Pf43A 序列。Pf43A 具有對(duì)應(yīng)于 SEQ ID NO:8第I至20位殘基(標(biāo)有下劃線(xiàn))的預(yù)測(cè)信號(hào)序列；信號(hào)序列的剪切預(yù)計(jì)會(huì)產(chǎn)生成熟蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:8第21至445位殘基的序列。信號(hào)序列預(yù)測(cè)使用SignalP算法(訪(fǎng)問(wèn)地址http://www. cbs. dtu. dk)進(jìn)行。預(yù)測(cè)保守域殘基以黑體表示,預(yù)測(cè)碳水化合物結(jié)合組件(“CBM”)殘基以大寫(xiě)字母表示，分隔CD和CBM的預(yù)測(cè)接頭以斜體表示。域預(yù)測(cè)基于Pfam、SMART或NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行。圖23A 至 23B :圖 23A :Fv43E 核苷酸序列(SEQ ID NO:9)。圖 23B :Fv43E 氨基酸序列(SEQ ID NO: 10)。SEQ ID NO: 10是未成熟的Fv43E序列。Fv43E具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 10第I至18位殘基(標(biāo)有下劃線(xiàn))的預(yù)測(cè)信號(hào)序列；信號(hào)序列的剪切預(yù)計(jì)會(huì)產(chǎn)生成熟蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 10第19至530位殘基的序列。信號(hào)序列預(yù)測(cè)使用SignalP算法(訪(fǎng)問(wèn)地址http://www. cbs. dtu. dk)進(jìn)行。預(yù)測(cè)保守域殘基以黑體表示。域預(yù)測(cè)基于Pfam、SMART或NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行。圖24A 至 24B :圖 24A Fv43B 核苷酸序列(SEQ ID NO: 11)。圖 24B Fv43B 氨基酸序列(SEQ ID NO: 12)。SEQ ID NO: 12是未成熟的Fv43B序列。Fv43B具有對(duì)應(yīng)于SEQ IDNO: 12第I至16位殘基(標(biāo)有下劃線(xiàn))的預(yù)測(cè)信號(hào)序列；信號(hào)序列的剪切預(yù)計(jì)會(huì)產(chǎn)生成熟蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 12第17至574位殘基的序列。信號(hào)序列預(yù)測(cè)使用SignalP算法(訪(fǎng)問(wèn)地址http://www. cbs. dtu. dk)進(jìn)行。預(yù)測(cè)保守域殘基以黑體表示。域預(yù)測(cè)基于Pfam、SMART或NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行。圖25A 至 25B :圖 25A Af43A 核苷酸序列(SEQ ID NO: 13)。圖 25B Af43A 氨基酸序列(SEQ ID NO: 14)。SEQ ID NO: 14是未成熟的Af43A序列。Af43A不具有預(yù)測(cè)信號(hào)序列，該序列能夠使用SignalP算法(訪(fǎng)問(wèn)地址http://www. cbs. dtu. dk)推算出。預(yù)測(cè)保守域殘基以黑體表示。域預(yù)測(cè)基于Pfam、SMART或NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行。圖26A 至 26B :圖 26A Fv51A 核苷酸序列(SEQ ID NO: 15)。圖 26B Fv51A 氨基酸序列(SEQ ID NO: 16)。SEQ ID NO: 16是未成熟的Fv51A序列。Fv51A具有對(duì)應(yīng)于SEQ IDNO: 16第I至19位殘基(標(biāo)有下劃線(xiàn))的預(yù)測(cè)信號(hào)序列；信號(hào)序列的剪切預(yù)計(jì)會(huì)產(chǎn)生成熟蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 16第20至660位殘基的序列。信號(hào)序列預(yù)測(cè)使用SignalP算法(訪(fǎng)問(wèn)地址http://www. cbs. dtu. dk)進(jìn)行。預(yù)測(cè)的L-α -阿拉伯呋喃糖苷酶保守域殘基以黑體表示。域預(yù)測(cè)基于Pfam、SMART或NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行。圖27A至27B :圖27A :里氏木霉Xyn3核苷酸序列(SEQ ID NO: 17)。圖27B :里氏木霉Xyn3氨基酸序列(SEQ ID NO: 18)。SEQ ID NO: 18是未成熟的里氏木霉Xyn3序列。里氏木霉Xyn3具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 18第I至16位殘基(標(biāo)有下劃線(xiàn))的預(yù)測(cè)信號(hào)序列；信號(hào)序列的剪切預(yù)計(jì)會(huì)產(chǎn)生成熟蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 18第17至347位殘基的序列。信號(hào)序列預(yù)測(cè)使用SignalP算法(訪(fǎng)問(wèn)地址http://www. cbs. dtu. dk)進(jìn)行。預(yù)測(cè)保守域殘基以黑體表示。域預(yù)測(cè)基于Pfam、SMART或NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行。圖28A 至 28B :圖 28A =XlnA 核苷酸序列(SEQ ID NO: 19)。圖 28B =XlnA 氨基酸序列(SEQ ID NO: 20)。SEQ ID NO: 20是未成熟的XlnA蛋白質(zhì)序列。XlnA具有對(duì)應(yīng)于SEQ IDNO: 20第I至27位殘基(標(biāo)有下劃線(xiàn))的預(yù)測(cè)信號(hào)序列；信號(hào)序列的剪切預(yù)計(jì)會(huì)產(chǎn)生成熟蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:20第28至211位殘基的序列。信號(hào)序列預(yù)測(cè)使用SignalP 算法(訪(fǎng)問(wèn)地址http://www. cbs. dtu. dk)進(jìn)行。SEQ ID NO: 19 是 XlnA 的基因組序列；起始密碼子和終止密碼子的核苷酸殘基在圖28A中以黑體示出，并且HnA基因的內(nèi)含子A在圖28A中標(biāo)有下劃線(xiàn)。圖29 :圖29示出了葡萄糖的“ α ”和“ β ”異頭物構(gòu)型。異頭物根據(jù)異頭碳上的環(huán)外氧原子和連接到構(gòu)型原子(將糖定義為D或L，通常是環(huán)中最遠(yuǎn)的手性中心)上的氧原子之間的立體化學(xué)關(guān)系確定為“α”或“ β”。其中這兩個(gè)位置具有相同構(gòu)型為α異頭物；在β異頭物中它們的構(gòu)型相反。因此，a-D-葡萄糖的Cl和C5均具有相同的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)，而β -D-葡萄糖Cl的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)與C5相反。 圖30Α 至 30Β :圖 30Α Gz43A 核苷酸序列(SEQ ID NO: 21)。圖 30B Gz43A 氨基酸序列(SEQ ID NO:22)。SEQ ID NO:22是未成熟的Gz43A序列。Gz43A具有對(duì)應(yīng)于SEQ IDN0:22第I至18位殘基(標(biāo)有下劃線(xiàn))的預(yù)測(cè)信號(hào)序列；信號(hào)序列的剪切預(yù)計(jì)會(huì)產(chǎn)生成熟蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:22第19至340位殘基的序列。信號(hào)序列預(yù)測(cè)使用SignalP算法(訪(fǎng)問(wèn)地址http://www. cbs. dtu. dk)進(jìn)行。預(yù)測(cè)保守域殘基以黑體表示。域預(yù)測(cè)基于Pfam、SMART或NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行。圖31A 至 31B :圖 31A :Fo43A 核苷酸序列(SEQ ID NO: 23)。圖 31B :Fo43A 氨基酸序列(SEQ ID NO:24)。SEQ ID NO:24是未成熟的Fo43A序列。Fo43A具有對(duì)應(yīng)于SEQ IDNO: 24第I至20位殘基(標(biāo)有下劃線(xiàn))的預(yù)測(cè)信號(hào)序列；信號(hào)序列的剪切預(yù)計(jì)會(huì)產(chǎn)生成熟蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:24第21至348位殘基的序列。信號(hào)序列預(yù)測(cè)使用SignalP算法(訪(fǎng)問(wèn)地址http://www. cbs. dtu. dk)進(jìn)行。預(yù)測(cè)保守域殘基以黑體表示。域預(yù)測(cè)基于Pfam、SMART或NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行。圖32-1至32-2 GH43家族水解酶的比對(duì)。家族成員中高度保守的氨基酸殘基以黑體和下劃線(xiàn)示出。圖33 XynB3 氨基酸序列(SEQ ID NO:25)。圖34 :里氏木霉Bgll氨基酸序列(SEQ ID N0:45)。信號(hào)序列標(biāo)有下劃線(xiàn)。預(yù)測(cè)保守域殘基以黑體表示。編碼序列在如下文獻(xiàn)中有所描述Barnett等人，1991，Bio-Technology (生物技術(shù))9 (6) :562_567。圖35A 至 35B :圖 35A =XlnD 核苷酸序列(SEQ ID NO: 39)。圖 35B =XlnD 氨基酸序列(SEQ ID NO:40)。SEQ ID NO:40 是未成熟的 XlnD序列。XlnD 具有對(duì)應(yīng)于 SEQ ID NO:40第I至17位殘基(標(biāo)有下劃線(xiàn))的預(yù)測(cè)信號(hào)序列；信號(hào)序列的剪切預(yù)計(jì)會(huì)產(chǎn)生成熟蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:40第18至804位殘基的序列。信號(hào)序列預(yù)測(cè)使用SignalP算法(訪(fǎng)問(wèn)地址http://www. cbs. dtu. dk)進(jìn)行。圖36A 至 36B :圖 36A Fv30A 核苷酸序列(SEQ ID NO:41)。圖 36B Fv30A 氨基酸序列(SEQ ID NO:42)。SEQ ID NO:42是未成熟的Fv30A序列。Fv30A具有對(duì)應(yīng)于SEQ IDNO:42第I至19位殘基(標(biāo)有下劃線(xiàn))的預(yù)測(cè)信號(hào)序列；信號(hào)序列的剪切預(yù)計(jì)會(huì)產(chǎn)生成熟蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:42第20至537位殘基的序列。信號(hào)序列預(yù)測(cè)使用SignalP 算法(訪(fǎng)問(wèn)地址http://www. cbs. dtu. dk)進(jìn)行。
圖37A 至 37B :圖 37A Fv30B 核苷酸序列(SEQ ID NO:43)。圖 37B Fv30B 氨基酸序列(SEQ ID NO:44)。SEQ ID NO:44是未成熟的Fv30B序列。Fv30B具有對(duì)應(yīng)于SEQ IDN0:44第I至24位殘基(標(biāo)有下劃線(xiàn))的預(yù)測(cè)信號(hào)序列；信號(hào)序列的剪切預(yù)計(jì)會(huì)產(chǎn)生成熟蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:44第25至485位殘基的序列。信號(hào)序列預(yù)測(cè)使用SignalP 算法(訪(fǎng)問(wèn)地址http://www. cbs. dtu. dk)進(jìn)行。圖38A 至 38B :圖 38A Fv39A 核苷酸序列(SEQ ID NO:45)。圖 38B Fv39A 氨基酸序列(SEQ ID NO:46)。SEQ ID NO:46是未成熟的Fv39A序列。Fv39A具有對(duì)應(yīng)于SEQ IDN0:46第I至19位殘基(標(biāo)有下劃線(xiàn))的預(yù)測(cè)信號(hào)序列；信號(hào)序列的剪切預(yù)計(jì)會(huì)產(chǎn)生成熟蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:46第20至439位殘基的序列。信號(hào)序列預(yù)測(cè)使用SignalP 算法(訪(fǎng)問(wèn)地址http://www. cbs. dtu. dk)進(jìn)行。圖39A 至 39B :圖 39A Fv39B 核苷酸序列(SEQ ID NO:47)。圖 39B Fv39B 氨基酸序列(SEQ ID NO:48)。SEQ ID NO:48是未成熟的Fv39B序列。Fv39B具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:48第I至18位殘基(標(biāo)有下劃線(xiàn))的預(yù)測(cè)信號(hào)序列；信號(hào)序列的剪切預(yù)計(jì)會(huì)產(chǎn)生成熟蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:48第19至456位殘基的序列。信號(hào)序列預(yù)測(cè)使用SignalP 算法(訪(fǎng)問(wèn)地址http://www. cbs. dtu. dk)進(jìn)行。圖40A 至 40B :圖 40A =XynB 核苷酸序列(SEQ ID NO:49)。圖 40B =XynB 氨基酸序列(SEQ ID NO:50)。XynB 不具有 SignalP 算法(訪(fǎng)問(wèn)地址http://www. cbs. dtu. dk)得到的預(yù)測(cè)信號(hào)序列。圖41A 至 41B :圖 41A :XylA 核苷酸序列(SEQ ID NO: 51)。圖 41B :XylA 氨基酸序列(SEQ ID NO:52) XylA 不具有 SignalP 算法(訪(fǎng)問(wèn)地址http://www. cbs. dtu. dk)得到的預(yù)測(cè)信號(hào)序列，但是具有Uniprot算法(訪(fǎng)問(wèn)地址http://www. uniprot. org/uniprot)預(yù)測(cè)的信號(hào)序列，該序列對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:52第I至18位殘基(標(biāo)有下劃線(xiàn));信號(hào)序列的剪切預(yù)計(jì)會(huì)產(chǎn)生成熟蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:52第19至705位殘基的序列。圖42A 至 42B :圖 42A =Xyll 核苷酸序列(SEQ ID NO:53)。圖 42B =Xyll 氨基酸序列(SEQ ID NO:54)。SEQ ID NO:54 是未成熟的 Xyll 序列。Xyll 具有對(duì)應(yīng)于 SEQ ID NO:54第I至21位殘基(標(biāo)有下劃線(xiàn))的預(yù)測(cè)信號(hào)序列；信號(hào)序列的剪切預(yù)計(jì)會(huì)產(chǎn)生成熟蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 54第22至500位殘基的序列。信號(hào)序列預(yù)測(cè)使用SignalP算法(訪(fǎng)問(wèn)地址http://www. cbs. dtu. dk)進(jìn)行。圖43A至43B :圖43A :利用bxlト里氏木霉菌株#229進(jìn)行SSF反應(yīng)第I天測(cè)量的EXP和こ醇濃度，其中向SSF反應(yīng)加入O. 5或I. 5mg/g純化里氏木霉Bxll木聚糖，或加入lmg/g純化Fv43D木聚糖；圖43B :利用bxll-里氏木霉#229進(jìn)行SSF反應(yīng)第3天測(cè)量的EXP和こ醇濃度，其中向SSF反應(yīng)加入O. 5或I. Omg/g木聚糖或純化里氏木霉Bxll，或加入lmg/g純化Fv43D木聚糖。SSF反應(yīng)條件在如下實(shí)例6中有所描述。
6.
具體實(shí)施例方式本文所用縮寫(xiě)詞的含義在下面列出“min”和“mins”意指分鐘；“hr”和“hrs”意指小吋，“d”意指天，“ μ L”意指微升，“mL”意指毫升，“L”意指升，“nm”意指納米，“mm”意指毫米，“cm”意指厘米，“ μ m”意指微米，“mM”意指毫摩爾每升，“M”意指摩爾每升，“mmoL”意指毫摩爾，“ μ mole”意指微摩爾，“g”意指克，“ μ g”意指微克，“mg”意指毫克，“kg”意指千克，“RPM”或“rpm”意指毎分鐘轉(zhuǎn)數(shù)，“vol. %”意指體積％，“wt. %”意指重量％，并且“RPS”意指每秒轉(zhuǎn)數(shù)。6. L通用定義除非另外指明，本文引用的所有美國(guó)專(zhuān)利和美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)全文以引用方式并入。此外，當(dāng)數(shù)量、濃度或其他值或參數(shù)以范圍、優(yōu)選的范圍或優(yōu)選的上限值或優(yōu)選的下限值的列表給出時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解為明確地公開(kāi)了沿著那些范圍形成的連續(xù)統(tǒng)的所有范圍或數(shù)字。當(dāng)本文引用數(shù)值范圍時(shí)，除非另外指明，該范圍g在涵蓋范圍的端點(diǎn)，以及該范圍內(nèi)的所有整數(shù)和分?jǐn)?shù)。當(dāng)限定范圍時(shí)，本發(fā)明的范圍不_在局限于引用的具體值。如本文所用，在本發(fā)明的成分或組分之前的冠詞“ー個(gè)”、“ー種”和“該” g在不對(duì)所述成分或組分的實(shí)例(如存在)數(shù)目構(gòu)成限制。因此“ー個(gè)”、“ー種”和“該”應(yīng)理解為包 括ー個(gè)或至少ー個(gè)，并且成分或組分的單數(shù)詞形式也包括復(fù)數(shù)，除非該數(shù)字明顯意指単數(shù)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“包含”或“包括”意指存在如權(quán)利要求中涉及的所述特征、整數(shù)、步驟或組分，但是不排除它們ー個(gè)或多個(gè)其他特征、整數(shù)、步驟、組分或組的存在或添加。術(shù)語(yǔ)“包含”或“包括” g在包括術(shù)語(yǔ)“基本上由…組成”和“由…組成”涵蓋的實(shí)施例。類(lèi)似地，術(shù)語(yǔ)“基本上由…組成” g在包括術(shù)語(yǔ)“由…組成”涵蓋的實(shí)施例。如本文所用，修飾成分或反應(yīng)物數(shù)量或本發(fā)明參數(shù)數(shù)量的術(shù)語(yǔ)“約”是指可能由于如下情形而發(fā)生數(shù)量變化例如現(xiàn)實(shí)世界中用于制備濃縮物或溶液的典型測(cè)量和移液操作、這些操作中因疏忽而造成的誤差、用于制備組合物或?qū)嵤┓椒ǖ某煞值闹苽洹?lái)源或純度差異等等。術(shù)語(yǔ)“約”還涵蓋特定初始混合物形成的組合物的不同平衡條件導(dǎo)致的數(shù)量差異。無(wú)論是否被術(shù)語(yǔ)“約”修飾，權(quán)利要求包括其引用的數(shù)量的等價(jià)物。術(shù)語(yǔ)“同步糖化發(fā)酵”或“ SSF”是指這樣的過(guò)程或反應(yīng)配置，其中生物質(zhì)被糖化，與此同時(shí)，通常在同一個(gè)反應(yīng)容器中糖化產(chǎn)生的可發(fā)酵糖被酶和/或發(fā)酵微生物利用而生成產(chǎn)物。術(shù)語(yǔ)“混合糖化發(fā)酵”或“HSF”是指這樣的過(guò)程或反應(yīng)配置，其中生物質(zhì)被糖化至有限程度(不完全或部分糖化)，然后繼續(xù)進(jìn)行同步糖化發(fā)酵。術(shù)語(yǔ)“分步糖化發(fā)酵”、“分步水解發(fā)酵”和“SHF”在本文中可以互換使用。它們是指這樣的過(guò)程或反應(yīng)配置，其中生物質(zhì)被基本完全(例如約60%或更完全、約70%或更完全、約80%或更完全、約90%或更完全、或約95%或更完全)或完全(例如約99%或更完全、或約100%完全，使得將會(huì)從給定糖化反應(yīng)釋放的所有可發(fā)酵糖都釋放)糖化或水解，然后進(jìn)行單獨(dú)且不同的發(fā)酵步驟，其中使糖化或水解步驟產(chǎn)生的發(fā)酵糖發(fā)酵以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物。術(shù)語(yǔ)“可發(fā)酵糖”是指在發(fā)酵過(guò)程中能夠被微生物用作碳源的低聚糖和單糖。術(shù)語(yǔ)“部分糖化”是指生物質(zhì)的有限糖化，其中釋放的可發(fā)酵糖少于糖化進(jìn)行完全時(shí)將會(huì)釋放的總可發(fā)酵糖。術(shù)語(yǔ)“纖維素的”是指包含纖維素和附加組分(包括例如半纖維素)的組合物。術(shù)語(yǔ)“糖化”是指從多糖或含多糖的材料產(chǎn)生可發(fā)酵糖。術(shù)語(yǔ)“生物質(zhì)”是指任何纖維素或木質(zhì)纖維素材料，并且其包括的材料包含纖維素，任選地還包含半纖維素、木質(zhì)素、淀粉、低聚糖和/或單糖。生物質(zhì)也能夠包含附加組分，例如蛋白質(zhì)和/或脂質(zhì)。生物質(zhì)能夠得自單個(gè)來(lái)源，或生物質(zhì)能夠包括得自多于ー種來(lái)源的混合物。例如，生物質(zhì)能夠包含玉米芯和玉米秸桿的混合物或草和葉片的混合物。生物質(zhì)包括但不限于生物能源作物、農(nóng)業(yè)廢棄物、市政固體垃圾、工業(yè)固體垃圾、來(lái)自造紙業(yè)的淤渣、庭院垃圾、木材廢料和林業(yè)垃圾。生物質(zhì)的實(shí)例包括但不限于玉米芯、作物廢棄物例如玉米殼、玉米秸桿、草、小麥、小麥秸桿、大麥秸桿、干草、稻桿、柳枝稷、廢紙、蔗渣、高粱、蘆竹、象草、芒草、日本柳杉、谷物碾磨而成的組分、枝條、樹(shù)枝、根、葉片、木片、鋸屑、灌木和灌叢、蔬菜、果實(shí)、花和動(dòng)物糞肥。術(shù)語(yǔ)“糖化酶”是指能夠催化生物質(zhì)組分轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖的酶。通常情況下，當(dāng)預(yù)處理生物質(zhì)時(shí)，酶產(chǎn)生可發(fā)酵糖的效率更高。6.2.發(fā)明詳沭從纖維素材料制備物質(zhì)或發(fā)酵產(chǎn)物通常包括三個(gè)主要步驟。這三個(gè)步驟為(I)預(yù)處理或預(yù)水解、(2)酶水解或糖化以及(3)發(fā)酵，然后回收物質(zhì)或發(fā)酵產(chǎn)物。以下舉例說(shuō)明了制備乙醇的方法，但應(yīng)當(dāng)理解類(lèi)似的方法能用于制備其他物質(zhì)。
預(yù)處理。在預(yù)處理或預(yù)水解步驟中，將纖維素材料(包括例如木質(zhì)纖維素材料)加熱以分解木質(zhì)素和碳水化合物結(jié)構(gòu)，溶解大多數(shù)半纖維素，并使纖維素部分觸及纖維素水解酶。加熱步驟直接使用蒸汽或在漿液或混合物中進(jìn)行，其中催化劑可任選地加入材料中以加速反應(yīng)。合適的催化劑包括例如強(qiáng)酸(如硫酸和SO2)或強(qiáng)堿(如氫氧化鈉)。預(yù)處理步驟會(huì)促進(jìn)酶和微生物的滲透。纖維素生物質(zhì)也可經(jīng)過(guò)水熱蒸汽爆破預(yù)處理(參見(jiàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi) 2002/0164730)。糖化。在酶水解步驟(也稱(chēng)為糖化步驟)中，將本文所述的酶加入預(yù)處理材料中，從而將纖維素部分轉(zhuǎn)化為葡萄糖和/或其他糖。糖化步驟通常在攪拌釜反應(yīng)器或發(fā)酵罐中于受控pH、溫度和混合條件下進(jìn)行。在某些情況下，糖化步驟可持續(xù)至多200小時(shí)。糖化能夠在約30°C至約65°C的溫度，尤其是約50°C，以及約4和約5之間的pH，尤其是約pH 4. 5下進(jìn)行。要制備能通過(guò)發(fā)酵微生物例如真菌(例如酵母或絲狀真菌)或細(xì)菌(例如運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌或熱纖梭菌)代謝而制備的葡萄糖，酶水解步驟通常在β -葡萄糖苷酶的存在下進(jìn)行。發(fā)酵。在發(fā)酵步驟中，將經(jīng)預(yù)處理和酶水解步驟而從纖維素材料釋放的糖通過(guò)發(fā)酵生物，例如真菌(例如酵母或絲狀真菌)或細(xì)菌(例如運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌或熱纖梭菌)發(fā)酵為乙醇(或其他物質(zhì))。SSF0本發(fā)明提供提高反應(yīng)產(chǎn)量的方法和組合物，其中發(fā)酵步驟與酶水解步驟在同一個(gè)容器中，優(yōu)選地在受控pH、溫度和混合條件下同時(shí)進(jìn)行，而不是在酶水解步驟后以不同或單獨(dú)的步驟進(jìn)行。在某些方面，糖化和發(fā)酵在同一個(gè)容器中同時(shí)進(jìn)行，即同步糖化發(fā)酵或“SSF”。如本文所述，該過(guò)程還涵蓋使用“混合糖化發(fā)酵”或“HSF”配置進(jìn)行的過(guò)程。在某些方面，當(dāng)不超過(guò)30%、不超過(guò)25%、不超過(guò)20%、不超過(guò)15%、不超過(guò)10%、或不超過(guò)5%的生物質(zhì)被糖化時(shí)引發(fā)SSF反應(yīng)(例如通過(guò)將發(fā)酵微生物加入糖化反應(yīng)，或通過(guò)設(shè)立一組促進(jìn)發(fā)酵的條件)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“SSF”還涵蓋多種糖的共發(fā)酵(Sheehan和 Himmel,1999,“Enzymes, energy and the environment:A strategic perspectiveon the U. S. Department of Energy' s research and development activities forbioethanol”(酶，能量和環(huán)境關(guān)于美國(guó)能源部對(duì)生物乙醇的研究和開(kāi)發(fā)活動(dòng)的戰(zhàn)略透視)，Biotechnol. Prog.(生物技術(shù)進(jìn)展)15 :817_827)。6. 3酶水解
高等植物的細(xì)胞壁包含多種碳水化合物聚合物(CP)組分。這些CP組分通過(guò)共價(jià)和非共價(jià)方式相互作用，為植物提供形成剛性細(xì)胞壁和抵抗膨壓所需的結(jié)構(gòu)完整性。存在于植物中的主要CP為纖維素，其形成植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)骨架。在纖維素生物合成期間，聚-β -1，4-D-葡萄糖鏈通過(guò)氫鍵和疏水相互作用自交聯(lián)形成纖維素微纖絲，纖維素微纖絲進(jìn)一步自交聯(lián)形成更大的原纖維。纖維素微纖絲有些不規(guī)則，并且包含不同結(jié)晶度的區(qū)域。纖維素原纖維的結(jié)晶度取決于任意兩種組分纖維素鏈之間氫鍵的緊密有序程度。低序鍵合因而更容易觸及葡萄糖鏈的區(qū)域稱(chēng)為非晶區(qū)。纖維素轉(zhuǎn)化或解聚為葡萄糖的一般模式涉及三種酶活性。內(nèi)切葡聚糖酶從內(nèi)部裂解纖維素鏈生成短鏈，并且增加可觸及末端的數(shù)量，然后外切葡聚糖酶對(duì)該末端作用。外切葡聚糖酶對(duì)短鏈的還原末端或非還原末端具有特異性，并且能夠釋放纖維二糖，其為葡萄糖二聚體。外切葡聚糖酶的實(shí)例包括但不限于各種纖維二糖水解酶。然后將累積的纖維二糖通過(guò)纖維二糖酶裂解形成葡萄糖。纖維二糖酶的實(shí)例包括但不限于各種β-1，4-葡萄糖苷酶。半纖維素包含一組不同于纖維素糖單體的糖單體，纖維素包含無(wú)水葡萄糖。例如， 除葡萄糖以外，半纖維素中的糖單體能夠包括木糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖和阿拉伯糖。半纖維素主要包含D-戊糖，有時(shí)也包含少量L-糖。木糖是含量最大的糖單體，但往往也存在甘露糖醛酸和半乳糖醛酸。半纖維素包括例如木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、阿糖基木聚糖、葡甘露聚糖和木葡聚糖。本發(fā)明的酶和多酶組合物用于半纖維素材料，例如木聚糖、阿糖基木聚糖和含木聚糖或阿拉伯木聚糖底物的糖化。阿糖基木聚糖是由木糖和阿拉伯糖組成的多糖，其中L-α -阿拉伯呋喃糖殘基作為分支點(diǎn)連接到β -(1，4)_連接木糖聚合物主鏈。由于大部分生物質(zhì)來(lái)源的復(fù)雜性(生物質(zhì)來(lái)源能夠包含纖維素、半纖維素、果膠、木質(zhì)素、蛋白質(zhì)和灰分以及其他組分)，在某些方面，本發(fā)明的酶共混物能夠包含具有一系列底物特異性的酶，所述酶協(xié)同通過(guò)有效方式將生物質(zhì)降解為可發(fā)酵糖。用于木質(zhì)纖維素糖化的多酶復(fù)合物的一個(gè)實(shí)例包含纖維二糖水解酶、木聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、β -葡萄糖苷酶、木糖苷酶和任選地各種輔助蛋白質(zhì)的混合物。因此，本發(fā)明設(shè)想了使用能夠單獨(dú)或共同產(chǎn)生碳水化合物的一種或多種酶，碳水化合物在產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物例如乙醇的SSF反應(yīng)中能夠被發(fā)酵生物用作能量來(lái)源。在某些方面，多酶組合物在SSF反應(yīng)中用于碳水化合物或含碳水化合物生物質(zhì)底物的水解以產(chǎn)生糖，所述糖在相同的反應(yīng)中被發(fā)酵微生物發(fā)酵。多酶組合物(包括制備產(chǎn)物、酶集合體或“共混物”)包含在某些方面為非天然存在的酶的混合物(或“共混物”)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“共混物”是指(I)將組分酶以發(fā)酵液的形式，或以部分地或完全地分離或純化的多肽的形式組合而制備的組合物；(2)通過(guò)經(jīng)修飾可表達(dá)一種或多種組分酶的生物制備的組合物；任選地，所述生物可經(jīng)修飾而缺失一個(gè)或多個(gè)基因或使一個(gè)或多個(gè)基因產(chǎn)物失活，其中所述基因編碼影響木聚糖水解、半纖維素水解和/或纖維素水解的蛋白質(zhì)；(3)在SSF反應(yīng)期間，將組分酶同步、分步或順序混合而制備的組合物；以及(4)例如在SSF反應(yīng)期間原位制備的酶混合物；
(5)上述(I)至⑷中任意或所有的組合。還應(yīng)當(dāng)理解，能夠?qū)⒈疚木唧w描述的任何酶與本文所述的任何一種或多種酶，或與任何其他可用和合適的酶組合，來(lái)制備多酶組合物。本發(fā)明不受限于或局限于本文列出或舉例說(shuō)明的具體示例性組合。在本發(fā)明的方法中，在SSF反應(yīng)之前或期間，包括發(fā)酵微生物增殖期間或之后，能夠加入本文所述的任何酶。所述酶能夠單獨(dú)、以酶共混物或以發(fā)酵液等加入。本文涉及的酶能夠源自或得自任何合適的來(lái)源，包括例如細(xì)菌、真菌、酵母或哺乳動(dòng)物來(lái)源。術(shù)語(yǔ)“得自”意指酶能夠以天然酶的形式從天然產(chǎn)酶的生物分離，或酶能夠在宿主生物中重組制備，其中重組制備的酶是宿主生物天然的或外源的，具有修飾的氨基酸序列，例如具有一個(gè)或多個(gè)缺失、插入和/或取代的氨基酸，或是本領(lǐng)域已知的核酸改組方法制備的酶。例如，重組制備的酶能夠是作為突變體和/或天然氨基酸序列片段的酶。所謂“天然酶”是指涵蓋生物基因組中天然位置的基因的產(chǎn)物，并且還涵蓋天然變體；所謂“外源酶”是指涵蓋通常不存在于宿主生物中，但通過(guò)基因轉(zhuǎn)移而引入宿主生物的基因，或插入非 天然生物中的基因，或嵌合基因的產(chǎn)物，其包括以重組方式例如通過(guò)定點(diǎn)誘變或改組獲得的酶。在某些方面，酶能夠是純化的。本文中用于修飾例如酶、蛋白質(zhì)、多肽、多核苷酸和其他組分的物質(zhì)的術(shù)語(yǔ)“純化的”是指酶不含或基本上不含所述酶來(lái)源生物的其他組分。在某些方面，術(shù)語(yǔ)“純化的”還涵蓋其中酶不含或基本上不含所述酶得自天然生物的組分的情形。酶能夠被視為“純化的”，但仍然結(jié)合或存在少量其他蛋白質(zhì)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“其他蛋白質(zhì)”具體地講是指其他酶。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“純化的”還指移除其他組分，具體地講是指移除其他蛋白質(zhì)，并且更具體地講存在于本發(fā)明的酶的來(lái)源細(xì)胞中的其他酶。因此，酶能夠是例如“基本上純的多肽”，該多肽基本上不含其他組分。其中產(chǎn)生給定酶的生物能夠是例如適于重組制備酶的宿主生物。例如,基本上純的多肽能夠指以50重量％或更多、60重量％或更多、70重量％或更多、80重量％或更多、90重量％或更多、95重量％或更多、98%或更多、或99%或更多的含量存在于混合物中作為其中一部分的多肽?；旧喜缓渌M分的多肽是存在于包含小于40重量％、小于30重量％、小于20重量％、小于10重量％、小于5重量％、小于2重量％、或小于I重量％其他組分的混合物中的多肽。6. 3. L纖維素酶本發(fā)明的酶共混物能夠包含一種或多種纖維素酶。纖維素酶是將纖維素(β -I, 4-葡聚糖或β -D-葡糖苷鍵)水解形成葡萄糖、纖維二糖、纖維低聚糖等的酶。纖維素酶習(xí)慣上分為三種主要類(lèi)型內(nèi)切葡聚糖酶(EC 3. 2. I. 4) ( “EG”)、外切葡聚糖酶或纖維二糖水解酶(EC 3. 2. I. 91) (“CBH”)和β -葡萄糖苷酶(β -D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶；EC3. 2. 1.21) ( “BG”) (Knowles 等人，1987, Trends in Biotechnol.(生物技術(shù)趨勢(shì))5 (9)255-261 和 Schulein, 1988, Methods of Enzymology (酶學(xué)方法)160 :234_242)。內(nèi)切葡聚糖酶主要作用于纖維素纖維的非晶部分，而纖維二糖水解酶能夠降解結(jié)晶纖維素。根據(jù)本發(fā)明的方法和組合物使用的纖維素酶能夠得自特別是一種或多種以下生物柄毛皮傘(Crinipellis scapella)、菜豆殼球抱(Macrophomina phaseolina)、嗜熱毀絲菌(Myceliophthora thermophila)、幾生幾殼菌(Sordaria fimicola)、擬刺盤(pán)抱周刺座霉(Volutella colletotrichoides)、太瑞斯梭抱殼霉(Thielavia terrestris)、支頂抱屬(Acremonium sp·)、黑耳(Exidia glandulosa)、木蹄層孑L菌(Fomes fomentarius)、綿皮孔菌屬(Spongipellis sp.)、紅根囊壺菌(Rhizophlyctis rosea)、微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)、閃光須霉(Phycomyces niteus)、弗雷生剌枝霉(Chaetostylumfresenii)、棉色二抱(Diplodia gossypina)、異色尾抱藻(Ulospora bigramii)、集抱類(lèi)盤(pán)菌(Saccobolus dilutellus)、撫抱青霉(Penicillium verruculosum)、產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)、撫狀頂抱霉(Thermomyces verrucosus)、合生腐皮殼菌(Diaporthe syngenesia)、黃瓜炭疽菌(Colletotrichum Iagenarium)、黑抱霉屬(Nigrospora sp·)、團(tuán)炭角菌(Xylaria hypoxylon)、松色叢赤殼菌(Nectria pinea)、大抱類(lèi)殼菌(Sordaria macrospora)、嗜熱梭抱殼霉(Thielavia thermophila)、突抱毛殼(Chaetomium mororum)、綠毛殼(Chaetomium virscens)、巴西毛殼(Chaetomiumbrasiliensis)、鏈絲毛殼菌(Chaetomium cunicolorum)、Syspastospora boninensis、多 生枝鼻菌(Cladorrhinum foecundissimum)、嗜熱柱霉(Scytalidium thermophila)、鏈抱粘帚菌(Gliocladium catenulatum)、尖抱德抱菌番煎亞種(Fusarium oxysporum ssp.lycopersici)、尖抱德抱菌西番蓮亞種(Fusarium oxysporum ssp. passiflora)、鑭素對(duì)德抱菌(Fusarium solani)、蛇形德抱菌(Fusarium anguioides)、梨抱德抱菌(Fusariumpoae)、黑腐質(zhì)霉(Humicola nigrescens)、灰腐質(zhì)霉(Humicola grisea)、網(wǎng)紋斑糟菌(Panaeolus retirugis)、血紅栓菌(Trametes sanguinea)、裂糟菌(Schizophyllumcommune)、粉紅單端抱(Trichothecium roseum)、小球殼抱菌(Microsphaeropsis sp.)、糞盤(pán)菌(Acsobolus stictoideus spej·)、點(diǎn)孔座殼(Poronia punctata)、多節(jié)抱屬(Nodulisporum sp.)、木霉屬(Trichoderma sp.)(如里氏木霉(Trichoderma reesei))和柱抱菌屬(Cylindrocarpon sp.) 在具體實(shí)施例中，如以下小節(jié)描述的卡爾科弗盧爾測(cè)定法所測(cè)定，用于本發(fā)明組合物的纖維素酶能夠達(dá)到至少O. I、至少O. 2、至少O. 3、至少O. 4、或至少O. 5分率產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，如以下小節(jié)描述的卡爾科弗盧爾測(cè)定法所測(cè)定，用于本發(fā)明組合物的纖維素酶是全纖維素酶和/或能夠達(dá)到至少O. I、至少O. 2、至少O. 3、至少O. 4、或至少O. 5分率產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，如卡爾科弗盧爾測(cè)定法所測(cè)定，用于本發(fā)明組合物的纖維素酶是全纖維素酶和/或能夠達(dá)到約O. I至約O. 5、或約O. I至約O. 4、或約O. 2至約O. 4、或約O. 3至約O. 4、或約O. 2至約O. 5、或約O. 3至約O. 5分率產(chǎn)物。6. 3. I. I.使用卡爾科弗盧爾熒光增白劑進(jìn)行纖維素酶活性測(cè)定磷酸溶脹纖維素(PASC)使用如下文獻(xiàn)的修訂方案從Avicel PH-IOl制備Walseth, 1971，TAPPI (紙漿的造紙工業(yè)技術(shù)協(xié)會(huì))35 :228 和 Wood，1971，Biochem.(生物化學(xué))J. 121 :353-362。簡(jiǎn)而言之，在示例性方法中，將Avicel溶解于濃磷酸中，然后使用冷去離子水沉淀。收集纖維素并且用水洗滌達(dá)到中性PH后，將其在50mM乙酸鈉緩沖液(pH
5.O)中稀釋到1%固體含量。所有酶稀釋液均使用50mM乙酸鈉緩沖液(pH 5.0)制備。將GC220纖維素酶(Danisco US Inc. , Genencor)稀釋至2. 5、5、10和15mg蛋白質(zhì)/gPASC，以繪制線(xiàn)性校準(zhǔn)曲線(xiàn)。將待測(cè)試的樣品稀釋至校準(zhǔn)曲線(xiàn)的范圍內(nèi)，即得到O. I至0.4分率產(chǎn)物的響應(yīng)。向合適容器例如96-孔微量滴定板中的每20 μ L酶溶液加入一百五十(150) μ L冷的1%PASC。蓋上滴定板，并且在培養(yǎng)箱/搖床中以200印111的轉(zhuǎn)速在50°C下溫育2小時(shí)。然后使用100 μ L溶于IOOmM甘氨酸(pH 10)的50 μ g/mL卡爾科弗盧爾淬滅反應(yīng)。熒光在熒光酶標(biāo)儀上讀取，激發(fā)波長(zhǎng)Ex=365nm，發(fā)射波長(zhǎng)Em=435nm。根據(jù)以下公式得到結(jié)果，以分率產(chǎn)物表示FP=I-(Fl樣品-含纖維二糖的Fl緩沖液)/(Fl起點(diǎn)酶-含纖維二糖的Fl緩沖液)，其中“FP”為分率產(chǎn)物，并且“F1”為熒光單位。6.3. 1.2. β-葡萄糖苷酶本發(fā)明的酶共混物任選地包含一種或多種葡萄糖苷酶。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“ β -葡萄糖苷酶”是指歸為或歸入EC 3. 2. I. 21的β -D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶和/或某些糖基水解酶(“GH”)家族，包括但不限于GH家族1、3、9或48成員酶。在某些方面，該術(shù)語(yǔ)是指能夠催化纖維二糖水解釋放β -D-葡萄糖的酶。β -葡萄糖苷酶能夠從任何合適的微生物獲得。它們能夠以重組方式獲得或制備，或能夠從商業(yè)來(lái)源獲得。合適的β -葡萄糖苷酶能夠例如從微生物，如細(xì)菌和真菌獲得。例·如，合適的β_葡萄糖苷酶能夠從絲狀真菌獲得。在某些方面,合適的β -葡萄糖苷酶能夠從棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)(Kawaguchi 等人，1996, Gene (基因)173 :287_288)、白曲霉(Aspergillus kawachi)(Iwashita 等人，1999, Appl. Environ. Microbiol.(微生物學(xué)應(yīng)用和環(huán)境)65 :5546_5553)、米曲霉(Aspergillus oryzae) (PCT專(zhuān)利申請(qǐng)公布WO 2002/095014)、雙氮纖維單胞菌(Cellulomonas biazotea) (Wong 等人，1998, Gene (基因)207 :79_86)、繩狀青霉(Penicillium funiculosum) (PCT 專(zhuān)利申請(qǐng)公布 WO 200478919)、扣囊復(fù)膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera) (Machida 等人，1988, Appl. Environ. Microbiol.(微生物學(xué)應(yīng)用和環(huán)境)54 :3147_3155)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe) (Wood等人，2002，Nature (自然)415 :871-880)或里氏木霉獲得。例如，得自里氏木霉的合適的β-葡萄糖苷酶能夠包括葡萄糖苷酶I (美國(guó)專(zhuān)利6，022，725)、里氏木霉β -葡萄糖苷酶3 (美國(guó)專(zhuān)利6，982，159)、里氏木霉β -葡萄糖苷酶4 (美國(guó)專(zhuān)利7，045，332)、里氏木霉β-葡萄糖苷酶5 (美國(guó)專(zhuān)利7，005，289)、里氏木霉β -葡萄糖苷酶6 (美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布20060258554)或里氏木霉β -葡萄糖苷酶7 (美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布20060258554)。在一些實(shí)施例中，合適的葡萄糖苷酶能夠通過(guò)表達(dá)編碼葡萄糖苷酶的基因制備。例如，合適的葡萄糖苷酶能夠例如通過(guò)某些革蘭氏陽(yáng)性生物(例如芽孢桿菌(Bacillus)或放線(xiàn)菌(Actinomycetes))或通過(guò)真核宿主(例如木霉、曲霉(Aspergillus)、酵母(Saccharomyces)或畢赤酵母(Pichia))分泌至細(xì)胞外間隙。合適的葡萄糖苷酶也能夠從商業(yè)來(lái)源獲得。適用于本發(fā)明方法、組合物和其他實(shí)施例的市售β -葡萄糖苷酶制品的實(shí)例包括但不限于以ACCelleraSe BG(丹尼斯科美國(guó)有線(xiàn)公司，杰能科(Danisco US Inc.，Genencor))商購(gòu)獲得的里氏木霉β -葡萄糖苷酶、N0V0ZYM 188 (得自黑曲霉的β _葡萄糖苷酶)、農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium sp.)β _葡萄糖苷酶和購(gòu)自 Megazyme (Megazyme International Ireland Ltd. , Bray BusinessPark, Bray, Co. (Wicklow, Ireland))的海棲熱袍菌(Thermatoga maritima) β -葡萄糖苷酶。在某些方面，合適的β -葡萄糖苷酶能夠是全纖維素酶的組分，如以下第6. 3. I. 5節(jié)所述。
β -葡萄糖苷酶活性能夠通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法測(cè)定。例如，能夠使用如下文獻(xiàn)所述的測(cè)定法Chen等人，1992, Biochimica et Biophysica Acta (生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào))121 :54-60。在該測(cè)定法中，一個(gè)單位pNPG表示在50°C (或122 °F)和pH 4. 8下10分鐘內(nèi)從對(duì)硝基苯基-β -D-吡喃葡萄糖苷釋放I μ moL硝基酚。6. 3. I. 3.內(nèi)切葡聚糖酶本發(fā)明的酶共混物任選地包含一種或多種內(nèi)切葡聚糖酶。術(shù)語(yǔ)“內(nèi)切葡聚糖酶”是指歸為EC 3. 2. I. 4的任何多肽。在某些方面，本發(fā)明的方法和組合物中使用里氏木霉EGl (Penttila等人，1986，Gene (基因)63 :103-112)和 / 或里氏木霉 EGII (Saloheimo 等人，1988，Gene (基因)63 :11-21)。在其他方面，內(nèi)切葡聚糖酶能夠是里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶VI (參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利7，351，568)、內(nèi)切葡聚糖酶VII (參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利7，449，319)或內(nèi)切葡聚糖酶VIII (參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利7，049, 125)。 在具體實(shí)施例中，合適的內(nèi)切葡聚糖酶能夠是太瑞斯梭孢殼霉熱穩(wěn)定內(nèi)切葡聚糖酶(Kvesitadaze 等人，1995, Appl. Biochem. Biotechnol.(生物化學(xué)和生物技術(shù)應(yīng)用)50 137-143)、里氏木霉 EGIII (Okada 等人，1988, Appl. Environ. Microbiol.(微生物學(xué)應(yīng)用和環(huán)境)64 :555-563),EGIV (Saloheimo 等人，1997,Eur. J. Biochem.(歐洲生物化學(xué)雜志)249 :584-591)、EG5 (Saloheimo 等人，1994,Mol. Microbiol.(分子微生物學(xué))13 :219-228),EGVI (美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布20070213249)或EGVII (美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布20090170181 )、解纖維熱酸菌(Acidothermus cellulolyticus)EI內(nèi)切葡聚糖酶(美國(guó)專(zhuān)利5，536，655)、特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)內(nèi)切葡聚糖酶V(EGV)(蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)4ENG)、堅(jiān)孢葡萄單孢(Staphylotrichum coccosporum)內(nèi)切葡聚糖酶(美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布20070111278)、棘孢曲霉內(nèi)切葡聚糖酶Fl-CMC (Ooi等人，1990, Nucleic Acid Res.(核酸研究)18 :5884)、白曲霉(Aspergillus kawachii) IFO 4308 內(nèi)切葡聚糖酶 CMCase-1 (Sakamoto 等人，1995，Curr. Genet.(當(dāng)代遺傳學(xué))27 :435_439)、或胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovara)(Saarilahti 等人，1990, Gene (基因)90 :9_14)、嗜熱支頂抱(Acremonium thermophilum)ALK04245內(nèi)切葡聚糖酶(美國(guó)專(zhuān)利公布20070148732)。適用于本發(fā)明的方法和組合物的內(nèi)切葡聚糖酶也能夠是例如PCT專(zhuān)利申請(qǐng)公布WO 91/17243、WO 91/17244、WO 91/10732 或美國(guó)專(zhuān)利 6，001，639 所述的那些。6. 3. I. 4.纖維二糖水解酶如本文所用，術(shù)語(yǔ)“纖維二糖水解酶”是指歸為EC 3. 2. 1.91的任何纖維二糖水解酶。本發(fā)明的方法和組合物能夠合適地包含一種或多種纖維二糖水解酶(“CBH”)。在某些方面，里氏木霉CBHI (Shoemaker 等人，1983, Bio/Technology (生物 / 技術(shù))1 :691-696)和 / 或 CBHII (Teeri 等人，1983，Bio/Technolgy (生物 / 技術(shù))1 :696-699)能夠用于本發(fā)明的方法和組合物。在某些方面，合適的CBH能夠是雙抱蘑燕(Agaricus bisporus) CBHlCSwiss Prot登錄號(hào)Q92400)、棘孢曲霉CBHl (Swiss Prot登錄號(hào)059843)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)CBHA (GenBank 登錄號(hào) AF420019)、構(gòu)巢曲霉 CBHB (GenBank 登錄號(hào) AF420020)、黑曲霉 CBHA (GenBank 登錄號(hào) AF156268)、黑曲霉 CBHB (GenBank 登錄號(hào) AF156269)、麥角菌(Claviceps purpurea) CBHlCSwiss Prot 登錄號(hào) 000082)、炭色旋抱腔菌(Cochlioboluscarbonarum)CBHl (Swiss Prot 登錄號(hào) Q00328)、寄生隱叢赤殼菌(Cryphonectriaparasitica)CBHl (Swiss Prot 登錄號(hào) Q00548)、尖抱鍵抱菌 CBHl (Cel7A) (Swiss Prot 登錄號(hào)P46238)、灰腐質(zhì)霉cbhl. 2 (GenBank登錄號(hào)U50594)、灰腐質(zhì)霉高溫變種(Humicolagrisea var. thermoidea) CBHl (GenBank 登錄號(hào) D63515)、灰腐質(zhì)霉高溫變種 CBHI. 2(GenBank登錄號(hào)AF123441)、灰腐質(zhì)霉高溫變種exol (GenBank登錄號(hào)AB003105)、熱白絲菌(Melanocarpus albomyces)Cel7B (GenBank 登錄號(hào) AJ515705)、粗糖脈抱菌(Neurospora crassa) CBHI (GenBank 登錄號(hào) X77778)、繩狀青霉 CBHI (Cel7A)(美國(guó)專(zhuān)利公布 20070148730)、微紫青霉(Penicillium janthinellum)CBHI (GenBank 登錄號(hào) S56178)、黃抱原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium) CBHCGenBank 登錄號(hào) M22220)、黃抱原毛平革菌 CBHI-2 (Cel7D) (GenBank 登錄號(hào) L22656)、埃默森籃狀菌(Talaromyces emersonii)CbhlA (GenBank 登錄號(hào) AF439935)、綠色木霉(Trichoderma viride) CBHl (GenBank 登錄號(hào) X53931)或草苑(Volvariella volvacea) V14 Cbhl (GenBank 登錄號(hào) AF156693)。6. 3. I. 5.全纖維素酶在某些方面，本發(fā)明的酶共混物包含全纖維素酶。如本文所用，“全纖維素酶”是指含天然存在的和非天然存在的纖維素酶的組合物，該組合物包含(I)內(nèi)切葡聚糖酶，其裂解纖維素的內(nèi)部β-1，4鍵，得到短葡萄糖寡聚糖；(2)纖維二糖水解酶，其以“外切”方式發(fā)揮作用，從短葡萄糖寡聚糖釋放纖維二糖單位；纖維二糖單位的實(shí)例包括β_1，4-葡萄糖-葡萄糖二糖，以及(3) β-葡萄糖苷酶，其催化作為葡萄糖二聚體的短纖維低聚糖或纖維二糖釋放葡萄糖單體?！昂烊淮嬖诘睦w維素酶的”組合物是由天然來(lái)源制備的組合物，該組合物具有一種或多種纖維二糖水解酶類(lèi)型、一種或多種內(nèi)切葡聚糖酶類(lèi)型以及一種或多種
葡萄糖苷酶類(lèi)型組分或活性，其中這些組分或活性各自以天然的、未受人工影響的比例和水平存在。因此，含天然存在的纖維素酶的組合物為例如這樣的生物所產(chǎn)生的組合物，該生物未針對(duì)纖維素水解酶進(jìn)行修飾，因此組分酶的比例和水平與自然界中天然生物產(chǎn)生的無(wú)差別。“含非天然存在的纖維素酶的組合物”是指通過(guò)以下方法產(chǎn)生的組合物(1)將組分纖維素水解酶以天然存在的比例或非天然存在的(即改變的)比例混合；或(2)修飾生物，使其過(guò)表達(dá)或低表達(dá)一種或多種纖維素水解酶；或(3)修飾生物，使得至少一種纖維素水解酶缺失?！昂翘烊淮嬖诘睦w維素酶的”組合物也能夠指調(diào)整天然存在生物的培養(yǎng)條件，使得天然存在生物在非天然條件下生長(zhǎng)，產(chǎn)生水平或比例改變的酶，從而得到的組合物。因此，在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的全纖維素酶制品能夠具有一種或多種缺失和/或過(guò)表達(dá)的EG和/或CBH和/或β-葡萄糖苷酶。在本發(fā)明中，全纖維素酶制品能夠得自任何能夠水解纖維素材料的微生物。在一些實(shí)施例中，全纖維素酶制品是絲狀真菌全纖維素酶。例如，全纖維素酶制品能夠得自支頂孢屬(Acremonium)、曲霉屬(Aspergillus)、裸胞殼屬(Emericella)、鍵抱屬(Fusarium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、毛霉菌屬(Mucor)、毀絲菌屬(Myceliophthora)、脈孢菌屬(Neurospora)、青霉屬(Penicillium)、柱霉屬(Sytalidium)、梭抱殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)或木霉屬(Trichoderma)菌種。全纖維素酶制品是例如棘抱曲霉、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉或米曲霉全纖維素酶。此外,全纖維素酶制品能夠是擬棒座鐮孢菌(Fusarium bactridioides)、小麥鐮孢菌(Fusarium cerealis)、克地鍵抱菌(Fusarium crookwellense)、黃色鍵抱菌(Fusarium cuImorum)、禾谷鍵抱菌(Fusarium graminearum)、禾赤鍵抱菌(Fusarium graminum)、異抱鍵抱菌(Fusariumheterosporum)、荊條鍵抱菌(Fusarium negundi)、尖抱鍵抱菌(Fusarium oxysporum) >多枝鐮孢菌(Fusarium reticulatum)、粉紅鐮孢菌(Fusarium roseum)、接骨木鐮孢菌(Fusarium sambucinum)、膚色鍵抱菌(Fusarium sarcochroum)、擬枝抱鍵抱菌(Fusariumsporotrichioides)、硫色鐮抱菌(Fusarium sulphureum)、簇囊鐮抱菌(Fusariumtorulosum)、擬絲抱鍵抱菌(Fusarium trichothecioides)或毒性鍵抱菌(Fusariumvenenatum)全纖維素酶制品。全纖維素酶制品也能夠是金孢子菌(ChrysosporiumIucknowense)、特異腐質(zhì)霉、綿毛狀腐質(zhì)霉(Humicola lanuginosa)、米赫毛霉(Mucormiehei)、嗜熱毀絲菌、粗糙脈孢菌、產(chǎn)紫青霉(Penicillium purpurogenum)、繩狀青霉、嗜熱革節(jié)孢(Scytalidium thermophilum)或太瑞斯梭孢殼霉全纖維素酶制品。此外，全纖維 長(zhǎng)枝木霉(Trichoderma Iongibrachiatum)、里氏木霉(例如 RL-P37 (Sheir-Neiss G等人，Appl. Microbiol. Biotechnol.(微生物和生物技術(shù)應(yīng)用)1984,20,第 46-53 頁(yè))、QM9414(ATCC No. 26921) ,NRRL 15709,ATCC 13631、56764、56466、56767)或綠色木霉(例如ATCC 32098和32086)全纖維素酶制品。具體地講，全纖維素酶制品能夠合適地為里氏木霉RutC30全纖維素酶制品，該制品以里氏木霉ATCC 56765得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type CultureCollection)。例如，全纖維素酶制品也能夠合適地為繩狀青霉全纖維素酶，該制品以繩狀青霉ATCC No. 10446得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。全纖維素酶制品也能夠從商業(yè)來(lái)源獲得。適用于本發(fā)明方法和組合物的市售纖維素酶制品的實(shí)例包括例如 CELLUCLAST 和 Cellie (Novozymes A/S)和 LAMINEX BG、IndiAge 44L> Primafast 100> Primafast 200> Spezyme CP> Accellerase 1000 和Accellerase 1500 (丹尼斯科美國(guó)有線(xiàn)公司，杰能科(Danisco US. Inc.，Genencor))。合適的全纖維素酶制品能夠使用本領(lǐng)域已知的任何微生物培養(yǎng)方法，尤其是發(fā)酵制備，使能夠水解纖維素材料的酶得到表達(dá)。如本文所用，“發(fā)酵”是指搖瓶培養(yǎng)、小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵，例如在允許纖維素酶和/或受關(guān)注的酶表達(dá)和/或分離的條件下，使用合適的培養(yǎng)基，在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中進(jìn)行的連續(xù)、分批、分批補(bǔ)料或固態(tài)發(fā)酵。一般來(lái)講，在適于產(chǎn)生能夠水解纖維素材料的酶的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。培養(yǎng)使用本領(lǐng)域已知的步驟和變化在合適的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行，所述培養(yǎng)基包含碳源和氮源及無(wú)機(jī)鹽。適于生長(zhǎng)和纖維素酶產(chǎn)生的培養(yǎng)基、溫度范圍和其他條件是本領(lǐng)域已知的。作為非限制性實(shí)例，通過(guò)里氏木霉產(chǎn)生纖維素酶的典型溫度范圍為24°C至28°C。通過(guò)發(fā)酵制備全纖維素酶制品后，即能夠按原樣使用，不需要回收和/或純化或只需要最低程度地回收和/或純化。例如，一旦纖維素酶分泌至細(xì)胞培養(yǎng)基中，即能夠直接使用包含纖維素酶的細(xì)胞培養(yǎng)基。全纖維素酶制品能夠包含未分離的發(fā)酵材料內(nèi)容物，其包括用過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)基、胞外酶和細(xì)胞。在另一個(gè)方面，全纖維素酶制品也能夠經(jīng)過(guò)多個(gè)常規(guī)步驟，例如沉淀、離心、親和色譜、過(guò)濾等等進(jìn)一步處理。例如，全纖維素酶制品能夠濃縮后直接使用無(wú)需進(jìn)一步純化。例如，全纖維素酶制品能夠配制為包含發(fā)酵后降低細(xì)胞活力或殺死細(xì)胞的某些化學(xué)試劑。例如，能夠使用本領(lǐng)域已知的方法裂解或透化細(xì)胞。全纖維素酶制品的內(nèi)切葡聚糖酶活性能夠使用羧甲基纖維素(CMC)作為底物測(cè)定。合適的測(cè)定法測(cè)量酶混合物對(duì)CMC作用產(chǎn)生的還原末端，其中I個(gè)單位為釋放I μ moL產(chǎn)物 /min 的酶量(Ghose, T. K. ,Pure & Appl. Chem.(純粹與應(yīng)用化學(xué))1987，59，第 257-268頁(yè))。全纖維素酶能夠是富含葡萄糖苷酶的纖維素酶。富含葡萄糖苷酶的全纖維素酶通常包含葡萄糖苷酶和全纖維素酶制品。富含葡萄糖苷酶的全纖維素酶組合物能夠通過(guò)重組方法制備。例如，此類(lèi)全纖維素酶制品能夠在能夠產(chǎn)生全纖維素酶的微生物中表達(dá)葡萄糖苷酶來(lái)獲得。例如，富含葡萄糖苷酶的全纖維素酶組合物也能夠包含全纖維素酶制品和葡萄糖苷酶。例如，富含葡萄糖苷酶的全纖維素酶制品能夠合適地包含基于該共混物/組合物中蛋白質(zhì)的總重量計(jì)至少5重量％、7重量％、10重量％、15重量％或20重量％以及至多25重量％、30重量％、35重量％、40重量％或50重量％的葡萄糖苷酶。
在某些方面，合適的全纖維素酶能夠從經(jīng)遺傳工程改造而減少或消除保持型β -木糖苷酶活性的微生物獲得。在其他方面，合適的全纖維素酶能夠從經(jīng)遺傳工程改造而增加翻轉(zhuǎn)型β_木糖苷酶活性的微生物獲得。在另外方面，合適的全纖維素酶能夠從經(jīng)遺傳工程改造而不僅減少或消除保持型木糖苷酶活性，而且增加翻轉(zhuǎn)型木糖苷酶活性的微生物獲得。例如，全纖維素酶能夠合適地從經(jīng)工程改造而使得天然bxll基因缺失的里氏木霉獲得。在另一個(gè)實(shí)例中，全纖維素酶能夠合適地從經(jīng)工程改造而重組表達(dá)具有翻轉(zhuǎn)型β_木糖苷酶活性的酶的里氏木霉獲得。在另一個(gè)實(shí)例中，全纖維素酶能夠合適地從經(jīng)工程改造而使其天然bxll基因缺失，并且重組表達(dá)具有翻轉(zhuǎn)型β -木糖苷酶活性的酶的里氏木霉獲得。具有翻轉(zhuǎn)型β_木糖苷酶活性的酶的實(shí)例包括但不限于Fv43D和本文第
6.4節(jié)中所述的其他酶。β -木糖苷酶活性能夠通過(guò)測(cè)量人工底物對(duì)硝基苯基-吡喃木糖苷的水解水平來(lái)確定。在反應(yīng)進(jìn)程期間，水解反應(yīng)能夠使用1H-NMR分析來(lái)跟蹤。產(chǎn)生糖苷鍵還原末端的殘基異頭質(zhì)子根據(jù)其直立或平伏取向的不同而具有不同的化學(xué)位移，正如水解后新形成的還原糖的異頭質(zhì)子一樣。與水解反應(yīng)相比，新形成的還原糖異頭質(zhì)子變旋為直立和平伏形式的平衡混合物更慢。因此，對(duì)最初形成的還原末端異頭質(zhì)子的取向與底物中存在的形式進(jìn)行比較的1H-NMR測(cè)定是保持構(gòu)型的機(jī)制相比于翻轉(zhuǎn)構(gòu)型的機(jī)制的測(cè)定法。實(shí)驗(yàn)方法在以下文獻(xiàn)中有所描述例如Pauly等人，1999, Glycobiology (糖生物學(xué)v43D) 9 :93_100。作為另外一種選擇，水解的水平能夠通過(guò)鑒定保持型酶的轉(zhuǎn)糖基酶活性來(lái)確定，翻轉(zhuǎn)型酶中不存在該活性。此類(lèi)測(cè)定的實(shí)例在圖16中示出。木二糖或木糖低聚物在保持型酶(例如MultifectK'木聚糖酶或Fv3A)的存在下顯示出，EXP/木糖快速增加至在EtOH的存在下平衡比的7至8倍，然后EXP/木糖回落至平衡比。就翻轉(zhuǎn)型酶(例如Fv43D)來(lái)說(shuō)，在相同的條件下，EXP/木糖單調(diào)增加至平衡比。6. 3. 2.半纖維素酶多種真菌和細(xì)菌能夠通過(guò)酶法水解半纖維素。與纖維素降解類(lèi)似，半纖維素水解涉及多種酶的協(xié)同作用。半纖維素酶通常分為三大類(lèi)攻擊多糖鏈內(nèi)部化學(xué)鍵的內(nèi)切作用酶，從多糖鏈的還原或非還原末端向前作用的外切作用酶，以及水解木質(zhì)素糖苷鍵的輔助酶、乙酰酯酶和/或酯酶。酯酶的實(shí)例能夠包括香豆酸酯酶和阿魏酸酯酶(Wong等人，1988, Microbiol. Rev.(微生物學(xué)評(píng)論)52 :305-317 ；Tenkanen 和 Poutanen, 1992,“Significance of esterases in the degradation of xylans”(酯酶在木聚糖降解中的重要意義)，Xylans and Xylanases (木聚糖和木聚糖酶)，Visser等人編輯，Elsevier,New York, N. Y.,第 203-212 頁(yè)；Cough I an 和 Hazlewood, 1993, “Hemicellulose andhemicellulases”(半纖維素和半纖維素酶)，Portland, London, UK ;Brigham 等人，1996，iiHemicellulases!Diversity and applications”(半纖維素酶多樣性和應(yīng)用),Handbookon Bioethanol:Production and Utilization (生物乙醇手冊(cè)生產(chǎn)和利用)，Wyman 編輯，Taylor & Francis, Washington, D. C.,第 119-141 頁(yè))。用于本發(fā)明組合物和/或方法的合適的半纖維素酶包括例如木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、葡糖醛酸酶、內(nèi)切半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、內(nèi)切或外切阿拉伯糖酶、外切半乳聚糖酶、以及它們的混合物。內(nèi)切作用半纖維素酶和輔助酶的實(shí)例包括但不限于內(nèi)切阿拉伯聚糖酶、內(nèi)切阿拉伯糖半乳聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、內(nèi)切甘露聚糖酶 、內(nèi)切木聚糖酶、和阿魏酰阿糖基木聚糖內(nèi)切木聚糖酶。外切作用半纖維素酶和輔助酶的實(shí)例包括但不限于a-L-阿拉伯糖苷酶、β-L-阿拉伯糖苷酶、a-l，2_L-巖藻糖苷酶、a-D-半乳糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、β-D-葡萄糖苷酶、β-D-葡糖醛酸酶、β-D-甘露糖苷酶、β -D-木糖苷酶、外切葡萄糖苷酶、外切纖維二糖水解酶、外切甘露二糖水解酶、外切甘露聚糖酶、外切木聚糖酶、木聚糖α-葡糖醛酸酶和松柏苷β-葡萄糖苷酶。酯酶的實(shí)例包括但不限于乙酰酯酶(乙酰半乳聚糖酯酶、乙酰甘露聚糖酯酶和乙酰木聚糖酯酶)和芳基酯酶(香豆酸酯酶和阿魏酸酯酶)。在某些方面，半纖維素酶是外切作用半纖維素酶。優(yōu)選地，外切作用半纖維素酶具有在酸性條件下，例如等于或低于PH 7時(shí)水解半纖維素的能力。在某些方面，半纖維素酶以有效量加入。例如，半纖維素酶以相對(duì)于完全發(fā)酵培養(yǎng)基中固體重量的約O. 001重量％或更多、約O. 002重量％或更多、約O. 0025重量％或更多、約O. 005重量％或更多、或約O. 01重量％或更多的量加入本發(fā)明的多酶共混物中。在另一個(gè)實(shí)例中，半纖維素酶以相對(duì)于完全發(fā)酵培養(yǎng)基中固體重量的約O. 001重量％至約5. O重量％，例如約0. 025重量％至約4. O重量％、約0. 005重量％至約2. O重量％的量加入本發(fā)明的多酶共混物中。6. 3. 2. L 木聚糖酶本發(fā)明的酶共混物任選地包含一種或多種木聚糖酶。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“木聚糖酶”是指歸為或歸入EC 3. 2. I. 8的任何木聚糖酶。合適的木聚糖酶包括例如解糖熱纖維菌(Caldocellum saccharoIvticum)木聚糖酶(Luthi 等人，1990, Appl. Environ. Microbiol.(微生物學(xué)應(yīng)用和環(huán)境)56 (9) :2677-2683),海棲熱袍菌木聚糖酶(Winterhalter和Liebel, 1995,Appl. Environ. Microbiol.(微生物學(xué)應(yīng)用和環(huán)境)61 (5) 1810 - 1815)、棲熱袍菌屬(Thermatoga Sp.)菌株 FJSS-B. I 木聚糖酶(Simpson 等人，1991, Biochem. J.(生物化學(xué)期刊)277,413-417)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)木聚糖酶(BcX)(美國(guó)專(zhuān)利5，405, 769)、黑曲霉木聚糖酶(Kinoshita等人，1995, J. Ferment. Bioeng.(發(fā)酵生物工程)79(5) :422_428)、淺青紫鏈霉菌(Streptomyces Iividans)木聚糖酶(Shareck 等人，1991，Gene (基因)107 :75-82 ；Morosoli 等人，1986，Biochem. J.(生物化學(xué)期刊)239 587-592 ；Kluepfel 等人，1990, Biochem. J.(生物化學(xué)期刊)287 :45_50)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)木聚糖酶(Bernier 等人，1983, Gene(基因)26 (I) 59 - 65)、幾肥纖維單胞菌(Cellulomonas fimi)木聚糖酶(Clarke 等人，1996,FEMS Microbiol. Lett. (FEMS微生物學(xué)報(bào))139 :27_35)、突光假單胞菌(Pseudomonas fIuorescens)木聚糖酶(Gilbert等人，1988，J. Gen. Microbiol.(普通微生物學(xué)期刊)134 :3239_3247)、熱纖梭菌木聚糖酶(Dominguez 等人，1995, Nat. Struct. Biol.(自然結(jié)構(gòu)生物學(xué))2 (7) :569_76)、短小芽抱桿菌(Bacillus pumilus)木聚糖酶(Nuyens 等人，2001, Appl. Microbiol. Biotech.(微生物和生物技術(shù)應(yīng)用)56 :431-434 ;Yang 等人，1988，Nucleic Acids Res.(核酸評(píng)論)16 (14B)7187)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)P262 木聚糖酶(Zappe 等人，1990,Nucleic Acids Res.(核酸評(píng)論)18 (8) :2179)或哈茨木霉木聚糖酶(Rose等人，1987,J. Mol. Biol.(分子生物學(xué)期刊)194(4) :755756)。木聚糖酶能夠合適地得自許多來(lái)源，包括例如真菌和細(xì)菌生物體，例如曲霉屬、 雙側(cè)孢霉屬(Disporotrichum)、青霉屬、脈孢菌屬、鐮孢屬、木霉屬、腐質(zhì)霉屬、嗜熱真菌屬(Thermomyces)和芽孢桿菌屬。某些可商購(gòu)獲得的包含木聚糖酶的制品也能夠用于本
發(fā)明的組合物和方法；那些制品包括Multifeet 木聚糖酶、Laminex BG和SpezymeR
CP (Danisco US, Genencor)以及Celiuclasl^ iWiscozyme* (Novozymes A/S)。在某些方面，木聚糖酶不具有保持型β -木糖苷酶活性和/或翻轉(zhuǎn)型木糖苷酶活性。酶能夠如上述第6. 3. I. 5節(jié)中所述測(cè)試保持與翻轉(zhuǎn)活性。6. 3. 2. 2. β -木糖苷酶本發(fā)明的酶共混物任選地包含一種或多種β -木糖苷酶。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“β-木糖苷酶”是指歸為或歸入EC 3. 2. 1.37的任何β-木糖苷酶。合適的β-木糖苷酶包括例如埃默森籃狀菌Bxll (Reen等人，2003，Biochem.Biophys. Res.(生物化學(xué)和生物物理學(xué)雜志)Commun.(交流)305 (3) :579-85);以及得自如下的β _木糖苷酶嗜熱脂肪芽抱桿菌(Geobacillus stearothermophilus) (Shallom等人，2005, Biochem.(生物化學(xué))44 :387-397),嗜熱革節(jié)孢(Zanoelo 等人，2004,J. Ind. Microbiol. Biotechnol.(工業(yè)微生物和生物技術(shù)期刊)31 :170_176)、木素木霉(Trichoderma lignorum) (Schmidt, 1988, Methods EnzymoI.(酶學(xué)方法)160 :662_671)、泡盛曲霉(Kurakake等人,2005, Biochim. Biophys. Acta (生物化學(xué)和生物物理學(xué)匯編)1726 :272_279)、雜色曲霉(Aspergillus versicolor) (Andrade 等人，Process Biochem.
(生物化學(xué)進(jìn)展)39 :1931-1938)、鏈霉菌屬(Streptomyces sp.) (Pinphanichakarn 等人，2004，World J. Microbiol. Biotechnol.(微生物和生物技術(shù)世界期刊)20 :727_733)、海棲熱袍菌(Xue 和 Shao，2004，Biotechnol. Lett.(生物技術(shù)學(xué)報(bào))26 :1511_1515)、木霉屬 SY(Kim 等人，2004，J. Microbiol. Biotechnol.(微生物和生物技術(shù)期刊)14 :643_645)、黑曲霉(Oguntimein 和 Reilly, 1980, Biotechnol. Bioeng.(生物技術(shù)和生物工程)22 :1143_1154)、或渥曼青霉(Penicillium wortmanni) (Matsuo 等人，1987,Agric. Biol. Chem.(農(nóng)業(yè)和生物化學(xué))51 :2367-2379)。在某些方面，β-木糖苷酶不具有保持型β-木糖苷酶活性。在其他方面，β-木糖苷酶具有翻轉(zhuǎn)型β-木糖苷酶活性。在另外方面，β-木糖苷酶不具有保持型β-木糖苷酶活性，但具有翻轉(zhuǎn)型β_木糖苷酶活性。酶能夠如上述第6. 3. I. 5節(jié)中所述測(cè)試保持與翻轉(zhuǎn)活性。 6. 3. 2. 3. L- g -阿柃伯呋喃糠苷酶本發(fā)明的酶共混物任選地包含一種或多種L-α -阿拉伯呋喃糖苷酶。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“L-a-阿拉伯呋喃糖苷酶”是指歸為或歸入EC3. 2. 1.55的任何酶。合適的L-a -阿拉伯呋喃糖苷酶能夠得自例如米曲霉(Numan和Bhosle，2006，J. Ind. Microbiol. Biotechnol.(工業(yè)微生物和生物技術(shù)期刊)33 :247_260)、醬油曲霉(Aspergillus sojae) (Oshima 等人，2005，J. Appl. Glycosci.(糖科學(xué)應(yīng)用期干丨J) 52 261-265)、短芽抱桿菌(Bacillus brevis) (Numan 和 Bhosle，2006，J. Ind. Microbiol.Biotechnol.(工業(yè)微生物和生物技術(shù)期刊)33 :247_260)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Kim等人，2004，J. Microbiol. Biotechnol.(微生物和生物技術(shù)期刊)14 :474_482)、短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve) (Shin 等人，2003，Appl. Environ. Microbiol.(微生物學(xué)應(yīng)用 和環(huán)境)69 :7116_7123)、長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacterium longum) (Margolles 等人，2003，Appl. Environ. Microbiol.(微生物學(xué)應(yīng)用和環(huán)境)69 :5096-5103)、熱纖梭菌(Taylor 等人，2006，Biochem. J.(生物化學(xué)期刊)395 :31_37)、尖孢鐮孢菌(Panagiotou 等人，2003，Can. J. Microbiol.(加拿大微生物學(xué)期刊)49 :639_644)、尖孢鐮孢菌石竹專(zhuān)化型(Fusariumoxysporum f. sp. dianthi) (Numan 和 Bhosle，2006，J. Ind. Microbiol. Biotechnol.(工業(yè)微生物和生物技術(shù)期刊)33 :247-260)、嗜熱脂肪芽孢桿菌T-6 (Shallom等人，2002，J. Biol. Chem.(生物化學(xué)期刊)277 :43667_43673)、多棱大麥(Hordeum vulgare) (Lee 等人，2003，J. Biol. Chem.(生物化學(xué)期刊)278 :5377_5387)、產(chǎn)黃青霉(Sakamoto 等人，2003，Biophys. Acta(生物物理學(xué)匯編)1621 :204_210)、青霉屬(Penicillium sp.) (Rahman 等人，2003, Can. J. Microbiol.(加拿大微生物學(xué)期刊)49 :58_64)、纖維素假單胞菌(Pseudomonascellulosa) (Numan 和 Bhosle，2006，J. Ind. Microbiol. Biotechnol.(工業(yè)微生物和生物技術(shù)期刊)33 :247_260)、微小根毛霉(Rahman等人，2003，Carbohydr. Res.(徑研究)338 :1469-1476)、教酒鏈霉菌(Streptomyces chartreusis) (Numan 和 Bhosle，2006，J. Ind. Microbiol. Biotechnol.(工業(yè)微生物和生物技術(shù)期刊)33 :247_260)、熱紫鏈霉菌(Streptomyces thermoviolacus) (Numan 和 Bhosle，2006，J. Ind. Microbiol. Biotechnol.
(工業(yè)微生物和生物技術(shù)期刊)33 :247-260)、嗜熱厭氧乙醇桿菌(Thermoanaerobacterethanolicus) (Numan 和 Bhosle，2006，J. Ind. Microbiol. Biotechnol.(工業(yè)微生物和生物技術(shù)期刊)33 :247_260)、解木聚糖熱桿菌(Thermobacillus xylanilyticus)(Numan 和 Bhosle，2006，J. Ind. Microbiol. Biotechnol.(工業(yè)微生物和生物技術(shù)期刊)33 :247_260)、褐色高溫單抱菌(Thermomonospora fusca) (Tuncer 和 Ball，2003，F(xiàn)oliaMicrobiol. (Praha)(微生物薄冊(cè)(布拉格))48 :168_172)、海棲熱袍菌(Miyazaki,2005，Extremophiles (極端生物)9 :399_406)、木霉屬 SY (Jung 等人，2005，Agric. Chem.Biotechnol.(農(nóng)業(yè)化學(xué)和生物技術(shù))48 :7_10)、白曲霉(Koseki 等人，2006，Biochim.Biophys. Acta (生物化學(xué)和生物物理學(xué)匯編)1760 :1458-1464)、尖孢鐮孢菌石竹專(zhuān)化型(Chacon-Martinez 等人，2004，Physiol. Mol. Plant Pathol.(生理分子學(xué)植物病理學(xué))64 201-208)、解木聚糖熱桿菌(Debeche 等人，2002，Protein Eng.(蛋白質(zhì)工程)15 :21_28)、特異腐質(zhì)霉(Sorensen等人，2007，Biotechnol. Prog.(生物技術(shù)進(jìn)展)23 :100_107)、大型亞灰樹(shù)花菌(Meripilus giganteus) (Sorensen 等人，2OO7, Biotechnol. Prog.(生物技術(shù)進(jìn)展)23 :100-107)、或蘿卜(Raphanus sativus) (Kotake 等人,2006，J. Exp. Bot. 57 2353-2362)。在某些方面，L-α-阿拉伯呋喃糖苷酶不具有保持型β-木糖苷酶活性。在其他方面，L- a -阿拉伯呋喃糖苷酶具有翻轉(zhuǎn)型β -木糖苷酶活性。在另外方面，L- a -阿拉伯呋喃糖苷酶不具有保持型β-木糖苷酶，但具有翻轉(zhuǎn)型β-木糖苷酶活性。酶能夠如上述第6. 3. I. 5節(jié)中所述測(cè)試保持與翻轉(zhuǎn)活性。6.3.3.輔助蛋白質(zhì) 許多具有纖維分解增強(qiáng)活性的多肽也能夠與上述酶和/或纖維分解蛋白質(zhì)共同使用，以進(jìn)一步降解生物質(zhì)底物的纖維素組分(參見(jiàn)例如Brigham等人，1995, Handbook onBioethanol (生物乙醇手冊(cè))(Charles E.Wyman 編輯)，第 119-141 頁(yè)，Taylor & Francis,Washington D. C. ；Lee, 1997, J. Biotechnol.(生物技術(shù)進(jìn)展)56 :1-24)。此類(lèi)具有纖維分解增強(qiáng)活性的多肽和纖維分解蛋白質(zhì)的最佳用量取決于多種因素，包括但不限于組分纖維分解蛋白質(zhì)的具體混合物、纖維質(zhì)底物、纖維質(zhì)底物的濃度、纖維質(zhì)底物的預(yù)處理、溫度、時(shí)間和pH、以及發(fā)酵生物的性質(zhì)。本發(fā)明的酶共混物/組合物能夠例如合適地進(jìn)一步包含一種或多種輔助蛋白質(zhì)。輔助蛋白質(zhì)的實(shí)例包括但不限于甘露聚糖酶(例如內(nèi)切甘露聚糖酶、外切甘露聚糖酶、和β-甘露糖苷酶)、半乳聚糖酶(例如內(nèi)切和外切半乳聚糖酶)、阿拉伯糖酶(例如內(nèi)切阿拉伯糖酶和外切阿拉伯糖酶)、木質(zhì)酶、淀粉酶、葡糖醛酸酶、蛋白酶、酯酶(例如阿魏酸酯酶、乙酰木聚糖酯酶、香豆酸酯酶或果膠甲基酯酶)、脂肪酶、糖苷水解酶家族61多肽、木葡聚糖酶、CIPU CIP2、膨脹因子、擴(kuò)展蛋白、和纖維素破壞蛋白。輔助蛋白質(zhì)的實(shí)例也能夠包括CIPl樣蛋白、CIP2樣蛋白、纖維二糖脫氫酶和錳過(guò)氧化物酶。在特定實(shí)施例中，纖維素破壞蛋白是纖維素結(jié)合模塊。
_9] 6. 4具有翻轉(zhuǎn)型g -木糖苷酶活性的酶根據(jù)本發(fā)明，具有翻轉(zhuǎn)型β -木糖苷酶活性的酶用于減少SSF反應(yīng)中AXP(如EXP)形成。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含至少一種翻轉(zhuǎn)型β-木糖苷酶多肽的組合物。在另一方面，本發(fā)明涉及在SSF反應(yīng)中產(chǎn)生所需發(fā)酵產(chǎn)物的方法，該方法包括培養(yǎng)完全發(fā)酵培養(yǎng)基，所述完全發(fā)酵培養(yǎng)基包含至少一種翻轉(zhuǎn)型β-木糖苷酶多肽。合適的翻轉(zhuǎn)型β-木糖苷酶多肽能夠選自作為糖苷水解酶家族43(“GH43”)成員的那些多肽。GH43家族酶具有許多已知活性。例如，GH43家族酶能夠是歸入EC 3.2.1.55的酶，并且能夠具有L-α-阿拉伯呋喃糖苷酶活性。在另一個(gè)實(shí)例中，GH43家族酶能夠是歸入EC 3. 2. I. 99的酶，并且能夠具有內(nèi)切阿拉伯聚糖酶活性。在另一個(gè)實(shí)例中，GH43家族酶能夠歸入EC 3. 2. I. 145，并且能夠具有半乳聚糖1，3-β -半乳糖苷酶活性。在其他實(shí)例中，GH43家族酶能夠歸入EC 3. 2. I. 37，并且能夠具有β -木糖苷酶活性。雖然GH43家族β -木糖苷酶(例如上述那些酶)通常僅能夠進(jìn)行翻轉(zhuǎn)水解，但與此相反，據(jù)報(bào)道得自GH3、-39、-52、和-54家族的各種β -木糖苷酶具有保持活性，并且能夠同時(shí)進(jìn)行水解和轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)。(Smaali等人,2006, Appl. Microbiol. Biotechnol.(微生物和生物技術(shù)應(yīng)用)73 :582-590)。GH43家族酶通常顯示出五葉β -螺旋槳三維構(gòu)象。結(jié)構(gòu)的“螺旋槳”部分基于包括四股β-折疊的“葉片”樣構(gòu)象的五倍重復(fù)。廣義催化堿天冬氨酸鹽、廣義催化酸谷氨酸鹽、調(diào)節(jié)廣義堿pKa的天冬氨酸殘基通過(guò)纖維弧菌(Cellvibrio japonicus) CjArb43A,的晶體結(jié)構(gòu)鑒定，并且通過(guò)定點(diǎn)誘變確認(rèn)(參見(jiàn)Nurizzo等人,2002, Nat. Struct. Biol.(生物學(xué)自然結(jié)構(gòu))9 (9) 665-8 )。催化殘基被布置在三個(gè)保守區(qū)，這些保守區(qū)廣泛分布于氨基酸序列中(Pons 等人，2004, Proteins: Structure, Function and Bioinformatics (蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能和生物信息學(xué))54 :424-432)。對(duì)于GH43家族β -木糖苷酶，預(yù)測(cè)的催化殘基在圖32的序列中以黑體和下劃線(xiàn)字體示出。嗜熱脂肪芽孢桿菌木糖苷酶的晶體結(jié)構(gòu)(Brux等人，2006，J. Mol. Bio.(分子生物期刊)359 :97-109)表明多個(gè)附加殘基對(duì)于該酶的底物結(jié)合可能是重要的。如上述第6. 3. I. 5節(jié)中所述，翻轉(zhuǎn)型β-木糖苷酶活性能夠通過(guò)合適的測(cè)定法測(cè)定。因此，在某些方面，本文中具有翻轉(zhuǎn)型β-木糖苷酶活性的酶是GH43家族成員。例如，所述酶是 Fv43D, Pf43A, Fv43E, Fv43B, Af43A, Fo43A, Gz43A,或 XynB3 多肽。此類(lèi)多肽如 下所述。6. 4. L Fv43D 多狀在某些實(shí)施例中，具有翻轉(zhuǎn)型β -木糖苷酶活性的酶是Fv43D多肽。Fv43D的氨基酸序列(SEQ ID NO: 2)在圖19B和圖32的第一行示出。SEQ ID NO: 2是未成熟的Fv43D序列。Fv43D具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:2第I至20位殘基的預(yù)測(cè)信號(hào)序列(在圖19B中標(biāo)有下劃線(xiàn));信號(hào)序列的剪切預(yù)計(jì)會(huì)產(chǎn)生成熟蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:2第21至350位殘基的序列。在圖19B中預(yù)測(cè)保守域殘基以黑體表示。已在使用對(duì)硝基苯基-β-吡喃木糖苷、木二糖或混合的線(xiàn)性木聚糖低聚物作為底物的測(cè)定中，證明Fv43D具有β -木糖苷酶活性。預(yù)測(cè)的催化殘基為D37或D71、D155、和Ε251。如本文所用，“Fv43D多肽”是指包含與SEQ ID NO:2第21至350位殘基中的至少50，例如至少75、100、125、150、175、200、250、300、或320個(gè)連續(xù)氨基酸殘基具有至少85%，例如至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 序列同一性的序列的多肽和/或其變體。與天然Fv43D相比，F(xiàn)v43D多肽的D37或D71、D155、和E251殘基優(yōu)選地是未改變的。Fv43D多肽優(yōu)選地至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、或99%的氨基酸殘基是未改變的，所述殘基對(duì)于Fv43D，F(xiàn)o43A, Gz43A, Pf43A, Fv43A, Fv43B, Af43A, Pf43B,和Fv43E，中的兩個(gè)或更多個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)、四個(gè)或更多個(gè)、五個(gè)或更多個(gè)、六個(gè)或更多個(gè)、七個(gè)或更多個(gè)、八個(gè)或更多個(gè)、或全部九個(gè)是保守的，如圖32的比對(duì)所示。如圖19B所示，F(xiàn)v43D多肽合適地包含天然Fv43D的整個(gè)預(yù)測(cè)保守域。本發(fā)明的示例性Fv43D多肽包含與圖19B所示的成熟Fv43D序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%同一性的序列。本發(fā)明的Fv43D多肽合適地具有β -木糖苷酶活性。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的Fv43D多肽具有翻轉(zhuǎn)型β -木糖苷酶活性。6. 4. 2. Pf43A 多肽在某些實(shí)施例中，具有翻轉(zhuǎn)型β -木糖苷酶活性的酶是Pf43A多肽。Pf43A的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)在圖22B和圖32的第四行示出。SEQ ID NO: 8是未成熟的Pf43A序列。Pf43A具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:8第I至20位殘基的預(yù)測(cè)信號(hào)序列(在圖22B中標(biāo)有下劃線(xiàn));信號(hào)序列的剪切預(yù)計(jì)會(huì)產(chǎn)生成熟蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:8第21至445位殘基的序列。在圖22B中預(yù)測(cè)催化域殘基以黑體表示，預(yù)測(cè)碳水化合物結(jié)合域殘基以大寫(xiě)字母表示，并且分隔催化域和碳水化合物結(jié)合域的預(yù)測(cè)接頭殘基以斜體表示。已在使用對(duì)硝基苯基- β -吡喃木糖苷、木二糖或混合的線(xiàn)性木聚糖低聚物作為底物的測(cè)定中，證明Pf43A具有β-木糖苷酶活性。預(yù)測(cè)的催化殘基為D32或D60、D145、和Ε196。如本文所用，“Pf43A多肽”是指包含與SEQ ID NO:8第21至445位殘基中的至少50，例如至少75、100、125、150、175、200、250、300、350、或400個(gè)連續(xù)氨基酸殘基具有至少85%,例如至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 序列同一性的序列的多肽和/或其變體。與天然Pf43A相比，Pf43A多肽的D32或D60、D145、和E196殘基優(yōu)選地是未改變的。Pf43A多肽優(yōu)選地至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、或99%的氨基酸殘基是未改變的，所述殘基對(duì)于Fv43D，F(xiàn)o43A, Gz43A, Pf43A, Fv43A, Fv43B, Af43A, Pf43B,和Fv43E，中的兩個(gè)或更多個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)、四個(gè)或更多個(gè)、五個(gè)或更多個(gè)、六個(gè)或更多個(gè)、七個(gè)或更多個(gè)、八個(gè)或更多個(gè)、或全部九個(gè)是保守的，如圖32的比對(duì)所示。如圖22B所示，Pf43A多肽合適地包含天然Pf43A的整個(gè)預(yù)測(cè)保守域。本發(fā)明的示例性Pf43A多肽包含與圖22B所示的成熟Pf43A序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%同一性的序列。本發(fā)明的Pf43A多肽合適地具有β-木糖苷酶活性。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的Pf 43Α多肽具有翻轉(zhuǎn)型β-木糖苷酶活性。6. 4. 3. Fv43E 多狀在某些實(shí)施例中，具有翻轉(zhuǎn)型β -木糖苷酶活性的酶是Fv43E多肽。Fv43E的氨基酸序列(SEQ ID NO: 10)在圖23B和圖32的第九行示出。SEQ ID NO: 10是未成熟的Fv43E序列。Fv43E具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 10第I至18位殘基的預(yù)測(cè)信號(hào)序列(在圖23B中標(biāo)有下劃線(xiàn))；信號(hào)序列的剪切預(yù)計(jì)會(huì)產(chǎn)生成熟蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 10第19至530位殘基的序列。在圖23B中預(yù)測(cè)催化域殘基以黑體表示。已在使用對(duì)硝基苯基- β -吡喃木糖苷、木二糖和混合的線(xiàn)性木聚糖低聚物作為底物的測(cè)定中，證明Fv43E具有β-木糖苷酶活性。預(yù)測(cè)的催化殘基為D40或D71、D155、和Ε242。如本文所用，“Fv43E多肽”是指包含與SEQ ID NO: 10第19至530位殘基中的至少50，例如至少 75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、或 500 個(gè)連續(xù)氨基酸殘基具有至少 85%，例如至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列同一性的序列的多肽和/或其變體。與天然Fv43E相比，F(xiàn)v43E多肽的D40或D71、D155、和E242殘基優(yōu)選地是未改變的。Fv43E多肽優(yōu)選地至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、或99%的氨基酸殘基是未改變的，所述殘基對(duì)于Fv43D，F(xiàn)o43A, Gz43A, Pf43A, Fv43
A,Fv43B, Af43A, Pf43B,和Fv43E，中的兩個(gè)或更多個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)、四個(gè)或更多個(gè)、五個(gè)或更多個(gè)、六個(gè)或更多個(gè)、七個(gè)或更多個(gè)、八個(gè)或更多個(gè)、或全部九個(gè)是保守的，如圖32的比對(duì)所示。如圖23B所示，F(xiàn)v43E多肽合適地包含天然Fv43E的整個(gè)預(yù)測(cè)保守域。本發(fā)明的示例性Fv43E多肽包含與圖23B所示的成熟Fv43E序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 同一性的序列。本發(fā)明的 Fv43E 多肽合適地具有β_木糖苷酶活性。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的Fv43E多肽具有翻轉(zhuǎn)型β-木糖苷酶活性。6. 4. 4. Fv43B 多肽
在某些實(shí)施例中，具有翻轉(zhuǎn)型β -木糖苷酶活性的酶是Fv43B多肽。Fv43B的氨基酸序列(SEQ ID NO: 12)在圖24B和圖32的第六行示出。SEQ ID NO: 12是未成熟的Fv43B序列。Fv43B具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 12第I至16位殘基的預(yù)測(cè)信號(hào)序列(在圖24B中標(biāo)有下劃線(xiàn));信號(hào)序列的剪切預(yù)計(jì)會(huì)產(chǎn)生成熟蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:12第17至574位殘基的序列。在圖24B中預(yù)測(cè)催化域殘基以黑體表示。已在使用對(duì)硝基苯基-β-吡喃木糖苷和/或?qū)ο趸交?a -L-阿拉伯呋喃糖苷作為底物的測(cè)定中，證明Fv43B同時(shí)具有β_木糖苷酶和L-α-阿拉伯呋喃糖苷酶活性。研究表明，其使支鏈阿拉伯木聚糖低聚物釋放出阿拉伯糖，并且在其他木糖苷酶的存在下使低聚物混合物釋放的木糖增加。預(yù)測(cè)的催化殘基為D38或D68、D151、和E236。如本文所用，“Fv43B多肽”是指包含與SEQ ID NO: 12第17至472位殘基中的至少50，例如至少 75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、或 550 個(gè)連續(xù)氨基酸殘基具有至少 85%，例如至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列同一性的序列的多肽和/或其變體。與天然Fv43B相比，F(xiàn)v43B多肽的D38或D68、D151、和E236殘基優(yōu)選地是未改變的。Fv43B多肽優(yōu)選地至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、或99%的氨基酸殘基是未改變的，所述殘基對(duì)于Fv43D，F(xiàn)o43A, Gz43A, Pf43A,Fv43A, Fv43B, Af43A, Pf43B,和Fv43E，中的兩個(gè)或更多個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)、四個(gè)或更多個(gè)、五個(gè)或更多個(gè)、六個(gè)或更多個(gè)、七個(gè)或更多個(gè)、八個(gè)或更多個(gè)、或全部九個(gè)是保守的，如圖32的比對(duì)所示。如圖24B所示，F(xiàn)v43B多肽合適地包含天然Fv43B的整個(gè)預(yù)測(cè)保守域。本發(fā)明的示例性Fv43B多肽包含與圖24B所示的成熟Fv43B序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、·90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 同一性的序列。本發(fā)明的 Fv43B 多肽合適地具有β_木糖苷酶活性。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的Fv43B多肽具有翻轉(zhuǎn)型β-木糖苷酶活性。6. 4. 5. Af43A 多狀在某些實(shí)施例中，具有翻轉(zhuǎn)型β -木糖苷酶活性的酶是Af43A多肽。Af43A的氨基酸序列(SEQ ID NO: 14)在圖25B和圖32的第七行示出。SEQ ID NO: 14是未成熟的Af43A序列。在圖25B中預(yù)測(cè)保守域殘基以黑體表示。已在使用對(duì)硝基苯基-a -L-阿拉伯呋喃糖苷的測(cè)定中，證明Af43A具有L- a -阿拉伯呋喃糖苷酶活性，并且通過(guò)對(duì)內(nèi)切木聚糖酶的作用產(chǎn)生的一組低聚物進(jìn)行轉(zhuǎn)化進(jìn)而釋放出阿拉伯糖也證明了這一點(diǎn)。預(yù)測(cè)的催化殘基為D26 或 D58、D139、和 E227。如本文所用，“Af43A多肽”是指包含與SEQ ID NO: 14的至少50，例如至少75、100、125、150、175、200、250、或300個(gè)連續(xù)氨基酸殘基具有至少85%，例如至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 序列同一性的序列的多肽和 /或其變體。與天然Af43A相比，Af43A多肽的D26或D58、D139、和E227殘基優(yōu)選地是未改變的。Af43A多肽優(yōu)選地至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、或99%的氨基酸殘基是未改變的，所述殘基對(duì)于 Fv43D, Fo43A, Gz43A, Pf43A, Fv43A, Fv43B, Af43A, Pf43B,和 Fv43E,中的兩個(gè)或更多個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)、四個(gè)或更多個(gè)、五個(gè)或更多個(gè)、六個(gè)或更多個(gè)、七個(gè)或更多個(gè)、八個(gè)或更多個(gè)、或全部九個(gè)是保守的，如圖32的比對(duì)所示。如圖25B所示，Af43A多肽合適地包含天然Af43A的整個(gè)預(yù)測(cè)保守域。本發(fā)明的示例性Fv43B多肽包含與圖25B所示的成熟 Af43A 序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%同一性的序列。本發(fā)明的Af43A多肽合適地具有β-木糖苷酶活性。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的Af43Α多肽具有翻轉(zhuǎn)型β -木糖苷酶活性。
6. 4. 6. Fo43A 多狀在某些實(shí)施例中，具有翻轉(zhuǎn)型β -木糖苷酶活性的酶是Fo43A多肽。Fo43A的氨基酸序列(SEQ ID NO: 24)在圖31B和圖32的第二行示出。SEQ ID NO: 24是未成熟的Fo43A序列。Fo43A具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 24第I至17位殘基的預(yù)測(cè)信號(hào)序列(在圖31B中標(biāo)有下劃線(xiàn))；信號(hào)序列的剪切預(yù)計(jì)會(huì)產(chǎn)生成熟蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:24第21至348位殘基的序列。在圖31B中預(yù)測(cè)保守域殘基以黑體表示。已在使用對(duì)硝基苯基- β -吡喃木糖苷、木二糖或混合的線(xiàn)性木聚糖低聚物作為底物的測(cè)定中，證明Fo43A具有β-木糖苷酶活性。預(yù)測(cè)的催化殘基為D37或D72、D159、和Ε251。如本文所用，“Fo43A多肽”是指包含與SEQ ID NO: 24第21至348位殘基中的至少50，例如至少75、100、125、150、175、200、250、300、或320個(gè)連續(xù)氨基酸殘基具有至少85%，例如至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 序列同一性的序列的多肽和/或其變體。與天然Fo43A相比，F(xiàn)o43A多肽的D37或D72、D159、和E251殘基優(yōu)選地是未改變的。Fo43A多肽優(yōu)選地至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、或99%的氨基酸殘基是未改變的，所述殘基對(duì)于Fv43D，F(xiàn)o43A, Gz43A, Pf43A, Fv43A, Fv43B, Af43A, Pf43B,和Fv43E，中的兩個(gè)或更多個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)、四個(gè)或更多個(gè)、五個(gè)或更多個(gè)、六個(gè)或更多個(gè)、七個(gè)或更多個(gè)、八個(gè)或更多個(gè)、或全部九個(gè)是保守的，如圖32的比對(duì)所示。如圖3IB所示，F(xiàn)o43A多肽合適地包含天然Fo43A的整個(gè)預(yù)測(cè)保守域。本發(fā)明的示例性Fo43A多肽包含與圖31B所示的成熟Fo43A序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%同一性的序列。本發(fā)明的Fo43A多肽合適地具有β-木糖苷酶活性。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的Fo43A多肽具有翻轉(zhuǎn)型β-木糖苷酶活性。6. 4. 7. Gz43A 多肽在某些實(shí)施例中，具有翻轉(zhuǎn)型β -木糖苷酶活性的酶是Gz43A多肽。Gz43A的氨基酸序列(SEQ ID NO: 22)在圖30B和圖32的第三行示出。SEQ ID NO: 22是未成熟的Gz43A序列。Gz43A具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 22第I至18位殘基的預(yù)測(cè)信號(hào)序列(在圖30B中標(biāo)有下劃線(xiàn))；信號(hào)序列的剪切預(yù)計(jì)會(huì)產(chǎn)生成熟蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:22第19至340位殘基的序列。在圖30B中預(yù)測(cè)保守域殘基以黑體表示。已在使用對(duì)硝基苯基- β -吡喃木糖苷、木二糖或混合的線(xiàn)性木聚糖低聚物作為底物的測(cè)定中，證明Gz43A具有β-木糖苷酶活性。預(yù)測(cè)的催化殘基為D33或D68、D154、和Ε243。如本文所用，“Gz43A多肽”是指包含與SEQ ID NO: 22第19至340位殘基中的至少50，例如至少75、100、125、150、175、200、250、或300個(gè)連續(xù)氨基酸殘基具有至少85%，例如至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 序列同一性的序列的多肽和/或其變體。與天然Gz43A相比，Gz43A多肽的D33或D68、D154、和E243殘基優(yōu)選地是未改變的。Gz43A多肽優(yōu)選地至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、或99%的氨基酸殘基是未改變的，所述殘基對(duì)于Fv43D，F(xiàn)o43A, Gz43A, Pf43A, Fv43A, Fv43B, Af43A, Pf43B,和Fv43E，中的兩個(gè)或更多個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)、四個(gè)或更多個(gè)、五個(gè)或更多個(gè)、六個(gè)或更多個(gè)、七個(gè)或更多個(gè)、八個(gè)或更多個(gè)、或全部九個(gè)是保守的，如圖32的比對(duì)所示。如圖30B所示,Gz43A多肽合適地包含天然Gz43A的整個(gè)預(yù)測(cè)保守域。本發(fā)明的示例性Gz43A多肽包含與圖 30B 所示的成熟 Fo43A 序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%同一性的序列。本發(fā)明的Gz43A多肽合適地具有β -木糖苷酶活性。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的Gz43A多肽具有翻轉(zhuǎn)型β -木糖苷酶活性。6.4.8.嗜熱脂肪芽孢桿菌XynB3多肽在其他方面，具有翻轉(zhuǎn)型β_木糖苷酶活性的酶是嗜熱脂肪芽孢桿菌XynB3多肽。嗜熱脂肪芽孢桿菌XynB3的序列以SEQ ID NO: 25表示。嗜熱脂肪芽孢桿菌XynB3是得自嗜熱脂肪芽孢桿菌T-6的具有535個(gè)氨基酸的GH43家族酶。該酶從木糖低聚物的非還原末端裂解單個(gè)木糖單元；據(jù)發(fā)現(xiàn)，三個(gè)催化殘基D15、D128、和E187對(duì)于其活性是必不可少的(Shallom 等人,2005, Biochemistry (生物化學(xué)),44 387 - 397)。如本文所用，“嗜熱脂肪芽孢桿菌XynB3多肽”是指包含與SEQ ID N0:25的至少50，例如至少 75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、或 500 個(gè)連續(xù)氨基酸殘基具有至少 85%，例如至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列同一性的序列的多肽和/或其變體。與天然XynB3相比，嗜熱脂肪芽孢桿菌XynB3多肽的D15、D128、和E187殘基優(yōu)選地是未改變的。本發(fā)明的嗜熱脂肪芽孢桿菌XynB3 多肽合適地具有β_木糖苷酶活性。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的嗜熱脂肪芽孢桿菌XynB3多肽具有翻轉(zhuǎn)型β-木糖苷酶活性。6. 4. 9.弧菌屬(Vibrio sd.)X1oA 多妝在某些實(shí)施例中，具有翻轉(zhuǎn)型β_木糖苷酶活性的酶是弧菌屬HoA多肽?；【鷮貶oA是得自弧菌屬菌株ΧΥ-214的β-1，3-木糖苷酶。如本文所用，“弧菌屬HoA多肽”是指包含與弧菌屬菌株ΧΥ-214來(lái)源β_1，3_木糖苷酶的至少50，例如至少75、100、125、150、175、200、250、300、350或400個(gè)連續(xù)氨基酸殘基具有至少 85%，例如至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列同一性的序列的多肽和/或其變體。(Umemoto等人,2008, Appl. Environ.Microbiol.(微生物學(xué)應(yīng)用和環(huán)境)74(I) :305-308 ;Genbank登錄號(hào)AB300564)。本發(fā)明的弧菌屬)CloA多肽合適地具有β-木糖苷酶活性。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的弧菌屬HoA多肽具有翻轉(zhuǎn)型β-木糖苷酶活性。6. 5具有保持型g -木糖苷酶活性的酶根據(jù)本發(fā)明，具有保持型β -木糖苷酶活性的酶用于提高或增加SSF反應(yīng)中AXP(例如EXP)的產(chǎn)量。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含至少一種保持型β-木糖苷酶多肽的組合物。在另一方面，本發(fā)明涉及在SSF反應(yīng)中產(chǎn)生所需的AXP化合物或提高或增加AXP產(chǎn)物的量的方法，該方法包括培養(yǎng)完全發(fā)酵培養(yǎng)基，所述完全發(fā)酵培養(yǎng)基包含至少一種保持型β-木糖苷酶多肽。合適的翻轉(zhuǎn)型β-木糖苷酶多肽能夠選自作為糖苷水解酶家族3 ( “GH3”)、GH30、GH31、GH39、GH52、GH54、*GH116家族酶成員的那些多肽。如上述第6. 3. I. 5節(jié)中所述，保持型β -木糖苷酶活性能夠通過(guò)合適的測(cè)定法測(cè)定。因此，在某些方面，本文中具有保持型β-木糖苷酶活性的酶是GH3、GH30、GH31、GH39、GH52、GH54、或GHl 16家族成員。例如，所述酶是日本曲霉XlnD，輪枝鐮孢菌Fv30A，輪枝鐮孢菌Fv30B，輪枝鐮孢菌Fv39A，輪枝鐮孢菌Fv39B，解糖熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacter saccharolyticum) XynB,嗜熱脂肪芽抱桿菌XylA或康寧木霉(康寧肉座菌(Hypocrea koningii) ) Xyll多肽。此類(lèi)多肽如下所述。
6. 5. L日本曲霍XlnD多狀在某些實(shí)施例中，具有保持型β -木糖苷酶活性的酶是HnD多肽。HnD的氨基酸序列(SEQ ID NO:40)在圖35Β中示出。SEQ ID NO:40是未成熟的XlnD序列。XlnD具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:40第I至17位殘基的預(yù)測(cè)信號(hào)序列(在圖35Β中標(biāo)有下劃線(xiàn))；信號(hào)序列的剪切預(yù)計(jì)會(huì)產(chǎn)生成熟蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:40第18至804位殘基的序列。如本文所用，IlnD多肽”是指包含與SEQ ID NO:40第18至804位殘基中的至少50，例如至少 75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、或750個(gè)連續(xù)氨基酸殘基具有至少85%，例如至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列同一性的序列的多肽和/或其變體。本發(fā)明的示例性XlnD多肽包含與圖35Β所示的成熟XlnD序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%同一性的序列。本發(fā)明的XlnB多肽合適地具有β -木糖苷酶活性。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的)ClnB多肽具有保持型β -木糖苷酶活性。 6. 5. 2.輪枝鐮孢菌Fv30A多狀在某些實(shí)施例中，具有保持型β -木糖苷酶活性的酶是Fv30A多肽。HnD的氨基酸序列(SEQ ID N0:42)在圖36B中示出。SEQ ID NO:42是未成熟的Fv30A序列。XlnD具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:42第I至19位殘基的預(yù)測(cè)信號(hào)序列(在圖36B中標(biāo)有下劃線(xiàn))；信號(hào)序列的剪切預(yù)計(jì)會(huì)產(chǎn)生成熟蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:42第20至537位殘基的序列。如本文所用，“Fv30A多肽”是指包含與SEQ ID NO: 42第20至537位殘基中的至少50，例如至少 75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、或 500 個(gè)連續(xù)氨基酸殘基具有至少 85%，例如至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列同一性的序列的多肽和/或其變體。本發(fā)明的示例性Fv30A多肽包含與圖36B所示的成熟 Fv30A 序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%同一性的序列。本發(fā)明的Fv30A多肽合適地具有β _木糖苷酶活性。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的Fv30A多肽具有保持型β -木糖苷酶活性。6. 5. 3.輪枝鐮孢菌Fv30B多肽在某些實(shí)施例中，具有保持型β -木糖苷酶活性的酶是Fv30B多肽。Fv30B的氨基酸序列(SEQ ID N0:44)在圖37B中示出。SEQ ID NO:44是未成熟的Fv30B序列。Fv30B具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:44第I至24位殘基的預(yù)測(cè)信號(hào)序列(在圖37B中標(biāo)有下劃線(xiàn))；信號(hào)序列的剪切預(yù)計(jì)會(huì)產(chǎn)生成熟蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:44第25至485位殘基的序列。如本文所用，“Fv30B多肽”是指包含與SEQ ID NO:44第25至485位殘基中的至少50，例如至少75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、或450個(gè)連續(xù)氨基酸殘基具有至少 85%，例如至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列同一性的序列的多肽和/或其變體。本發(fā)明的示例性Fv30B多肽包含與圖37B所示的成熟 Fv30B 序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%同一性的序列。本發(fā)明的Fv30B多肽合適地具有β _木糖苷酶活性。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的Fv30B多肽具有保持型β -木糖苷酶活性。
6. 5. 4.輪枝鐮孢菌Fv39A多狀在某些實(shí)施例中，具有保持型β -木糖苷酶活性的酶是Fv39A多肽。Fv39A的氨基酸序列(SEQ ID N0:46)在圖38B中示出。SEQ ID NO:46是未成熟的Fv39A序列。Fv39A具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:46第I至19位殘基的預(yù)測(cè)信號(hào)序列(在圖38B中標(biāo)有下劃線(xiàn))；信號(hào)序列的剪切預(yù)計(jì)會(huì)產(chǎn)生成熟蛋白質(zhì)， 該蛋白質(zhì)具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:46第20至439位殘基的序列。如本文所用，“Fv39A多肽”是指包含與SEQ ID NO:46第20至439位殘基中的至少50，例如至少75、100、125、150、175、200、250、300、350、或400個(gè)連續(xù)氨基酸殘基具有至少 85%，例如至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100%序列同一性的序列的多肽和/或其變體。本發(fā)明的示例性Fv39A多肽包含與圖38B所示的成熟 Fv39A 序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%同一性的序列。本發(fā)明的Fv39A多肽合適地具有β -木糖苷酶活性。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的Fv39A多肽具有保持型β -木糖苷酶活性。6. 5. 5.輪枝鐮孢菌Fv39B多狀在某些實(shí)施例中，具有保持型β -木糖苷酶活性的酶是Fv39B多肽。Fv39B的氨基酸序列(SEQ ID N0:48)在圖39B中示出。SEQ ID NO:48是未成熟的Fv39B序列。Fv39B具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:48第I至18位殘基的預(yù)測(cè)信號(hào)序列(在圖39B中標(biāo)有下劃線(xiàn))；信號(hào)序列的剪切預(yù)計(jì)會(huì)產(chǎn)生成熟蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:48第19至456位殘基的序列。如本文所用，“Fv39B多肽”是指包含與SEQ ID N0:48第19至456位殘基中的至少50，例如至少75、100、125、150、175、200、250、300、或350個(gè)連續(xù)氨基酸殘基具有至少85%,例如至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 序列同一性的序列的多肽和/或其變體。本發(fā)明的示例性Fv39B多肽包含與圖39B所示的成熟 Fv39B 序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%同一性的序列。本發(fā)明的Fv39B多肽合適地具有β-木糖苷酶活性。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的Fv39B多肽具有保持型β -木糖苷酶活性。6. 5. 6.角軍糖熱厭氧桿菌XynB多肽在某些實(shí)施例中，具有保持型β -木糖苷酶活性的酶是XynB多肽。XynB的氨基酸序列(SEQ ID NO:50)在圖40Β中示出。XynB不具有SignalP算法(訪(fǎng)問(wèn)地址http://www. cbs. dtu. dk)得到的預(yù)測(cè)信號(hào)序列。如本文所用，“XynB多肽”是指包含與SEQ ID NO:50的至少50，例如至少75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、或450個(gè)連續(xù)氨基酸殘基具有至少85%，例如至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 序列同一性的序列的多肽和/或其變體。本發(fā)明的示例性XynB多肽包含與圖40B所示的XynB序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 同一性的序列。本發(fā)明的XynB多肽合適地具有β -木糖苷酶活性。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的XynB多肽具有保持型β_木糖苷酶活性。6. 5. 7.嗜熱脂肪芽孢桿菌XylA多肽在某些實(shí)施例中，具有保持型β -木糖苷酶活性的酶是XylA多肽。XylA的氨基酸序列(SEQ ID N0:52)在圖41B中示出。XylA不具有SignalP算法(訪(fǎng)問(wèn)地址http://WWW. cbs. dtu. dk)得到的預(yù)測(cè)信號(hào)序列，但是具有Uniprot算法(訪(fǎng)問(wèn)地址http://www.uniprot. org/uniprot)預(yù)測(cè)的信號(hào)序列，該序列對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:52第I至18位殘基(標(biāo)有下劃線(xiàn));信號(hào)序列的剪切預(yù)計(jì)會(huì)產(chǎn)生成熟蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:52第19至705位殘基的序列。如本文所用，“XylA多肽”是指包含與SEQ ID NO:52的至少50，例如至少75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、或 650 個(gè)連續(xù)氨基酸殘基或 SEQ IDNO:52 第 19 至 705 位殘基具有至少 85%,例如至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列同一性的序列的多肽和/或其變體。本發(fā)明的示例性XylA多肽包含與圖41B所示的成熟XylA序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 同一性的序列。本發(fā)明的 XylA 多肽合適地具有β_木糖苷酶活性。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的XylA多肽具有保持型β-木糖苷酶活性。
6.5.8.康寧木霍(康寧肉座菌)Xvll多狀在某些實(shí)施例中，具有保持型β -木糖苷酶活性的酶是Xyl I多肽。Xyll的氨基酸序列(SEQ ID NO:54)在圖42Β中示出。SEQ ID Ν0:54是未成熟的Xyll序列。Xyll具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 54第I至21位殘基的預(yù)測(cè)信號(hào)序列(在圖42Β中標(biāo)有下劃線(xiàn))；信號(hào)序列的剪切預(yù)計(jì)會(huì)產(chǎn)生成熟蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 54第22至500位殘基的序列。如本文所用，“Xyll多肽”是指包含與SEQ ID NO:54第22至500位殘基中的至少50，例如至少75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、或450個(gè)連續(xù)氨基酸殘基具有至少 85%，例如至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列同一性的序列的多肽和/或其變體。本發(fā)明的示例性Xyll多肽包含與圖42B所示的成熟 Xyll 序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%同一性的序列。本發(fā)明的Xyll多肽合適地具有β _木糖苷酶活性。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的Xyll多肽具有保持型β_木糖苷酶活性。6. 6用于SSF的酶的重組制備方法6. 6. I.核酸和表達(dá)載體能夠?qū)⒕幋a用于SSF的酶(“SSF酶”)的天然或合成多核苷酸片段并入異源核酸構(gòu)建體或載體，所述酶包括翻轉(zhuǎn)型β -木糖苷酶多肽或其他糖化酶(例如纖維素酶或半纖維素酶)。然后能夠?qū)⒛切┹d體引入合適的宿主細(xì)胞或在合適的宿主細(xì)胞中復(fù)制，所述合適的宿主細(xì)胞包括例如絲狀真菌、酵母、或細(xì)菌細(xì)胞。本文所公開(kāi)的載體和方法能夠用于表達(dá)一種或多種SSF酶。只要能夠在其被引入的細(xì)胞中復(fù)制并且存活，任何載體都能夠使用。許多合適的載體和啟動(dòng)子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，其中多種載體和啟動(dòng)子是可商購(gòu)獲得的?？寺『捅磉_(dá)載體已在如下文獻(xiàn)中詳細(xì)描述例如Sambrook等人,2001, MolecularCloning:A Laboratory Manual (分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))(CSHL Press)和 Ausubel 等人，2002, Short Protocols in Molecular Biology (Current Protocols)(分生物學(xué)短期協(xié)議(當(dāng)前協(xié)議))，其中各自關(guān)于表達(dá)載體的內(nèi)容明確地以引用方式并入本文。適用于真菌宿主細(xì)胞的其他示例性表達(dá)載體在如下文獻(xiàn)中有所描述van den Hondel等人，1991, Bennett和 Lasure (編輯)More Gene Manipulations in Fungi (真菌中的更多基因操作)，AcademicPress (學(xué)術(shù)出版社),第396-428頁(yè)。本領(lǐng)域已知的是，多種所關(guān)注的DNA序列能夠使用許多標(biāo)準(zhǔn)步驟插入質(zhì)粒或載體(本文統(tǒng)稱(chēng)為“載體”)。通常，例如使用標(biāo)準(zhǔn)步驟并且在標(biāo)準(zhǔn)條件下將所關(guān)注的DNA序列插入合適的限制性?xún)?nèi)切核酸酶位點(diǎn)。此類(lèi)步驟和相關(guān)的亞克隆步驟在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。包含SSF酶編碼序列的重組絲狀真菌能夠通過(guò)將包含編碼SSF酶的DNA序列的異源核酸構(gòu)建體弓I入絲狀真菌宿主細(xì)胞的遺傳物質(zhì)而制備。
一旦得到所需形式的編碼SSF酶的核酸序列，則能夠任選地以多種方式修飾。當(dāng)序列包含非編碼側(cè)翼區(qū)時(shí)，能夠?qū)?cè)翼區(qū)進(jìn)行切除、誘變等。因此，能夠在天然存在的序列上進(jìn)行轉(zhuǎn)換、顛換、缺失和/或插入。所選的編碼SSF酶的序列能夠根據(jù)熟知的重組技術(shù)插入合適的載體中，然后該載體能夠用于轉(zhuǎn)化能夠表達(dá)SSF酶的絲狀真菌宿主細(xì)胞。由于遺傳密碼固有的簡(jiǎn)并性，編碼基本上相同或功能等效的氨基酸序列的其他DNA序列能夠用于克隆和表達(dá)SSF酶。如上所述，本發(fā)明還包括重組核酸構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含一個(gè)或多個(gè)編碼SSF酶的核酸序列。每個(gè)構(gòu)建體合適地包含其中已正向或反向插入了本發(fā)明序列的載體，例如質(zhì)?；虿《据d體。異源核酸構(gòu)建體能夠合適地包括如下形式的SSF酶編碼序列(i)孤立形式；(ii)與附加編碼序列(例如融合蛋白或信號(hào)肽編碼序列)的組合形式，其中所需的編碼SSF酶的序列是主導(dǎo)編碼序列與一種或多種使編碼序列在合適的宿主中高效表達(dá)的非編碼序列的組合形式，所述非編碼序列例如內(nèi)含子和控制元件(例如啟動(dòng)子和終止子元件、或5'和/或3'非翻譯區(qū))；和/或(iv)在載體或宿主環(huán)境中，其中編碼SSF酶的序列相對(duì)于宿主細(xì)胞是異源的。在某些方面，異源核酸構(gòu)建體用于在體外將編碼SSF酶的核酸序列轉(zhuǎn)移至細(xì)胞，例如已構(gòu)建的絲狀真菌或酵母細(xì)胞系。對(duì)于SSF酶的長(zhǎng)期制備，穩(wěn)定表達(dá)是優(yōu)選的。因此，對(duì)產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體有效的任何方法都能夠合適地應(yīng)用于本文所公開(kāi)的發(fā)明。合適的載體通常配有編碼選擇性標(biāo)記的核酸序列、插入位點(diǎn)、以及合適的控制元件，例如啟動(dòng)子和終止序列。該載體可包含調(diào)節(jié)序列，包括例如非編碼序列，如可操作地連接至編碼序列，并且使編碼序列在宿主細(xì)胞中高效表達(dá)的內(nèi)含子和控制元件。合適的控制元件包括例如啟動(dòng)子和終止子元件、或5'和/或3'非翻譯區(qū)。許多載體和啟動(dòng)子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，其中多種載體和啟動(dòng)子是可商購(gòu)獲得的。合適的載體和啟動(dòng)子在如下文獻(xiàn)中也有所描述例如 Sambrook 等人，2001, Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))(CSHL Press)。示例性啟動(dòng)子包括例如組成型啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子,例如但不限于CMV啟動(dòng)子、SV40早期啟動(dòng)子、RSV啟動(dòng)子、EF-I α啟動(dòng)子、包含tet-on或tet_off系統(tǒng)中的四環(huán)素應(yīng)答元件(TRE)的啟動(dòng)子(參見(jiàn)例如ClonTech對(duì)Tet-Onw*Tet-Off先進(jìn)可誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)的描述)、或β -肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子以及能夠通過(guò)加入某些金屬鹽來(lái)上調(diào)的金屬硫蛋白啟動(dòng)子。啟動(dòng)子序列是被具體絲狀真菌宿主細(xì)胞識(shí)別以實(shí)現(xiàn)表達(dá)目的的DNA序列。啟動(dòng)子序列可操作地連接至編碼所關(guān)注的SSF酶的DNA序列。此類(lèi)連接將啟動(dòng)子定位在表達(dá)載體中相對(duì)于編碼所關(guān)注SSF酶的DNA序列的起始密碼子的位置。啟動(dòng)子序列包含轉(zhuǎn)錄和/或翻譯控制序列，其介導(dǎo)所關(guān)注SSF酶的表達(dá)。實(shí)例包括得自如下基因的啟動(dòng)子黑曲霉、泡盛曲霉、或米曲霉葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、或α-葡萄糖苷酶編碼基因、構(gòu)巢曲霉gpdA或trpC基因、粗糙脈孢菌cbhl或trpl基因、黑曲霉或米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶編碼基因、紅褐肉座菌(H. jecorina) cbhl、cbh2、egll、egl2、或其他纖維素酶編碼基因。選擇性標(biāo)記的選擇將取決于宿主細(xì)胞，并且適用于不同宿主細(xì)胞的合適選擇性標(biāo)記在本領(lǐng)域是已知的。示例性選擇性標(biāo)記基因包括得自構(gòu)巢曲霉或紅褐肉座菌的argB、得自構(gòu)巢曲霉的amdS、得自粗糙脈孢菌或紅褐肉座菌的pyr4、得自黑曲霉或構(gòu)巢曲霉的PyrG0其他合適的選擇性標(biāo)記包括例如trpc、trpl、oliC31、niaD、或leu2,所述標(biāo)記包含在異源核酸構(gòu)建體中，該構(gòu)建體用于轉(zhuǎn)化突變株，例如trp-、pyr-、或Ieu-突變株等等。此類(lèi)選擇性標(biāo)記能夠賦予轉(zhuǎn)化體利用在其他情形下宿主細(xì)胞不能代謝的代謝物的能力。例如，得自紅褐肉座菌的amdS基因編碼乙酰胺酶，該基因允許轉(zhuǎn)化細(xì)胞以乙酰胺作為氮源生長(zhǎng)。在另一個(gè)實(shí)例中，選擇性標(biāo)記(例如pyrG)能夠恢復(fù)營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株在選擇性基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的能力。在另一個(gè)實(shí)例中，選擇性標(biāo)記(例如olic31)能夠賦予轉(zhuǎn)化體在抑制性藥物或抗生素的存在下生長(zhǎng)的能力。使用本領(lǐng)域已知的方法和技術(shù)將選擇性標(biāo)記編碼序列合適地克隆到質(zhì)粒中。示例性質(zhì)粒包括但不限于PUC18、pBR322、pRAX和pUClOO。例如，pRAX質(zhì)粒包含得自構(gòu)巢曲霉的AMAL序列，使其能夠在黑曲霉中復(fù)制。除非另外具體指明，本發(fā)明的實(shí)踐將利用分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。此類(lèi)技術(shù)在文獻(xiàn)中有詳細(xì)描述。參見(jiàn)例如 Sambrook 等人，2001, Moecular Cloning:A Laboratory Manual (分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))(CSHL Press) ;Ausubel 等人，2002, Short Protocols in MolecularBiology (Current Protocols)(分子生物學(xué)短息協(xié)議(當(dāng)前協(xié)議));Freshney, 2005, Cultureof Animal Cells:A Manual of Basic Technique (動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物技術(shù)技術(shù)手冊(cè))(Wiley-Liss);和 Dunn 等人，2003, Short Protocols in Protein Science (蛋白質(zhì)科學(xué)短期協(xié)議)(Wiley)。本文涉及的所有專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)、文章和出版物據(jù)此以引用方式并入。6.6.2.宿主牛物和蛋白質(zhì)表汰本發(fā)明提供了經(jīng)工程改造而表達(dá)所關(guān)注的SSF蛋白的宿主細(xì)胞，該蛋白用于本文所述的方法。合適的宿主細(xì)胞包括任何微生物(例如細(xì)菌、原生生物、藻類(lèi)、真菌(如酵母或絲狀真菌)、或任何其他微生物)。合適的宿主細(xì)胞優(yōu)選地是細(xì)菌、酵母、或絲狀真菌細(xì)胞。合適的細(xì)菌屬包括但不限于埃希氏菌屬(Escherichia)、芽孢桿菌屬、乳桿菌屬(Lactobacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和鏈霉菌屬。合適的細(xì)菌種包括但不限于大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽抱桿菌、地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis)、短乳桿菌(Lactobacillus brevis)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和淺青紫鏈霉菌。合適的酵母屬包括但不限于酵母菌屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、假絲酵母屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)、畢赤酵母屬 (Pichia)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、和法夫酵母屬(Phaffia)。合適的酵母種包括但不限于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母、白假絲酵母(Candidaalbicans)、多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)、加拿大畢赤酵母(P. canadensis)、馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)和紅法夫酵母(Phaffia rhodozyma)。合適的絲狀真菌包括真菌亞門(mén)的所有絲狀形式。合適的絲狀真菌屬包括但不限于支頂孢屬、曲霉屬、出芽短梗霉屬(Aureobasidium)、黑管菌屬(Bjerkandera)、擬錯(cuò)菌屬(Ceriporiopsis)、金孢子菌屬(Chrysoporium)、鬼傘屬(Coprinus)、革蓋菌屬(Coriolus)、棒囊殼屬(Corynascus)、毛殼菌屬(Chaertomium)、隱球酵母屬(Cryptococcus)、線(xiàn)黑粉酵母屬(Filobasidium)、鐮孢屬、赤霉菌屬(Gibberella)、腐質(zhì)霉屬、大角間座殼菌屬(Magnaporthe)、毛霉菌屬、毀絲菌屬、毛霉菌屬、新美鞭菌屬(Neocallimastix)、脈孢菌屬、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬、平革菌屬(Phanerochaete)、射脈菌屬(Phlebia)、Piromyces、側(cè)耳屬(Pleurotus)、柱頂抱屬(Scytaldium)、裂糟菌屬(Schizophyllum)、孢子絲菌屬(Sporotrichum)、籃狀菌屬 (Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬、彎頸霉屬、栓菌屬(Trametes)和木霉屬。合適的絲狀真菌種包括但不限于泡盛曲霉、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、金孢子菌(Chrysosporium Iucknowense)、擬棒座鐮孢菌(Fusarium bactridioides)、小麥鐮孢菌、克地鐮孢菌、黃色鐮孢菌、禾谷鐮孢菌、禾赤鐮孢菌、異孢鐮孢菌、荊條鐮孢菌(Fusarium negundi)、尖孢鐮孢菌、多枝鐮孢菌、粉紅鐮孢菌、接骨木鐮孢菌、膚色鐮孢菌、擬枝孢鐮孢菌、硫色鐮孢菌、簇囊鐮孢菌(Fusariumtorulosum)、擬絲抱德抱菌、毒性德抱菌(Fusarium venenatum)、煙管菌(Bjerkanderaadusta)、干擬錯(cuò)菌(Ceriporiopsis aneirina)、擬錯(cuò)菌(Ceriporiopsis caregiea)、淺黃擬錯(cuò)菌(Ceriporiopsis caregiea)、乾擬錯(cuò)孔菌(Ceriporiopsis gilvescens)、擬錯(cuò)菌(Ceriporiopsis pannocinta)、環(huán)帶擬錯(cuò)菌(Ceriporiopsis rivulosa)、淺紅擬錯(cuò)菌(Ceriporiopsis subrufa)、蟲(chóng)擬錯(cuò)菌(Ceriporiopsis subvermispora)、灰蓋鬼傘(Coprinus cinereus)、毛云芝菌(Coriolus hirsutus)、特異腐質(zhì)霉、綿毛狀腐質(zhì)霉、米赫毛霉、嗜熱毀絲菌、粗糙脈孢菌、間型脈孢菌(Neurospora intermedia)、產(chǎn)紫青霉、變灰青霉(Penicillium canescens)、離生青霉(Penicillium solitum)、繩狀青霉、黃抱原毛平革菌、射脈菌(Phlebia radiate)、杏鮑燕(Pleurotus eryngii)、黃色籃狀菌(Talaromycesflavus)、太瑞斯梭孢殼霉、長(zhǎng)域毛栓菌(Trametes villosa)、變色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉、康寧木霉、長(zhǎng)枝木霉、里氏木霉和綠色木霉。一旦產(chǎn)生重組SSF酶表達(dá)構(gòu)建體，例如根據(jù)本文所述的方法產(chǎn)生，則該構(gòu)建體即能夠使用常規(guī)方法轉(zhuǎn)化至合適的宿主細(xì)胞。6. 6. 3.酶分離和/或純化方法在某些方面，重組SSF酶是經(jīng)工程改造具有信號(hào)序列的，使得重組SSF酶分泌至宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基。在某些方面，所關(guān)注的SSF酶以發(fā)酵液的形式回收。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“發(fā)酵液”是指通過(guò)發(fā)酵并隨后不經(jīng)過(guò)或幾乎不經(jīng)過(guò)回收和/或純化而制備的酶制品。例如，微生物培養(yǎng)物生長(zhǎng)至飽和，在碳源限制條件下溫育，從而允許蛋白質(zhì)合成(例如酶的表達(dá))，一旦酶分泌至細(xì)胞培養(yǎng)基后，發(fā)酵液便成為能夠從中回收所關(guān)注的SSF酶的發(fā)酵液。例如發(fā)酵液能夠包含發(fā)酵結(jié)束時(shí)得到的未分離的或分離的發(fā)酵材料內(nèi)容物。通常，發(fā)酵液是未分離的，并且包含用過(guò)的培養(yǎng)基，以及例如通過(guò)離心移除微生物細(xì)胞(如絲狀真菌細(xì)胞)后存在的細(xì)胞碎片。在某些實(shí)施例中，發(fā)酵液包含用過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)基、胞外酶、以及存活的或死亡的微生物細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，使發(fā)酵液分離以移除微生物細(xì)胞，從而使其包含用過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)基和胞外酶。在一些方面，SSF酶的部分或完全純化可以是所期望的。在某些實(shí)施例中，SSF酶被純化為具有至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少95%、至少98%、或至少99%均一性。然而，在某些其他方面，所關(guān)注的SSF酶能夠以細(xì)胞形式制備(即部分或完全不分泌的)，然后所述酶可能需要從細(xì)胞裂解物中回收。在這種情況下，使用本領(lǐng)域的常用技術(shù)從產(chǎn)生SSF酶的細(xì)胞純化SSF酶。此類(lèi)技術(shù)的實(shí)例包括但不限于親和色譜法(參見(jiàn)例如vanTilbeurgh等人，1984，F(xiàn)EBS Lett. (FEBS學(xué)報(bào))169 :215_218)、離子交換色譜法·(參見(jiàn)例如Goyal 等人，1991, Bioresource Technol.(生物資源技術(shù))36 :37-50 ；Fliess 等人，1983,Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol.(歐洲微生物和生物技術(shù)應(yīng)用期刊)17 :314-318 ；Bhikhabhai 等人，1984, J. Appl. Biochem.(生物化學(xué)應(yīng)用期刊)6 :336-345 ；Ellouz 等人，1987，J. Chromatography (色譜法期刊)396 :307_317)、利用具有高分辨力的材料的離子交換色譜法(參見(jiàn)例如Medve等人，1998, J. Chromatography (色譜法期刊)A808 :153_165)、疏水相互作用色譜法(參見(jiàn)例如Tomaz和Queiroz, 1999, J. Chromatography (色譜法期刊)A 865 :123-128)、和兩相分配(參見(jiàn)例如Brumbauer等人，1999,Bioseparation (生物分離)7 :287-295)。適當(dāng)?shù)胤蛛xSSF酶以分離具有預(yù)先確定特性的蛋白質(zhì)，所述特性例如與具體結(jié)合試劑或介質(zhì)，如抗體或受體的結(jié)合親和力；某些分子量范圍；或某些等電點(diǎn)范圍。一旦實(shí)現(xiàn)給定SSF酶的表達(dá)，由此制備的SSF酶即能夠從細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物純化。適用于此類(lèi)純化的示例性步驟包括但不限于抗體-親和柱層析、離子交換色譜法、乙醇沉淀、反相HPLC、硅膠或陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(例如DEAE)色譜法、色譜聚焦、SDS-PAGE、硫酸銨沉淀、和使用例如Sephadex G_75進(jìn)行的凝膠過(guò)濾。許多蛋白質(zhì)純化方法都能夠使用,這些方法在本領(lǐng)域是已知的，并且在文獻(xiàn)中有所詳細(xì)描述。例如，蛋白質(zhì)純化方法在如下文獻(xiàn)中有所描述Deutscher, 1990, Methods in Enzymology (酶學(xué)方法)，182 (57) :779 ;和 Scopes,1982, Methods in Enzymology (酶學(xué)方法)90 :479-91。通常，純化步驟或方法的選擇取決于例如制備方法和所制備的具體蛋白質(zhì)的性質(zhì)。6.6.4.發(fā)酵微牛物本發(fā)明的SSF方法利用“發(fā)酵微生物”從伴隨糖化反應(yīng)產(chǎn)生的和/或加入體系的糖產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物(例如乙醇)。能夠產(chǎn)生乙醇的發(fā)酵微生物有時(shí)稱(chēng)為產(chǎn)乙醇生物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“發(fā)酵微生物”是指適用于所需發(fā)酵方法的任何微生物。根據(jù)本發(fā)明的合適發(fā)酵微生物能夠直接或間接使糖，例如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、或低聚糖發(fā)酵，即轉(zhuǎn)化為所需的發(fā)酵產(chǎn)物。合適的發(fā)酵微生物的實(shí)例包括但不限于真菌生物，例如酵母。具體地講，合適的酵母能夠選自酵母(Saccharomyces spp.)菌株,具體地講釀酒酵母。各種類(lèi)型的酵母是可商購(gòu)獲得的，其中例如ETHANOL RED 酵母(得自Fermentis/Lesaffre, USA)、FALI (得自Fleischmann' s Yeast, USA)、SUPERSTART 和鮮酵母(得自 EthanolTechnology (WI, USA) )、BIOFERM AFT 和 XR (得自 NABC—North American BioproductsCorporation (GA, USA) )、GERT STRAND (得自 Gert Strand AB, Sweden)、或 FERMIOL (得自DSM Specialties)能夠用于執(zhí)行本文所述發(fā)明的方法。在其他方面，酵母是糖化酵母(Saccharomyces distaticus)或葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)。在其他方面,酵母是克魯維酵母。克魯維酵母的非限制性實(shí)例包括馬克斯克魯維酵母或脆壁克魯維酵母(Kluyveromyces fragilis)。在其他方面,酵母是假絲酵母。假絲酵母的非限制性實(shí)例包括擬熱帶假絲酵母(Candida pseudotropicalis)和云苔假絲酵母(Candida brassicae)。在其他方面，酵母是棒孢酵母(Clavispora)。棒孢酵母的非限制性實(shí)例包括葡萄牙棒孢酵母(Clavispora Iusitaniae)和仙人掌棒孢酵母(Clavispora opuntiae)。在另一方面，酵母是管囊酵母(Pachysolen)，例如嗜鞋管囊 酵母(Pachysolen tannophilus)。在另一方面，酵母是酒香酵母(Bretannomyces),例如克勞森酒香酵母(Bretannomyces clausenii)。酵母發(fā)酵在文獻(xiàn)中已有所描述。參見(jiàn)例如 Philippidis, 1996，“Cellulose bioconversion technology” (纖維素生物轉(zhuǎn)化技術(shù))，Handbook on Bioethanol:Production and Utilization (生物乙醇手冊(cè)生產(chǎn)和利用)(Wyman 編輯，Taylor & Francis, Washington, D. C.，179-212)。能夠有效地將葡萄糖發(fā)酵為乙醇的細(xì)菌包括例如運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌和熱纖梭菌(參見(jiàn)例如 Philippidis, 1996，上文)。在釀酒酵母(參見(jiàn)例如Chen 和 Ho, 1993, Appl. Biochem. Biotechnol.(生物化學(xué)和生物技術(shù))39-40 :135-147 ；Ho 等人，1998，Appl. Environ. Microbiol.(微生物學(xué)應(yīng)用和環(huán)境)64 :1852-1859)或細(xì)菌例如大腸桿菌(參見(jiàn)例如Beall等人，1991，Biotech. Bioeng.
(生物技術(shù)和生物工程)38 :296_303)、產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)(參見(jiàn)例如Ingram等人，1998, Biotechnol. Bioeng.(生物技術(shù)和生物工程)58 :204_214)、或運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(參見(jiàn)例如 Zhang 等人，1995, Science(科學(xué))267 :240-243 ；Deanda 等人，1996, Appl.Environ. Microbiol.(微生物學(xué)應(yīng)用和環(huán)境)62 =4465-4470)中克隆異源基因使構(gòu)建的生物能夠?qū)⒓禾呛臀焯寝D(zhuǎn)換為乙醇(共發(fā)酵)。此類(lèi)微生物能夠有利地用于本發(fā)明的方法。在某些實(shí)施例中，發(fā)酵微生物是具有改善的乙酸鹽耐受性的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利公布US 2009/0221078)。在某些實(shí)施例中，發(fā)酵微生物是具有改善的木糖利用率的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利公布US 2009/0246846)ο在某些實(shí)施例中，發(fā)酵微生物是具有將戊糖發(fā)酵為乙醇的能力的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利公布US 2003/0162271)。6. 6. 5.發(fā)酵培養(yǎng)基在一些方面，本發(fā)明的SSF反應(yīng)或方法在發(fā)酵培養(yǎng)基或完全發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“發(fā)酵培養(yǎng)基”是指SSF反應(yīng)發(fā)生所必需的所有組分存在之前的培養(yǎng)基。因此，發(fā)酵培養(yǎng)基能夠是例如得自部分糖化方法的培養(yǎng)基。在其他實(shí)施例中，發(fā)酵培養(yǎng)基能夠是包含SSF反應(yīng)發(fā)生所必需的所有組分的培養(yǎng)基。在此種情況下，發(fā)酵培養(yǎng)基也稱(chēng)為“完全發(fā)酵培養(yǎng)基”。此外，在其他實(shí)施例中，發(fā)酵培養(yǎng)基能夠是其中SSF反應(yīng)處于進(jìn)行中的培養(yǎng)基，因此該培養(yǎng)基可包含某些糖化產(chǎn)物。完全發(fā)酵培養(yǎng)基包含能夠水解碳水化合物基纖維質(zhì)底物或其他底物的酶、發(fā)酵生物、和碳水化合物基纖維質(zhì)底物或其他底物(例如下面第6. 7. 2節(jié)中所述)。在完全發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)過(guò)程中，可發(fā)酵糖通過(guò)酶水解形成，繼而通過(guò)發(fā)酵生物代謝而產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物。6.7.同步糖化發(fā)酵方法在某些方面，本發(fā)明的SSF反應(yīng)在25°C和50°C之間的溫度下進(jìn)行。例如，SSF反應(yīng)在25°C或以上、28°C或以上、30°C或以 上、32°C或以上、35°C或以上、或38°C或以上的溫度下發(fā)生。例如，SSF反應(yīng)在50°C或以下、45°C或以下、40°C或以下、38°C或以下、35°C或以下、或30°C或以下的溫度下發(fā)生。例如，SSF反應(yīng)在28V至45°C，例如30°C至40°C、32°C至38°C的溫度范圍內(nèi)發(fā)生。在示例性實(shí)施例中，SSF反應(yīng)在32°C至35°C的溫度下進(jìn)行。在另一個(gè)實(shí)施例中，SSF反應(yīng)在約32°C的溫度下進(jìn)行。在反應(yīng)期間，SSF反應(yīng)進(jìn)行的溫度能夠例如調(diào)聞或調(diào)低。在SSF中，纖維素的酶水解和葡萄糖發(fā)酵為乙醇組合成一個(gè)步驟(參見(jiàn)例如Philippidis, 1996，“Cellulose bioconversion technology” (纖維素生物轉(zhuǎn)化技術(shù))，Handbook on Bioethanol:Production and Utilization (生物乙醇手冊(cè)生產(chǎn)和利用)，Wyman 編輯，Taylor & Francis, Washington, D. C.，第 179-212 頁(yè))。SSF過(guò)程通常以分批發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行，其中發(fā)酵從開(kāi)始至完成在單個(gè)發(fā)酵罐中進(jìn)行。作為另外一種選擇，SSF過(guò)程能夠以連續(xù)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行，該過(guò)程是運(yùn)行無(wú)中斷的穩(wěn)定狀態(tài)的發(fā)酵體系，并且其中每個(gè)發(fā)酵階段在給定發(fā)酵體系的單獨(dú)部分進(jìn)行，流量設(shè)置對(duì)應(yīng)于所需的保留時(shí)間。換句話(huà)講，本發(fā)明發(fā)酵過(guò)程中的單個(gè)步驟能夠以分批方式或連續(xù)方式進(jìn)行。本文設(shè)想了其中所有步驟以分批方式進(jìn)行的過(guò)程，或其中所有步驟以連續(xù)方式進(jìn)行的過(guò)程，或其中一個(gè)或多個(gè)步驟以分批方式進(jìn)行并且一個(gè)或多個(gè)步驟以連續(xù)方式進(jìn)行的過(guò)程。在某些實(shí)施例中，分批補(bǔ)料SSF過(guò)程可以是所期望的。分批補(bǔ)料過(guò)程需要分批階段和進(jìn)料階段。分批階段的培養(yǎng)基和進(jìn)料階段過(guò)程中加入的培養(yǎng)基是化學(xué)成分限定的，并且進(jìn)料階段的培養(yǎng)基在至少一部分進(jìn)料階段，以遵循預(yù)定義的指數(shù)函數(shù)的進(jìn)料速率加入，從而使比生長(zhǎng)速率保持在預(yù)定義值。本發(fā)明的SSF反應(yīng)能夠合適地進(jìn)行3至7天的時(shí)間。例如，本發(fā)明的SSF反應(yīng)能夠進(jìn)行最多3天、4天、5天、6天、或7天。本發(fā)明的SSF發(fā)酵過(guò)程包括但不限于用于制備發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵過(guò)程，所述發(fā)酵產(chǎn)物包括醇(例如乙醇、甲醇、丁醇、1，3-丙二醇)、有機(jī)酸(例如檸檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡萄糖酸、葡萄糖酸鹽、乳酸、琥珀酸、2，5-二酮-D-葡萄糖酸)、酮(例如丙酮)、氨基酸(例如谷氨酸)、氣體(例如H2和C02)、以及更復(fù)雜的化合物，包括例如抗生素(例如青霉素和四環(huán)素)、酶、維生素(例如核黃素、Β12、β-胡蘿卜素)、激素和其他化合物。在某些方面，本發(fā)明提供一組特別適用于重組發(fā)酵細(xì)菌例如發(fā)酵單胞菌的SSF條件(即，本文也稱(chēng)為“重組發(fā)酵單胞菌SSF條件”)。例如，這些條件包括使用預(yù)處理的底物，例如玉米芯、蔗渣、牛皮紙漿底物以合適的重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌厭氧地實(shí)施SSF燒瓶批次，以及使反應(yīng)在約33°C、pH 5. 8以及約10重量％至25重量％固體負(fù)載量下進(jìn)行，固體負(fù)載量取決于具體的底物和預(yù)處理。這些條件還包括例如通過(guò)向反應(yīng)混合物中加入10%合適的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌菌株，例如菌株ZW705 (重組體)或ZWl (野生型)種菌(5克)來(lái)開(kāi)始發(fā)酵，無(wú)需任何另外的營(yíng)養(yǎng)物。在某些方面，本發(fā)明提供一組特別適用于發(fā)酵微生物的SSF條件，所述微生物為真菌，例如釀酒酵母(即，本文也稱(chēng)為“酵母SSF條件”)。例如，這些條件包括利用合適的酵母菌株，例如Thermosaccw dry酵母，在38°c和ph 5.0下進(jìn)行反應(yīng)，以ο. ι重量％接種，無(wú)需任何另外的營(yíng)養(yǎng)物，通過(guò)例如CO2釋氣，使用包含預(yù)處理底物、水、硫酸、糖化酶和酵母菌株的反應(yīng)混合物，并且以適當(dāng)?shù)乃俣?，例如IOORPM攪拌反應(yīng)容器合適的時(shí)間段例如3天來(lái)厭氧地實(shí)施SSF批次。6. 7. L SSF產(chǎn)物的回收發(fā)酵產(chǎn)物能夠是發(fā)酵生物產(chǎn)生的任何物質(zhì)。在具體方面，該物質(zhì)是醇。應(yīng)當(dāng)理解， 術(shù)語(yǔ)“醇”涵蓋包含一種或多種羥基部分的物質(zhì)。在具體方面，醇是阿拉伯糖醇。在另一方面，醇是丁醇。在另一方面，醇是乙醇。在另一方面，醇是甘油。在另一方面，醇是甲醇。在另一方面，醇是I，3-丙二醇。在又一方面，醇是山梨醇。在又一方面，醇是木糖醇。參見(jiàn)例如Gong等人，1999,“Ethanol production from renewable resources'由可再生資源制備乙醇)，Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology(生物化學(xué)工程 / 生物技術(shù)進(jìn)展)，Scheper 編輯，Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany, 65 :207-241 ；Silveira和 Jonas 2002, Appl. Microbiol. Biotechnol.(微生物和生物技術(shù)應(yīng)用)59 :400-408 ；Nigam和 Singh, 1995, Process Biochem.(生物化學(xué)進(jìn)展)30 (2) : 117-124 ；Ezeji 等人，2003, WorldJ. Microbiol. Biotechnol.(世界微生物和生物技術(shù)期刊)19(6) : 595-603。能夠?qū)Φ米园l(fā)酵步驟的發(fā)酵液進(jìn)行蒸餾，以回收發(fā)酵產(chǎn)物例如乙醇。發(fā)酵和蒸餾步驟能夠同步或分步/順序進(jìn)行。在一些方面，蒸餾后，回收兩種產(chǎn)物醇例如乙醇以及發(fā)酵剩余物或殘余產(chǎn)物(全釜餾物)。醇是與水的共沸混合物，在分離步驟中通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法例如分子篩分法進(jìn)一步純化。例如，能夠得到純度最多約96體積％的乙醇，所述乙醇能夠用作例如燃料乙醇、飲用乙醇即飲用中性酒精、或工業(yè)乙醇。對(duì)于其他物質(zhì)或發(fā)酵產(chǎn)物，本領(lǐng)域已知的任何方法均能夠用于回收，包括但不限于色譜法(例如離子交換、親和、疏水、色譜聚焦和分子排阻)、電泳步驟(例如制備式等電聚焦)、差別溶解(例如硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE、蒸餾、或萃取。6. 7. 2.碳水化合物或給料的來(lái)源任何合適的纖維質(zhì)底物或原料都能夠應(yīng)用于本發(fā)明的SSF過(guò)程。如本領(lǐng)域所熟 知，能夠根據(jù)所需的發(fā)酵產(chǎn)物，即得自發(fā)酵的物質(zhì)，以及使用的方法來(lái)選擇底物。適用于本發(fā)明方法的底物實(shí)例包括含有纖維素的材料，例如木材廢料或植物殘?bào)w或能夠隨后通過(guò)發(fā)酵微生物代謝而從處理纖維素材料獲得的低分子糖DP1-3，和/或能夠通過(guò)直接加入發(fā)酵培養(yǎng)基來(lái)提供低分子糖DP1-3。生物質(zhì)能夠包括含纖維素和/或半纖維素的任何組合物(木質(zhì)纖維素生物質(zhì)也能夠包含木質(zhì)素)，例如種子、谷物、塊莖、植物廢料或食品加工或工業(yè)加工副產(chǎn)物(例如莖)、玉米(包括芯、稻桿等等)、草(例如印度草，如黃假高梁(Sorghastrum nutans);或軟枝草，例如黍?qū)?Panicum)物種例如柳枝稷(Panicum virgatum))、木材(包括木片、加工廢料)、紙材、紙漿、回收紙(例如報(bào)紙)。其他生物質(zhì)材料包括但不限于土豆、大豆(油菜籽)、大麥、黑麥、燕麥、小麥、甜菜或鹿洛。6.8.牛物質(zhì)的預(yù)處理
在SSF反應(yīng)前，生物質(zhì)(例如木質(zhì)纖維素材料)優(yōu)選地經(jīng)過(guò)預(yù)處理步驟以使木聚糖、半纖維素、纖維素和/或木質(zhì)素材料更容易接觸酶，因此更容易通過(guò)本發(fā)明的方法進(jìn)行糖化和發(fā)酵。在一個(gè)方面，預(yù)處理需要將合適容器例如反應(yīng)器中的干燥生物質(zhì)材料接觸催化齊U，所述催化劑包含強(qiáng)酸和金屬鹽的稀釋溶液；這樣能夠降低纖維素水解的活化能或溫度，以得到更高的糖產(chǎn)量；參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利6，660，506,6, 423，145。另一個(gè)示例性預(yù)處理方法需要使材料經(jīng)過(guò)第一階段水解步驟來(lái)水解生物質(zhì)，該步驟在含水培養(yǎng)基中進(jìn)行，所選擇的溫度和壓力水平會(huì)實(shí)現(xiàn)半纖維素的初步解聚，而纖維素不會(huì)大量解聚為葡萄糖。該步驟產(chǎn)生了漿液，其中液體水相包含半纖維素解聚得到的溶解單糖，固相包含纖維素和木質(zhì)素。第二水解步驟能夠涉及這樣的條件，在此條件下至少纖維素主要部分解聚，從而得到含溶解/可溶解纖維素解聚產(chǎn)物的液體水相。參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利 5，536，325。另一個(gè)示例性方法包括使用約O. 4%至2%的強(qiáng)酸，通過(guò)一個(gè)或多個(gè)階段的稀酸水解來(lái)處理生物質(zhì)材料；以及通過(guò)堿法脫木素處理酸水解生物質(zhì)材料的未反應(yīng)固體木質(zhì)纖維素組分。參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利6，409, 841。另一個(gè)示例性預(yù)處理方法包括在預(yù)水解容器例如反應(yīng)器中預(yù)水解生物質(zhì)(例如木質(zhì)纖維素材料)；將酸性液體加入固體木質(zhì)纖維素材料制得混合物；將混合物加熱至合適的反應(yīng)溫度；保持反應(yīng)溫度一段時(shí)間，使之足夠使木質(zhì)纖維素材料分解成溶解部分和固體部分，所述溶解部分包含至少約20%得自木質(zhì)纖維素材料的木質(zhì)素，所述固體部分包含纖維素；將溶解部分從固體部分移除，同時(shí)使混合物保持在反應(yīng)溫度或附近，在這樣的情況下使得固體部分中的纖維素更容易被酶消化；以及回收溶解部分。參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利5，705，369。在另一個(gè)示例性方法中，預(yù)處理方法使用過(guò)氧化氫H202。參見(jiàn)例如Gould，1984，Biotech.Bioengr. 26:46-52。在又一個(gè)示例性方法中，預(yù)處理包括使生物質(zhì)以非常低的生物質(zhì)濃度接觸化學(xué)計(jì)量的氫氧化鈉和氫氧化銨。參見(jiàn)例如Teixeira等人，1999,Appl. Biochem. Biotech.(生物化學(xué)和生物技術(shù)應(yīng)用)77-79:19-34。在另一個(gè)實(shí)施例中，預(yù)處理包括使木質(zhì)纖維素在約9至約14的pH、適當(dāng)溫度、壓力和PH下接觸化學(xué)品(例如堿，如碳酸鈉或氫氧化鉀)。參見(jiàn)例如PCT專(zhuān)利申請(qǐng)公布W02004/081185。在另一個(gè)示例性方法中，預(yù)處理使用氨。例如，預(yù)處理方法包括在高固體含量的條件下使生物質(zhì)接觸低濃度的氨。參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利公布20070031918、PCT專(zhuān)利申請(qǐng)公布WO2006/11901。本發(fā)明還通過(guò)以下實(shí)例闡述。這些實(shí)例的提供僅出于例證性目的。它們不應(yīng)解釋為以任何方式限制本發(fā)明的范圍或內(nèi)容。7.實(shí)例I =SSF反應(yīng)中Exp形成的分析7. I.材料與方法7. I. I.底物下面列出這項(xiàng)工作中所用的底物。也列出預(yù)處理底物的纖維素、木聚糖和木質(zhì)素組分。組成分析利用 “NREL protocols for Standard Biomass Analytical Procedures”(標(biāo)準(zhǔn)生物質(zhì)分析步驟的 NREL 方案)(可在 http://www. nrel. gov/biomass/pdfs/42618. pdf處獲得)中詳述的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定法進(jìn)行稀氨水預(yù)處理的玉米芯。在酶促水解之前對(duì)玉米芯進(jìn)行預(yù)處理，根據(jù)例如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布 2007-0031918-A1、US-2007-0031919-A1、US-2007-0031953-A1、US-2007-0037259-A1，和PCT專(zhuān)利申請(qǐng)公布W006/110901 A2中描述的方法和加工范圍進(jìn)行(除非另外指明)。該底物的組成包含34. 8%纖維素、29. 2%木聚糖、12. 8%木質(zhì)素。稀硫酸預(yù)處理的蔗渣。這種底物由NREL生產(chǎn)和提供，如Schell等人，2003 (App.Biochem. Biotechnol.(生物化學(xué)和生物技術(shù)應(yīng)用)第105-108卷,69_85)中詳述的。對(duì)鹿渣進(jìn)行預(yù)處理，處理?xiàng)l件為固體濃度為20% (重量/重量)，溫度為165°C，酸濃度為1.44%(重量/重量)，以及停留時(shí)間約為8min。該底物的組成包含:55. 0%纖維素、3. 1%木聚糖、 31. 2%木質(zhì)素?；旌系墓I(yè)未漂白闊葉紙漿底物。這種底物利用牛皮紙漿制法和氧脫木素方法制備(卡伯值=13)。(研究得到 I’Agence Nationale de la Recherche (ANR-05-BI0E-007)與11 Agence de I’Environnement et de la Maitrise de 11 Energie(ADEME 0501C0099)資助)。該底物的組成包含:74. 6%纖維素、20. 7%木聚糖、2. 6%木質(zhì)素。工業(yè)未漂白針葉紙漿底物。這種底物利用牛皮紙漿制法和氧脫木素方法制備(卡伯值=14)。(研究得到 I’Agence Nationale de la Recherche (ANR-O5-BI0E-007)與11 Agence de I jEnvironnement et de la Maitrise de 11 Energie (ADEME 0501C0099)資助)。該底物的組成包含81. 9%纖維素、8. 0%木聚糖、I. 9%木質(zhì)素。7. I. 2.酶下面列出這項(xiàng)工作中所用的酶和酶混合物。Accellerase 1500 (Danisco U. S. Inc. , Genencor)是具有較高 β -葡萄糖昔酶活性的纖維素酶復(fù)合物，其由經(jīng)基因修飾的里氏木霉制備。它包含多種酶活性，其中的大多數(shù)為外切葡聚糖酶活性、內(nèi)葡聚糖酶活性、β -葡萄糖苷酶活性，和半纖維素酶活性。Multifect 木聚糖酶(Danisco U. S. Inc.，Genencor)也由里氏木霉生產(chǎn)，是半纖維素酶復(fù)合物，其設(shè)計(jì)用于充當(dāng)為全纖維素酶補(bǔ)充木聚糖酶活性的輔助產(chǎn)品，以及用于協(xié)同作用從而促進(jìn)木質(zhì)纖維素生物質(zhì)加工工業(yè)中的各種多糖轉(zhuǎn)化。Mukifeetx木聚糖酶中的主要木聚糖酶活性是里氏木霉Xyn2的木聚糖酶活性(參見(jiàn)LaGrange等人，1996, Appl.Environ. Microbiol.(微生物應(yīng)用和環(huán)境)62 :1036 - 1044)。Bxll :是來(lái)自里氏木霉的木糖苷酶。Bxll的氨基酸序列是隨同本文提供的SEQID Ν0:4。已在使用對(duì)硝基苯基-β-吡喃木糖苷、木二糖或混合的線(xiàn)性木聚糖低聚物作為底物的測(cè)定中，證明Bxll具有β -木糖苷酶活性。Χ η3 :是來(lái)自里氏木霉的GHlO家族木聚糖酶。Xyn3的氨基酸序列是隨同本文提供的SEQ ID NO: 18。已使用樺木偶氮木聚糖(Megazyme, Wicklow, Ireland)證明Xyn3具有內(nèi)切木聚糖酶活性，而且當(dāng)Xyn3與木二糖糖苷酶共同對(duì)預(yù)處理的生物質(zhì)或分離的半纖維素起作用時(shí)在木二糖糖苷酶的存在下Xyn3具有增大木糖單體產(chǎn)量的能力，這間接地證明了這一點(diǎn)。
FvM :是來(lái)自輪枝鐮孢菌的GH3家族酶。Fv3A的氨基酸序列是隨同本文提供的SEQID N0:6。已在使用對(duì)硝基苯基-β-吡喃木糖苷、木二糖和混合的線(xiàn)性木聚糖低聚物(圖15和16)以及來(lái)自半纖維素的支化的阿糖基木聚糖低聚物作為底物的測(cè)定中，證明Fv3A具有β -木糖苷酶活性。Fv51A是來(lái)自輪枝鐮孢菌的GH51家族酶。Fv51A的氨基酸序列是本文提供的SEQID NO: 16。已在使用對(duì)硝基苯基-a-L-阿拉伯呋喃糖苷的測(cè)定中，證明Fv51A具有L-α-阿拉伯呋喃糖苷酶活性，而且半纖維素因內(nèi)切木聚糖酶的作用而釋放的一組低聚物釋放出阿拉伯糖也證明了這一點(diǎn)。Fv43D :是來(lái)自輪枝鐮孢菌的GH43家族酶。Fv43D的氨基酸序列是本文提供的SEQID N0:2。已在使用對(duì)硝基苯基-β-吡喃木糖苷、木二糖或混合的線(xiàn)性木聚糖低聚物作為底物的測(cè)定中，證明Fv43D具有β -木糖苷酶活性。(圖15和16)。Fv43B :是來(lái)自輪枝鐮孢菌的GH43家族酶。Fv43B的氨基酸序列是本文提供的SEQID NO: 12。已在使用對(duì)硝基苯基-β-吡喃木糖苷、木二糖或混合的線(xiàn)性木聚糖低聚物作為底物的測(cè)定中，證明Fv43E具有β -木糖苷酶活性。Pf43A :是來(lái)自繩狀青霉的GH43家族酶。Pf43A的氨基酸序列是本文提供的SEQID N0:8。已在使用對(duì)硝基苯基-β-吡喃木糖苷、木二糖或混合的線(xiàn)性木聚糖低聚物作為底物的測(cè)定中，證明Pf43A具有β -木糖苷酶活性。Fv43E :是來(lái)自輪枝鐮孢菌的GH43家族酶。Fv43E的氨基酸序列是本文提供的SEQID NO: 10。已在使用對(duì)硝基苯基-β-吡喃木糖苷、木二糖或混合的線(xiàn)性木聚糖低聚物作為底物的測(cè)定中，證明Fv43E具有β -木糖苷酶活性。Af43A :是來(lái)自煙曲霉的GH43家族酶。Af43A的氨基酸序列是本文提供的SEQ IDNO: 14。已在使用對(duì)硝基苯基-a -L-阿拉伯呋喃糖苷的測(cè)定中，證明Af43A具有L- a -阿 拉伯呋喃糖酶活性，而且半纖維素因內(nèi)切木聚糖酶的作用而釋放的一組低聚物釋放出阿拉伯糖也證明了這一點(diǎn)。XlnA Χ1ηΑ 是來(lái)自塔賓曲霉(Aspergillus tubengensis)的木聚糖酶。XlnA的氨基酸序列是本文提供的SEQ ID NO: 20。本實(shí)例中所用的HnA蛋白質(zhì)是未純化的，是主要組分為HnA的酶制品形式。Mil=Bgll是里氏木霉β-葡萄糖苷酶I (SEQ ID NO: 26)。Bgll基因已在如下文獻(xiàn)中描述例如 Barnett 等人，1991, Bio-Technology (生物技術(shù))9 (6) :562_567。7. I. 3.菌株菌株#229 利用PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化(參見(jiàn)，例如Penttila等人，1987，Gene61(2) :155-64)，將通過(guò)誘變和選擇高纖維素酶生產(chǎn)滴度從RL-P37 (Sheir-Neiss和Montenecourt, 1984, Appl. Microbiol. Biotechnol.(微生物和生物技術(shù)應(yīng)用)20 46-53)得到的里氏木霉菌株用β-葡萄糖苷酶表達(dá)盒(其包含cbhl啟動(dòng)子、里氏木霉β-葡糖苷酶I基因、cbhl終止子和amdS標(biāo)記(構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶))和內(nèi)切木聚糖酶表達(dá)盒(其包含cbhl啟動(dòng)子、里氏木霉xyn3和cbhl終止子)進(jìn)行共轉(zhuǎn)化。分離出許多轉(zhuǎn)化體并對(duì)它們的β -葡萄糖苷酶和內(nèi)切木聚糖酶生產(chǎn)進(jìn)行檢測(cè)。將一個(gè)稱(chēng)為里氏木霉菌株#229的轉(zhuǎn)化體用于本文所述的某些研究中。菌株Η3Α :利用電穿孔(參見(jiàn)，例如，PCT專(zhuān)利申請(qǐng)公布TO2008/153712 Α2)，將里氏木霉菌株#229用β -木糖苷酶Fv3A表達(dá)盒(其包含cbhl啟動(dòng)子、fv3A基因、cbhl終止子和alsR標(biāo)記(天然里氏木霉乙酰乳酸合酶的氯嘧磺隆抗性突變體))、β -木糖苷酶Fv43D表達(dá)盒(其包含egl I啟動(dòng)子、fv43D基因、天然fv43D終止子)和Fv5IA α -阿拉伯呋喃糖苷酶表達(dá)盒(其包含egll啟動(dòng)子、fv51A基因、天然fv51A終止子)進(jìn)行共轉(zhuǎn)化。在含有氯嘧磺隆的Vogels瓊脂板上挑選轉(zhuǎn)化體。分離出許多轉(zhuǎn)化體并對(duì)它們的β -木糖苷酶和L- α -阿拉伯呋喃糖苷酶生產(chǎn)進(jìn)行檢測(cè)。分離出重組表達(dá)里氏木霉β-葡萄糖苷酶I、里氏木霉xyn3、Fv3A, Fv51A,和Fv43D，的里氏木霉整合型表達(dá)菌株H3A，并將其用于本文所述的某些研究中。 7. I. 4.牛物和種菌制各7. I. 4. I.運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌置量運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌菌株ZWl是野生型菌株，類(lèi)似于來(lái)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC 31821, Manassas, VA)的菌株ZM4。重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌菌株ZW705由菌株ZW801-4制得，如下所概述。讓運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌菌株ZW801-4的培養(yǎng)物在如下所述的應(yīng)力條件下生長(zhǎng)。ZW801-4是運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的木糖利用重組菌株，其描述在美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布2008/0286870中。菌株ZW801-4來(lái)源于菌株ZW800，菌株ZW800繼而來(lái)源于菌株ZW658，它們都描述于美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布2008/0286870中。ZW658通過(guò)下列方法構(gòu)建經(jīng)由連續(xù)的轉(zhuǎn)座事件將兩個(gè)包含編碼木糖異構(gòu)酶、木酮糖激酶、轉(zhuǎn)醛醇酶和轉(zhuǎn)酮醇酶的四個(gè)木糖利用基因的操縱子PgapXylAB和Pgaptaltkt整合到ZWl (ATCC#31821)基因組中，然后在含有木糖的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行適應(yīng)步驟。ZW658的保藏號(hào)為ATCC#PTA-7858。在ZW658中，利用宿主介導(dǎo)的雙交換同源重組，以壯觀霉素抗性為選擇性標(biāo)記對(duì)編碼葡萄糖-果糖氧化還原酶的基因插入失活從而構(gòu)建ZW800。使用Cre重組酶通過(guò)位點(diǎn)特異性重組除去以IoxP位點(diǎn)為邊界的壯觀霉素抗性標(biāo)記，從而構(gòu)建ZW801-4。將ZW801-4的連續(xù)培養(yǎng)物培養(yǎng)于250mL pH和溫度受控的攪拌發(fā)酵罐(Sixfors; Bottmingen, Switzerland)中。發(fā)酵的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是5g/L酵母提取物、15mM憐酸銨、lg/L硫酸鎂、IOmM山梨醇、50g/L木糖和50g/L葡萄糖。通過(guò)逐漸增大上述連續(xù)培養(yǎng)基中的醋酸銨濃度，同時(shí)維持如通過(guò)在97天的時(shí)間內(nèi)達(dá)到160mM濃度所需的特定稀釋速率測(cè)得的既定生長(zhǎng)速率，實(shí)現(xiàn)在高濃度醋酸鹽和氨的存在下培養(yǎng)的適應(yīng)。通過(guò)增量添加磷酸銨來(lái)進(jìn)一步增大銨離子的濃度，直至在139天的連續(xù)培養(yǎng)結(jié)束時(shí)達(dá)到210mM的最終總銨離子濃度。通過(guò)平板法、PCR擴(kuò)增和/或其他常規(guī)的熟知方法，從適應(yīng)的種群中分離出菌株ZW705。7. I. 4. 2.用于SSF的種子培養(yǎng)物的牛長(zhǎng)將運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌菌株ZW705和ZWl作為20%甘油儲(chǔ)液保存，冷凍在_80°C下。為了制備種子培養(yǎng)物，將2mL的這種凍存儲(chǔ)液解凍，并用來(lái)接種45mL pH 5. 8的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基含有5g/L酵母提取物、4g/L磷酸氫鉀、lg/L硫酸鎂和100g/L葡萄糖。起始OD 600nm為O. 4。讓該培養(yǎng)物于32°C在50mL的加蓋管中生長(zhǎng)至OD 600nm為約2. 5，然后將其用來(lái)接種pH5. 8的最終種子培養(yǎng)物，所述培養(yǎng)物含有200g/L葡萄糖、4g/L磷酸氫鉀、2g/L硫酸鎂和20g/L酵母提取物。讓該培養(yǎng)物于32°C在pH受控的攪拌發(fā)酵罐中生長(zhǎng)，直至OD 600nm為約10和剩余葡萄糖濃度為約80g/L。使用與10%SSF發(fā)酵體積相等的體積的這種種子培養(yǎng)物(具有約10的0D600nm)來(lái)啟動(dòng)SSF。
7. L 4. 3.酵母所用的產(chǎn)乙醇酵母為T(mén)HERMOSACC DRY酵母(EthanolTechnology, Milwaukee, WI),其只能夠使C6 (即，葡萄糖)碳糖發(fā)酵成乙醇(EtOH)。在接種之前，將干酵母用無(wú)菌去離子水水化2至3小時(shí)。7. I. 5.使用糖的發(fā)酵采用分批和分批補(bǔ)料方法,在500mLSixfors生物反應(yīng)器中使用合成糖進(jìn)行運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌發(fā)酵，持續(xù)3天。合成糖由葡萄糖和木糖組成。對(duì)于分批方法，初始裝載約80g/L葡萄糖和70g/L木糖的濃度的糖。對(duì)于分批補(bǔ)料方法，首先制備濃縮儲(chǔ)備糖溶液，然后利用注射器泵(PHD2000, Harvard Apparatus, Holliston, MA)注入生物反應(yīng)器中。對(duì)流速進(jìn)行設(shè)定和控制，使得它在第3天時(shí)供給約80g/L葡萄糖和70g/L木糖的最終等效糖負(fù)載量。對(duì)于分批或分批補(bǔ)料方法，開(kāi)始時(shí)將10重量％的發(fā)酵單胞菌屬種菌裝入反應(yīng)混合物中，并在33°C和pH 5. 5下進(jìn)行厭氧發(fā)酵。7. L 6.同步糖化發(fā)酵(SSF)SSF燒瓶批次在適宜的重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌和酵母發(fā)酵條件下厭氧進(jìn)行。除非另有說(shuō)明，否則使用稀氨水預(yù)處理的玉米芯、蔗渣或牛皮紙漿底物的重組發(fā)酵單胞菌屬SSF實(shí)驗(yàn)都在33°C、pH 5. 8下，分別以25重量％、20重量％、10重量％固體負(fù)載量進(jìn)行。首先將25重量％固體(12. 5g干重)、20重量％固體(10. Og干重)或10重量％固體(5. Og干重)的相應(yīng)底物各自裝入125mL錐形瓶中，接著加入預(yù)先與所需量的6N硫酸混合的去離子水以便將底物PH滴定至5. 8。添加上述纖維素酶和半纖維素酶，它們的添加量分別基于生物質(zhì)底物中的毫克纖維素酶蛋白質(zhì)/克纖維素和毫克半纖維素酶蛋白質(zhì)/克木聚糖。通過(guò)向反應(yīng)混合物中加入10重量％的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌菌株ZW705 (重組)或ZWl (野生型)種菌(5g)開(kāi)始發(fā)酵，無(wú)需另外的營(yíng)養(yǎng)物。對(duì)于TH ER MOSACXw DRY酵母SSF，該反應(yīng)在38°C和pH5. O下進(jìn)行。酵母接種水平為O. 1%重量/重量，無(wú)任何另外的營(yíng)養(yǎng)物。通過(guò)從用來(lái)封蓋燒瓶的橡膠塞突出的23號(hào)針保持無(wú)氧環(huán)境和CO2釋氣。在發(fā)酵開(kāi)始時(shí)，所有SSF批次都在燒瓶中具有初始50g總反應(yīng)重量，反應(yīng)混合物由預(yù)處理的底物、水、硫酸、酶以及發(fā)酵單胞菌屬或酵母細(xì)胞組成。將燒瓶放在振蕩培養(yǎng)箱(New Brunswick Scientific, Innova 44, Edison, NewJersey)內(nèi)以100RPM搖動(dòng)3天。7. I. 7.分步水解發(fā)酵(SHF)SHF批次涉及糖化階段，糖化階段之后是發(fā)酵階段。除了對(duì)酶類(lèi)型和/或水平、纖維素負(fù)載量和pH的某些修改之外，糖化條件都是基于“NREL LaboratoryAnalytical Procedure” (NREL 實(shí)驗(yàn)室分析步驟)(參見(jiàn)，Selig 等人,2008, EnzymaticSaccharifcation of Lignocellulosic Biomass Laboratory Analytical Procedure(LAP), Technical Report (木質(zhì)纖維素生物質(zhì)酶糖化的實(shí)驗(yàn)室分析方法(LAP)技術(shù)報(bào)告)NREL/TP-510-42629)。將25重量％固體(12. 5g干重)的稀氨水預(yù)處理的玉米芯或10重量％固體(5. Og干重)的混合闊葉紙漿裝入125mL錐形瓶中。然后，接著加入預(yù)先與所需量的6N硫酸混合的去離子水以便將底物pH滴定至5. 3。糖化步驟通過(guò)加入纖維素酶和半纖維素酶開(kāi)始，纖維素酶和半纖維素酶的添加量分別基于生物質(zhì)底物中的總毫克蛋白質(zhì)/克纖維素和總毫克蛋白質(zhì)/克木聚糖。對(duì)于所有發(fā)酵單胞菌屬SHF批次，溫度50°C和pH 5. 30用于持續(xù)3天的糖化，接著利用與SSF過(guò)程(上文)中描述的條件相似的條件進(jìn)行發(fā)酵步驟。使用氫氧化鈉將pH值從5. 3增大至5. 8。然后加入10重量％的發(fā)酵單胞菌屬種菌從而開(kāi)始發(fā)酵。7. I. 8.分枇補(bǔ)料 SSF分批補(bǔ)料SSF研究在與SSF過(guò)程(上文)中描述的條件相似的條件下進(jìn)行，不同的是將稀氨水預(yù)處理的玉米芯底物(獲得最終25重量％固體所需的)平均分成8批，并分批加入生物反應(yīng)器中，最后一批在第30小時(shí)裝載。7. L 9. HPLC 分析和 EXP 定量按定時(shí)的間隔取出發(fā)酵樣品，并利用Waters HPLC系統(tǒng)(Alliance system, WatersCorp.，Milford, MA)對(duì)乙醇、殘余糖、乙基_ β -吡喃木糖苷(EXP)和其他代謝產(chǎn)物，例如，乙酸和甘油進(jìn)行分析。HPLC色譜柱購(gòu)自BioRad (Aminex ΗΡΧ-87Η, BioRad Inc.，Hercules, CA)。根據(jù)折射指數(shù)檢測(cè)的EXP定量按照與Zhang等人(2009, Enzyme andMicrobial Technology (酶和微生物技術(shù))44 :196-202)所述類(lèi)似的一整套步驟進(jìn)行。發(fā)現(xiàn)另一種代謝副產(chǎn)物琥珀酸與EXP共洗脫，并潛在地使EXP定量值增大。經(jīng)測(cè)定，對(duì)于酵母和發(fā)酵單胞菌屬發(fā)酵，在測(cè)試條件下產(chǎn)生的琥珀酸濃度不超過(guò)I至2g/L，如利用UV檢測(cè)器在 220nm 處和酶分析試劑盒(K-SUCC, Megazyme, Co. Wicklow, Ireland)測(cè)得的。7.2.結(jié)果7. 2. L EXP形成和鑒定7. 2. I. I.使用重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的SSF中的EXP形成使用能夠使葡萄糖和木糖共發(fā)酵成乙醇的重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌菌株，在上述SSF發(fā)酵條件下觀察到副產(chǎn)物的形成。這項(xiàng)研究中所用的底物是稀氨水預(yù)處理的玉米芯，其具有高木聚糖含量，并用市售纖維素酶/半纖維素酶制品(20mg/g纖維素的Accellerase 1500)和Multifeet 木聚糖酶(5mg/g木聚糖)進(jìn)行處理，這二者都來(lái)源于里氏木霉。在測(cè)試條件下，發(fā)現(xiàn)分批補(bǔ)料SSF中的副產(chǎn)物的形成量最大，SSF中的副產(chǎn)物的形成量第二大(表
I)。使用稀氨水預(yù)處理的玉米芯的SHF、使用糖(80g/L葡萄糖+70g/L木糖)的分批和分批補(bǔ)料發(fā)酵過(guò)程形成的這種副產(chǎn)物的量很少。使用稀氨水預(yù)處理的玉米芯和如上所述的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌菌株，在SSF條件下產(chǎn)生的副產(chǎn)物在HPLC HPX-87H色譜柱上的洗脫時(shí)間為約11. 75min(在0. 6mL/min的流速下)，與琥珀酸的洗脫時(shí)間接近。圖I第2組示出在將木糖和Muhifeet''5木聚糖酶與乙醇溫育之后在11.611min洗脫的峰。當(dāng)溫育過(guò)程中無(wú)醇存在時(shí)，這個(gè)特定峰不存在。發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫育過(guò)程中有醇存在時(shí)產(chǎn)生的副產(chǎn)物的位置朝某一方向發(fā)生一定程度的遷移，所述方向和程度隨著所添加的醇變化。與甲醇(MeOH)溫育之后產(chǎn)生的副產(chǎn)物的洗脫時(shí)間為19. 46min，與n-Pr0H溫育之后產(chǎn)生的副產(chǎn)物的洗脫時(shí)間為27.65min，它們分別短于和長(zhǎng)于與乙醇(EtOH)溫育之后產(chǎn)生的副產(chǎn)物的洗脫時(shí)間21. 99min。通過(guò)溫育木糖與Multifeef木聚糖酶和0. 72M醇產(chǎn)生的產(chǎn)物的洗脫時(shí)間相對(duì)于乙醇誘導(dǎo)的產(chǎn)物(11.61min)發(fā)生遷移，在MeOH的存在下向較短的洗脫時(shí)間(11.03min)遷移，在n_Pr0H的存在下向較長(zhǎng)的洗脫時(shí)間(13. 60min)遷移。這些結(jié)果符合如下結(jié)論所討論的可移動(dòng)峰是由木糖和醇逆水解形成的木糖-醇加合物(烷基吡喃木糖苷)，其中在11. 03、11. 61和13. 60min洗脫的組分分別對(duì)應(yīng)于甲基吡喃木糖苷、乙基吡喃木糖苷和正丙基吡喃木糖苷。7. 2. I. 2.時(shí)間講稈
甲基吡喃木糖苷、乙基吡喃木糖苷和正丙基吡喃木糖苷出現(xiàn)的時(shí)間進(jìn)程在圖2中示出。100小時(shí)后形成的產(chǎn)物的相對(duì)量如下甲基木糖苷〉乙基木糖苷〉正丙基木糖苷(圖
2)，與 Drouet 等人(在 1994，Biotech. &Bioeng.(生物技術(shù)和生物工程)43:1075-1080 中)針對(duì)在Me0H、Et0H和n_PrOH的存在下由逆水解形成烷基_ β -D-吡喃木糖苷?qǐng)?bào)道的順序一致。乙基吡喃木糖苷(EXP)的洗脫時(shí)間與在SSF條件下觀察到的那些的一致性、洗脫時(shí)間對(duì)醇的存在和性質(zhì)的依賴(lài)性，以及這些醇的相對(duì)反應(yīng)性，所有這些都表明EXP是在SSF條件下產(chǎn)生的副產(chǎn)物。7. 2. I. 3.通討1H NMR分析鑒定EXP樣品中的乙某-β -糖苷制備乙基b-D-吡喃木糖苷標(biāo)準(zhǔn)品:通過(guò)下列方式制備乙基木糖苷樣品將50mgD-木糖溶解在3mL乙醇中并將所得溶液在Amberlyst 15H+樹(shù)脂(IOOmg)的存在下在70°C加熱3小時(shí)。過(guò)濾樹(shù)脂，減壓除去乙醇溶劑，得到無(wú)色油狀物。1H NMR分析顯示為乙基木糖 苷的混合物，其中a-D-吡喃木糖苷占優(yōu)勢(shì)，還有一些量的乙基β-吡喃木糖苷和乙基α/β-呋喃木糖苷。EXP樣品的1H NMR :將從稀氨水預(yù)處理的玉米芯SSF發(fā)酵液樣品中純化和分餾(利用HPLC)出的凍干的EXP樣品復(fù)原于750 μ L D2O中，并將其轉(zhuǎn)移至PP-528NMR玻璃管中。質(zhì)子NMR波譜是在Varian 500MHz VNMRS NMR系統(tǒng)上使用基本s2pul脈沖序列持續(xù)超過(guò)8個(gè)脈沖獲得的。1H NMR波譜(500MHz, D2O)以d 4. 80處的HOD信號(hào)為參照，基于d I. 20-1. 26區(qū)域出現(xiàn)的數(shù)個(gè)三重信號(hào)，指示存在至少4種不同的乙基糖苷。該波譜還包含5個(gè)不同的雙重信號(hào)，位于d 4. 43、4. 49、4. 53和4. 66處，耦合常數(shù)為7. 8Hz，指示存在b-糖苷鍵。d4. 43處的信號(hào)最強(qiáng)烈并與文獻(xiàn)(Drouet等人，1994, Biotech. & Bioeng.(生物技術(shù)和生物工程)43 :1075-1080), Zhang 等人(2009, Enzyme and Microbial Technology (酶和微生物技術(shù))44 :196 - 202)中所報(bào)道的乙基-β-D-吡喃木糖苷的化學(xué)位移匹配?？傮w而言，在1H NMR波譜(圖3)中觀察到的信號(hào)指示存在β -異頭物、β -D-乙基吡喃木糖苷，以及3至4種另外的乙基β-糖苷。7. 2. 2.使用酵母和野牛型運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌時(shí)的EXP形成在使用稀氨水預(yù)處理的玉米芯底物的SSF和分批補(bǔ)料SSF條件下，使用產(chǎn)乙醇運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的C5/C6糖共發(fā)酵產(chǎn)生高水平的ΕΧΡ。設(shè)計(jì)新的實(shí)驗(yàn)以確定當(dāng)使用野生型酵母和運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(它們是只能夠發(fā)酵C6糖的生物)進(jìn)行SSF時(shí)是否有EXP形成。結(jié)果(圖4)表明在由酵母(5. 5g/L)或野生型運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(9. lg/L)進(jìn)行發(fā)酵的SSF反應(yīng)中產(chǎn)生高水平的EXP。因而，EXP形成并不是重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌所特有的，因?yàn)樵谑褂冕劸平湍负鸵吧瓦\(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的SSF期間也檢測(cè)到EXP形成。7. 2. 3.用其他牛物質(zhì)來(lái)源時(shí)的EXP形成設(shè)計(jì)另外的實(shí)驗(yàn)以確定使用不同于稀氨水預(yù)處理的玉米芯的底物是否能夠形成EXP。從表2中所示的結(jié)果可看出，在使用里氏木霉纖維素酶/半纖維素酶制品的SSF條件下，EXP的形成似乎與任何高木聚糖含量的底物的發(fā)酵都有關(guān)聯(lián)。例如，使用具有高木聚糖含量的混合闊葉工業(yè)牛皮紙漿在重組發(fā)酵單胞菌屬SSF條件下形成的EXP多達(dá)16. Ig/L。另一方面，低木聚糖含量的底物，如預(yù)先處理的蔗渣和針葉紙漿在相似條件下產(chǎn)生的EXP量較少(分別為0. 9lg/L和4. 75g/L)。此外，再次證明僅在本文所述的SSF過(guò)程中有大量的EXP生成。在SHF過(guò)程條件下即使使用高木聚糖含量的底物，形成的EXP也少很多(3. 52g/L)。7. 2. 4.在對(duì)SSF中所用的酶進(jìn)行不同的排列時(shí)的EXP形成 7. 2. 4. I.俥用 Bxll 時(shí)的 EXP 形成根據(jù)Drouet等人(1994, Biotech. & Bioeng.(生物技術(shù)和生物工程)43 1075-1080中)，里氏木霉Bxll經(jīng)由轉(zhuǎn)木糖基化(transxylosylation)和逆水解反應(yīng)催化EXP的形成。圖5表明在里氏木霉Bxll的存在下，上述酵母SSF條件下的EXP形成增加。在加入5mg/gBxll 時(shí)，EXP 產(chǎn)量從 5. 5g/L 增加至 18. 8g/L。如圖6所示，在里氏木霉Bxll的存在下，使用25重量％固體的稀氨水預(yù)處理的玉米芯底物在重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌SSF條件下形成的EXP也增加。在加入6mg/g里氏木霉Bxll時(shí)，EXP穩(wěn)定在25. 6g/L濃度。將來(lái)自里氏木霉整合型菌株#229 (其過(guò)表達(dá)木聚糖酶，即里氏木霉Xyn3)的纖維素酶/半纖維素酶復(fù)合物用在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中以代替Accellerase 1500+ Multifecf木聚糖酶。里氏木霉Bxll催化EXP形成的能力驚人地強(qiáng)大，因?yàn)樵趦H添加lmg/g里氏木霉Bxll時(shí)，明顯觀察到EXP與對(duì)照樣品(單獨(dú)的來(lái)自里氏木霉整合型菌株#229的酶復(fù)合物)相比增加超過(guò)2倍。研究了輪枝鐮孢菌半纖維素酶的加入對(duì)EXP形成的影響。使用Accellerase 1500+ Multifect 木聚糖酶、Accellerase 1500+XlnA以及整合型里氏木霉菌株#229產(chǎn)生的酶復(fù)合物，加有Bxll和輪枝鐮孢菌半纖維素酶(Fv3A，和Fv51A L-α-阿拉伯呋喃糖苷酶)。這項(xiàng)研究是在重組發(fā)酵單胞菌屬SSF條件下進(jìn)行的。所用的底物為25重量％固體的稀氨水預(yù)處理的玉米芯。結(jié)果在圖7中示出，表明加入)(1ηΑ和Accellerase 1500所產(chǎn)生的EXP比加入Mllitifecf木聚糖酶和Accellerase 1500所產(chǎn)生的EXP多(31. 5相對(duì)于19. 5)。在所有三種酶配置中，單獨(dú)的來(lái)自整合型里氏木霉菌株#229的酶復(fù)合物所產(chǎn)生的EXP量最少(9. lg/L)。這可能是由于Bxll在里氏木霉菌株#229酶復(fù)合物中的酶復(fù)合物中蛋白質(zhì)總量中只占較小的一部分，里氏木霉菌株#229酶復(fù)合物還產(chǎn)生與其他兩種酶配置相比相對(duì)大量的累積的木二糖。對(duì)于Accellerase 1500+ Mu]tifecf:木聚糖酶和Accellerase 1500+XlnA，F(xiàn)v3A或Fv51A的加入沒(méi)有導(dǎo)致EXP的形成明顯增加。然而，對(duì)于整合型里氏木霉菌株#229產(chǎn)生的酶復(fù)合物，單獨(dú)加入Fv3A使EXP的形成增加2倍，F(xiàn)v51A的加入使EXP的形成增加I. 4倍，相比之下，當(dāng)將里氏木霉Bxll加入到整合型里氏木霉菌株#229產(chǎn)生的酶復(fù)合物中時(shí)EXP增加3倍。7. 2. 4. 2.使用純化酶時(shí)的EXP形成上面討論的結(jié)果表明里氏木霉Bxll極大地影響并有效地催化EXP形成，并且里氏木霉Bxll在使用某些高木聚糖含量的生物質(zhì)底物的SSF條件下顯著且特別有效地制備EXP。然而，到目前為止測(cè)試的(和上面討論的)所有酶都沒(méi)有純化，并可包含與能夠制備EXP的里氏木霉Bxll的酶活性相似的背景酶活性。為了查明背景酶活性的影響，還研究了純化酶對(duì)EXP形成的影響。將純化的里氏木霉纖維二糖水解酶CBHl和CBH2 ;里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶EG2 ;和里氏木霉β-葡萄糖苷酶Bgll的纖維素酶混合物用作ACCelleraSeTM1500的替代品，而將純化的里氏木霉Xyn3用作Multifect 木聚糖酶的替代品。從圖8中所示的結(jié)果可明顯看出，單獨(dú)的纖維素酶不產(chǎn)生EXP。未純化里氏木霉Xyn3的加入產(chǎn)生大量的EXP，例如，約13. lg/L。這種大幅度增加可能是由于未純化里氏木霉Xyn3樣品中存在較多的背景里氏木霉Bxll。7. 2. 4. 3.俥用GH43類(lèi)Bxl酶時(shí)的EXP形成Bxll是GH3家族水解酶，已被證明對(duì)于在SSF條件(上文)下催化EXP的形成有活性且有效。仍然存在的問(wèn)題是其他GH家族β-木糖苷酶是否也能夠在類(lèi)似條件下催化EXP形成。使用25重量％固體的稀氨水預(yù)處理的玉米芯底物在重組發(fā)酵單胞菌屬SSF條件下，測(cè)試來(lái)自GH43家族的許多β -木糖苷酶，包括Fv43B，Pf43A, Fv43E,和Af43A，。已發(fā)現(xiàn)，與由菌株#229蛋白質(zhì)制品制成的對(duì)照樣品相比，Pf43A, Fv43E,和Af43A使EXP的形成稍有增加。另一方面，F(xiàn)v43B使EXP的形成增加較多，增加I. 5倍(圖9)。因?yàn)樗羞@些GH43家族酶都表達(dá)于里氏木霉中，并且因?yàn)樗鼈冊(cè)谶@項(xiàng)研究中都是未純化蛋白質(zhì)制品，所以能夠推斷，EXP形成的增加可能歸因于蛋白質(zhì)制品中存在天然Bxll。8.實(shí)例2 :半纖維素酶導(dǎo)致exp減小
·
下面的實(shí)例說(shuō)明在SSF反應(yīng)中某些半纖維素酶的加入使EXP減少。8. I. Fv43D導(dǎo)致發(fā)酵單朐菌屬SSF中的EXP減小EXP形成通常等摩爾比地消耗木糖(直接消耗，或從木二糖或其他木糖低聚物消耗)和乙醇。這種消耗機(jī)制直接導(dǎo)致乙醇的產(chǎn)量明顯減小，因?yàn)榘òl(fā)酵單胞菌屬在內(nèi)的許多微生物都不能降解或發(fā)酵EXP，或以其他方式利用EXP。計(jì)算出一(I)克EXP相當(dāng)于已產(chǎn)生的乙醇損失O. 688g (假設(shè)木糖以O(shè). 51g/g木糖的比率發(fā)酵成乙醇)。因而，阻止EXP的形成能使得乙醇的產(chǎn)量隨之增大。已發(fā)現(xiàn)，如圖10所示，以?xún)Hlmg/g木聚糖的量加入輪枝鐮孢菌β -木糖苷酶Fv43D，極大地減少(約4倍)在重組發(fā)酵單胞菌屬SSF條件下形成的EXP 量。8. 2Fv43D導(dǎo)致酵母SSF中的EXP減少類(lèi)似于從C5/C6-發(fā)酵重組發(fā)酵單胞菌屬獲得的結(jié)果，在使用酵母作為C6-發(fā)酵微生物的SSF反應(yīng)中，在Accellerase 1500+ Multifect"'木聚糖酶中補(bǔ)加Fv43D也導(dǎo)致EXP的形成減少。具體地講，以lmg/g木聚糖的量加入的Fv43D導(dǎo)致EXP減少2至3倍(圖11)。8. 3Fv43D導(dǎo)致使用Multifect木聚糖酶、使用XlnA和使用來(lái)自里氏木霉整合型菌株#229的酶復(fù)合物的SSF中的EXP減少研究了在重組發(fā)酵單胞菌屬SSF條件下，在三種酶配置即Accellerase 1500+ Multifect:K木聚糖酶、Accellerase 1500+黑曲霉木聚糖酶、和整合型里氏木霉菌株#229產(chǎn)生的酶復(fù)合物中Fv43D的加入所導(dǎo)致的EXP減少。所用的底物為25重量％固體的稀氨水預(yù)處理的玉米芯。圖12 表明，向 Accellerase I5OO+.JVlultifect'R 木聚糖酶中，和向 Accellerase 1500+XlnA中加入僅lmg/g木聚糖的Fv43D導(dǎo)致EXP形成減少超過(guò)4倍，并且以同樣方式加入由整合型里氏木霉菌株#229產(chǎn)生的酶復(fù)合物中導(dǎo)致EXP形成減少I(mǎi). 36倍。同時(shí)，在所有三種酶配置中都觀察到乙醇相應(yīng)地增多，證實(shí)Fv43D在減少EXP的形成和防止乙醇產(chǎn)量損失方面的有益效果。8. 4使用純化酶的SSF中EXP形成的減少為了確保Fv43D所導(dǎo)致的EXP減少不是由背景酶活性引起的，使用包括純化Fv43D在內(nèi)的純化酶測(cè)試EXP形成的減少。將純化CBHl、CBH2、EG2和Bgl I的里氏木霉纖維素酶混合物用作Accellerase 1500的替代品，并將純化里氏木霉Xyn3用作Mllltifecf木聚糖酶的替代品。如圖13中所示的結(jié)果表明，當(dāng)加入純化和未純化的Fv43D時(shí)，EXP的形成稍有減少，乙醇滴度隨之稍有增大。EXP形成的相對(duì)小的減少可能是由純化酶(例如，纖維素酶和Xyn3)中缺少背景里氏木霉Bxll引起的。還注意到，由于里氏木霉Xyn3的作用，對(duì)照樣品僅形成少量的EXP(5. 7g/L)。進(jìn)一步加入Fv43D因而沒(méi)有明顯減少EXP的形成。為了進(jìn)一步查明這點(diǎn)，進(jìn)行另一項(xiàng)研究(結(jié)果在圖14A中示出)，從而查明在大量Bxll的存在下加入Fv43D對(duì)EXP減少的影響。8. 5在SSF中加入Fv43D時(shí)EXP減小的劑量響應(yīng)在Bxll的存在下EXP的形成是明顯的，其中持續(xù)檢測(cè)到多于20g/L的EXP，但確切的數(shù)量隨著所用的SSF條件改變。進(jìn)行劑量響應(yīng)研究以評(píng)估EXP形成的減少與所加入的Fv43D量的關(guān)系。圖14A示出向由里氏木霉整合型菌株#229產(chǎn)生的酶復(fù)合物和里氏木霉Bxll中加入遞增量的Fv43D所導(dǎo)致的EXP減少的結(jié)果。與前面所示的結(jié)果類(lèi)似，發(fā)現(xiàn)lmg/g的Fv43D有效地使EXP形成減少近3倍，并同時(shí)導(dǎo)致乙醇滴度增大。然而，以3mg/g、6mg/g 和9mg/g的遞增量加入Fv43D并沒(méi)有極大地減少EXP的形成，但觀察到乙醇滴度顯著增大。似乎即使加入大量的Fv43D (為9mg/g)，EXP濃度也不能降低至低于6. 6g/L，即，EXP量在測(cè)試所用的特定條件下可到達(dá)平衡的水平。在這些特定實(shí)驗(yàn)條件下，進(jìn)一步加入超過(guò)例如lmg/g木聚糖的Fv43D,不再對(duì)減少EXP的形成有影響。這些觀察結(jié)果能潛在地由SSF條件下EXP形成和減少的機(jī)制加以解釋。所提出的機(jī)制基于從這項(xiàng)工作得到的觀察結(jié)果，與文獻(xiàn)(參見(jiàn)，例如，Dixmet等人，1994, Biotech. & Bioeng.(生物技術(shù)和生物工程)43 :1075-1080 和 Zhang等人，2009，Enzymeand Microbial Technology (酶和微生物技術(shù))44 :196 - 202)中報(bào)道的數(shù)據(jù)一致,并詳細(xì)描述在下面的實(shí)例3中。8. 6在SSF中Fo43A和Gz43A的加入所導(dǎo)致的EXP減少還在本文所述的SSF條件下測(cè)試作為翻轉(zhuǎn)型GH43家族β -木糖苷酶的Fo43A和Gz43A,減少EXP形成的功效。基于圖14B中所示的結(jié)果，當(dāng)將這兩種酶以3mg/g木聚糖的量加入到包含由里氏木霉整合型菌株#229產(chǎn)生的酶復(fù)合物、里氏木霉Bxll、稀氨水預(yù)處理的玉米芯底物、和重組發(fā)酵單胞菌屬的酶共混物中時(shí)，它們各自均能夠使EXP形成減少近4倍。與加入Fv43D (上文)觀察到的結(jié)果類(lèi)似，觀察到EXP形成的減少和乙醇滴度的相應(yīng)增大(增大約10g/L)。9.實(shí)例3 =EXP形成機(jī)制在SSF條件下(圖10和11)，在輪枝鐮孢菌β -木糖苷酶Fv3A的存在下的EXP產(chǎn)量比在輪枝鐮孢菌β -木糖苷酶Fv43D的存在下的EXP產(chǎn)量高出大約4倍，這樣的觀察結(jié)果激發(fā)人們努力去了解EXP形成的機(jī)制。對(duì)于EXP的形成，潛在地存在兩種可能的途徑(I)通過(guò)轉(zhuǎn)糖基作用；或(2)通過(guò)逆水解。這些途徑中的每種描述如下I)轉(zhuǎn)糖基作用X-0-X+Et0H — X-O-Et+X2)逆水解X + EtOH <—> X-O-Et + H2O根據(jù)Drouet等人(1994, Biotech. & Bioeng.(生物技術(shù)和生物工程)43 1075-1080)，轉(zhuǎn)糖基作用機(jī)制是這兩者中較迅速的。轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)中僅形成β異頭物(參見(jiàn)圖29)的這一事實(shí)暗示，該反應(yīng)由以保持異頭構(gòu)型的方式對(duì)底物起作用的酶催化，其中糖通過(guò)β_糖基鍵連接。另一方面，逆水解形成EXP的β異頭物，這提示起始底物是α-或β -木糖，具體取決于EXP是通過(guò)異頭構(gòu)型的翻轉(zhuǎn)還是異頭構(gòu)型的保持形成。β -木糖苷酶、Fv3A (GH3家族成員)和Fv43D (GH43家族成員)分別以構(gòu)型保持和翻轉(zhuǎn)的方式起作用。為了鑒別和鑒定上述兩種潛在機(jī)制中的哪一種是真正的機(jī)制，進(jìn)行這樣的實(shí)驗(yàn)，其中將Multifcef .木聚糖酶(其為酶制品，特征在于具有里氏木霉Xyn2保持活性)以及純化的Fv43D和Fv3A與木二糖和乙醇一起在46°C下溫育。這些樣品中EXP形成的動(dòng)力學(xué)通過(guò)HPLC檢查。如圖15和表3所示，很短的一段時(shí)間之后， Mukifeetx木聚糖酶和Fv3A產(chǎn)生大量EXP，這似乎與木糖的形成相對(duì)應(yīng)(例如，隨著時(shí)間的推移，EXP形成與木糖形成具有恒定的比率)。另一方面，當(dāng)將Fv43D和Multifect'木聚糖酶一起使用時(shí)，EXP相對(duì)于木糖的形成似乎明顯滯后。能夠推斷，Multifect 木聚糖酶和Fv3A通過(guò)轉(zhuǎn)糖基作用而迅速地產(chǎn)生EXP。木糖-酶酯加合物應(yīng)經(jīng)如下方式形成，其中首先是Cl異頭構(gòu)型翻轉(zhuǎn)，接著是第二次翻轉(zhuǎn)，所述第二次翻轉(zhuǎn)由乙醇在附連木糖的Cl碳處進(jìn)行活性部位羧基的Sn2取代完成。雙重翻轉(zhuǎn)使得產(chǎn)物的構(gòu)型保持。另一方面，F(xiàn)v43D似乎沒(méi)有催化轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)；相反，它通過(guò)逆水解產(chǎn)生EXP，速度要慢很多。因?yàn)镕v43D以異頭構(gòu)型翻轉(zhuǎn)的方式起作用，所以EXP可能由a-D-木糖形成，a -D-木糖繼而由木二糖在Fv43D，的作用下，通過(guò)水溶液中β -D-木糖的Cl處的翻轉(zhuǎn)形成。圖15示出EXP也可以由用Multifect木聚糖酶催化的木糖逆水解形成。因?yàn)檫@種情況下的β-木糖苷酶機(jī)制是保持型，所以這個(gè)反應(yīng)的底物可能是β-D-木糖。9. IEXP形成的平衡方稈式在SSF條件下，Mu丨tifecf.木聚糖酶和Fv3A不僅會(huì)與木二糖相遇，而且還會(huì)與較大的木糖低聚物相遇。此種低聚物的水解將導(dǎo)致EXP的形成量增大，如果發(fā)生斷裂，則低聚物產(chǎn)物之一將被轉(zhuǎn)糖基化從而產(chǎn)生乙基糖基加合物。由轉(zhuǎn)糖基作用引起的進(jìn)一步斷裂然后能形成另外的乙基加合物，使得EXP形成與木糖形成的比率大于在僅木二糖被轉(zhuǎn)糖基化時(shí)觀察到的比率。例如3) X4+EtOH — X2_Et+X24) X2-Et+Et0H — 2EXP5) X2+Et0H — EXP+X注意如果僅木二糖被轉(zhuǎn)糖基化，則EXP的形成僅來(lái)自行5)的反應(yīng)。通過(guò)對(duì)木糖低聚物(平均分子量=539)的水解與木二糖的水解進(jìn)行比較檢查這些可能性，使用如下相同的三種酶中的每種Fv3A，F(xiàn)v43D，和Multifeet*.木聚糖酶。結(jié)果在圖16中示出。圖16 (左圖)和圖16 (右圖)中繪制出在使彼此之間的木糖形成率在兩倍以?xún)?nèi)的濃度的 Multifect 木聚糖酶(560 μ g/mL)、Fv43D (36 μ g/mL)、或 Fv3A (54 μ g/mL)的存在下，將木二糖(20mg/mL)(圖16 (左))或木糖低聚物(20mg/mL)(圖16 (右))在O. 9M EtOH的存在下在46°C溫育之后產(chǎn)生的EXP與木糖RI峰面積的比率。在Multifectii木聚糖酶和Fv43D的存在下，木二糖和木糖低聚物的EXP形成率幾乎相同。然而，在Fv3A，的情況下，在木糖低聚物的存在下的EXP產(chǎn)量比在木二糖的存在下的EXP產(chǎn)量高出約1/3。如上所述，這項(xiàng)觀察結(jié)果表明至少對(duì)于Fv3A，而言，比木二糖大的低聚物在斷裂之后能夠與乙醇發(fā)生轉(zhuǎn)糖基作用。在Multifeet:K木聚糖酶情況下彡dp3低聚物的此種轉(zhuǎn)糖基作用似乎并沒(méi)有如此普遍地發(fā)生，但在木二糖和木糖低聚物兩例中EXP產(chǎn)量似乎確實(shí)都高于使用Fv3A時(shí)觀察到的產(chǎn)量。這種較高的產(chǎn)量可能說(shuō)明，使用MuUifeeP木聚糖酶時(shí)與乙醇的轉(zhuǎn)糖基化率高于使用Fv3A時(shí)與乙醇的轉(zhuǎn)糖基化率。對(duì)于Multifect'木聚糖酶和Fv3A，二者而言，EXP是由每2. 5至3. 5個(gè)斷裂反應(yīng)形成的，這一事實(shí)引人注目，因?yàn)橐掖嫉哪枬舛仁荗. 9M，相比之下&0的摩爾濃度是55M。對(duì)乙醇的選擇性可能說(shuō)明，在特定酶活性部位或附近對(duì)乙醇的親和力大于對(duì)水的親和力,其中MultifectK木聚糖酶的這種親和力相對(duì)于Fv3A而言較高。在以木二糖或木糖低聚物作為底物時(shí)，EXP與木糖的比率在Fv43D的情況下是相同的，這能夠由這一事實(shí)加以解釋?zhuān)矗贔v43D，情況下，EXP是由木糖逆水解形成，而木糖是木二糖和木糖低聚物底物的水解產(chǎn)物。/l:Mu丨tifect 木聚糖酶和Fv3A，情況下，EXP的產(chǎn)量在溫育3. 5小時(shí)之后達(dá)到最大。使用Multifeet 木聚糖酶時(shí)這個(gè)溫育時(shí)間點(diǎn)處的EXP產(chǎn)量是使用Fv43D所獲得的EXP產(chǎn)量的約7至8倍。3. 5小時(shí)后，Multifeef'.木聚糖酶反應(yīng)和Fv3A反應(yīng)中的EXP產(chǎn)量降低，t1/2為40至60小時(shí)。涉及Fv3A的反應(yīng)可能是酶催化的EXP水解，使EXP從在轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)中形成的高值朝向在逆水解后形成的EXP/木糖平衡值移動(dòng)。在SSF反應(yīng)中，在有保持活性的β -木糖苷酶的存在下EXP形成的快速性和隨后EXP水解的遲滯性揭示，在存在保持型β -木糖苷酶時(shí)整個(gè)SSF反應(yīng)期間EXP濃度可能一直明顯高于存在翻轉(zhuǎn)型β -木糖苷酶時(shí)的EXP濃度。這進(jìn)一步揭示在SSF反應(yīng)中用翻轉(zhuǎn)型β-木糖苷酶代替保持型β-木糖苷酶將對(duì)產(chǎn)物產(chǎn)量有益。注意，所有上述反應(yīng)都是酶催化反應(yīng)。在將木二糖、木糖低聚物、或木糖在O. 9Μ乙醇的存在下在46°C溫育之后，不存在酶的對(duì)照樣品/反應(yīng)顯示無(wú)EXP形成。9. 2平衡常數(shù)計(jì)算Drouet 等人(1994, Biotech. & Bioeng.(生物技術(shù)和生物工程)43 :1075-1080)已提出，逆水解之后烷基吡喃木糖苷(AXP)例如EXP的形成程度能夠由醇、木糖和烷基吡喃木糖苷產(chǎn)物之間建立的平衡確定。乙基吡喃木糖苷(EXP)的解離常數(shù)為
權(quán)利要求
1.一種用于同步糖化發(fā)酵(SSF)的方法，所述方法包括在適于發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)完全發(fā)酵培養(yǎng)基一段時(shí)間，所述完全發(fā)酵培養(yǎng)基包含至少一種發(fā)酵微生物、至少一種含木聚糖的生物質(zhì)、至少一種纖維素酶、至少一種半纖維素酶和至少一種翻轉(zhuǎn)型3 -木糖苷酶。
2.權(quán)利要求I的方法，其中所述完全發(fā)酵培養(yǎng)基包含有效量的所述翻轉(zhuǎn)型￠-木糖苷酶，使得所述完全發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)生的短鏈烷基-￠-吡喃木糖苷(“AXP”)少于缺少所述翻轉(zhuǎn)型￠-木糖苷酶的對(duì)照發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)生的。
3.權(quán)利要求I或2的方法，其中所述完全發(fā)酵培養(yǎng)基包含有效量的所述翻轉(zhuǎn)型3-木糖苷酶，使得所述完全發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)生的AXP比缺少所述翻轉(zhuǎn)型3 -木糖苷酶的對(duì)照發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)生的AXP少至少40%。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述完全發(fā)酵培養(yǎng)基包含有效量的所述翻轉(zhuǎn)型￠-木糖苷酶，使得所述完全發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)生的AXP比缺少所述翻轉(zhuǎn)型3 -木糖苷酶的對(duì)照發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)生的AXP少至少50%。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述完全發(fā)酵培養(yǎng)基包含有效量的所述翻轉(zhuǎn)型￠-木糖苷酶，使得所述完全發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)生的AXP比缺少所述翻轉(zhuǎn)型3 -木糖苷酶的對(duì)照發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)生的AXP少至少60%。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述完全發(fā)酵培養(yǎng)基包含有效量的所述翻轉(zhuǎn)型￠-木糖苷酶，使得所述完全發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)生的AXP比缺少所述翻轉(zhuǎn)型3 -木糖苷酶的對(duì)照發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)生的AXP少至少70%。
7.權(quán)利要求I至6中任一項(xiàng)的方法，其中所述AXP是甲基-吡喃木糖苷(MXP)、乙基 吡喃木糖苷(EXP)、丙基-3 -吡喃木糖苷(PXP)，或丁基-3 -吡喃木糖苷(BXP)。
8.權(quán)利要求I至7中任一項(xiàng)的方法，其中所述完全發(fā)酵培養(yǎng)基包含有效量的所述翻轉(zhuǎn)型@ -木糖苷酶，從而使所述發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量與通過(guò)培養(yǎng)缺少所述翻轉(zhuǎn)型3 -木糖苷酶的對(duì)照發(fā)酵培養(yǎng)基獲得的所述發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量相比有所增大。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量增大至少1%。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量增大至少2%。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量增大至少3%。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量增大至少5%。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量增大至少7.5%。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量增大至少10%。
15.權(quán)利要求I至14中任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)物是醇。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述醇是甲醇、乙醇、丙醇、丙烷-1，3-二醇、或丁醇。
17.權(quán)利要求I至16中任一項(xiàng)的方法，其中所述翻轉(zhuǎn)型P-木糖苷酶是GH43家族酶。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述翻轉(zhuǎn)型P-木糖苷酶是Fv43D，Pf43A, Fv43E, Fv43B,Af43A, Fo43A, Gz43A,或 XynB3 多肽。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述Fv43D多肽與SEQID NO: 2或SEQID NO: 2的第21至350位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性。
20.權(quán)利要求18的方法，其中所述Pf43A多肽與SEQID NO:8或SEQID NO:8的第21至445位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性。
21.權(quán)利要求18的方法，其中所述Fv43E多肽與SEQID N0:10或SEQID N0:10的第19至530位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性。
22.權(quán)利要求18的方法，其中所述Fv43B多肽與SEQID NO: 12或SEQ ID NO: 12的第17至574位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性。
23.權(quán)利要求18的方法，其中所述Af43A多肽與SEQID NO: 14或SEQ ID NO: 14的第15至558位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性。
24.權(quán)利要求18的方法，其中所述Fo43A多肽與SEQID NO: 24或SEQ ID NO: 24的第21至348位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性。
25.權(quán)利要求18的方法，其中所述Gz43A多肽與SEQID NO: 22或SEQ ID NO: 22的第19至340位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性。
26.權(quán)利要求18的方法，其中所述XynB3多肽與SEQID NO: 25對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性。
27.權(quán)利要求17至26中任一項(xiàng)的方法，其中所述翻轉(zhuǎn)型￠-木糖苷酶在所述完全發(fā)酵培養(yǎng)基中的存在濃度為0. 3mg至10mg/g所述含木聚糖生物質(zhì)中的木聚糖。
28.權(quán)利要求27的方法,其中所述翻轉(zhuǎn)型P-木糖苷酶的存在濃度為0. 4mg至10mg/g所述含木聚糖生物質(zhì)中的木聚糖。
29.權(quán)利要求27的方法,其中所述翻轉(zhuǎn)型P-木糖苷酶的存在濃度為0. 3mg至3mg/g所述含木聚糖生物質(zhì)中的木聚糖。
30.權(quán)利要求I至29中任一項(xiàng)的方法，所述方法作為連續(xù)、分批、或分批補(bǔ)料SSF過(guò)程進(jìn)行。
31.權(quán)利要求I至30中任一項(xiàng)的方法，所述方法還包括形成所述完全發(fā)酵培養(yǎng)基的步驟。
32.權(quán)利要求31的方法，其中形成所述完全發(fā)酵培養(yǎng)基的所述步驟包括混合(a)所述發(fā)酵微生物、(b)所述含木聚糖的生物質(zhì)、(C)所述纖維素酶、(d)所述半纖維素酶、(e)所述翻轉(zhuǎn)型￠-木糖苷酶，和(f)缺少(a)至(e)中的一種或多種或全部的培養(yǎng)基。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述纖維素酶以全纖維素酶制品形式存在。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述全纖維素酶制品包含半纖維素酶。
35.權(quán)利要求33或34的方法，其中所述全纖維素酶制品是通過(guò)培養(yǎng)絲狀真菌獲得的培養(yǎng)液。
36.權(quán)利要求35所述的方法，其中所述絲狀真菌是里氏木霉(T.reesei)。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述里氏木霉(T.reesei)經(jīng)工程化改造，使得所述天然3-木糖苷酶基因缺失或失活。
38.權(quán)利要求I至37中任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵微生物是真菌。
39.權(quán)利要求38的方法,其中所述真菌是釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。
40.權(quán)利要求I至37中任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵微生物是細(xì)菌。
41.權(quán)利要求40的方法,其中所述細(xì)菌是運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis)。
42.權(quán)利要求I至41中任一項(xiàng)的方法，其中所述含木聚糖的生物質(zhì)是玉米秸桿、蔗渣、高粱、蘆竹、象草、芒草、日本柳杉、小麥秸桿、柳枝稷、闊葉紙漿、或針葉紙漿。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述含木聚糖的生物質(zhì)是漿液形式的。
44.權(quán)利要求42或43的方法，其中所述含木聚糖的生物質(zhì)已經(jīng)過(guò)預(yù)處理。
45.權(quán)利要求I至44中任一項(xiàng)的方法，所述方法還包括回收所述發(fā)酵產(chǎn)物的所述步驟。
46.權(quán)利要求I至45中任一項(xiàng)的方法，其中基于摩爾計(jì)、基于分子量計(jì)、或者基于摩爾和分子量計(jì)，所述完全發(fā)酵培養(yǎng)基包含的翻轉(zhuǎn)型3-木糖苷酶的量大于保持型￠-木糖苷酶的量。
47.權(quán)利要求46的方法，其中基于摩爾計(jì)、基于分子量計(jì)、或者基于摩爾和分子量計(jì)，所述完全發(fā)酵培養(yǎng)基中的翻轉(zhuǎn)型3-木糖苷酶和保持型3-木糖苷酶的所述比率為至少2:1。
48.一種里氏木霉(T. reesei)細(xì)胞，所述細(xì)胞經(jīng)工程化改造，使得所述天然￠-木糖苷酶基因缺失或者使其沒(méi)有可檢測(cè)的3-木糖苷酶活性。
49.權(quán)利要求48的里氏木霉(T.reesei)細(xì)胞，所述細(xì)胞經(jīng)工程化改造而重組表達(dá)GH43家族酶。
50.權(quán)利要求48的里氏木霉(T.reesei)細(xì)胞，所述細(xì)胞經(jīng)工程化改造而重組表達(dá)Fv43D, Pf43A, Fv43E, Fv43B, Af43A, Fo43A, Gz43A,或 XynB3 多肽。
51.權(quán)利要求49至50的里氏木霉(T.reesei)細(xì)胞，其中所述Fv43D多肽與SEQIDNO:2或SEQ ID NO:2的第21至350位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性。
52.權(quán)利要求51的里氏木霉(T.reesei)細(xì)胞，其中所述Pf43A多肽與SEQID NO:8或SEQ ID NO:8的第21至445位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性。
53.權(quán)利要求51的里氏木霉(T.reesei)細(xì)胞，其中所述Fv43E多肽與SEQID NOilO或SEQ ID NO: 10的第19至530位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性。
54.權(quán)利要求51的里氏木霉(Y.reesei)細(xì)胞，其中所述Fv43B多肽與SEQID NO: 12或SEQ ID NO: 12的第17至574位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性。
55.權(quán)利要求51的里氏木霉(T.reesei)細(xì)胞，其中所述Af43A多肽與SEQID NO: 14或SEQ ID NO: 14的第15至558位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性。
56.權(quán)利要求51的里氏木霉(T.reesei)細(xì)胞，其中所述Fo43A多肽與SEQID NO: 24或SEQ ID NO:24的第21至348位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性。
57.權(quán)利要求51的里氏木霉(T.reesei)細(xì)胞，其中所述Gz43A多肽與SEQID NO: 22或SEQ ID NO:22的第19至340位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性。
58.權(quán)利要求51的里氏木霉(T.reesei)細(xì)胞，其中所述XynB3多肽與SEQID NO: 25對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性。
59.一種用于生產(chǎn)纖維素酶制品的方法，所述方法包括在導(dǎo)致所述纖維素酶制品產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求49至58中任一項(xiàng)所述的里氏木霉(T. reesei)細(xì)胞。
60.權(quán)利要求59的方法，所述方法還包括回收所述纖維素酶制品。
61.一種通過(guò)執(zhí)行權(quán)利要求59或60所述的方法獲得的纖維素酶制品。
62.一種通過(guò)培養(yǎng)權(quán)利要求49至58中任一項(xiàng)所述的里氏木霉(T. reesei)細(xì)胞制得的培養(yǎng)液。
63.—種生物質(zhì)糖化的方法，所述方法包括使所述生物質(zhì)與權(quán)利要求61所述的纖維素酶制品接觸。
64.—種生物質(zhì)糖化的方法，所述方法包括使所述生物質(zhì)與權(quán)利要求62所述的培養(yǎng)液接觸。
65.一種組合物，所述組合物包含至少一種發(fā)酵微生物、至少一種含木聚糖的生物質(zhì)、至少一種纖維素酶、至少一種半纖維素酶和至少一種翻轉(zhuǎn)型3 -木糖苷酶。
66.權(quán)利要求65的組合物，其中所述翻轉(zhuǎn)型P-木糖苷酶是GH43家族酶。
67.權(quán)利要求65的組合物，其中所述翻轉(zhuǎn)型P-木糖苷酶是Fv43D，Pf43A, Fv43E, Fv43B, Af43A, Fo43A, Gz43A,或 XynB3 多肽。
68.權(quán)利要求66或67的組合物，其中如果存在的話(huà)，所述Fv43D多肽與SEQID NO: 2或SEQ ID NO:2的第21至350位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性。
69.權(quán)利要求66或67的組合物，其中如果存在的話(huà)，所述Pf43A多肽與SEQID NO:8或SEQ ID NO:8的第21至445位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性。
70.權(quán)利要求66或67的組合物，其中如果存在的話(huà)，所述Fv43E多肽與SEQID NOilO或SEQ ID NO: 10的第19至530位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性。
71.權(quán)利要求66或67的組合物，其中如果存在的話(huà)，所述Fv43B多肽與SEQID NO: 12或SEQ ID NO: 12的第17至574位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性。
72.權(quán)利要求66或67的組合物，其中如果存在的話(huà)，所述Af43A多肽與SEQID NO: 14或SEQ ID NO: 14的第15至558位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性。
73.權(quán)利要求66或67的組合物，其中如果存在的話(huà)，所述Fo43A多肽與SEQID NO: 24或SEQ ID NO:24的第21至348位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性。
74.權(quán)利要求66或67的組合物，其中如果存在的話(huà)，所述Gz43A多肽與SEQID NO: 22或SEQ ID NO:22的第19至340位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性。
75.權(quán)利要求66或67的組合物，其中如果存在的話(huà)，所述XynB3多肽與SEQID NO: 25對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性。
76.權(quán)利要求65至75中任一項(xiàng)的組合物，其中所述含木聚糖的生物質(zhì)是玉米秸桿、蔗渣、高粱、蘆竹、象草、芒草、日本柳杉、小麥秸桿、柳枝稷、闊葉紙漿、或針葉紙漿。
77.權(quán)利要求65至76中任一項(xiàng)的組合物，其中所述發(fā)酵微生物是真菌或細(xì)菌。
78.權(quán)利要求77的組合物,其中所述真菌是釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。
79.權(quán)利要求77的組合物,其中所述細(xì)菌是運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis)。
80.權(quán)利要求65至79中任一項(xiàng)的組合物，其中所述纖維素酶以全纖維素酶制品形式存在。
81.權(quán)利要求80的組合物，其中所述纖維素酶制品包含半纖維素酶。
82.權(quán)利要求65至81中任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物基本上不含保持型￠-木糖苷酶或沒(méi)有可檢測(cè)的保持型3-木糖苷酶活性。
83.—種生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的方法，所述方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求65至82中任一項(xiàng)所述的組合物一段時(shí)間。
84.權(quán)利要求83的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)物是醇。
85.權(quán)利要求84的方法，其中所述醇是甲醇、乙醇、丙醇、丙烷-1，3-二醇、或丁醇。
86.一種用于同步糖化發(fā)酵(SSF)的方法，所述方法包括在適于烷基-￠-吡喃木糖苷(“AXP”)產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)完全發(fā)酵培養(yǎng)基一段時(shí)間，所述完全發(fā)酵培養(yǎng)基包含至少一種發(fā)酵微生物、至少一種含木聚糖的生物質(zhì)、至少一種纖維素酶、至少一種半纖維素酶和至少一種保持型￠-木糖苷酶。
87.權(quán)利要求86的方法，其中所述完全發(fā)酵培養(yǎng)基包含有效量的保持型3-木糖苷酶，使得所述完全發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)生的AXP多于缺少所述保持型3 -木糖苷酶或具有較少量的所述保持型P -木糖苷酶的對(duì)照發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)生的AXP。
88.權(quán)利要求86或87的方法，其中所述AXP是甲基-￠-吡喃木糖苷(MXP)、乙基 吡喃木糖苷(EXP)、丙基-3 -吡喃木糖苷(PXP)、或丁基-3 -吡喃木糖苷(BXP)。
89.權(quán)利要求86至88中任一項(xiàng)的方法，其中所述保持型P-木糖苷酶是GH3、GH30、GH31、GH39、GH52、GH54*GH116 家族酶。
90.權(quán)利要求86至89中任一項(xiàng)的方法，其中所述保持型3-木糖苷酶是XlnD, Fv30A, Fv30B, Fv39A, Fv39B,或 XynB 多肽。
91.權(quán)利要求90的方法，其中所述HnD多肽與SEQID N0:40或SEQID NO:40的第18至804位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性。
92.權(quán)利要求90的方法，其中所述Fv30A多肽與SEQID NO:42或SEQ ID NO:42的第20至537位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性。
93.權(quán)利要求90的方法，其中所述Fv30B多肽與SEQID NO:44或SEQ ID NO:44的第25至485位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性。
94.權(quán)利要求90的方法，其中所述Fv39A多肽與SEQID NO:46或SEQ ID NO:46的第20至439位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性。
95.權(quán)利要求90的方法，其中所述Fv39B多肽與SEQID N0:48或SEQ ID NO:48的第19至456位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性。
96.權(quán)利要求90的方法，其中所述XynB多肽與SEQID NO: 50對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性。
97.權(quán)利要求90的方法，其中所述XylA多肽與SEQID NO:52或SEQID NO:52的第19至705位殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性。
98.權(quán)利要求90的方法，其中所述Xyll多肽與SEQID NO:54對(duì)應(yīng)的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性。
99.權(quán)利要求86至98中任一項(xiàng)的方法，所述方法作為連續(xù)、分批、或分批補(bǔ)料SSF過(guò)程進(jìn)行。
100.權(quán)利要求86至99中任一項(xiàng)的方法，所述方法還包括形成所述完全發(fā)酵培養(yǎng)基的步驟。
101.權(quán)利要求100的方法，其中形成所述完全發(fā)酵培養(yǎng)基的所述步驟包括混合(a)所述發(fā)酵微生物、(b)所述含木聚糖的生物質(zhì)、(C)所述纖維素酶、(d)所述半纖維素酶、(e)所述保持型￠-木糖苷酶，和(f)缺少(a)至(e)中的一種或多種或全部的培養(yǎng)基。
102.權(quán)利要求101的方法，其中所述纖維素酶以全纖維素酶制品形式存在。
103.權(quán)利要求102的方法，其中所述全纖維素酶制品包含半纖維素酶。
104.權(quán)利要求102或103的方法，其中所述全纖維素酶制品是通過(guò)培養(yǎng)絲狀真菌獲得的培養(yǎng)液。
105.權(quán)利要求104所述的方法，其中所述絲狀真菌是里氏木霉(T.reesei)。
106.權(quán)利要求105的方法,其中所述里氏木霉(T.reesei)經(jīng)工程化改造而過(guò)表達(dá)天然的保持型￠-木糖苷酶基因或表達(dá)外源的保持型￠-木糖苷酶基因。
107.權(quán)利要求86至106中任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵微生物是真菌或細(xì)菌。
108.權(quán)利要求86至107中任一項(xiàng)的方法，其中所述含木聚糖的生物質(zhì)是玉米秸桿、蔗渣、高粱、蘆竹、象草、芒草、日本柳杉、小麥秸桿、柳枝稷、闊葉紙漿、或針葉紙漿。
109.權(quán)利要求108的方法，其中所述含木聚糖的生物質(zhì)已經(jīng)過(guò)預(yù)處理。
110.權(quán)利要求86至108中任一項(xiàng)的方法，所述方法還包括回收所述AXP化合物的所述步驟。
111.權(quán)利要求86至110中任一項(xiàng)的方法，其中基于摩爾計(jì)、基于分子量計(jì)、或者基于摩爾和分子量計(jì)，所述完全發(fā)酵培養(yǎng)基包含的保持型3 -木糖苷酶的量大于翻轉(zhuǎn)型￠-木糖苷酶的量。
112.—種里氏木霉(T.reesei)細(xì)胞，所述細(xì)胞經(jīng)工程化改造，使得其天然P _木糖苷酶基因過(guò)表達(dá)或者使其表達(dá)外源的3-木糖苷酶基因。
113.權(quán)利要求112的里氏木霉(T.reesei)細(xì)胞，所述細(xì)胞經(jīng)工程化改造而重組表達(dá)GH3、GH30、GH31、GH39、GH52、GH54*GH116 家族酶。
114.權(quán)利要求112的里氏木霉(T.reesei)細(xì)胞，所述細(xì)胞經(jīng)工程化改造而重組表達(dá)XInD, Fv30A, Fv30B, Fv39A, Fv39B, XynB, XylA 或 Xyll 多肽。
115.一種用于生產(chǎn)纖維素酶制品的方法，所述方法包括在導(dǎo)致所述纖維素酶制品產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求112至114中任一項(xiàng)所述的里氏木霉(T. reesei)細(xì)胞。
116.權(quán)利要求115的方法，該方法還包括回收所述纖維素酶制品。
117.—種通過(guò)執(zhí)行權(quán)利要求115或116所述的方法獲得的纖維素酶制品。
118.一種通過(guò)培養(yǎng)權(quán)利要求112至114中任一項(xiàng)所述的里氏木霉(T. reesei)細(xì)胞制得的培養(yǎng)液。
119.一種生物質(zhì)糖化的方法，所述方法包括使所述生物質(zhì)與權(quán)利要求117所述的纖維素酶制品接觸。
120.一種生物質(zhì)糖化的方法，所述方法包括使所述生物質(zhì)與權(quán)利要求118所述的培養(yǎng)液接觸。
121.—種組合物，所述組合物包含至少一種發(fā)酵微生物、至少一種含木聚糖的生物質(zhì)、至少一種纖維素酶、至少一種半纖維素酶和至少一種保持型3 -木糖苷酶。
122.權(quán)利要求121的組合物，其中所述保持型0-木糖苷酶是6113、61130、61131、61139、GH52、GH54 或 GH116 家族酶。
123.權(quán)利要求121的組合物，其中所述翻轉(zhuǎn)型P-木糖苷酶是HnD，F(xiàn)v30A, Fv30B, Fv39A, Fv39B, XynB, XylA 或 Xyll 多肽。
124.權(quán)利要求121至123中任一項(xiàng)的組合物，其中所述含木聚糖的生物質(zhì)是玉米秸桿、蔗渣、高粱、蘆竹、象草、芒草、日本柳杉、小麥秸桿、柳枝稷、闊葉紙漿、或針葉紙漿。
125.權(quán)利要求121至124中任一項(xiàng)的組合物，其中所述發(fā)酵微生物是真菌或細(xì)菌。
126.權(quán)利要求121至125中任一項(xiàng)的組合物，其中所述纖維素酶以全纖維素酶制品形式存在。
127.權(quán)利要求126的組合物，其中所述纖維素酶制品包含半纖維素酶。
128.權(quán)利要求121至127中任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物基本上不含翻轉(zhuǎn)型木糖苷酶或沒(méi)有可檢測(cè)的翻轉(zhuǎn)型3-木糖苷酶活性。
129.—種生產(chǎn)AXP化合物的方法，所述方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求121至128中任一項(xiàng)所述的組合物一段時(shí)間。
全文摘要
本發(fā)明在第一方面涉及翻轉(zhuǎn)型β-木糖苷酶在減少副產(chǎn)物形成和增大發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量中的用途，以及在第二方面涉及保持型β-木糖苷酶在提高同步糖化發(fā)酵反應(yīng)中烷基-β-吡喃木糖苷化合物的產(chǎn)量中的用途。
文檔編號(hào)C12N1/22GK102686736SQ201080058488
公開(kāi)日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2010年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月23日
發(fā)明者B·A·戴納, C·古提爾雷茲, C·米奇森, P·J·費(fèi)根, T·T·黃, W·D·希茨 申請(qǐng)人:丹尼斯科美國(guó)公司