專利名稱：具有改進的產(chǎn)品特異性的蔗糖變位酶的制作方法
具有改進的產(chǎn)品特異性的蔗糖變位酶說明書本發(fā)明涉及由蔗糖生物技術(shù)制備異麥芽酮糖和含異麥芽酮糖的組合物和為此提供改進的工具(Mittel)，尤其是具有改進的產(chǎn)品特異性的蔗糖變位酶以及包含所述改進的蔗糖變位酶的微生物細胞。眾所周知，在生物技術(shù)工藝中可通過酶促異構(gòu)化由蔗糖(甘蔗糖、甜菜糖)制備異麥芽酮糖(帕拉金糖)。異麥芽酮糖是一種生理學有價值的糖，其作為蔗糖替代物質(zhì)在食品和相關(guān)產(chǎn)品中的重要性日益增長。異麥芽酮糖是非致齲的并且在與蔗糖能量含量基本相同 的情況下具有低的血糖指數(shù)。自2005年以來，異麥芽酮糖已被允許用于食品中。此外，異麥芽酮糖是用于制備糖醇異麥芽酮糖醇的原料，異麥芽酮糖醇是1，6-GPS (6-0- a -D-批喃葡萄糖基-D-山梨醇)和1，I-GPM (1-0- a -D-吡喃葡萄糖基-D-甘露醇)的消旋混合物及其修飾物，尤其是GPS或GPM富集的混合物。眾所周知，由蔗糖生物技術(shù)制備異麥芽酮糖在使用顯示細菌酶活性的蔗糖變位酶，E. C. 5. 4. 99. 11 (同義詞蔗糖變位酶、蔗糖異構(gòu)酶、異麥芽酮糖合成酶)的優(yōu)選固定的細菌細胞或其碎片的條件下進行。已知具有蔗糖變位酶活性且可以用于生物技術(shù)工藝的微生物，尤其是紅色精I元桿菌(Protaminobacter rubrum)、大黃歐文菌(Erwinia rhapontici)、嗜中酸假單胞菌(Pseudomonas mesoacidophila)、分散泛菌(Pantoea dispersa)和普利茅斯沙雷氏菌(Serratia plymuthica)。其內(nèi)源性鹿糖變位酶以SmuA、Pall、SmtA、MutB、SIM等縮寫而聞名。蔗糖變位酶由染色體基因編碼。在已知的生物技術(shù)體系中，蔗糖被不完全酶促異構(gòu)為異麥芽酮糖。確切地說，其生成其它的異構(gòu)產(chǎn)物和副產(chǎn)物。一種重要的其它異構(gòu)產(chǎn)物是海藻糖。在微生物紅色精朊桿菌(Protaminobacter rubrum)中存在鹿糖變位酶SmuA,其產(chǎn)品特異性被如此設(shè)計,使得即使在最佳的培養(yǎng)條件下也僅使最高約85%的鹿糖異構(gòu)化為異麥芽酮糖。所述鹿糖變位酶SmuA的產(chǎn)品特異性是值得改善的。但是，用生物技術(shù)方法的異麥芽酮糖工業(yè)化生產(chǎn)是基于紅色精朊桿菌(P. rubrum)的鹿糖變位酶SmuA。所以，本發(fā)明的目的在于，提供一種改進的基于SmuA的蔗糖變位酶以及一種包含這種改進的蔗糖變位酶的微生物，所述微生物具有改進的產(chǎn)品特異性和異麥芽酮糖選擇性，由此提高異構(gòu)化產(chǎn)品中異麥芽酮糖的比例，這樣也可以更有效地在其它已知的生物技術(shù)工藝中進行蔗糖向異麥芽酮糖的轉(zhuǎn)化。這里，本發(fā)明的目的特別在于，提供一種改進的基于SmuA的蔗糖變位酶，其可以用于基本無改變的、已經(jīng)確立的工業(yè)化生物技術(shù)工藝中，而不必高成本地調(diào)整已確立的工藝中的反應條件和工藝流程。應避免使用來自其它生物的蔗糖變位酶和調(diào)整為新的生物技術(shù)工藝。作為本發(fā)明的基礎(chǔ)的技術(shù)問題通過提供一種新的聚氨基酸分子得以完全解決，對于蔗糖向異麥芽酮糖的轉(zhuǎn)化，所述聚氨基酸分子具有改進的蔗糖變位酶活性，即對異麥芽酮糖較高的產(chǎn)品特異性。根據(jù)本發(fā)明，所述改進的蔗糖變位酶具有氨基酸序列，其優(yōu)選直接來源于紅色精朊桿菌(Protaminobacter rubrum)的鹿糖變位酶SmuA的野生型序列,其中分別相對于SEQ ID NO. I中的野生型序列的位置號，在至少一個下述氨基酸位置中具有一個或多個以下列舉的氨基酸取代S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369L和A346Q以及兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種或者所有十種的組合。這里，根據(jù)本發(fā)明，所述位置取決于活性中心的位置而定。所以，本發(fā)明提供如下解決辦法改進的新型的蔗糖變位酶，其特征在于，其具有、僅具有或其包含修飾的氨基酸序列，其選自相對于以SEQ ID NO. I表示的序列具有一個或多個下列氨基酸取代的氨基酸序列S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369L和 A346Q。本發(fā)明也涉及其功能性的修飾，即聚氨基酸分子具有、僅具有或包含根據(jù)本發(fā)明對以SEQ ID NO. I表示的序列進行修飾的氨基酸序列的片段，從而聚氨基酸分子具有根據(jù) 本發(fā)明改善的新型蔗糖變位酶的功能。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地由這里給出的序列數(shù)據(jù)制造相應的功能性修飾并以熟悉的方式測試其作為蔗糖變位酶的功能。在本發(fā)明的第一個實施方式中，所述氨基酸取代在位置S303處；優(yōu)選取代為氨基酸P。在本發(fā)明一個替代的或另外的實施方式中，所述氨基酸取代在位置D302處；優(yōu)選取代為氨基酸Y。特別優(yōu)選S303P與D302Y的取代組合。在本發(fā)明一個替代的或另外的實施方式中，所述氨基酸取代在位置K180處；優(yōu)選取代為氨基酸P。在本發(fā)明一個替代的或另外的實施方式中，所述氨基酸取代在位置M199處；優(yōu)選取代為氨基酸I (M199I)。在本發(fā)明一個替代的或另外的實施方式中，所述氨基酸取代在位置Q276處；優(yōu)選取代為氨基酸A。在本發(fā)明一個替代的或另外的實施方式中，所述氨基酸取代在位置A198處；優(yōu)選取代為氨基酸D。在本發(fā)明一個替代的或另外的實施方式中，所述氨基酸取代在位置Y219處；優(yōu)選取代為氨基酸F。在本發(fā)明一個替代的或另外的實施方式中，所述氨基酸取代在位置V324處；優(yōu)選取代為氨基酸T。在本發(fā)明一個替代的或另外的實施方式中，所述氨基酸取代在位置T369處；優(yōu)選取代為氨基酸L。在本發(fā)明一個替代的或另外的實施方式中，所述氨基酸取代在位置A346處；優(yōu)選取代為氨基酸Q。除下文中詳細描述的優(yōu)選的多種氨基酸取代的組合而外，可以是單獨的或組合的下列另外氨基酸M199I 組合 V114I、Q122R、Q276A、N423E、L426I、L426F。還優(yōu)選的是S303P 與選自由 D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369L和A346Q組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合。一種優(yōu)選的組合是S303P+D302Y。一種優(yōu)選的組合是S303P+M199I。另一種優(yōu)選的組合是S303P+Q276A。另一種優(yōu)選的組合是S303P+A198D。另一種優(yōu)選的組合是S303P+Y219F。另一種優(yōu)選的組合是S303P+V324T。另一種優(yōu)選的組合是S303P+T369L。另一種優(yōu)選的組合是S303P+A346Q。S303P 與 D302Y 以及選自由 K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369L 和A346Q組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合也是優(yōu)選的。S303P 與 K180P 以及選自由 D302Y、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369L 和A346Q組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合也是優(yōu)選的。S303P 與 M199I 以及選自由 D302Y、K180P、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369L 和A346Q組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合也是優(yōu)選的。S303P 與 Q276A 以及選自由 D302Y、K180P、M199I、A198D、Y219F、V324T、T369L 和A346Q組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合也是優(yōu)選的。S303P 與 A198D 以及選自由 D302Y、K180P、M199I、Q276A、Y219F、V324T、T369L 和A346Q組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合也是優(yōu)選的。S303P 與 Y219F 以及選自由 D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、V324T、T369L 和 A346Q組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合也是優(yōu)選的。S303P 與 V324T 以及選自由 D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、T369L 和A346Q組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合也是優(yōu)選的。S303P 與 T369L 以及選自由 D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T 和A346Q組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合也是優(yōu)選的。S303P 與 A346Q 以及選自由 D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T 和T369L組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合也是優(yōu)選的。其一種優(yōu)選的組合是S303P+D302Y+K180P。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369L 和 A346Q。優(yōu)選 S303P+D302Y+K180P+S303P+D302Y+K180P+M199I、S303P+D302Y+K180P+S303P+D302Y+K180P+Q276A、S303P+D302Y+K180P+A198D、S303P+D302Y+K180P+Y219F、S303P+D302Y+K180P+V324T,S303P+D302Y+K180P+T369L 和 / 或 S303P+D302Y+K180P+A346Q。另一種優(yōu)選的組合是S303P+D302Y+M199I。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合K180P、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369L 和 A346Q。優(yōu)選 S303P+D302Y+M199I+S303P+D302Y+M199I+Q276A.S303P+D302Y+M199I+A198D.S303P+D302Y+M199I+Y219F,S303P+D302Y+M199I+V324T、S303P+D302Y+M199I+T369L 和 / 或 S303P+D302Y+M199I+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是S303P+D302Y+Q276A。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合:K180P、M199I、A198D、Y219F、V324T、T369L 和 A346Q。優(yōu)選S303P+D302Y+Q276A+A198D、 S303P+D302Y+Q276A+Y219F、 S303P+D302Y+Q276A+V324T、S303P+D302Y+Q276A+T369US303P+D302Y+Q276A+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是S303P+D302Y+A198D。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合:K180P、M199I、Q276A、Y219F、V324T、T369L 和 A346Q。優(yōu)選S303P+D302Y+A198D+Y219F、S303P+D302Y+A198D+V324T、S303P+D302Y+A198D+T369L 和 / 或S303P+D302Y+A198D+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是S303P+D302Y+Y219F。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合K180P、M199I、Q276A、A198D、V324T、T369L 和 A346Q。優(yōu)選S303P+D302Y+Y219F+V324T、S303P+D302Y+Y219F+T369L 和 / 或 S303P+D302Y+Y219F+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。
另一種優(yōu)選的組合是S303P+D302Y+V324T。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合:K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、T369L 和 A346Q。優(yōu)選S303P+D302Y+V324T+T369L 和 / 或 S303P+D302Y+V324T+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是S303P+D302Y+T369L。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合:K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T 和 A346Q。優(yōu)選S303P+D302Y+T369L+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是S303P+D302Y+A346Q。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T和T369L。其另外優(yōu)選的實施方 式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是S303P+K180P+M199I。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合D302Y、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369L 和 A346Q。優(yōu)選 S303P+K180P+M199I+S303P+K180P+M199I+Q276A、S303P+K180P+M199I+A198D、S303P+K180P+M199I+Y219F、S303P+K180P+M199I+V324T、S303P+K180P+M199I+T369L 和 / 或 S303P+K180P+M199I+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是S303P+K180P+Q276A。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合D302Y、M199I、A198D、Y219F、V324T、T369L 和 A346Q。優(yōu)選S303P+K180P+Q276A+A198D、 S303P+K180P+Q276A+Y219F、 S303P+K180P+Q276A+V324T、S303P+K180P+Q276A+T369L 和 / 或 S303P+K180P+Q276A+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是S303P+K180P+A198D。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合D302Y、M199I、Q276A、Y219F、V324T、T369L 和 A346Q。優(yōu)選S303P+K180P+A198D+Y219F、S303P+K180P+A198D+V324T、S303P+K180P+A198D+T369L 和 / 或S303P+K180P+A198D+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是S303P+K180P+Y219F。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合D302Y、M199I、Q276A、A198D、V324T、T369L 和 A346Q。優(yōu)選S303P+K180P+Y219F+V324T、S303P+K180P+Y219F+T369L 和 / 或 S303P+K180P+Y219F+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是S303P+K180P+V324T。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合:D302Y、M199I、Q276A、A198D、Y219F、T369L 和 A346Q。優(yōu)選S303P+K180P+V324T+T369L 和 / 或 S303P+K180P+V324T+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是S303P+K180P+T369L。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合:D302Y、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T 和 A346Q。優(yōu)選S303P+K180P+T369L+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是S303P+K180P+A346Q。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合D302Y、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T和T369L。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是S303P+M199I+Q276A。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合D302Y、K180P、A198D、Y219F、V324T、T369L 和 A346Q。優(yōu)選 S303P+M199I+Q276A+S303P+M199I+Q276A+A198D、S303P+M199I+Q276A+Y219F、S303P+M199I+Q276A+V324T 和/ 或 S303P+M199I+Q276A+T369L、S303P+M199I+Q276A+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是S303P+M199I+A198D。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合:D302Y、K180P、Q276A、Y219F、V324T、T369L 和 A346Q。優(yōu)選S303P+M199I+A198D+Y219F、S303P+M199I+A198D+V324T、S303P+M199I+A198D+T369L 和 / 或S303P+M199I+A198D+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是S303P+M199I+Y219F。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合D302Y、K180P、Q276A、A198D、V324T、T369L 和 A346Q。優(yōu)選S303P+M199I+Y219F+V324T 和 / 或 S303P+M199I+Y219F+T369L、S303P+M199I+Y219F+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。
另一種優(yōu)選的組合是S303P+M199I+V324T。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合:D302Y、K180P、Q276A、A198D、Y219F、T369L 和 A346Q。優(yōu)選S303P+M199I+V324T+T369L 和 / 或 S303P+M199I+V324T+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是S303P+M199I+T369L。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合:D302Y、K180P、Q276A、A198D、Y219F、V324T 和 A346Q。優(yōu)選S303P+M199I+T369L+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是S303P+M199I+A346Q。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合D302Y、K180P、Q276A、A198D、Y219F、V324T和T369L。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是S303P+Q276A+A198D。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合D302Y、K180P、M199I、Y219F、V324T、T369L 和 A346Q。優(yōu)選S303P+Q276A+A198D+Y219F、S303P+Q276A+A198D+V324T、S303P+Q276A+A198D+T369L 和 / 或S303P+Q276A+A198D+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是S303P+Q276A+Y219F。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合D302Y、K180P、M199I、A198D、V324T、T369L 和 A346Q。優(yōu)選S303P+Q276A+Y219F+V324T、S303P+Q276A+Y219F+T369L 和 / 或 S303P+Q276A+Y219F+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是S303P+Q276A+V324T。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合D302Y、K180P、M199I、A198D、Y219F、T369L 和 A346Q。優(yōu)選S303P+Q276A+V324T+T369L 和 / 或 S303P+Q276A+V324T+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是S303P+Q276A+T369L。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合:D302Y、K180P、M199I、A198D、Y219F、V324T 和 A346Q。優(yōu)選S303P+Q276A+T369L+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是S303P+Q276A+A346Q。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合D302Y、K180P、M199I、A198D、Y219F、V324T和T369L。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是S303P+A198D+Y219F。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合D302Y、K180P、M199I、Q276A、V324T、T369L 和 A346Q。優(yōu)選S303P+A198D+Y219F+V324T、S303P+A198D+Y219F+T369L 和 / 或 S303P+A198D+Y219F+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是S303P+A198D+V324T。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合:D302Y、K180P、M199I、Q276A、Y219F、T369L 和 A346Q。優(yōu)選S303P+A198D+V324T+T369L、S303P+A198D+V324T+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。

另一種優(yōu)選的組合是S303P+A198D+T369L。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合:D302Y、K180P、M199I、Q276A、Y219F、V324T 和 A346Q。優(yōu)選S303P+A198D+T369L+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是S303P+A198D+A346Q。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合D302Y、K180P、M199I、Q276A、Y219F、V324T和T369L。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是S303P+Y219F+V324T。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、T369L 和 A346Q。優(yōu)選S303P+Y219F+V324T+T369L 和 / 或 S303P+Y219F+V324T+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是S303P+Y219F+T369L。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、V324T 和 A346Q。優(yōu)選S303P+Y219F+T369L+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是S303P+Y219F+A346Q。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、V324T和T369L。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是S303P+V324T+T369L。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F 和 A346Q。優(yōu)選S303P+V324T+T369L+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是S303P+V324T+A346Q。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F和T369L。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是S303P+T369L+A346Q。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F和V324T。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。D302Y 與選自 S303P、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369L 和 A346Q的至少另外一種或恰好另外一種的組合是優(yōu)選的。一種優(yōu)選的組合是D302Y+K180P。另一種優(yōu)選的組合是D302Y+M199I。另一種優(yōu)選的組合是D302Y+Q276A。另一種優(yōu)選的組合是D302Y+A198D。另一種優(yōu)選的組合是D302Y+Y219F。另一種優(yōu)選的組合是D302Y+V324T。另一種優(yōu)選的組合是D302Y+T369L。另一種優(yōu)選的組合是D302Y+A346Q。D302Y 與 K180P 以及選自由 S303P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369L 和A346Q組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合也是優(yōu)選的。D302Y 與 M199I 以及選自由 S303P、K180P、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369L 和A346Q組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合也是優(yōu)選的。D302Y 與 Q276A 以及選自由 S303P、K180P、M199I、A198D、Y219F、V324T、T369L 和A346Q組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合也是優(yōu)選的。D302Y 與 A198D 以及選自由 S303P、K180P、M199I、Q276A、Y219F、V324T、T369L 和A346Q組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合也是優(yōu)選的。D302Y 與 Y219F 以及選自由 S303P、K180P、M199I、Q276A、A198D、V324T、T369L 和A346Q組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合也是優(yōu)選的。D302Y 與 V324T 以及選自由 S303P、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、T369L 和 A346Q組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合也是優(yōu)選的。D302Y 與 T369L 以及選自由 S303P、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T 和A346Q組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合也是優(yōu)選的。D302Y 與 A346Q 以及選自由 S303P、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T 和T369L組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合也是優(yōu)選的。D302Y 與選自由 S303P、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369L 和 A346Q組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合也是優(yōu)選的。另一種優(yōu)選的組合是D302Y+K180P+M199I。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369L 和 A346Q。優(yōu)選 D302Y+K180P+M199I+D302Y+K180P+M199I+Q276A、D302Y+K180P+M199I+A198D、D302Y+K180P+M199I+Y219F、D302Y+K180P+M199I+V324T.D302Y+K180P+M199I+T369L 和 / 或 D302Y+K180P+M199I+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是D302Y+K180P+Q276A。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、M199I、A198D、Y219F、V324T、T369L 和 A346Q。(優(yōu)選)D302Y+K180P+Q276A+A198D、D302Y+K180P+Q276A+Y219F、D302Y+K180P+Q276A+V324T、D302Y+K180P+Q276A+T369L 和 / 或 D302Y+K180P+Q276A+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是D302Y+K180P+A198D。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、M199I、Q276A、Y219F、V324T、T369L 和 A346Q。優(yōu)選D302Y+K180P+A198D+Y219F、D302Y+K180P+A198D+V324T、D302Y+K180P+A198D+T369L 和 / 或D302Y+K180P+A198D+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是D302Y+K180P+Y219F。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、M199I、Q276A、A198D、V324T、T369L 和 A346Q。優(yōu)選D302Y+K180P+Y219F+V324T.D302Y+K180P+Y219F+T369L 和 / 或 D302Y+K180P+Y219F+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是D302Y+K180P+V324T。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合:S303P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、T369L 和 A346Q。優(yōu)選D302Y+K180P+V324T+T369L 和 / 或 D302Y+K180P+V324T+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。
另一種優(yōu)選的組合是D302Y+K180P+T369L。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T 和 A346Q。優(yōu)選D302Y+K180P+T369L+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是D302Y+K180P+A346Q。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T和T369L。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是D302Y+M199I+Q276A。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、K180P、A198D、Y219F、V324T、T369L 和 A346Q。(優(yōu)選)D302Y+M199I+Q276A+A198D、D302Y+M199I+Q276A+Y219F、D302Y+M199I+Q276A+V324T 和 / 或 D302Y+M199I+Q276A+T369L、D302Y+M199I+Q276A+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是D302Y+M199I+A198D。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、K180P、Q276A、Y219F、V324T、T369L 和 A346Q。優(yōu)選D302Y+M199I+A198D+Y219F、D302Y+M199I+A198D+V324T、D302Y+M199I+A198D+T369L 和 / 或D302Y+M199I+A198D+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是D302Y+M199I+Y219F。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、K180P、Q276A、A198D、V324T、T369L 和 A346Q。優(yōu)選D302Y+M199I+Y219F+V324T、D302Y+M199I+Y219F+T369L 和 / 或 D302Y+M199I+Y219F+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是D302Y+M199I+V324T。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、K180P、Q276A、A198D、Y219F、T369L 和 A346Q。優(yōu)選D302Y+M199I+V324T+T369L、D302Y+M199I+V324T+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是D302Y+M199I+T369L。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、K180P、Q276A、A198D、Y219F、V324T 和 A346Q。優(yōu)選D302Y+M199I+T369L+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是D302Y+M199I+A346Q。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、K180P、Q276A、A198D、Y219F、V324T和T369L。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是D302Y+Q276A+A198D。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、K180P、M199I、Y219F、V324T、T369L 和 A346Q。優(yōu)選D302Y+Q276A+A198D+Y219F、D302Y+Q276A+A198D+V324T、D302Y+Q276A+A198D+T369L 和 / 或D302Y+Q276A+A198D+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是D302Y+Q276A+Y219F。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、K180P、M199I、A198D、V324T、T369L 和 A346Q。優(yōu)選D302Y+Q276A+Y219F+V324T 和 / 或 D302Y+Q276A+Y219F+T369L、D302Y+Q276A+Y219F+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是D302Y+Q276A+V324T。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、K180P、M199I、A198D、Y219F、T369L 和 A346Q。優(yōu)選D302Y+Q276A+V324T+T369L、D302Y+Q276A+V324T+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是D302Y+Q276A+T369L。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、K180P、M199I、A198D、Y219F、V324T 和 A346Q。優(yōu)選D302Y+Q276A+T369L+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是D302Y+Q276A+A346Q。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、K180P、M199I、A198D、Y219F、V324T和T369L。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是D302Y+A198D+V324T。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、K180P、M199I、Q276A、Y219F、T369L 和 A346Q。優(yōu)選D302Y+A198D+V324T+T369L 和 / 或 D302Y+A198D+V324T+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是D302Y+A198D+T369L。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、K180P、M199I、Q276A、Y219F、V324T 和 A346Q。優(yōu)選D302Y+A198D+T369L+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。
另一種優(yōu)選的組合是D302Y+A198D+A346Q。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、K180P、M199I、Q276A、Y219F、V324T和T369L。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是D302Y+Y219F+V324T。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、K180P、M199I、Q276A、A198D、T369L 和 A346Q。優(yōu)選D302Y+Y219F+V324T+T369L、D302Y+Y219F+V324T+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是D302Y+Y219F+T369L。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、K180P、M199I、Q276A、A198D、V324T 和 A346Q。優(yōu)選D302Y+Y219F+T369L+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是D302Y+Y219F+A346Q。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、K180P、M199I、Q276A、A198D、V324T和T369L。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是D302Y+V324T+T369L。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F 和 A346Q。優(yōu)選D302Y+V324T+T369L+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是D302Y+V324T+A346Q。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F和T369L。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是D302Y+T369L+A346Q。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F和V324T。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。K180P 與選自由 S303P、D302Y、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369L 和A346Q組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合是優(yōu)選的。另一種優(yōu)選的組合是K180P+Q276A。另一種優(yōu)選的組合是K180P+A198D。另一種優(yōu)選的組合是K180P+Y219F。另一種優(yōu)選的組合是K180P+V324T。另一種優(yōu)選的組合是K180P+T369L。另一種優(yōu)選的組合是 K180P+A346Q.K180P 與 M199I 以及選自由 S303P、D302Y、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369L 和A346Q組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合也是優(yōu)選的。K180P 與 Q276A 以及選自由 S303P、D302Y、M199I、A198D、Y219F、V324T、T369L 和A346Q組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合也是優(yōu)選的。K180P 與 A198D 以及選自由 S303P、D302Y、M199I、Q276A、Y219F、V324T、T369L 和A346Q組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合也是優(yōu)選的。K180P 與 Y219F 以及選自由 S303P、D302Y、M199I、Q276A、A198D、V324T、T369L 和A346Q組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合也是優(yōu)選的。K180P 與 V324T 以及選自由 S303P、D302Y、M199I、Q276A、A198D、Y219F、T369L 和 A346Q組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合也是優(yōu)選的。K180P 與 T369L 以及選自由 S303P、D302Y、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T 和A346Q組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合也是優(yōu)選的。K180P 與 A346Q 以及選自由 S303P、D302Y、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T 和T369L組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合也是優(yōu)選的。另一種優(yōu)選的組合是K180P+M199I+Q276A。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、A198D、Y219F、V324T、T369L 和 A346Q。(優(yōu)選)K180P+M199I+Q276A+A198D、K180P+M199I+Q276A+Y219F、K180P+M199I+Q276A+V324T、K180P+M199I+Q276A+T369L 和 / 或 K180P+M199I+Q276A+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是K180P+M199I+A198D。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、Q276A、Y219F、V324T、T369L 和 A346Q。優(yōu)選K180P+M199I+A198D+Y219F、K180P+M199I+A198D+V324T、K180P+M199I+A198D+T369L 和 / 或K180P+M199I+A198D+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是K180P+M199I+Y219F。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、Q276A、A198D、V324T、T369L 和 A346Q。優(yōu)選K180P+M199I+Y219F+V324T、K180P+M199I+Y219F+T369L 和 / 或 K180P+M199I+Y219F+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是K180P+M199I+V324T。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、Q276A、A198D、Y219F、T369L 和 A346Q。優(yōu)選K180P+M199I+V324T+T369L、K180P+M199I+V324T+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是K180P+M199I+T369L。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、Q276A、A198D、Y219F、V324T 和 A346Q。優(yōu)選K180P+M199I+T369L+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是K180P+M199I+A346Q。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、Q276A、A198D、Y219F、V324T和T369L。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是K180P+Q276A+A198D。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、M199I、Y219F、V324T、T369L 和 A346Q。優(yōu)選K180P+Q276A+A198D+Y219F、K180P+Q276A+A198D+V324T、K180P+Q276A+A198D+T369L 和 / 或K180P+Q276A+A198D+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。
另一種優(yōu)選的組合是K180P+Q276A+Y219F。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、M199I、A198D、V324T、T369L 和 A346Q。優(yōu)選K180P+Q276A+Y219F+V324T.K180P+Q276A+Y219F+T369L 和 / 或 K180P+Q276A+Y219F+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是K180P+Q276A+V324T。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、M199I、A198D、Y219F、T369L 和 A346Q。優(yōu)選K180P+Q276A+V324T+T369L 和 / 或 K180P+Q276A+V324T+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是K180P+Q276A+T369L。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、M199I、A198D、Y219F、V324T 和 A346Q。優(yōu)選K180P+Q276A+T369L+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是K180P+Q276A+A346Q。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、M199I、A198D、Y219F、V324T和T369L。其另外優(yōu)選的實施方 式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是K180P+A198D+Y219F。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、M199I、Q276A、V324T、T369L 和 A346Q。優(yōu)選K180P+A198D+Y219F+V324T、K180P+A198D+Y219F+T369L 和 / 或 K180P+A198D+Y219F+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是K180P+A198D+V324T。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、M199I、Q276A、Y219F、T369L 和 A346Q。優(yōu)選K180P+A198D+V324T+T369L 和 / 或 K180P+A198D+V324T+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是K180P+A198D+T369L。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、M199I、Q276A、Y219F、V324T 和 A346Q。優(yōu)選K180P+A198D+T369L+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是K180P+A198D+A346Q。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、M199I、Q276A、Y219F、V324T和T369L。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是K180P+Y219F+V324T。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、M199I、Q276A、A198D、T369L 和 A346Q。優(yōu)選K180P+Y219F+V324T+T369L、K180P+Y219F+V324T+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是K180P+Y219F+T369L。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、M199I、Q276A、A198D、V324T 和 A346Q。優(yōu)選K180P+Y219F+T369L+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是K180P+Y219F+A346Q。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、M199I、Q276A、A198D、V324T和T369L。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是K180P+V324T+T369L。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、M199I、Q276A、A198D、Y219F 和 A346Q。優(yōu)選K180P+V324T+T369L+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是K180P+V324T+A346Q。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、M199I、Q276A、A198D、Y219F和T369L。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是K180P+T369L+A346Q。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、M199I、Q276A、A198D、Y219F和V324T。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。M199I 與選自由 S303P、D302Y、K180P、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369L 和A346Q組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合是優(yōu)選的。另一種優(yōu)選的組合是 M199I+Q276A。另一種優(yōu)選的組合是M199I+A198D。另一種優(yōu)選的組合是M199I+Y219F。另一種優(yōu)選的組合是M199I+V324T。另一種優(yōu)選的組合是M199I+T369L。另一種優(yōu)選的組合是 M199I+A346Q。M199I 與 Q276A 以及選自由 S303P、D302Y、K180P、A198D、Y219F、V324T、T369L 和A346Q組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合也是優(yōu)選的。M199I 與 A198D 以及選自由 S303P、D302Y、K180P、Q276A、Y219F、V324T、T369L 和A346Q組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合也是優(yōu)選的。M199I 與 Y219F 以及選自由 S303P、D302Y、K180P、Q276A、A198D、V324T、T369L 和A346Q組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合也是優(yōu)選的。M199I 與 V324T 以及選自由 S303P、D302Y、K180P、Q276A、A198D、Y219F、T369L 和A346Q組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合也是優(yōu)選的。M199I 與 T369L 以及選自由 S303P、D302Y、K180P、Q276A、A198D、Y219F、V324T 和A346Q組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合也是優(yōu)選的。M199I 與 A346Q 以及選自由 S303P、D302Y、K180P、Q276A、A198D、Y219F、V324T 和T369L組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合也是優(yōu)選的。另一種優(yōu)選的組合是M199I+Q276A+A198D。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、K180P、Y219F、V324T、T369L 和 A346Q。優(yōu)選M199I+Q276A+A198D+Y219F、M199I+Q276A+A198D+V324T、M199I+Q276A+A198D+T369L 和 / 或M199I+Q276A+A198D+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是M199I+Q276A+Y219F。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、K180P、A198D、V324T、T369L 和 A346Q。優(yōu)選的是M199I+Q276A+Y219F+V324T 和 / 或 M199I+Q276A+Y219F+T369L、M199I+Q276A+Y219F+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是M199I+Q276A+V324T。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、K180P、A198D、Y219F、T369L 和 A346Q。優(yōu)選M199I+Q276A+V324T+T369L 和 / 或 M199I+Q276A+V324T+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是M199I+Q276A+T369L。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、K180P、A198D、Y219F、V324T 和 A346Q。優(yōu)選M199I+Q276A+T369L+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。
另一種優(yōu)選的組合是M199I+Q276A+A346Q。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、K180P、A198D、Y219F、V324T和T369L。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是M199I+A198D+Y219F。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、K180P、Q276A、V324T、T369L 和 A346Q。優(yōu)選M199I+A198D+Y219F+V324T 和 / 或 M199I+A198D+Y219F+T369L、M199I+A198D+Y219F+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是M199I+A198D+V324T。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、K180P、Q276A、Y219F、T369L 和 A346Q。優(yōu)選M199I+A198D+V324T+T369L、M199I+A198D+V324T+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是M199I+A198D+T369L。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、K180P、Q276A、Y219F、V324T 和 A346Q。優(yōu)選M199I+A198D+T369L+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。 另一種優(yōu)選的組合是M199I+A198D+A346Q。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、K180P、Q276A、Y219F、V324T和T369L。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是M199I+Y219F+V324T。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、K180P、Q276A、A198D、T369L 和 A346Q。優(yōu)選M199I+Y219F+V324T+T369L 和 / 或 M199I+Y219F+V324T+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是M199I+Y219F+T369L。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、K180P、Q276A、A198D、V324T 和 A346Q。優(yōu)選M199I+Y219F+T369L+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是M199I+Y219F+A346Q。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、K180P、Q276A、A198D、V324T和T369L。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是M199I+V324T+T369L。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、K180P、Q276A、A198D、Y219F 和 A346Q。優(yōu)選M199I+V324T+T369L+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是M199I+V324T+A346Q。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、K180P、Q276A、A198D、Y219F和T369L。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是M199I+T369L+A346Q。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、K180P、Q276A、A198D、Y219F和V324T。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。Q276A 與選自由 S303P、D302Y、K180P、M199I、A198D、Y219F、V324T、T369L 和A346Q組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合是優(yōu)選的。另一種優(yōu)選的組合是Q276A+A198D。另一種優(yōu)選的組合是Q276A+Y219F。另一種優(yōu)選的組合是Q276A+V324T。另一種優(yōu)選的組合是Q276A+T369L。另一種優(yōu)選的組合是Q276A+A346Q。
Q276A 與 A198D 以及選自由 S303P、D302Y、K180P、M199I、Y219F、V324T、T369L 和A346Q組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合也是優(yōu)選的。Q276A 與 Y219F 以及選自 S303P、D302Y、K180P、M199I、A198D、V324T、T369L 和A346Q組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合也是優(yōu)選的。Q276A 與 V324T 以及選自 S303P、D302Y、K180P、M199I、A198D、Y219F、T369L 和A346Q組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合也是優(yōu)選的。Q276A 與 T369L 以及選自 S303P、D302Y、K180P、M199I、A198D、Y219F、V324T 和A346Q組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合也是優(yōu)選的。Q276A 與 A346Q 以及選自 S303P、D302Y、K180P、M199I、A198D、Y219F、V324T 和T369L組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合也是優(yōu)選的。Q276A 與選自由 S303P、D302Y、K180P、M199I、A198D、Y219F、V324T、T369L 和 A346Q 組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合是優(yōu)選的。另一種優(yōu)選的組合是Q276A+A198D+Y219F。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、K180P、M199I、V324T、T369L 和 A346Q。優(yōu)選Q276A+A198D+Y219F+V324T 和 / 或 Q276A+A198D+Y219F+T369L、Q276A+A198D+Y219F+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是Q276A+A198D+V324T。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、K180P、M199I、Y219F、T369L 和 A346Q。優(yōu)選Q276A+A198D+V324T+T369L 和 / 或 Q276A+A198D+V324T+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是Q276A+A198D+T369L。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、K180P、M199I、Y219F、V324T 和 A346Q。優(yōu)選Q276A+A198D+T369L+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是Q276A+A198D+A346Q。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、K180P、M199I、Y219F、V324T和T369L。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是Q276A+Y219F+V324T。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、K180P、M199I、A198D、T369L 和 A346Q。優(yōu)選Q276A+Y219F+V324T+T369L 和 / 或 Q276A+Y219F+V324T+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是Q276A+Y219F+T369L。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、K180P、M199I、A198D、V324T 和 A346Q。優(yōu)選Q276A+Y219F+T369L+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是Q276A+Y219F+A346Q。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、K180P、M199I、A198D、V324T和T369L。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是Q276A+V324T+T369L。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、K180P、M199I、A198D、Y219F 和 A346Q。優(yōu)選Q276A+V324T+T369L+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。
另一種優(yōu)選的組合是Q276A+V324T+A346Q。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、K180P、M199I、A198D、Y219F和T369L。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是Q276A+T369L+A346Q。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、K180P、M199I、A198D、Y219F和V324T。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。A198D 與選自由 S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、Y219F、V324T、T369L 和A346Q組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合是優(yōu)選的。一種優(yōu)選的組合是A198D+Y219F。另一種優(yōu)選的組合是A198D+V324T。另一種優(yōu)選的組合是A198D+T369L。另 一種優(yōu)選的組合是A198D+A346Q。A198D 與 Y219F 以及選自由 S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、V324T、T369L 和A346Q組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合也是優(yōu)選的。A198D 與 V324T 以及選自由 S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、Y219F、T369L 和A346Q組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合也是優(yōu)選的。A198D 與 T369L 以及選自由 S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、Y219F、V324T 和A346Q組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合也是優(yōu)選的。A198D 與 A346Q 以及選自由 S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、Y219F、V324T 和T369L組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合也是優(yōu)選的。A198D 與選自由 S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、Y219F、V324T、T369L 和 A346Q組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合也是優(yōu)選的。一種優(yōu)選的組合是A198D+Y219F+V324T。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、T369L 和 A346Q。優(yōu)選A198D+Y219F+V324T+T369L 和 / 或 A198D+Y219F+V324T+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是A198D+Y219F+T369L。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、V324T 和 A346Q。優(yōu)選A198D+Y219F+T369L+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是A198D+Y219F+A346Q。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、V324T和T369L。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是A198D+V324T+T369L。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、Y219F 和 A346Q。優(yōu)選A198D+V324T+T369L+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是A198D+V324T+A346Q。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、Y219F和T369L。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是A198D+T369L+A346Q。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、Y219F和V324T。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。
Y219F 與選自由 S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、V324T、T369L 和A346Q組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合是優(yōu)選的。一種優(yōu)選的組合是Y219F+V324T。另一種優(yōu)選的組合是Y219F+T369L。另一種優(yōu)選的組合是Y219F+A346Q.Y219F 與 V324T 以及選自由 S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、T369L 和A346Q組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合也是優(yōu)選的。Y219F 與 T369L 以及選自由 S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、V324T 和A346Q組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合也是優(yōu)選的。Y219F 與 A346Q 的選自由 S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、V324T 和T369L組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合也是優(yōu)選的。Y219F 與選自由 S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、V324T、T369L 和 A346Q組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合是優(yōu)選的。
另一種優(yōu)選的組合是Y219F+V324T+T369L。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D 和 A346Q。優(yōu)選Y219F+V324T+T369L+A346Q。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是Y219F+V324T+A346Q。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D和T369L。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。另一種優(yōu)選的組合是Y219F+T369L+A346Q。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D和V324T。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。V324T 與選自由 S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、T369L 和A346Q組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合是優(yōu)選的。一種優(yōu)選的組合是V324T+T369L。另一種優(yōu)選的組合是 V324T+A346Q。V324T 與 T369L 以及選自由 S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F 和A346Q組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合也是優(yōu)選的。V324T 與 A346Q 以及選自由 S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F 和T369L組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合也是優(yōu)選的。一種優(yōu)選的組合是V324T+T369L+A346Q。在其它變體中，該組合與選自以下的一種或多種組合S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D和Y219F。其另外優(yōu)選的實施方式如上所述。T369L 與選自由 S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T 和A346Q組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合是優(yōu)選的。一種優(yōu)選的組合是T369L+A346Q。T369L 與 A346Q 以及選自由 S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F 和V324T組成的組的至少另外一種或恰好另外一種的組合也是優(yōu)選的。本發(fā)明也涉及核酸分子，即多核苷酸分子，其各自編碼前述的通過氨基酸取代修飾的SmuA氨基酸序列。不言而喻，這包含了大量多核苷酸分子，由于簡并性遺傳密碼(degenerativen genetischen Code),其可以出現(xiàn)在多種實施方式中，但仍然編碼同樣的根據(jù)本發(fā)明的聚氨基酸分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉適于由給出的根據(jù)本發(fā)明的氨基酸序列找到編碼該氨基酸序列的多核苷酸分子的確定的組的生物信息方法。在第一個實施方式中,根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸分子作為分尚的聚核酸分子存在。在一個替代的實施例中，根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸分子以構(gòu)建體的形式或作為構(gòu)建體的組成部分存在，所述構(gòu)建體介導根據(jù)本發(fā)明的修飾的蔗糖變位酶在生物體系中，尤其在生物細胞中，優(yōu)選在細菌細胞中的表達。在一個第一個實施方式中，這樣的構(gòu)建體是包含一個或多個拷貝的根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸分子的表達盒。所述表達盒優(yōu)選另外包含用于調(diào)控所述多核苷酸分子表達的至少一個啟動子元件和任選的終止子序列。本發(fā)明的另一目的是包含至少一個或優(yōu)選多個表達盒的載體構(gòu)建體。

表達盒和載體構(gòu)建體的啟動子可以是用于在生物體系中表達本發(fā)明的多核苷酸分子的公知啟動子。優(yōu)選蔗糖變位酶野生型基因的天然啟動子?；蛘邇?yōu)選更好地介導根據(jù)本發(fā)明修飾的蔗糖變位酶表達的啟動子元件，其尤其可以實現(xiàn)數(shù)倍提高的活性，即尤其是表達的蔗糖變位酶的體積活性(Vol umenaktivitat)。除了上述用于根據(jù)本發(fā)明修飾的蔗糖變位酶的優(yōu)選染色體外表達的表達載體，本發(fā)明也涉及適合于用編碼根據(jù)本發(fā)明修飾的蔗糖變位酶的根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸分子取代包含在生物細胞的基因組內(nèi)的編碼蔗糖變位酶的野生型基因的構(gòu)建體。此外，這樣的交換質(zhì)粒起到將根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸分子整合在細胞的染色體基因組中的作用。介導基因取代的交換質(zhì)粒尤其被設(shè)置為使得其自身在其被引入的宿主細胞中不被復制。優(yōu)選的載體構(gòu)建體是基于R6K復制原點的pUT衍生物。該載體尤其不在紅色精朊桿菌(P. rubrum)菌種的宿主細胞內(nèi)復制，至少并非有條件地復制。根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸分子可以以染色體外表達構(gòu)建體的形式或者通過染色體基因取代而被引入至宿主細胞中，所述宿主細胞選自在其它情況下適于將蔗糖轉(zhuǎn)化為異麥芽酮糖的宿主細胞。本發(fā)明也涉及上述根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸分子、取代啟動子及其片段或完整的蔗糖變位酶表達盒用于制備根據(jù)本發(fā)明的細胞的應用。本發(fā)明也涉及上述載體用于制備這樣的細胞的應用，所述載體按照本發(fā)明的第一方面即為交換質(zhì)粒，按照本發(fā)明的第二方面即為表達載體。本發(fā)明也包括具有新型產(chǎn)物譜的生物細胞，即能夠由含蔗糖的底物合成具有至少85重量％或更多(基于異麥芽酮糖組分的干物質(zhì)重量計)，優(yōu)選86重量％或更多，87重量％或更多，88重量％或更多，89重量％或更多，90重量％或更多，91重量％或更多，92重量％或更多,93重量％或更多,94重量％或更多，特別優(yōu)選95重量％或更多的異麥芽酮糖組合物的細胞。選自伽瑪變形菌和未分類的伽瑪變形菌的組的微生物的宿主細胞是優(yōu)選的。選自由以下屬的微生物組成的組的細胞是優(yōu)選的埃希菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷菌屬(Serratia)、歐文菌屬(Erwinia)、腸桿菌屬(Enterobacter)、克雷伯菌屬(Klebsiella)、拉烏爾菌屬(Rauol tel la)、果膠桿菌屬(Pectobacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、固氮菌屬(Azotobacter)、泛菌屬(Pantoea)、銀合歡屬(Leucanea)以及精朊桿菌屬(Protaminobacter)。尤其優(yōu)選的是選自由以下組成的組的細胞克雷伯菌屬(Klebsiella sp.)，尤其是菌株LX3和菌株NK33-98-8 ;肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)，尤其是菌株342 ;腸桿菌屬(Enterobacter sp.)，尤其是菌株SZ62 ;腸桿菌屬(Enterobacter sp.),尤其是菌株 FMBl ;植生拉烏爾菌(Rauoltella planticola)；分散泛菌(Pantoea dispersa);大黃歐文菌(Erwinia rhapontici);塔斯馬尼亞歐文菌(Erwinia tasmaniensis),尤其是菌株 Etl/99 ;黑腐果膠桿菌(Pectobacteriumatrosepticum),尤其是菌株 SCRI1043 ;胡蘿卜果膠桿菌(Pectobacterium carovotum),尤其是巴西(brasiliensis)亞種，尤其是菌株P(guān)BR1692 ;紅色精朊桿菌(Protaminobacterrubrum);嗜中酸假單胞菌(Pseudomonas mesoacidophila);普利茅斯沙雷氏菌(Serratia plymuthica)以及維氏固氮菌(Azotobacter vinelandii)和白頭銀合歡(Leucanealeucocephalia)。在一個特別優(yōu)選的變種中，所述細胞是紅色精朊桿菌(P. rubrum)或由其衍生的生物技術(shù)可用的菌株。本發(fā)明也包括這些宿主細胞的固定的和/或以其它方式修飾的形式，使其尤其適用于生物技術(shù)方法。宿主細胞尤其是在細胞中可能存在的蔗糖變位酶-野生型基因的缺失突變體。一個優(yōu)選的變體是一種細胞，在其中存在于細胞中的染色體蔗糖變位酶野生型基因在染色體中被編碼根據(jù)本發(fā)明修飾的蔗糖變位酶的核苷酸序列取代。在第一個變體中， 該根據(jù)本發(fā)明修飾的基因由野生型蔗糖變位酶基因的啟動子控制。在進一步優(yōu)選的變體中，該根據(jù)本發(fā)明修飾的基因由優(yōu)選內(nèi)源性同源取代啟動子控制。這樣的啟動子尤其選自由以下組成的組3，4- 二羥基-2- 丁酮-4-磷酸鹽合成酶ribB的基因的啟動子、編碼舊膜蛋白的基因ompA的啟動子、編碼推定的轉(zhuǎn)錄激活子ECA2934的基因的啟動子、核糖核酸酶Erne的基因的啟動子、50S-核糖體L21-蛋白的操縱子的啟動子、冷休克蛋白CspE的操縱子的啟動子、50S-核糖體L28-蛋白的操縱子的啟動子和NAD依賴性差向異構(gòu)酶_脫氫酶的基因的啟動子及其功能性啟動子片段，其可以控制根據(jù)本發(fā)明修飾的蔗糖變位酶的表達。參考DE 10 2009 053566的全部公開內(nèi)容，尤其是表1A、1B和序列表的序列SEQ IDNo:2-21。本發(fā)明也涉及一種細胞，根據(jù)本發(fā)明修飾的蔗糖變位酶在其中被染色體外(游離)地表達，尤其在至少一種前述啟動子的調(diào)節(jié)下被表達。本發(fā)明也涉及用于制備這種細胞的工具。一種這樣的工具是多核苷酸分子，其包含至少一個或多個拷貝的編碼根據(jù)本發(fā)明修飾的蔗糖變位酶的可表達的片段，還包含至少一個或多個拷貝的調(diào)節(jié)所述蔗糖變位酶表達的其他元件，尤其是啟動子元件。在本發(fā)明這方面一個替代的變體中，根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸分子作為表達盒以分離的形式存在。因此，例如可以將其以已知的方式轉(zhuǎn)移至宿主細胞內(nèi)。本發(fā)明的另一目的是用于制備根據(jù)本發(fā)明的能夠?qū)⒄崽寝D(zhuǎn)化為異麥芽酮糖或含異麥芽酮糖的組合物的細胞的方法，其中所述方法至少包含下列步驟在第一步中，提供細胞的野生型菌株或已經(jīng)經(jīng)典地或重組地修飾的菌株；在第二步中，使該菌株與至少一種編碼根據(jù)本發(fā)明修飾的蔗糖變位酶的根據(jù)本發(fā)明的前述多核苷酸分子和/或至少一種前述載體接觸或結(jié)合，以此將根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸分子以可表達的形式引入細胞中。在本發(fā)明的上下文中，“異麥芽酮糖組合物(或含異麥芽酮糖的組合物)”被理解為由于蔗糖變位酶的作用而由底物蔗糖生成的異麥芽酮糖產(chǎn)物。其包含占絕大部分比例的異麥芽酮糖。其它的組分尤其是海藻糖、異松三糖和果糖以及葡萄糖。其中尤其主要被理解為以下組成80-99%異麥芽酮糖、1-10%海藻糖、0-0. 5%異松三糖、0-0. 2%三糖、0_5%單糖和0-0. 2%其它糖。
在異麥芽酮糖組合物中，特別優(yōu)選異麥芽酮糖的比例為至少85重量％或更多(基于異麥芽酮糖組合物的干物質(zhì)重量)，優(yōu)選86重量％或更多,87重量％或更多,88重量％或更多，89重量％或更多，90重量％或更多，91重量％或更多，92重量％或更多，93重量％或更多，94重量％或更多，特別優(yōu)選95重量％或更多。本發(fā)明也涉及由蔗糖底物或含蔗糖的底物生物技術(shù)制備異麥芽酮糖和/或含異麥芽酮糖的組合物的方法。在第一個方面，所述方法是由含蔗糖的底物生物技術(shù)制備異麥芽酮糖和/或異麥芽酮糖組合物的方法，其中，在第一步中，特別地，在使得底物能夠轉(zhuǎn)化成異麥芽酮糖或異 麥芽酮糖組合物的條件下，使含蔗糖的底物與根據(jù)本發(fā)明的蔗糖變位酶或與生物催化劑接觸。在另一方面，所述方法是由含蔗糖的底物生物技術(shù)制備異麥芽酮糖和/或異麥芽酮糖組合物的方法，其中，在第一步中包含下述步驟在使得底物能夠轉(zhuǎn)化成異麥芽酮糖或異麥芽酮糖組合物的條件下，在含所述底物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)前述細胞。優(yōu)選在一個優(yōu)選的后續(xù)步驟中，從培養(yǎng)基中把異麥芽酮糖或異麥芽酮糖組合物分離出來。在一個特別的基于細胞制備的實施方式中，以已知的方式將細胞固定在基質(zhì)上或基質(zhì)中，尤其是藻酸鹽基質(zhì)等。這是特別為蔗糖工業(yè)化轉(zhuǎn)化成異麥芽酮糖或異麥芽酮糖組合物而設(shè)計的。因此，本發(fā)明的目的還是根據(jù)本發(fā)明的前述細胞用于優(yōu)選地由蔗糖或含蔗糖的底物，并且優(yōu)選按照本文描述的方法，生物技術(shù)生產(chǎn)異麥芽酮糖或異麥芽酮糖組合物的應用。進一步提供根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸分子，其尤其以分離的形式或作為細胞碎片的組分用于開發(fā)無細胞體系和生物催化劑。在一個優(yōu)選的實施方式中，生物催化劑具有支持物(Tdger)，根據(jù)本發(fā)明修飾的蔗糖變位酶固定于其上。在另一個優(yōu)選的實施方式中，將根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸分子(尤其以分離的形式)未固定地作為蔗糖變位酶生物催化劑(尤其以溶解的形式)使用。因此，本發(fā)明也涉及生物催化劑，其基本上是不含細胞的，且其特點優(yōu)選為，在其上固定地存在有根據(jù)本發(fā)明修飾的蔗糖變位酶。一個優(yōu)選的第一變體是固定在支持物(優(yōu)選過濾膜)上的細胞碎片。或者，優(yōu)選存在分離的(優(yōu)選以已知方式合成制備的)根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸分子，其具有根據(jù)本發(fā)明修飾的蔗糖變位酶活性。在一個替代優(yōu)選的實施方式中，所述生物催化劑通過未固定的、分離的根據(jù)本發(fā)明的具有蔗糖變位酶活性的多核苷酸分子形成。通過下列附圖
和實施例進一步說明本發(fā)明，但不應理解為將其僅限于此圖I示例性地顯示了根據(jù)本發(fā)明制備的，smuA缺失質(zhì)粒pUT-GntR-P3Cl_DsmuA的載體圖，所述缺失質(zhì)粒包含取代序列SEQ ID NO: I (深灰色方框)。該區(qū)域在上游smuA-缺失區(qū)域1267bp顯示與紅色精朊桿菌(P. rubrum)染色體的同源性。該區(qū)域具有與GntR型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子基因和無痕插入的3C1-啟動子的同源性。smuA-缺失區(qū)域的下游存在655bp的同源DNA序列。在取代序列內(nèi)的smuA基因的真正缺失區(qū)域顯示為放大的黑體核苷酸序列。天然的smuA起始密碼子ATG和TAA終止密碼子以下劃線標出。對于限制酶Nsil和Pmel的界面識別序列同樣通過虛線標出。PUT衍生物基于R6K ori (“轉(zhuǎn)移起點”)且為了選擇而具有耐卡那霉素的基因aphll和用于編碼兒茶酚_2，3雙加氧酶的xylE基因。Ml圖示并示例性地說明了根據(jù)本發(fā)明的用于制備smuA缺失突變體紅色精朊桿菌(P. rubrum) 3ClDsmuA的方法通過同源重組取代天然smuA基因。基于在宿主細胞紅色精朊桿菌(P. rubrum)3CI內(nèi)優(yōu)選不復制的載體(例如pUT載體),優(yōu)選在大腸桿菌(E. coli)中構(gòu)建smuA-取代質(zhì)粒。為此，將smuA基因的上游和下游的兩個DNA片段準確擴增并融合(參見圖I)。連接以后形成Xmal/PstI-片段(參見SEQ ID No: 2)，其在缺失的smuA基因的上游為長1267bp的DNA片段(其編碼推定的gntR-調(diào)節(jié)子并帶有3C1-啟動子)，和下游為長655bp的DNA片段。這樣生成的質(zhì)粒被轉(zhuǎn)移到宿主細胞中，這里紅色精朊桿菌(P. rubrum)3C1。通過優(yōu)選對卡那霉素的選擇，由此選擇出這樣的菌群其在染色體中具有交換質(zhì)粒，該質(zhì)粒優(yōu)選經(jīng)兩個同源區(qū)域的至少一個整合到染色體中。在不含卡那霉素的培養(yǎng)基中的孵育，允許選擇缺失的菌株，其中整合的質(zhì)粒經(jīng)第二次交換(第二次重組)再從染色體去整合。這樣的菌落優(yōu)選是由于xylE-活性的缺乏而以已知的方法在加入兒茶酚后，通過表型檢測的(不泛黃)。隨后,可以通過分子生物學的方法(例如PCR)以已知的方法來檢驗缺失菌株的成功制備，以能夠額外排除導致重建野生型的取代質(zhì)粒完全去整合。

S3圖示并示例性地說明了根據(jù)本發(fā)明的用于在smuA缺失突變體紅色精朊桿菌(P. rubrum) 3ClDsmuA中表達smuA序列變體的方法基于在宿主細胞紅色精朊桿菌(P. rubrum) 3ClDsmuA中優(yōu)選非復制的載體(例如pUT載體),優(yōu)選在大腸桿菌(E. coli)中構(gòu)建整合的smuA*-表達質(zhì)粒。為此，將編碼前述根據(jù)本發(fā)明通過氨基酸取代而修飾的SmuA的氨基酸序列的smuA*-基因與編碼推定的gntR-調(diào)節(jié)子并帶有用于表達必需的3C1-啟動子的1267bp的DNA片段融合。然后，將融合產(chǎn)物插入到優(yōu)選非復制的載體(例如pUT載體)中。將生成的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到宿主細胞中，這里為紅色精朊桿菌(P. rubrum) 3ClDsmuA。通過對優(yōu)選卡那霉素的選擇，由此選擇出這樣的菌群其smuA*-表達質(zhì)粒經(jīng)由同源重組而整合到染色體中。隨后,可以通過成熟的分子生物學的方法(例如PCR)來檢驗整合菌株的成功制備。整合的smuA*-變體基因的表達通過強3C1啟動子進行。序列表包含SEQ ID NO: I 根據(jù) Ravaud 等人 2009 (FEBS Letters 583，1964-1968)，來自紅色精朊桿菌(P. rubrum)的野生型蔗糖變位酶SmuA的氨基酸序列=TQQPLLNEKSIEQSKTIPKffffKEAVFYQVYPRSFKDTNGDGI⑶INGIIEKLDYLKALGIDAIWINPHYDSPNTDNGYDIRDYRKMKEYGTMEDFDRLISEMKKRNMRLMIDVVINHTSDQNEWFVKSKSSKDNPYRGYYFWKDAKEGQAPNNYPSFFGGSAffQKDEKTNQYYLHYFAKQQPDLNWDNPKVRQDLYAMLRFWLDKGVSGLRFDTVATYSKIPDFPNLTQQQLKNFAAEYTKGPNIHRYVNEMNKEVLSHYDIATAGEIFGVPLDQSIKFFDRRRDELNIAFTFDLIRLDRDSDQRWRRKDWKLSQFRQIIDNVDRTAGEYGWNAFFLDNHDNPRAVSHFGDDRPQWREPSAKALATLTLTQRATPFIYQGSELGMTNYPFKAIDEFDDIEVKGFWHDYVETGKVKADEFLQNVRLTSRDNSRTPFQWDGSKNAGFTSGKPWFKVNPNYQEINAVSQVTQPDSVFNYYRQLIKIRHDIPALTYGTYTDLDPANDSVYAYTRSLGAEKYLVVVNFKEQMMRYKLPDNLSIEKVIIDSNSKNVVKKNDSLLELKPWQSGVYKLNQSEQ ID N0:21942bp的Xmal/PstI-片段的DNA序列，所述片段在克隆后產(chǎn)生非復制載體，例如smuA-缺失質(zhì)粒pUT-GntR-P3Cl-DSmuA(圖I),并且可通過同源重組刪除用于smuA基因。所述DNA序列由兩個DNA片段的融合產(chǎn)生,其位于紅色精朊桿菌(P. rubrum)3Cl中待除去的smuA基因的上游和下游。CCCGGGATCGCATTCATGTTTTCTCCTTCGGTGAAGTGGTCTACTTTTATGGCGATTTGTATACATTAAAGTGATCAAGGAAAAAATAGCCAGAGGAATAGCCAAATAAATTTCAGGTTTTACAGTGCGGTAACCTCTTTTTGTTGCGCGGTTATCAGGATTCATTTAGGGATAAAGAGGTCTTCAAGTGATCTACAAAACGCTTGCTGAACGTCTGAGAATACGTATCAATTCTGCTGATTTTGCTATCGGCGATGCTTTACCCAGTGAGAAACGTCTGGCTGCCGAATTTTCTGTATC
GAGGATGACACTCCGCAAAGCGGTAAATTTACTGATTGAATGGGGGCTGGTACGTCGCTGTCACGGCAGCGGAACCT
TCGTCGCGCAGAAAGATCTCCAACATGAAACTCGTGGGCTGATGGGGTTTTCAGAACTGATGAAAGAACTGGGCCGC
CCCACGGTGAGCGAGGTGCTGGAGTTTCGAATGATGGGAGCCCCCCCAGCCATCGCCAGCCAGCTGCGAATCAAGGC
CGATGAACGCATTTACTATTCGCGTCGCGTAAGGTTTGTGGAAGGGAAGCCTGTGGTGCTGGAAGATAGTTACATGC
CTGGCAGGTTATTTGGCAACCTTTCAGTCGCACATCTGGAGGGTTCAAAGTTTTCGTATATAGAAGACGAATGCCAT
ATCAATATCGCAGGGAATTACGAAAGCTTCAGCCCGATCTTGGCAGACAGCACGATCGGCGCGCTACTGCACGTTGC
CGAAGGCACGCCGCTGCTGCGCCTGACATCGCTTTCTTACAGTGATACCGGCGACTATATCAACTATTCGGTGATAT
TCAGAAATGCCAATGAATACCACGTGGACTACCATTTGAAGAGGAATAAATAGCGGGCGAAGGGGAGCTACATTCCT
ACTATATAGCAATTCTGTTGCCTAGTGTAATGCGAGTTGCCCGCCGGATAAACCAATAACCGCATTCTCCGCAGGGG
GCCGAATTGTGCTTTTGCCAATTGCCCTGATTAATCATTAGCGTTATAGTCAGAATGCTTATTCTCAGGGCGGGGTG
CAAGTCCCCACCGGCGGTAAATCACCTTCTACGGTGAAAGCCCGCGAGCGCTCAGCCAGTCTCTTGTAGTTTGGTTA
GAGGTCAGCAGATCCGGTGTAATTCCGGGGCCGACGGTTATAGTCCGGATGGGAGAGAGTAACGGTATCTGCCGGGC
TTGCGCCCGCTTGCGTTATTTTTTTAGAAACAGGAGAGTATTGTAATGCATTTTGTTTAAACTAAATCAATAAATCT
CATAGTCACGCCAAATAATGTAAATATATTGAAACTATTAAAACCGGCATTTTATGCCGGTTTTTTTAGCGCAAAAT
AGGGCTGGCAAAGATAAAGCAGGAGGCTACCACCGTGAGCTATATGCTTTTTTAAAAGGCAAGATTCTCCATCGAGG
CTCTGCCGTCACCCGAACGCGATAAACCGCGTTTATCCTCAGATGCCTGGCCGTTGCGCGCAAACGAAGACCGGGGT
TTGAGGGCTTGTGGGGCAACGCCGGCGAGCCAGTCAGCTTCTCGTGGGTGCGAGCACATTGCTAATGAACAATCTCG
CTTCAAATGTTATCGTGAGAATGAAGTGTTGCAGTGGCGCCGCCGGGGTTTGCGCTCGATTCAGGTCTGATTCACAT
AACAAGGTCACATGGAAATGAAAGTGTTATTCATCGCTTCGCTAGGCGCTTTATCGTTAATGCAAGCATCATTCTCC
TTCGCGGATAATGCCAATGGGAAAAACATCTATTCACAGAGATGTACTATGTGCCACGGAACCGATCTCAAAGGCAC
GGGGCCATTGGCTGATAAAACCAACCCGCCGACACCTGATCTGACAACCCCCGCTTTCAAAGCACGCCTCAATGATT
ATCCGGGCGTTATTGTATCCTGCAGSEQID No :3用于編碼SmuA-氨基酸取代變體D302Y的全長基因的核苷酸序列。被取代的核苷酸以黑體顯示。ATGCCCCGTCAAGGATTGAAAACTGCACTAGCGATTTTTCTAACCACATCATTATGCATCTCATGCCAGCAAGCCTTCGGTACGCAACAACCCTTGCTTAACGAAAAGAGTATCGAACAGTCGAAAACCATACCTAAATGGTGGAAGGAGGCTGTTTTTTATCAGGTGTATCCGCGCTCCTTTAAAGACACCAACGGAGATGGCATCGGGGATATTAACGGCATCATAGAAAAATTAGACTATCTAAAAGCCTTGGGGATTGATGCCATTTGGATCAACCCACATTATGATTCTCCGAACACGGATAATGGTTACGATATACGTGATTATCGAAAAATCATGAAAGAATATGGCACGATGGAGGATTTTGACCGCCTGATTTCTGAAATGAAAAAACGGAATATGCGGTTGATGATTGATGTGGTCATCAACCACACCAGCGATCAAAACGAATGGTTTGTTAAAAGTAAAAGCAGTAAGGATAATCCTTATCGCGGCTATTATTTCTGGAAAGATGCTAAAGAAGGGCAGGCGCCTAATAATTACCCTTCATTCTTTGGTGGCTCGGCGTGGCAAAAAGATGAAAAGACCAATCAATACTACCTGCACTATTTTGCTAAACAACAGCCTGACCTAAACTGGGATAATCCCAAAGTCCGTCAAGATCTTTATGCAATGTTACGTTTCTGGTTAGATAAAGGCGTGTCTGGTTTACGTTTTGATACGGTAGCGACCTACTCAAAAATTCCGGATTTCCCAAATCTCACCCAACAACAGCTGAAGAATTTTGCAGCGGAGTATACCAAGGGCCCTAATATTCATCGTTACGTCAATGAAATGAATAAAGAGGTCTTGTCTCATTACGACATTGCGACTGCCGGTGAAATCTTTGGCGTACCCTTGGATCAATCGATAAAGTTCTTCGATCGCCGCCGTGATGAGCTGAACATTGCATTTACCTTTGACTTAATCAGACTCGATCGA T A T TCTGATCAAAGATGGCGTCGAAAAGATTGGAAATTGTCGCAATTCCGGCAGATCATCGATAACGTTGACCGTACTGCAGGAGAATATGGTTGGAATGCCTTCTTCTTGGATAACCACGACAATCCGCGCGCTGTCTCGCACTTTGGCGATGATCGCCC
ACAATGGCGTGAGCCATCGGCTAAAGCGCTTGCAACCTTGACGCTGACTCAACGAGCAACACCTTTTATTTATCAAG
GTTCAGAATTGGGCATGACCAATTACCCGTTTAAAGCTATTGATGAATTCGATGATATTGAGGTGAAAGGTTTTTGG
CATGACTACGTTGAGACAGGAAAGGTCAAAGCCGACGAGTTCTTGCAAAATGTACGCCTGACGAGCAGGGATAACAG
CCGGACGCCGTTCCAATGGGATGGGAGCAAAAATGCAGGATTCACGAGCGGAAAACCTTGGTTCAAGGTCAACCCAA
ACTACCAGGAAATCAATGCAGTAAGTCAAGTCACACAACCCGACTCAGTATTTAACTATTATCGTCAGTTGATCAAG
ATAAGGCATGACATCCCGGCACTGACCTATGGTACATACACCGATTTGGATCCTGCAAATGATTCGGTCTACGCCTA
TACACGCAGCCTTGGGGCGGAAAAATATCTTGTTGTTGTTAACTTCAAGGAGCAAATGATGAGATATAAATTACCGG
ATAATTTATCCATTGAGAAAGTGATTATAGACAGCAACAGCAAAAACGTGGTGAAAAAGAATGATTCATTACTCGAG
CTAAAACCATGGCAGTCAGGGGTTTATAAACTAAATCAATAASEQ ID No :4用于編碼SmuA-雙突變體D302Y/S303P的全長基因的核苷酸序列。被取代的核苷酸以黑體顯示。ATGCCCCGTCAAGGATTGAAAACTGCACTAGCGATTTTTCTAACCACATCATTATGCATCTCATGCCAGCAAGCCTTCGGTACGCAACAACCCTTGCTTAACGAAAAGAGTATCGAACAGTCGAAAACCATACCTAAATGGTGGAAGGAGGCTGTTTTTTATCAGGTGTATCCGCGCTCCTTTAAAGACACCAACGGAGATGGCATCGGGGATATTAACGGCATCATAGAAAAATTAGACTATCTAAAAGCCTTGGGGATTGATGCCATTTGGATCAACCCACATTATGATTCTCCGAACACGGATAATGGTTACGATATACGTGATTATCGAAAAATCATGAAAGAATATGGCACGATGGAGGATTTTGACCGCCTGATTTCTGAAATGAAAAAACGGAATATGCGGTTGATGATTGATGTGGTCATCAACCACACCAGCGATCAAAACGAATGGTTTGTTAAAAGTAAAAGCAGTAAGGATAATCCTTATCGCGGCTATTATTTCTGGAAAGATGCTAAAGAAGGGCAGGCGCCTAATAATTACCCTTCATTCTTTGGTGGCTCGGCGTGGCAAAAAGATGAAAAGACCAATCAATACTACCTGCACTATTTTGCTAAACAACAGCCTGACCTAAACTGGGATAATCCCAAAGTCCGTCAAGATCTTTATGCAATGTTACGTTTCTGGTTAGATAAAGGCGTGTCTGGTTTACGTTTTGATACGGTAGCGACCTACTCAAAAATTCCGGATTTCCCAAATCTCACCCAACAACAGCTGAAGAATTTTGCAGCGGAGTATACCAAGGGCCCTAATATTCATCGTTACGTCAATGAAATGAATAAAGAGGTCTTGTCTCATTACGACATTGCGACTGCCGGTGAAATCTTTGGCGTACCCTTGGATCAATCGATAAAGTTCTTCGATCGCCGCCGTGATGAGCTGMCATTGCATTTACCTTTGACTTAATCAGACTCGATCGAJa.TCcTGATCAAAGATGGCGTCGAAAAGATTGGAAATTGTCGCAATTCCGGCAGATCATCGATAACGTTGACCGTACTGCAGGAGAATATGGTTGGAATGCCTTCTTCTTGGATAACCACGACAATCCGCGCGCTGTCTCGCACTTTGGCGATGATCGCCCACAATGGCGTGAGCCATCGGCTAAAGCGCTTGCAACCTTGACGCTGACTCAACGAGCAACACCTTTTATTTATCAAGGTTCAGAATTGGGCATGACCAATTACCCGTTTAAAGCTATTGATGAATTCGATGATATTGAGGTGAAAGGTTTTTGGCATGACTACGTTGAGACAGGAAAGGTCAAAGCCGACGAGTTCTTGCAAAATGTACGCCTGACGAGCAGGGATAACAGCCGGACGCCGTTCCAATGGGATGGGAGCAAAAATGCAGGATTCACGAGCGGAAAACCTTGGTTCAAGGTCAACCCAAACTACCAGGAAATCAATGCAGTAAGTCAAGTCACACAACCCGACTCAGTATTTAACTATTATCGTCAGTTGATCAAGATAAGGCATGACATCCCGGCACTGACCTATGGTACATACACCGATTTGGATCCTGCAAATGATTCGGTCTACGCCTATACACGCAGCCTTGGGGCGGAAAAATATCTTGTTGTTGTTAACTTCAAGGAGCAAATGATGAGATATAAATTACCGGATAATTTATCCATTGAGAAAGTGATTATAGACAGCAACAGCAAAAACGTGGTGAAAAAGAATGATTCATTACTCGAGCTAAAACCATGGCAGTCAGGGGTTTATAAACTAAATCAATAA實施例I :在紅色精朊桿菌(P. rubrum)3Cl/Z12A中smuA里予生型基因被smuA序歹丨J變體基因取代根據(jù)本發(fā)明的鹿糖變位酶變體(SmuA*)的表征在紅色精朊桿菌(P. rubrum)菌株3C1中進行。在該菌株中，通過將天然smuA-啟動子無痕取代成3，4- 二羥基-2- 丁酮-4-磷酸酯-合成酶基因ribB的同源啟動子，SmuA的表達被顯著提高(ribB-啟動子序列在菌株3C1中，參見SEQ ID No: 2核苷酸位置1013-1270)。為確定根據(jù)本發(fā)明的SmuA*-序列變體的鹿糖變位酶產(chǎn)品特異性，首先將存在于紅色精朊桿菌(P. rubrum)菌株3C1中的smuA野生型基因通過同源重組除去。然后，通過同源重組將編碼SmuA*-變體的基因整合在smuA缺失突變體中。此操作方法允許序列修飾的基因在同源體系中的表達和根據(jù)本發(fā)明的序列變體的產(chǎn)品特異性的詳細確定而不受SmuA-野生型活性的影響。I. I紅色精朊桿菌(P. rubrum) 3C1/Z12A中smuA-野生型基因的缺失所有克隆和DNA 修飾均按照 Sambrook 等人 1989 (Molecular cloning: Alaboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)描述的進行。除非另外指明，PCR方法、用于核酸分離的試劑盒、檢測方法和選擇方法以及 培養(yǎng)，均以已知的方式按照各生產(chǎn)商的說明進行。紅色精朊桿菌(P. rubrum) 3C1/Z12A中smuA-野生型基因的缺失通過同源重組進行。為此，將smuA-基因的上游和下游的兩個DNA片段精準擴增并通過例如無連接酶的克隆融合在一起(Geu-Flores, F.等人 2007，Nucleic Acids Research 35 (7) : e55)(參見圖I)。或者存在這樣的可能性通過DNA合成來制備希望的DNA片段。在連接或合成后，生成Xmal/PstI-片段(參見SEQ ID No:2)，其為與缺失的smuA-基因上游的紅色精朊桿菌(P. rubrum)3Cl染色體同源的1267bp序列的區(qū)域。一方面,該區(qū)域編碼與GntR型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子高度同源的“開放閱讀框”(0RF)，且另一方面具有3，4- 二羥基-2- 丁酮-4-磷酸酯-合成酶基因ribB的紅色精朊桿菌(P. rubrum)同源啟動子3C1。在缺失的smuA-基因的下游，與紅色精朊桿菌(P. rubrum)染色體同源的區(qū)域為655bp。為了進行真正的smuA-缺失，將1942bp的Xmal/PstI-片段克隆進入不在紅色精朊桿菌(P. rubrum)中復制的合適的基因取代載體中。適于在紅色精朊桿菌(P. rubrum)中進行基因取代的基礎(chǔ)載體(Basisvektor)是所謂的pUT-衍生物，其基于R6K復制起點(Herrero等人,1990, J. Bacteriol. , 172:6557-67)。僅當存在對于復制必不可少的編碼蛋白的Pir-基因時，這些載體才復制。一種這樣的菌株是大腸桿菌(E. coli)S17-1 A pir (Herrero et al. , 1990, J. Bacteriol. , 172:6557-67)，它被用于構(gòu)建各種啟動子取代質(zhì)粒。在同源重組后介導smuA的精準缺失的一個示例性最終的缺失構(gòu)建體(pUT-GntR-P3CI-DSmuA)顯示于圖 I 中。所得的smuA-缺失質(zhì)粒向紅色精朊桿菌(P. rubrum) 3C1的轉(zhuǎn)移優(yōu)選通過大腸桿菌(E. colil) S17-1 A pir和紅色精朊桿菌(P. rubrum)之間的基因間接合來實現(xiàn)。所用的PUT-質(zhì)粒具有RP4質(zhì)粒的“轉(zhuǎn)移起點”(oriT)，并且可以通過染色體整合在大腸桿菌(E. colil) S17-1入pir中的RP4質(zhì)粒而移動至紅色精朊桿菌(P. rubrum) (Herrero etal. , 1990, J. Bacteriol. , 172:6557-67)。如下述優(yōu)化基因間接合的條件潛在的紅色精朊桿菌(P. rubrum) 3C1轉(zhuǎn)接合子的選擇需要一個在紅色精朊桿菌(P. Rubrum)中可選擇的質(zhì)粒標記物(例如aphll,卡那霉素抗性)，和可以選擇性地抑制大腸桿菌(E. colil)供體。通過在含利福霉素的培養(yǎng)基(100 u g/ml)上鋪板(Ausplattieren),自發(fā)產(chǎn)生抗利福霉素的紅色精朊桿菌(P. rubrum)3C1菌群(紅色精朊桿菌(P. rubrum) 3ClRif)，除此以外，其與野生型沒有區(qū)別。所述接合如下進行將具有smuA-取代質(zhì)粒的大腸桿菌(E. colil) S17-pir供體菌株在5mldYT培養(yǎng)基(每升16g細菌用胰蛋白胨、IOg細菌用酵母萃取物和5g NaCl)中，在加入卡那霉素(50 ii g/ml)的條件下在37°C過夜培養(yǎng)。類似地，將受體紅色精朊桿菌(P. rubrum)3CI在加入利福霉素(IOOii g/ml)的5ml dYT中，在30°C過夜培養(yǎng)。將各Iml過夜培養(yǎng)物接種到含100ml dYT培養(yǎng)基(添加物見上)的錐形瓶中，并在30°C (紅色精朊桿菌(P. rubrum)3C1)或370C (大腸桿菌(E. colil))和250轉(zhuǎn)/分鐘孵育，直至0. 4至0. 8的OD (600nm)。將供體和受體以1:4的比例混合，離心，用Iml dYT洗滌并最后容納在100 ill dYT-培養(yǎng)基中。將該懸浮液移液至位于dYT板上的硝基纖維素過濾器(孔徑0. 45 y m)上，并在30°C孵育過夜。隨后，將細胞用Iml dYT由過濾器洗下，稀釋，平鋪到選擇板(dYT+卡那霉素50 y g/ml和利 福霉素IOOy g/ml)上并在30°C孵育過夜。通過卡那霉素的選擇，得到這樣的紅色精朊桿菌(P. rubrum) 3C1轉(zhuǎn)接合子，質(zhì)粒在其中優(yōu)選經(jīng)兩個同源區(qū)域之一被整合在染色體中(圖I)。在無卡那霉素的培養(yǎng)基上的孵育允許選擇這樣的smuA缺失菌株，其中整合的質(zhì)粒經(jīng)第二次交換而被從染色體去整合。為證明去整合成功，可以使用存在于取代質(zhì)粒上的彩色標記物基因xylE。xylE基因編碼兒茶酚_2，3雙加氧酶，其將兒茶酚轉(zhuǎn)化為2-羥基己二烯二酸半醛，其可通過顯著的黃色而顯性識別。之前整合的取代質(zhì)粒的去整合是少見的事情(1000個菌落里有一個)并且可以借助于此標記物通過加入兒茶酚(噴霧劑0. 2ml 0. 5mol/l的水溶液)之后在希望的克隆中黃色消失來檢測。因為交換質(zhì)粒的去整合也可以導致野生型的重構(gòu)，所有生成的smuA-缺失菌株均可以通過PCR實驗、Southern印跡分析和基因組測序來核實并驗證。smuA-缺失菌株被稱作紅色精朊桿菌(P. rubrum) 3ClDSmuA (圖2)。I. 2序列變體的制備及其在紅色精朊桿菌(P. rubrum) 3ClDSmuA中的整合編碼前述根據(jù)本發(fā)明的通過氨基酸取代而修飾的SmuA的氨基酸序列的多核苷酸分子可以通過各種本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法(例如基因合成、無連接酶克隆或重疊延伸PCR)生成。示例性地描述了兩個序列變體D302Y和雙突變體D302Y/S303P的制備和測試(參比序列是SEQ-ID No: I)。SEQ-ID-No. 3描述了編碼SmuA氨基酸取代變體D302Y的全長基因的核苷酸序列，和SEQ-ID-No. 4描述了編碼SmuA雙突變體D302Y/S303P的全長基因的核苷酸序列。編碼根據(jù)本發(fā)明的SmuA的氨基酸取代物(SmuA*)的修飾的smuA基因序列變體(smuA*)可以轉(zhuǎn)移到實施例I. I所述的SmuA缺失菌株中用于表達。為此，將相應的smuA*-變體基因通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法例如無連接酶克隆(見上)精準克隆在非復制的PUT衍生物中。如圖3所示，這樣的質(zhì)粒如pUT-GntR-P3Cl-SmuA*，除了 smuA-變體基因smuA*之外還在smuA*上游具有一個1267bp的區(qū)域,其與smuA缺失菌株紅色精朊桿菌(P. rubrum)3ClDsmuA的染色體同源。經(jīng)由此區(qū)域，可以將質(zhì)粒通過同源重組整合入紅色精朊桿菌(P. rubrum) 3ClDSmuA的染色體中(圖3)。該轉(zhuǎn)移可通過基因間接合(見實施例
I.I)進行。通過卡那霉素選擇得到這樣的轉(zhuǎn)移結(jié)合子，質(zhì)粒在其中經(jīng)由smuA*上游的同源區(qū)域整合進染色體中。通過PCR實驗證明正確的整合。驗證過的轉(zhuǎn)移結(jié)合子帶有smuA*-變體基因，其通過強3C1啟動子組成型地表達。隨后，分析在這些菌株中產(chǎn)生的根據(jù)本發(fā)明通過氨基酸取代而修飾的SmuA-序列變體在全細胞生物轉(zhuǎn)化中的產(chǎn)品譜。實施例2 :根據(jù)本發(fā)明的SmuA-奪體菌株在紅色精朊桿菌(P. rubrum)3Cl/Z12A中的產(chǎn)品譜2. I借助于HPLC分析碳水化合物組成通過具有下列部件的HPLC進行分離的碳水化合物的確定HPLC泵；進樣器；RI(折射率)檢測器；預柱10mmX4. 6mm,氨基相(例如Zorbax_NH2);分離柱250mmX4. 6mm,氨基相(例如Zorbax-NH2);用于測量數(shù)據(jù)采集和分析的界面、電腦和軟件。在以下色譜條件下進行測量注射體積10 ill ;流速1. 0至I. 8ml/min。用于最佳分離所設(shè)置的流速取決于分離柱的類型和狀態(tài)以及洗脫液的組成。其它的分析參數(shù)見表丄° 表I :
儀器 HP11 PO HPLC-系統(tǒng)__
色譜柱 Zorbax-NH2 250 X 4.6 mm，5 nm, 在室溫_具有預柱10X4.6 mm__
檢測器 折射率檢測器_在30 0C下加熱
洗脫液 乙腈 73%(v/v)_流速:1.400 mi/min
注射體積10 __
分析時間:30 mill
樣品濃度 10 %的樣品溶液2. 2在振動瓶中的全細胞生物轉(zhuǎn)化根據(jù)本發(fā)明的菌種和野生型對照菌種的培養(yǎng)在30ml LB-培養(yǎng)基(起始0D_為0.05)中進行。培養(yǎng)物分別在30° C、200rmp下在水平振動器中孵育。在首先發(fā)酵24小時后，取出5X0D細胞，離心并且用Iml醋酸鈣緩沖液(O.Olmol/1，pH 5.5)洗滌。將細胞沉淀物(相當于5 X OD細胞)分別重懸?guī)в杏?. 584mol/l (200g/l)的蔗糖溶液的I. 25ml醋酸鈣緩沖液(0. 01mol/l,pH 5. 5)中。將該制劑在深孔板中在輕柔振動下在室溫孵育90分鐘，以進行生物轉(zhuǎn)化。反應通過加熱處理(5分鐘，98°C)來終止。轟I顯示了蔗糖培養(yǎng)下發(fā)酵后上清液的HPLC分析結(jié)果。表2
權(quán)利要求
1.具有以下氨基酸序列的蔗糖變位酶，所述氨基酸序列選自由相對于SEQID NO: I所示的序列，具有一個或多個氨基酸取代的氨基酸序列組成的組，所述氨基酸取代選自S303P、D302Y、K180P、M199I、Q276A、A198D、Y219F、V324T、T369L 和 A346Q。
2.根據(jù)前述權(quán)利要求的蔗糖變位酶，其具有以下氨基酸序列，所述氨基酸序列相對于SEQ ID NO: I所示的序列具有氨基酸取代S303P。
3.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的蔗糖變位酶，其具有以下氨基酸序列，所述氨基酸序列相對于SEQ ID NO: I所示的序列至少具有氨基酸取代D302Y。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的蔗糖變位酶，其具有以下氨基酸序列，所述氨基酸序列相對于SEQ ID NO: I所示的序列至少具有氨基酸取代S303P和D302Y。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的蔗糖變位酶，其具有以下氨基酸序列，所述氨基酸序列相對于SEQ ID NO: I所示的序列至少具有氨基酸取代K180P。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的蔗糖變位酶，其具有以下氨基酸序列，所述氨基酸序列相對于SEQ ID NO: I所示的序列至少具有氨基酸取代M199I。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的蔗糖變位酶，其具有以下氨基酸序列，所述氨基酸序列相對于SEQ ID NO: I所示的序列至少具有氨基酸取代Q276A。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的蔗糖變位酶，其具有以下氨基酸序列，所述氨基酸序列相對于SEQ ID NO: I所示的序列至少具有氨基酸取代A198D。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的蔗糖變位酶，其具有以下氨基酸序列，所述氨基酸序列相對于SEQ ID NO: I所示的序列至少具有氨基酸取代Y219F。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的蔗糖變位酶，其具有以下氨基酸序列，所述氨基酸序列相對于SEQ ID NO: I所示的序列至少具有氨基酸取代V324T。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的蔗糖變位酶，其具有以下氨基酸序列，所述氨基酸序列相對于SEQ ID NO: I所示的序列至少具有氨基酸取代T369L。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的蔗糖變位酶，其具有以下氨基酸序列，所述氨基酸序列相對于SEQ ID NO: I所示的序列至少具有氨基酸取代A346Q。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的蔗糖變位酶，其中所述酶作為分離的聚氨基酸分子存在。
14.生物催化劑，其包含固定在支持物上的如前述權(quán)利要求之一的蔗糖變位酶。
15.多核苷酸分子，其編碼前述權(quán)利要求之一的蔗糖變位酶。
16.載體,其包含一個或多個權(quán)利要求15的多核苷酸分子。
17.細胞，其包含權(quán)利要求16的多核苷酸分子。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的細胞，其在所述細胞的染色體中包含權(quán)利要求15的多核苷酸分子。
19.根據(jù)權(quán)利要求17的細胞，其在染色體外(游離地)包含權(quán)利要求15的多核苷酸分子。
20.根據(jù)權(quán)利要求17-19之一的細胞，其選自由下列屬的微生物組成的組埃希菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷菌屬(Serratia)、歐文菌屬(Erwinia)、腸桿菌屬(Enterobacter )、克雷伯菌屬(Klebsiella)、拉烏爾菌屬(Rauol tel la)、果膠桿菌屬(Pectobacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、固氮菌屬(Azotobacter)、泛菌屬(Pantoea)、銀合歡屬(Leucanea)以及精I元桿菌屬(Protaminobacter)。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的細胞,其選自紅色精朊桿菌(Protaminobacterrubrum)的生物。
22.用于制備權(quán)利要求17-21之一所述的細胞的方法，其包括下列步驟 -提供細胞，和 -使所述菌種與權(quán)利要求15的多核苷酸分子和/或權(quán)利要求16的載體接觸。
23.由含蔗糖的底物生物技術(shù)制備異麥芽酮糖或異麥芽酮糖組合物的方法，其包括下列步驟在有利于所述底物轉(zhuǎn)化成異麥芽酮糖或異麥芽酮糖組合物的條件下，使所述含蔗糖的底物與權(quán)利要求1-13之一的蔗糖變位酶或權(quán)利要求14的生物催化劑接觸。
24.由含蔗糖的底物生物技術(shù)制備異麥芽酮糖或異麥芽酮糖組合物的方法，其包括下列步驟在有利于所述底物轉(zhuǎn)化成異麥芽酮糖或異麥芽酮糖組合物的條件下，在含所述底物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求17-21之一的細胞或可按照權(quán)利要求22的方法制備的細胞。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述細胞固定在基質(zhì)中以用于轉(zhuǎn)化。
26.根據(jù)權(quán)利要求24或25的方法，其進ー步包含下列步驟從培養(yǎng)基和/或細胞中分離所述異麥芽酮糖或異麥芽酮糖組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供用于從蔗糖生物技術(shù)制備異麥芽酮糖和含異麥芽酮糖的組合物的改進的工具，所述工具尤其是具有改進的產(chǎn)品特異性的蔗糖變位酶以及包含所述改進的蔗糖變位酶的微生物細胞。
文檔編號C12P7/58GK102695793SQ201080058570
公開日2012年9月26日 申請日期2010年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月23日
發(fā)明者于爾格·艾克斯, 卡斯滕·哈姆斯, 斯蒂芬·佩爾澤, 沃爾夫?qū)ぐ＠? 沃爾夫?qū)ね吆? 米夏埃爾·克林貝格 申請人:甜糖(曼海姆/奧克森富特)股份公司