專利名稱：用于同步糖化和發(fā)酵以生產(chǎn)乙醇的方法
用于同步糖化和發(fā)酵以生產(chǎn)乙醇的方法本申請(qǐng)要求于2009年12月23日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)61/289749的優(yōu)先權(quán)。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于由纖維素生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇的方法。具體地講，在用于生產(chǎn)高濃度乙醇的特定同步糖化和發(fā)酵方法條件下來使用發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)。
背景技術(shù)：
由可再生資源生產(chǎn)燃料乙醇是針對(duì)全球的化石燃料短缺、能源成本增加、以及與大氣二氧化碳含量提高相關(guān)的全球變暖效應(yīng)的一種長(zhǎng)期解決方案。來自可再生資源的燃料乙醇通過糖發(fā)酵來生產(chǎn)。目前在美國(guó)來源于玉米粒的葡萄糖是用于乙醇生產(chǎn)的最豐富的糖來源。由于對(duì)作為飼料和食品供應(yīng)的玉米粒的需求，正在研發(fā)將多種類型的纖維素生物質(zhì)(包括半纖維素)轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖的方法。來源于這種生物質(zhì)來源的糖是己糖和戊糖的混 合物，主要是葡萄糖和木糖。作為開發(fā)纖維素生物質(zhì)加工方法的結(jié)果，可釋放高濃度的這些糖并將其用于高濃度發(fā)酵以產(chǎn)生乙醇，同時(shí)減少水消耗并具有較高的生產(chǎn)能力。同樣地，將生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成乙醇通過向化石燃料提供潛在地經(jīng)濟(jì)上可行的替代方案，提出了對(duì)于改善環(huán)境影響的極大可能性。將纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成乙醇的典型方法包括三個(gè)步驟；化學(xué)和/或物理處理生物質(zhì)以降低生物質(zhì)的木質(zhì)素含量并制備酶水解可利用的多糖；糖化或消化或水解，其中將多糖酶促轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖；以及發(fā)酵，其中通過用于產(chǎn)生乙醇的產(chǎn)乙醇生物(ethanologen)消耗可發(fā)酵糖。在一些情況下，取決于條件和產(chǎn)乙醇生物的性質(zhì)，組合糖化和發(fā)酵步驟可能是能量上最高效的。需要優(yōu)化這些步驟中的每一步以生產(chǎn)高濃度乙醇。產(chǎn)乙醇生物通常為酵母(例如糖酵母屬(Saccharomyce))或細(xì)菌(例如發(fā)酵單胞菌屬)。發(fā)酵單胞菌屬適用于乙醇生產(chǎn)，因?yàn)樗话闵?qiáng)，在相對(duì)高的葡萄糖濃度下生長(zhǎng)良好，并且能夠經(jīng)工程化以利用C5糖例如木糖和阿拉伯糖(常見的糖化產(chǎn)物)產(chǎn)生乙醇。然而，發(fā)酵單胞菌屬的有效利用需要改善使用發(fā)酵單胞菌屬作為產(chǎn)乙醇生物的方法。發(fā)酵單胞菌屬作為產(chǎn)乙醇生物的用途是已知的(Saddler等人，Can.J. Microbiol. (1982)，28 (12)，1311-19 :Golias 等人，J. Biotechnol.，(2002 年 6 月 26 日)
(96)2，第 155168 頁(yè)；Ma 等人，Renewable Energy (2009) 34 :1466-1470)，然而發(fā)酵單胞菌屬對(duì)由多種生物質(zhì)預(yù)處理方法產(chǎn)生的高濃度乙酸敏感?？赏ㄟ^例如洗滌經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)的方法降低乙酸水平(Teixeira 等人，Appl. Biochem. Biotechnol. , (Spring, 2000)第 84-86卷，第 111-127頁(yè))。在同步糖化和發(fā)酵中利用木糖的發(fā)酵單胞菌屬的用途也是已知的，其中所述生物質(zhì)用氫氧化鈉處理，隨后用過乙酸處理并洗漆(Teixeira等人，同上)。Eklund等人(Enzymeand Microbial Technology (1995), 17 (3), 255-9)展不了使用發(fā)酵單胞菌屬作為產(chǎn)乙醇生物的同步糖化和發(fā)酵，其中所述生物質(zhì)用蒸汽和二氧化硫進(jìn)行預(yù)處理并洗滌，然后發(fā)酵在燒瓶和發(fā)酵罐中以約10%的總不溶性固體濃度進(jìn)行，同時(shí)進(jìn)行一定地?cái)嚢瑁渲兴鲆掖籍a(chǎn)量為約28g/L。
此外，McMillan等人(Appl. Biochem. Biotechnol. (1999) Vol. 77-79 :649-665)展示了發(fā)酵單胞菌屬在同步糖化和發(fā)酵方法中的用途，其中所述發(fā)酵單胞菌屬菌株經(jīng)改造以適用于楊樹水解產(chǎn)物，所述生物質(zhì)用稀酸預(yù)處理，然后用MTBE萃取，糖化酶為纖維素酶，并且其中發(fā)酵在發(fā)酵罐中以11. 5%的不溶性固體濃度和150RPM的攪拌速度進(jìn)行。使用這種方法，作者能夠獲得約35g/L的乙醇產(chǎn)量。上述方法說明發(fā)酵單胞菌屬可用于用來生產(chǎn)乙醇的同步糖化和發(fā)酵方法中。然而，使用這些方法的乙醇產(chǎn)量低并且清楚的是所述方法需要進(jìn)行優(yōu)化以影響商業(yè)數(shù)量的乙
醇產(chǎn)量。發(fā)明概沭通過確定允許在糖化和發(fā)酵混合物中使用的高輸入不溶性固體含量并維持 原核產(chǎn)乙醇生物生產(chǎn)以便獲得高乙醇產(chǎn)量,本發(fā)明的方法尋求解決優(yōu)化原核產(chǎn)乙醇生物在同步糖化和發(fā)酵(SSF)方法中的使用的問題。使用本發(fā)明方法的乙醇產(chǎn)量可超過60g/L。因此本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)乙醇的方法，包括a)提供包含不溶性固體和多糖的經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)；b)提供至少一種用于將多糖轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖的糖化酶；c)提供原核產(chǎn)乙醇生物；d)在包括攪拌裝置的生物反應(yīng)器中制備糖化-發(fā)酵混合物，其包含a)的經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)、b)的糖化酶、和c)的原核產(chǎn)乙醇生物；以及e)在所述糖化-發(fā)酵混合物中使所述原核產(chǎn)乙醇生物生長(zhǎng)，其中在所述糖化-發(fā)酵混合物中的總輸入不溶性固體的濃度基于每升干重計(jì)為至少約16%，并且其中所述原核產(chǎn)乙醇生物產(chǎn)生乙醇。在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明的所述攪拌裝置提供不超過約O. 2瓦特/kg總糖化-發(fā)酵混合物的功率。在另一方面，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)乙醇的方法，包括a)提供粒度等于或小于約100 μ m或粒度等于或大于約600 μ m的經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)，所述經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)包含不溶性固體和多糖；b)提供至少一種用于將多糖轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖的糖化酶；c)提供原核產(chǎn)乙醇生物；d)在包括攪拌裝置的生物反應(yīng)器中制備糖化-發(fā)酵混合物，其包含a)的經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)、b)的糖化酶、和c)的原核產(chǎn)乙醇生物；以及e)在所述糖化-發(fā)酵混合物中使所述原核產(chǎn)乙醇生物生長(zhǎng)，其中I)在所述糖化-發(fā)酵混合物中的總輸入不溶性固體的濃度基于每升干重計(jì)為至少約16% ;并且2)其中所述原核產(chǎn)乙醇生物產(chǎn)生乙醇。在另一方面，本發(fā)明提供糖化-發(fā)酵體系，包括a)包含不溶性固體和多糖的經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)；b)至少一種用于將多糖轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖的糖化酶；和c)原核產(chǎn)乙醇生物；其中(a)的生物質(zhì)、(b)的酶、和(C)的產(chǎn)乙醇生物在糖化-發(fā)酵混合物中混合，所述混合物具有基于每升干重計(jì)至少約16重量％的總輸入不溶性固體濃度。
附圖
簡(jiǎn)沭、牛物保藏和序列描沭申請(qǐng)人:已經(jīng)按照國(guó)際承認(rèn)的用于專利程序目的的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約的有關(guān)條款進(jìn)行了以下生物保藏保藏菌株信息·
國(guó)際
保藏人鑒定保藏所
參考文獻(xiàn)_命名__保藏日期_
發(fā)酵單胞菌屬ZW658 ATCC No PTA-7858 2006年9月12日?qǐng)DI為顯示了固體載量和攪拌RPM對(duì)SSF的效應(yīng)的圖，所述SSF使用重組發(fā)酵單胞菌屬和稀氨預(yù)處理過的玉米芯，其具有15mg的H3A蛋白/g葡聚糖+木聚糖。圖2為顯示了在SSF條件下RPM和固體載量對(duì)重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis)活力的效應(yīng)的圖,所述SSF使用稀氨預(yù)處理過的玉米芯,其具有15mg的H3A蛋白/g葡聚糖+木糖。圖3A和B為顯示了不同粒度對(duì)使用重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌進(jìn)行的發(fā)酵的效應(yīng)的圖，所述發(fā)酵在25%的固體載量中使用具有不同粒度的Ballotini玻璃小珠。A和B是使用不同粒度范圍的不同實(shí)驗(yàn)。圖4為顯示了來自IL SSF級(jí)別的乙醇、木糖和葡萄糖濃度的圖，其具有兩個(gè)Rushton 6葉片葉輪(直徑45mm)，轉(zhuǎn)速為100RPM。圖5為顯示了來自IL SSF級(jí)別的乙醇、木糖和葡萄糖濃度的圖，其具有兩個(gè)船用式6葉片葉輪(直徑45mm)，轉(zhuǎn)速為150RPM。圖6為顯示了在SSF運(yùn)行中的乙醇產(chǎn)量的圖，該運(yùn)行具有初始的25重量％的生物質(zhì)加入量并在250或750RPM下攪拌(A);或者分開加入生物質(zhì)并在80或250RPM下攪拌⑶。圖7A為顯示了 SSF運(yùn)行中的攪拌速率(Njs)的圖，該運(yùn)行具有22. 5%的固體，使用菌株AR3 7-31和兩個(gè)不同的載入酶。圖7B是在相同SSF運(yùn)行中的乙醇產(chǎn)量圖。圖8為顯示了在使用玉米秸桿水解產(chǎn)物和兩個(gè)不同載入酶的SSF運(yùn)行中的乙醇產(chǎn)量的圖。圖9為顯示了在SSF運(yùn)行樣品中的葡萄糖、木糖和乙醇濃度的圖，該運(yùn)行樣品使用酵母、大腸桿菌、或運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌作為生物催化劑。下列序列符合37C. F. R. I. 821-1. 825 (“對(duì)含有核酸序列和/或氨基酸序列公開的專利申請(qǐng)的要求一序列規(guī)則”)，并且與世界知識(shí)產(chǎn)權(quán)組織(WIPO)標(biāo)準(zhǔn)ST. 25(1998)和EPO和PCT的序列列表要求(規(guī)則5. 2和49. 5 (a-bis)，并且行政指導(dǎo)的208節(jié)和附錄C相一致)。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號(hào)和格式遵循在37C.F.R. § I. 822中列出的規(guī)定。SEQ ID NO : I是Fv43D的氨基酸序列，其包括對(duì)應(yīng)于位點(diǎn)I至20的預(yù)測(cè)信號(hào)序列。SEQ ID NO 2是未成熟的Fv3A的序列，其包括對(duì)應(yīng)于位點(diǎn)I至23的預(yù)測(cè)信號(hào)序列。SEQ ID NO 3是未成熟的Fv51A的序列，其包括對(duì)應(yīng)于位點(diǎn)I至19的預(yù)測(cè)信號(hào)序列。SEQ ID NO :4是未成熟的Xyn3的序列，其包括對(duì)應(yīng)于位點(diǎn)I至16的預(yù)測(cè)信號(hào)序列。SEQ ID NO 5是里氏木霉(T. reesei) β -葡糖苷酶BglI的氨基酸序列。發(fā)明詳沭本發(fā)明涉及原核產(chǎn)乙醇生物例如發(fā)酵單胞菌屬在用于由纖維素生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇的同步糖化和發(fā)酵(SSF)方法或混合糖化和發(fā)酵(HSF)方法中的通途。由可再生資源生產(chǎn)用作燃料添加劑的乙醇將解決化石燃料短缺問題、降低能耗并影響全球變暖。SSF或HSF方法在乙醇生產(chǎn)中是優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈兲岣邚脑侠w維素生物質(zhì)到乙醇的轉(zhuǎn)化過程中的總體
效率。 以下定義和縮寫用于權(quán)利要求和說明書的解釋。除非另外指明，本文引用的所有美國(guó)專利公開和美國(guó)專利公開申請(qǐng)全文以引用方式并入本文。此外，當(dāng)數(shù)量、濃度或其它數(shù)值或參數(shù)以范圍、優(yōu)選范圍或優(yōu)選上限數(shù)值和優(yōu)選下限數(shù)值的列表形式給出時(shí)，它應(yīng)理解為具體地公開由任何范圍上限或優(yōu)選數(shù)值和任何范圍下限或優(yōu)選數(shù)值的任何一對(duì)所構(gòu)成的所有范圍，而無論所述范圍是否被單獨(dú)地公開。當(dāng)本文描述數(shù)值范圍時(shí)，除非另外指明，所述范圍旨在包括其端點(diǎn)，以及所述范圍內(nèi)的所有整數(shù)和分?jǐn)?shù)。當(dāng)定義范圍時(shí)，不旨在將本發(fā)明的范圍限定于所列舉的具體值。如本文所用，在本發(fā)明的元件或組分之前的詞語(yǔ)“一個(gè)”、“一種”旨在表明元件或組分的實(shí)例(即出現(xiàn)的事物)數(shù)量為非限制性的。因此，應(yīng)將“一個(gè)”和“一種”理解為包括一個(gè)(種)或至少一個(gè)(種)，并且元件或組分的詞語(yǔ)單數(shù)形式也包括復(fù)數(shù)指代，除非有數(shù)字明顯表示單數(shù)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“包含”是指如權(quán)利要求中提及的所述特征、整數(shù)、步驟或成分的存在，但它不預(yù)先排除一種或更多種其它特征、整數(shù)、步驟、成分或其組的存在或添加。術(shù)語(yǔ)“包含”旨在包括由術(shù)語(yǔ)“基本上由…組成”和“由…組成”涵蓋的實(shí)施方案。類似地，術(shù)語(yǔ)“基本上由…組成”旨在包括由術(shù)語(yǔ)“由…組成”涵蓋的實(shí)施方案。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“約”指本發(fā)明的成分或反應(yīng)物的數(shù)量變化，或用于指數(shù)值數(shù)量的變化，它們可能發(fā)生在，例如典型的測(cè)量和用于制備濃縮液或?qū)嶋H使用溶液的液體處理程序中；這些程序中的偶然誤差中；制造、來源、或用于制備組合物或?qū)嵤┓椒ǖ某煞值募兌鹊牟町愔?；等。術(shù)語(yǔ)“約”還包括由于相對(duì)于由特定起始混合物所得組合物的不同平衡條件而不同的量。無論是否通過術(shù)語(yǔ)“約”來修飾，權(quán)利要求包括量的等同量。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“發(fā)明”或“本發(fā)明”是非限制性術(shù)語(yǔ)，并且不旨在指本發(fā)明的任何單獨(dú)實(shí)施方案，而是涵蓋如本說明書和權(quán)利要求所述的所有可能的實(shí)施方案。術(shù)語(yǔ)“產(chǎn)乙醇生物”指通過代謝碳水化合物原料而生產(chǎn)乙醇的生物。術(shù)語(yǔ)“同步糖化和發(fā)酵(SSF) ”指生物質(zhì)被糖化并且同時(shí)糖化產(chǎn)生的可發(fā)酵糖通過生物催化劑被用于產(chǎn)生某種產(chǎn)物的方法，其通常在相同反應(yīng)容器中進(jìn)行。術(shù)語(yǔ)“混合糖化和發(fā)酵(HSF) ”指生物質(zhì)被糖化至有限程度(不完全或部分糖化)，隨后繼續(xù)糖化和發(fā)酵同時(shí)進(jìn)行的方法。術(shù)語(yǔ)“可發(fā)酵糖”指在發(fā)酵過程中能被微生物用作碳源的低聚糖和單糖。術(shù)語(yǔ)“部分糖化”指生物質(zhì)的有限糖化，其中釋放的可發(fā)酵糖少于如果糖化完全的話將釋放的總可發(fā)酵糖。術(shù)語(yǔ)“纖維質(zhì)”指包含纖維素和包括半纖維素和木質(zhì)素在內(nèi)的附加組分的組合物。術(shù)語(yǔ)“糖化”指由多糖產(chǎn)生可發(fā)酵糖。術(shù)語(yǔ)“預(yù)處理的生物質(zhì)”是指在糖化之前已經(jīng)經(jīng)過預(yù)處理的生物質(zhì)。“生物質(zhì)”指任何纖維質(zhì)的或木質(zhì)纖維質(zhì)的材料并包括包含纖維素的，并且任選地還包含半纖維素、木質(zhì)素、淀粉、低聚糖和/或單糖的材料。生物質(zhì)也可包含附加組分例如蛋白質(zhì)和/或脂質(zhì)。生物質(zhì)可來源于單一來源，或者生物質(zhì)可包括來源于一種以上來源的混合物；例如，生物質(zhì)可包括玉米芯和玉米秸桿的混合物，或草和葉片的混合物。生物質(zhì)包括但不限于生物能作物、農(nóng)業(yè)殘余物、市政固體垃圾、工業(yè)固體垃圾、來自造紙業(yè)的淤渣、庭院垃圾、木材和林業(yè)垃圾。生物質(zhì)的實(shí)例包括但不限于玉米芯、作物殘余例如玉米殼、玉米秸桿、草、小麥、小麥秸桿、大麥秸桿、干草、稻桿、柳枝稷、廢紙、甘蔗渣、高粱，得自谷物、樹、枝、根、葉、木屑、鋸末、灌木及灌叢、蔬菜、水果、花和動(dòng)物糞肥的研磨物的組分?！吧镔|(zhì)水解產(chǎn)物”指來源于生物質(zhì)糖化的產(chǎn)物。也可在糖化前經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“糖化酶”指能夠催化生物質(zhì)組分轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖的酶。如果生物質(zhì)為預(yù)處理的，所述酶通常更有效。術(shù)語(yǔ)“不溶性固體”指不溶于溶液的固體。術(shù)語(yǔ)“總輸入不溶性固體”指在糖化-發(fā)酵混合物中包括的生物質(zhì)不溶性固體的總干重。當(dāng)將生物質(zhì)以多個(gè)部分加入時(shí)，每部分不溶性固體的干重相加得到總輸入不溶性固體。在糖化-發(fā)酵混合物中的不溶性固體的濃度用基于每升干重計(jì)的％表示，是指每升總糖化-發(fā)酵混合物的干重克數(shù)，因此例如基于每升干重計(jì)16%指每升總糖化-發(fā)酵混合物干重為160克。術(shù)語(yǔ)“攪拌裝置”指可通過其施用功率于混合物以混合該混合物組分的機(jī)構(gòu)。通常有一個(gè)旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)的機(jī)構(gòu)通過攪拌裝置進(jìn)行混合。除非另外特別說明，當(dāng)本文提供數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解它涵蓋范圍的端點(diǎn)。應(yīng)理解，數(shù)值具有由有效數(shù)字位數(shù)提供的精度。例如，應(yīng)將數(shù)值I理解為涵蓋O. 5至I. 4的范圍,而應(yīng)將數(shù)值I. O理解為涵蓋O. 95至I. 04的范圍，包括所述范圍的端值。本發(fā)明涉及在SSF方法中使用發(fā)酵單胞菌屬菌株來生產(chǎn)乙醇的方法。所述方法如下進(jìn)行在至少一種糖化酶的存在下，在低速攪拌能量條件下預(yù)處理纖維素生物質(zhì)并在糖化-發(fā)酵混合物中包括高濃度不溶性固體，所述糖化-發(fā)酵混合物包含發(fā)酵單胞菌屬產(chǎn)乙醇生物。所得方法可產(chǎn)生超過60g/L的乙醇。預(yù)處理過的牛物質(zhì)本發(fā)明方法的生物質(zhì)可通過任何方法來預(yù)處理，所述方法使生物質(zhì)在糖化期間有效釋放可發(fā)酵糖。預(yù)處理是本領(lǐng)域熟知的并且包括例如用酸性或堿性化學(xué)制品處理和/或機(jī)械處理以減小尺寸。預(yù)處理的生物質(zhì)包含不溶性固體、多糖(其通常是不溶性固體的一部分)和其它組分，所述其它組分包括一些抑制發(fā)酵單胞菌屬生長(zhǎng)和乙醇生產(chǎn)的組分。期望在本發(fā)明方法中使用的經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)具有足夠低的發(fā)酵抑制劑含量以使在包含經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)的糖化-發(fā)酵混合物中原核產(chǎn)乙醇生物如發(fā)酵單胞菌屬的生長(zhǎng)和生產(chǎn)最大化。
例如，乙酸是經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)的組分，它抑制發(fā)酵單胞菌屬?？赏ㄟ^洗滌經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)來降低經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)中的乙酸含量以除去乙酸和其它抑制劑。作為另外一種選擇，特定的預(yù)處理可導(dǎo)致乙酸含量與發(fā)酵單胞菌屬生長(zhǎng)和生產(chǎn)相容。在預(yù)處理中使用氨可導(dǎo)致經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)中的抑制劑例如乙酸的含量降低。申請(qǐng)人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)氨處理的生物質(zhì)可具有大于約I的乙酰胺/乙酸根的摩爾比以及大于60%，例如大于約65%，或大于約70%的乙?；D(zhuǎn)化率。因此由于抑制劑濃度降低，過濾和洗滌步驟不是獲得改善的糖收率所必需的，并且因?yàn)榕c這些步驟相關(guān)聯(lián)的成本可對(duì)所述方法的經(jīng)濟(jì)性產(chǎn)生不利影響，優(yōu)選地不進(jìn)行生物質(zhì)的過濾和洗滌。因此在本發(fā)明方法中優(yōu)選使用氨預(yù)處理的生物質(zhì)。按照在共有的美國(guó)專利公開7，781，191中公開的預(yù)處理方法，優(yōu)選地使用相對(duì)于生物質(zhì)干重小于約12重量％的氨濃度。此外，不同的發(fā)酵單胞菌屬或其它產(chǎn)乙醇生物菌株可具有對(duì)經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)中 存在的乙酸和/或其它抑制劑的不同耐受性水平。發(fā)酵單胞菌屬菌株可對(duì)例如4_5g/L的乙酸水平敏感。此外，可制備具有改善的乙酸耐受性的發(fā)酵單胞菌屬菌株，例如通過在共有的和共同未決的美國(guó)專利申請(qǐng)公布US 2009-0203099A1中公開的基因工程制備上述菌株。此外，可通過適應(yīng)包含乙酸的培養(yǎng)基獲得改善的乙酸耐受性，這公開于共有的和共同未決的美國(guó)專利申請(qǐng)12/641642中，該專利申請(qǐng)以WO 2010/075241公布，其以引用方式并入本文。使用該公開適應(yīng)方法制備的發(fā)酵單胞菌屬菌株對(duì)至少約9-10g/L的乙酸具有合適的耐受性。為了最大化發(fā)酵單胞菌屬的生長(zhǎng)和乙醇產(chǎn)量，在包含糖化-發(fā)酵混合物的經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)中的乙酸水平與用于乙醇生產(chǎn)的發(fā)酵單胞菌屬菌株的乙酸耐受性水平之間存在相容性，其基于發(fā)酵單胞菌屬菌株的耐受性水平，其中耐受性指菌株在具有特定乙酸水平的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)并制備乙醇的能力與在具有更少乙酸或無乙酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)并制備乙醇的能力相似。同步糖化和發(fā)酵本發(fā)明方法涉及同步糖化和發(fā)酵(SSF)。制備糖化-發(fā)酵混合物，其包括預(yù)處理的生物質(zhì)、原核產(chǎn)乙醇生物和至少一種酶，所述酶將經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)的多糖轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖。附加的培養(yǎng)基組分例如糖、鹽、生長(zhǎng)增強(qiáng)劑、和/或?qū)?yīng)于產(chǎn)乙醇生物細(xì)胞中的抗生素抗性基因的抗生素通常不是必需的，但是可包括它們。通過一種或更多種糖化酶將經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)的組分糖化、或水解以釋放可發(fā)酵糖如葡萄糖和木糖。從預(yù)處理的生物質(zhì)中逐漸釋放糖。通過產(chǎn)乙醇生物代謝釋放的糖以產(chǎn)生乙醇作為產(chǎn)物。糖化糖化酶參見Lynd, L. R.等人(Microbiol. Mol. Biol. Rev.，66 :506-577, 2002)。使用至少一種酶，并且通常使用糖化酶聚生體，其包括一種或更多種糖苷酶。糖苷酶水解二糖、低聚糖和多糖的醚鍵，并且存在于廣義“水解酶”(EC 3.)的酶分類EC 3. 2. I. X (EnzymeNomenclature 1992, Academic Press, San Diego, CA,以及增補(bǔ) I (1993)、增補(bǔ) 2 (1994)中、增補(bǔ) 3(1995、增補(bǔ) 4(1997)和增補(bǔ) 5[分別在 Eur. J. Biochem. ”，223 :1_5，1994 ;“Eur.J. Biochem. ”，232 :1_6，1995 ;“Eur. J. Biochem. ”，237 :1_5，1996 ;“Eur. J. Biochem. ”,250 :1-6，1997 ;和 “Eur. J. Biochem. ”，264 :610-650 1999 中])中。本發(fā)明的方法中可用的糖苷酶能根據(jù)它們水解的生物質(zhì)組分進(jìn)行分類?？捎糜诒景l(fā)明方法中的糖苷酶包括纖維素水解糖苷酶(例如，纖維素酶、內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、β-葡糖苷酶)、半纖維素水解糖苷酶(例如木聚糖酶、內(nèi)切木聚糖酶、外切木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯木聚糖酶、甘露聚糖酶、半乳糖酶、果膠酶、葡糖醛酸糖苷酶)和淀粉水解糖苷酶(例如淀粉酶、α -淀粉酶、β -淀粉酶、葡糖淀粉酶、α -葡糖苷酶、異淀粉酶)。此外，它可用于將其它活性加入到糖化酶聚生體中，例如肽酶(EC 3. 4. X. y)、脂肪酶(EC 3. I. I. x和3. I. 4. X)、木素酶(EC I. 11. I. X)和阿魏酸酯酶(EC3. I. I. 73)以有助于從生物質(zhì)的其它組分中釋放多糖。本領(lǐng)域熟知的生產(chǎn)多糖水解酶的微生物常常表現(xiàn)出某種活性，例如纖維素降解，該活性由多種酶或一組具有不同底物特異性的酶(或“酶聚生體”)催化。因此，來自微生物的“纖維素酶”可包括一組酶、一種或更多種酶或所有酶，它們都可有助于纖維素降解活性。取決于獲取酶制劑時(shí)利用 的純化方案，商業(yè)或非商業(yè)酶制劑，如纖維素酶，可包括多種酶。糖化酶可以分離形式商購(gòu)獲得,例如Spezyme CP纖維素酶(Danisco US, Inc.,Rochester, NY)和Multifect 木聚糖酶(Danisco US, Inc.)。此外糖化酶可為未純化的并以細(xì)胞提取物或完整細(xì)胞制劑的形式提供。可使用已經(jīng)經(jīng)工程化以表達(dá)多個(gè)糖化酶的重組微生物制備所述酶。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將懂得如何測(cè)定在本發(fā)明的SSF方法中使用的酶的有效量，以及如何調(diào)節(jié)條件以在SSF中獲得最佳酶活性。本領(lǐng)域的技術(shù)人員也將懂得如何優(yōu)化此類酶的所需活性，以在選擇條件下獲得給定經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)的最佳糖化效果?；旌咸腔桶l(fā)酵此外，本發(fā)明的方法可進(jìn)行為混合糖化和發(fā)酵(HSF)。在這個(gè)方法中糖化在發(fā)酵前一段時(shí)間發(fā)生，其中發(fā)生部分而非完全的糖化。在這個(gè)方法中在經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)和糖化酶混合后一段時(shí)間加入產(chǎn)乙醇生物以便在未進(jìn)行發(fā)酵的情況下發(fā)生一些糖化。在加入產(chǎn)乙醇生物前的時(shí)間段可不同并且通常在一小時(shí)至多個(gè)小時(shí)的范圍內(nèi)，以便釋放可發(fā)酵糖并在加入產(chǎn)乙醇生物時(shí)已經(jīng)呈現(xiàn)期望的濃度。在實(shí)施例4中例示了 HSF，其中在加入糖化酶一小時(shí)后加入發(fā)酵單胞菌屬細(xì)胞。原核產(chǎn)乙醇牛物本發(fā)明的糖化-發(fā)酵混合物最初包括來自原核產(chǎn)乙醇生物菌株的種子細(xì)胞種菌。高效生產(chǎn)乙醇的任何原核細(xì)胞可被用作產(chǎn)乙醇生物。使用的細(xì)胞可天然產(chǎn)生乙醇、經(jīng)工程化以產(chǎn)生乙醇、或者可為經(jīng)工程化以具有改善乙醇產(chǎn)量的天然乙醇生產(chǎn)者。原核產(chǎn)乙醇生物的實(shí)例包括但不限于梭菌屬(Clostridium) (Stevenson和Weimer (2005)Appliedand Environmental Microbiology 71 :4672-4678)、經(jīng)工程化以生產(chǎn)乙醇的大腸桿菌菌株(US 5，000，000)、經(jīng)工程化以生產(chǎn)乙醇的嗜熱葡糖苷酶地芽孢桿菌(Geobacillusthermoglucosidasius)菌株(Cripps 等人(2OO9)Metabolic Engineering 11 :398-408) >經(jīng)工程化以生產(chǎn)乙醇的產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)菌株(Ohta等人(1991)Applied and Environmental Microbiology 57 :2810-2815)、發(fā)酵桿菌屬(Zymobacter)(Yanase 等人(2007) Appl. Environ. Mirobiol. 73 :2592-2599)、以及發(fā)酵單胞菌屬。優(yōu)選的原核產(chǎn)乙醇生物是發(fā)酵單胞菌屬，它天然發(fā)酵葡萄糖以產(chǎn)生乙醇。發(fā)酵單胞菌屬菌株已經(jīng)經(jīng)工程化以用于木糖利用率(美國(guó)專利公開5，514，583,5, 712，133、6，566，107、PCT 專利申請(qǐng)?zhí)?WO 95/28476，F(xiàn)eldmann 等人(1992) Appl MicrobiolBiotechnol 38:354-361，Zhang 等人(1995) Science 267 :240-243)，它可用于本發(fā)明的方法。已經(jīng)通過基因工程和/或適應(yīng)制備出具有改善的與乙醇產(chǎn)量相關(guān)的特性的發(fā)酵單胞菌屬菌株。優(yōu)選地是具有多個(gè)工程化和/或適應(yīng)改善的發(fā)酵單胞菌屬菌株，其用于本發(fā)明方法中以最大化乙醇產(chǎn)量。已經(jīng)進(jìn)行了可存在的改善，其包括但不限于1)工程化并適應(yīng)改善的木糖利用率(美國(guó)專利公開7，223，575和共有的美國(guó)專利公開7，741，119、US-2009-0246876A1和US-2009-024 6846A1) ；2)減少不利于乙醇生產(chǎn)的副產(chǎn)物的合成(共有的US 7，741，119) ；3)工程化以改善乙酸耐受性(共有的和共同未決的美國(guó)專利申請(qǐng)公布US2009-0203099A1，以及公布為 WO 2010/075241 的美國(guó)專利申請(qǐng) 12/641642)。如WO 2010/075241中公開的方法制備的具有改善的乙酸耐受性的發(fā)酵單胞菌屬菌株優(yōu)選地用于本發(fā)明方法。由于使用這些菌株，在本發(fā)明的糖化-發(fā)酵混合物中可包括高濃度的經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)，同時(shí)保留不妨害乙醇生產(chǎn)的乙酸水平，不需要進(jìn)行大量的洗滌以從經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)中除去乙酸。通常期望的發(fā)酵單胞菌屬菌株作為種子培養(yǎng)物進(jìn)行培養(yǎng)。種子培養(yǎng)物可例如在由以下組分組成的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)5-20g/L的酵母提取物，2-4g/L的磷酸氫二鉀，l-5g/L的硫酸鎂七水合物和100-200g/L的葡萄糖，所述培養(yǎng)物在32°C -33°C,pH 5. 5-5. 8的上述培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至0D600nm為10。種子培養(yǎng)物用于啟動(dòng)SSF，其加入體積等同于糖化-發(fā)酵混合物體積的約10%。SSF中的不溶件固體為了最大化SSF中的乙醇產(chǎn)量，在糖化-發(fā)酵混合物中包括高水平的存在于經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)中的不溶性固體量。經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)中包括的不溶性固體量與在SSF期間可生成的可發(fā)酵糖量相關(guān)聯(lián)，它繼而關(guān)聯(lián)可從發(fā)酵單胞菌屬細(xì)胞中代謝可發(fā)酵糖生成的乙醇量。取決于所用的特定預(yù)處理以及是否包括任何洗滌步驟，相對(duì)于經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)制劑中的固體量的不溶性固體量將不同。洗滌將增溶不溶解的固體，在總固體中留下較高的不溶性固體百分比。一些酸預(yù)處理可將多達(dá)30%的未預(yù)處理的生物質(zhì)固體轉(zhuǎn)化成可溶固體,從而留下的總固體的70 %為不溶性固體。與之相反，用低氨預(yù)處理的固體量和不溶性固體量在經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)中可能是相似的。相對(duì)于經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)樣品中的總固體的不溶性固體量通常可在約70%至約99%的范圍內(nèi)。例如，在本文實(shí)施例中使用的低氨預(yù)處理的生物質(zhì)中，不溶性固體占總固體的90% -91%。在本發(fā)明的方法中，糖化-發(fā)酵混合物包括的來自經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)的總輸入不溶性固體量對(duì)原核產(chǎn)乙醇生物的乙醇生產(chǎn)的輸入功率效應(yīng)是重要的。在本發(fā)明的方法中，糖化-發(fā)酵混合物中載入的不溶性固體總量為每升總糖化-發(fā)酵混合物至少約160克干重或16%。為了輔助混合糖化-發(fā)酵混合物，可將經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)分成兩個(gè)或更多個(gè)部分加入。當(dāng)加入初始部分時(shí)，不溶性固體濃度可小于16%。在較低的不溶性固體濃度下調(diào)節(jié)PH和溫度有促進(jìn)作用。然后可加入附加的經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)使得總輸入不溶性固體重量為至少約16%?？稍谳d入酶和/或發(fā)酵單胞菌屬之前或之后加入附加的生物質(zhì)?？蓪⒏郊拥纳镔|(zhì)分成一個(gè)或更多個(gè)部分加入。載入的總輸入不溶性固體可為至少約16%、17%、18%、19%、20%、21%、24%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、或更高，包括所述列出數(shù)值間的任何整數(shù)。
隨著SSF運(yùn)行進(jìn)行，由于SSF中存在的糖化酶糖化經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)，不溶性固體量降低。在給定的SSF運(yùn)行約120小時(shí)后，不溶性固體通?？蓽p少至約一半、或更少的初始量。攪拌裝置的功率在生物反應(yīng)器中使用攪拌裝置攪拌糖化-發(fā)酵混合物以混合組分，所述組分包括經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)、糖化酶、發(fā)酵單胞菌屬細(xì)胞、以及任選的其它培養(yǎng)基組分。申請(qǐng)人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)在包含例如約25%或更多不溶性固體的糖化-發(fā)酵混合物的攪拌中提供高能量時(shí)，發(fā)酵單胞菌屬產(chǎn)乙醇生物的乙醇產(chǎn)量受到負(fù)面影響。劇烈振蕩(200RPM)具有25%不溶性固體濃度的混合物導(dǎo)致乙醇產(chǎn)量和發(fā)酵單胞菌屬活力降低，而劇烈振蕩具有12%固體的混合物無此類效應(yīng)。
因此在SSF期間需要混合，然而需要保持發(fā)酵單胞菌屬細(xì)胞的乙醇生產(chǎn)能力。如本文實(shí)施例5所述，申請(qǐng)人已經(jīng)計(jì)算出攪拌器可提供給包含發(fā)酵單胞菌屬產(chǎn)乙醇生物和至少約22. 5%不溶性固體的糖化-發(fā)酵混合物的功率以維持期望的乙醇產(chǎn)量。在本發(fā)明的方法中進(jìn)行混合，其中通過攪拌裝置提供的功率不超過約O. 2瓦特每千克總糖化-發(fā)酵混合物。對(duì)于最大化乙醇產(chǎn)量，優(yōu)選的輸入功率小于約O. 2、0. 15,0. 1、0. 05、0. 01、0. 005、或O. 003瓦特/kg總糖化-發(fā)酵混合物。攪拌裝置可為任何旋轉(zhuǎn)攪拌器，包括任何類型的葉輪如Rushton(6葉片)和任何類型的斜葉槳(船用式、4葉片、3片段)?？墒褂脙煞N或更多種葉輪葉片，其中單個(gè)葉輪功率的總和小于約O. 2瓦特/kg。功率可隨時(shí)間變化，因?yàn)樘腔?發(fā)酵混合物的粘度由于生物質(zhì)的糖化而降低。此外，發(fā)現(xiàn)在粒度范圍介于100 μ m和600 μ m之間的玻璃小珠的存在下，當(dāng)進(jìn)行劇烈攪拌時(shí)發(fā)酵單胞菌屬的乙醇生產(chǎn)性能降低。因此當(dāng)生物質(zhì)粒度在這一范圍內(nèi)時(shí)，如上所述減少攪拌以最大化乙醇產(chǎn)量。當(dāng)生物質(zhì)粒度小于約100 μ m或大于約600 μ m時(shí),可使用劇烈攪拌。然而，經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)初始可為較大粒度，但是粒度減小可在SSF運(yùn)行期間發(fā)生。任何類型的生物質(zhì)的粒度可對(duì)發(fā)酵單胞菌屬細(xì)胞產(chǎn)生效應(yīng)，如玻璃小珠所示。SSF的條件在具有攪拌裝置的生物反應(yīng)器中保留糖化-發(fā)酵混合物以生產(chǎn)乙醇。保持有利于發(fā)酵單胞菌屬糖化并發(fā)酵的條件。通常使用苛性溶液(例如氫氧化銨、氫氧化鉀、或氫氧化鈉)以及或者硫酸或者磷酸將PH保持在約5和約7之間。通常使用NaOH作為堿并使用H2SO4作為酸將pH保持在5. 8。溫度保持在約28°C和約37°C之間。通常溫度保持在約33°C或在33°C和約28°C之間變化。SSF持續(xù)至少約40小時(shí)，通常120小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間為一次運(yùn)行。所述運(yùn)行可為分批形式的，其中進(jìn)行極小的改變?nèi)鏿H調(diào)節(jié)，或者可為分批補(bǔ)料形式的，其中當(dāng)進(jìn)行SSF時(shí)將組分給料于糖化-發(fā)酵混合物。分批和分批補(bǔ)料培養(yǎng)方法在本領(lǐng)域內(nèi)是常用的且熟知的，并且實(shí)例可見于Biotechnology :A Textbook of IndustrialMicrobiology, Crueger, Crueger,和 Brock,第二版(1989) Sinauer Associates, Inc.(Sunderland, MA)或 Deshpande, Mukund V. ,Appl. Biochem. Biotechnol. ,36,227, (1992)。在本發(fā)明方法中在分批補(bǔ)料運(yùn)行中可加入的組分可包括附加的經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)和/或附加的糖化酶。乙醇濃度
使用本發(fā)明方法可獲得高乙醇產(chǎn)量。在本發(fā)明SSF方法中產(chǎn)生的特定乙醇量將取決于以下條件而不同，如使用的具體發(fā)酵單胞菌屬菌株、生物質(zhì)類型、生物質(zhì)預(yù)處理方法、不溶性固體濃度和糖化酶。通?？缮a(chǎn)大于約40g/L的乙醇。生產(chǎn)的乙醇可為例如約45、約50、約55、約60、約65、約70、約75、約80、或約85g/L。
實(shí)施例本發(fā)明將在以下實(shí)施例中得到進(jìn)一步闡述。應(yīng)該理解，盡管這些實(shí)施例說明了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但僅是以例證的方式給出的。通過上述論述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可確定本發(fā)明的必要特征，并且在不脫離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種變化和修改以使其適應(yīng)多種用途和條件。使用的縮寫詞的含義如下“min”指分鐘，“h”指小時(shí)，“ μ L”指微升，“mL”或“ml”指毫升，“L”指升，“nm”指納米，“mm”指毫米，“cm”指厘米，“ μ m”指微米，“mM”指毫摩爾每升，“M”指摩爾，“mmol ”指毫摩爾，“ μ mole”指微摩爾，“g”指克，“ μ g”指微克，“mg”指毫克，“kg”指千克，“g”指引力常數(shù)，“RPM”或“rpm”指每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)，“h. p. ”指馬力，”為體積％，“atm”指大氣，“”為重量百分比，“CFU”為菌落形成單位數(shù)，“ ”指大約，“hr”指小時(shí)，“ P ”指密度，“ μ ”指粘度，“D/’指葉輪直徑，“RPS”指每秒轉(zhuǎn)數(shù)，“EFT”指過去的發(fā)酵時(shí)間。一般方法適合細(xì)菌培養(yǎng)物維持及生長(zhǎng)的材料和方法在領(lǐng)域內(nèi)也是眾所周知的。適用于下面實(shí)施例的技術(shù)可存在于以下文獻(xiàn)中Manual of Methods for GeneralBacteriology,Phillipp Gerhardt,R. G. E. Murray,Ralph N. Costilow,Eugene ff. Nester,Willis A. Wood, Noel R. Krieg 和 G. Briggs Phillips,編輯，American Society forMicrobiology(Washington, DC. ) 1994,或者 Thomas D. Brock 在 Biotechnology 中的 A Textbook of Industrial Microbiology,第二 版，Sinauer Associates, Inc.(Sunderland, MA) 1989。使用的用于細(xì)菌細(xì)胞生長(zhǎng)和維持的所有試劑和材料均得自 Aldrich Chemicals(Milwaukee, WI)> BD Diagnostic Systems(Sparks, MD) > LifeTechnologies (Rockville,MD)或Sigma Chemical Company (St. Louis,MO),除非另外說明。芯的預(yù)處理將玉米芯在酶水解之前進(jìn)行預(yù)處理，所述預(yù)處理使用如共有的美國(guó)專利公開7，781，191中所述的低氨方法。使用水平Littleford Day 130L反應(yīng)容器進(jìn)行預(yù)處理以生成稱為SSL21的預(yù)處理芯，所述反應(yīng)容器包含圍繞容器主體用于傳輸蒸汽的夾套。容器載入來自加工種子谷物(尺寸小于Imm)的芯以達(dá)到基于濕芯的46￥%的反應(yīng)器填充度(57. 51bs)。使用大型微粒粉磨機(jī)(Model#lSH, Serial#10019),用I. Omm的篩網(wǎng)將所述芯減小到小于Imm的尺寸。在碾磨前按需加入一匙干冰到所述芯中以防止設(shè)備升溫。微粒粉磨機(jī)的主要驅(qū)動(dòng)裝置是5h. p.馬達(dá)，其最大轉(zhuǎn)速為9，600RPM。它有六個(gè)旋轉(zhuǎn)錘；殼，并且沿相對(duì)作用邊排列。所述芯具有0. 420g/cm3的松散濕堆積密度和7. 5重量％的水分。在加入28. 9重量％的氫氧化銨溶液(11. 21bs)和水(20. Ilbs)到靠近容器頂部以提供容器中相對(duì)于生物·質(zhì)干重6重量％的順3和60重量％的固體之前向容器施加真空以達(dá)到0. latm。表I列出了用于二次預(yù)處理批(稱為SSL22)的芯特性和氫氧化銨與水的量。在兩種情況下，均將反應(yīng)器攪拌器設(shè)為70rpm并且蒸汽通過容器的夾套。當(dāng)容器達(dá)到內(nèi)部溫度80°C時(shí)，將蒸汽導(dǎo)入靠近容器頂部以提高容器內(nèi)部溫度至145°C。保持這一溫度20分鐘。在保持15分鐘后，停止流經(jīng)夾套的蒸汽流。在預(yù)處理末期，通過排氣冷凝器將反應(yīng)器壓力降至大氣壓。隨后，在打開容器的底部閥門并回收經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)之前，施加真空(大約小于latm) 15分鐘以將溫度降至小于60°C并從預(yù)處理芯中除去多余的氨和水。表2列出了 SSL21和SSL22批的預(yù)處理芯規(guī)程。期望小于O. 3kg順3/1001^干固體的殘余氨以及大于1.0的乙酰胺對(duì)乙酸比率。測(cè)得SSL21芯預(yù)處理批的不溶性固體為總固體的90% -91 %。表I:用于二次預(yù)處理批(SSL 22)的芯特性和氫氧化銨與水的暈。
權(quán)利要求
1.用于生產(chǎn)乙醇的方法，包括 a)提供包含不溶性固體和多糖的經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)； b)提供至少一種用于將多糖轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖的糖化酶； c)提供原核產(chǎn)乙醇生物； d)在包括攪拌裝置的生物反應(yīng)器中制備糖化-發(fā)酵混合物，其包含a)的經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)、b)的糖化酶、和c)的原核產(chǎn)乙醇生物；以及 d)在所述糖化-發(fā)酵混合物中使所述原核產(chǎn)乙醇生物生長(zhǎng)，其中在所述糖化-發(fā)酵混合物中的總輸入不溶性固體的濃度基于每升干重計(jì)為至少約16%，并且其中所述原核產(chǎn)乙醇生物產(chǎn)生乙醇。
2.權(quán)利要求I的方法，其中所述攪拌裝置提供不超過約O.2瓦特/kg總糖化-發(fā)酵混合物的功率。
3.權(quán)利要求I的方法，其中所述原核產(chǎn)乙醇生物是選自下組的屬的成員發(fā)酵單胞菌屬、發(fā)酵桿菌屬、梭菌屬、埃希氏菌屬、克雷伯氏菌屬和地芽孢桿菌屬。
4.權(quán)利要求I的方法，其中所述攪拌裝置包括至少一個(gè)葉輪。
5.權(quán)利要求I的方法，其中c)的產(chǎn)乙醇生物在加入b)的糖化酶后已經(jīng)發(fā)生部分糖化的時(shí)間加入。
6.權(quán)利要求I的方法，其中經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)以至少兩份被加入，所述至少兩份聯(lián)合提供基于每升干重計(jì)至少約16%的總輸入不溶性固體濃度。
7.權(quán)利要求I的方法，其中在所述糖化-發(fā)酵混合物中的總輸入不溶性固體的濃度基于每升干重計(jì)為至少約20%。
8.權(quán)利要求I的方法，其中所述原核產(chǎn)乙醇生物耐受所述糖化-發(fā)酵混合物中的乙酸濃度。
9.權(quán)利要求I的方法，其中生物質(zhì)選自柳枝稷、廢紙、來自造紙業(yè)的淤渣、玉米芯、玉米殼、玉米稻桿、草、小麥、小麥稻桿、干草、大麥稻桿、稻桿、甘鹿洛、高粱、得自谷物、樹、枝、根、葉、木屑、鋸末、灌木及灌叢、蔬菜、水果、花和動(dòng)物糞肥的加工的組分。
10.權(quán)利要求I的方法，其中所述經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)通過用氨處理纖維素生物質(zhì)而制成。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述氨相對(duì)于生物質(zhì)的干重為小于約12重量％。
12.權(quán)利要求I的方法，其中所述至少一種糖化酶選自纖維素水解糖苷酶和半纖維素水解糖苷酶。
13.權(quán)利要求I的方法，其中所述至少一種糖化酶是酶聚生體中的一員。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述糖化酶聚生體包含選自以下的酶纖維素酶、內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、β -葡糖苷酶、木聚糖酶、內(nèi)切木聚糖酶、外切木聚糖酶、β -木糖苷酶、阿拉伯木聚糖酶、甘露聚糖酶、半乳糖酶、果膠酶、葡糖醛酸糖苷酶、淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、α -葡糖苷酶、異淀粉酶、肽酶、脂肪酶、木素酶和阿魏酸酯酶。
15.權(quán)利要求I的方法，其中所述多糖包括木聚糖和葡聚糖。
16.權(quán)利要求I的方法，其中所述可發(fā)酵糖包括木糖和葡萄糖。
17.權(quán)利要求I的方法，其中所述產(chǎn)生的乙醇的濃度為至少約40g/L。
18.用于生產(chǎn)乙醇的方法，包括 a)提供粒度等于或小于約100μ m或粒度等于或大于約600 μ m的經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)，其包含不溶性固體和多糖； b)提供至少一種用于將多糖轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖的糖化酶； c)提供原核產(chǎn)乙醇生物； d)在包括攪拌裝置的生物反應(yīng)器中制備糖化-發(fā)酵混合物，其包含a)的經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)、b)的糖化酶、和c)的原核產(chǎn)乙醇生物；以及 e)在所述糖化-發(fā)酵混合物中使所述原核產(chǎn)乙醇生物生長(zhǎng),其中 1)在所述糖化-發(fā)酵混合物中的總輸入不溶性固體的濃度基于每升干重計(jì)為至少約16% ;并且 2)其中所述原核產(chǎn)乙醇生物產(chǎn)生乙醇。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述原核產(chǎn)乙醇生物是選自下組的屬的成員發(fā)酵單胞菌屬、發(fā)酵桿菌屬、梭菌屬、埃希氏菌屬、克雷伯氏菌屬和地芽孢桿菌屬。
20.糖化-發(fā)酵體系，包括 a)包含不溶性固體和多糖的經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)； b)至少一種用于將多糖轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖的糖化酶；和 c)原核產(chǎn)乙醇生物； 其中(a)、(b)和(C)的生物質(zhì)、酶和產(chǎn)乙醇生物在糖化-發(fā)酵混合物中混合，所述混合物具有基于每升干重計(jì)至少約16%的總輸入不溶性固體濃度。
21.權(quán)利要求20的體系，其中(a)、(b)和(C)的生物質(zhì)、酶和產(chǎn)乙醇生物被包含在生物反應(yīng)器中，所述生物反應(yīng)器包括提供不超過O. 2瓦特/kg總糖化-發(fā)酵混合物的功率的功能性攪拌裝置。
22.權(quán)利要求20的糖化-發(fā)酵體系，其中所述原核產(chǎn)乙醇生物選自發(fā)酵單胞菌屬、發(fā)酵桿囷屬、fe囷屬、埃希氏囷屬、克雷伯氏囷屬和地牙抱桿囷屬。
全文摘要
本發(fā)明公開了使用發(fā)酵單胞菌屬作為產(chǎn)乙醇生物從生物質(zhì)中生產(chǎn)高濃度乙醇的方法。在用于生產(chǎn)高濃度乙醇的同步糖化和發(fā)酵反應(yīng)期間，使發(fā)酵單胞菌屬在低葉輪攪拌、糖化-發(fā)酵混合物中的不溶性固體的高濃度條件下生長(zhǎng)。
文檔編號(hào)C12P7/06GK102933714SQ201080059411
公開日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2010年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月23日
發(fā)明者W·D·希茨, T·黃, A·K·艾弗森, B·G·勒菲弗爾, C·米欽森 申請(qǐng)人:納幕爾杜邦公司