專利名稱：c-kit基因的多態(tài)性檢測用探針及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測C-kit基因的多態(tài)性的探針及其用途。
背景技術(shù)：
c-kit受體為細(xì)胞表面的受體型酪氨酸激酶，與干細(xì)胞因子結(jié)合。編碼c-kit受體的c-kit基因位于人的第4染色體。已知c-kit基因例如在序列編號I所示的c-kit基因的部分序列中，堿基編號108的堿基(W)的腺嘌呤(a)突變成胸腺嘧啶(t)、堿基編號127的堿基(d)的胸腺嘧啶(t)突變成鳥嘌呤(g)或腺嘌呤(a)等(非專利文獻(xiàn)I等)。c-kit受體中，通過堿基編號108的堿基的突變，第816位的天冬氨酸(D)突變成纈氨酸(V)，通過堿基編號127的堿基的突變，第822位的天門冬酰胺(N)突變成賴氨酸(K)。報(bào)告了這樣的 突變例如與急性骨髓白血病、胃腸道間質(zhì)瘤(GIST)等癌癥疾病有關(guān)，與所述癌癥疾病的預(yù)后不良有關(guān)等(非專利文獻(xiàn)I等)。因此，c-kit基因中的這些突變的有無即多態(tài)性的檢測例如在疾病的診斷、選擇更有效的疾病的治療方法等方面是極其重要的。
另一方面，檢測基因的多態(tài)性的方法報(bào)告了各種方法，例如可以舉出PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，Polymerase Chain Reaction)-RFLP(限制片段長度多態(tài)性，RestrictionFragment Length Polymorphism)法等。
所述PCR-RFLP法是對試樣的靶標(biāo)DNA，用PCR擴(kuò)增檢測目標(biāo)的區(qū)域，用限制性內(nèi)切酶處理其擴(kuò)增產(chǎn)物，通過southern雜交對由與多態(tài)性而產(chǎn)生的限制片段長度的變化進(jìn)行分型的方法。由于當(dāng)基因中存在目標(biāo)突變時(shí)，限制性內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)消失，因此能夠通過有無切斷、即限制片段長度的變化來檢測突變的有無。
然而，所述PCR-RFLP法例如需要在PCR之后，用各種限制性內(nèi)切酶處理所得到的擴(kuò)增物并分析，花費(fèi)工夫。另外，對所得的擴(kuò)增物的限制性內(nèi)切酶處理需要臨時(shí)提取擴(kuò)增物來進(jìn)行。因此，有可能造成第一次的反應(yīng)所得的擴(kuò)增物飛散，混入第二次的其他的反應(yīng)中。由于這樣的問題，難以進(jìn)行多態(tài)性的檢測的自動化。
由于這樣的問題，近年來，作為多態(tài)性的檢測方法，Tm (Melting Temperature,熔解溫度)分析受到關(guān)注。所述Tm分析也稱熔解曲線分析。這種方法為如下方法。首先，使用與含有檢測目標(biāo)的多態(tài)性的區(qū)域互補(bǔ)的探針，使待測核酸與所述探針的雜交體(雙鏈核酸)形成。然后，對所得到的雜交體實(shí)施加熱處理，通過吸光度等的信號測定來檢測伴隨溫度上升的雜交體向單鏈核酸的解離(熔解)?；谠摍z測結(jié)果來確定Tm值，由此判斷多態(tài)性。雜交體中兩條單鏈核酸的互補(bǔ)性越高，則Tm值越高，互補(bǔ)性越低，則Tm值越低。因此，在檢測對象位點(diǎn)的多態(tài)性為X或Y的情況下，對于含有目標(biāo)多態(tài)性(例如Y)的核酸和與其100%互補(bǔ)的探針的雜交體，預(yù)先求得Tm值(評價(jià)基準(zhǔn)值)。接著，測定所述待測核酸和所述探針的Tm值(測定值)。并且，如果該測定值與所述評價(jià)基準(zhǔn)值相同，則可以判斷為所述待測核酸與所述探針完全匹配，即，所述待測核酸的檢測對象位點(diǎn)為目標(biāo)多態(tài)性(Y)。另一方面，如果所述測定值低于所述評價(jià)基準(zhǔn)值，則可以判斷為所述待測核酸和所述探針為錯(cuò)配，即，所述待測核酸的檢測對象位點(diǎn)為另一種多態(tài)性(X)。通過這樣的方法，例如僅通過對添加了所述探針的PCR反應(yīng)液實(shí)施溫度處理，進(jìn)行信號測定，即可檢測多態(tài)性。因此，可以實(shí)現(xiàn)檢測裝置的自動化。
但是，利用了這樣的Tm分析的檢測方法，例如必須通過Tm值來判斷單一堿基的差異。另外，在基因具有多種多態(tài)性的情況下，分析一個(gè)樣品也需要花費(fèi)大量的勞動力。因此，在分析多個(gè)樣品時(shí)也存在不實(shí)用的問題。因此，尤其需要在野生型的多態(tài)性和多個(gè)突變型的多態(tài)性混合存在時(shí)等，也能夠正確地檢測突變的有無。
現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
非專利文獻(xiàn)
非專利文獻(xiàn)I J Clin Oncol.，2006 年 8 月 20 日，Vol. 24，No. 24，p. 3904-3911發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題
由于這些理由，c-kit基因的多態(tài)性的檢測例如在所述疾病的診斷和治療方法的選擇中非常重要。因此，本發(fā)明的目的在于提供一種能夠簡便并且可靠性優(yōu)良地針對c-kit基因判別多態(tài)性的多態(tài)性檢測用探針及其用途。
用于解決問題的手段
為了達(dá)到所述目的，本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針為c-kit基因的多態(tài)性檢測用探針，其特征在于，含有下述(pi) (P4)和(pr ) (P4’)中的至少一種寡核苷酸。
(Pl)寡核苷酸，其由為堿基長4 50堿基長、與含有序列編號I中的堿基編號105 108的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成，在3’末端區(qū)域具有與所述堿基編號105的堿基互補(bǔ)的喊基；
(pr )寡核苷酸，其由與所述(pi)寡核苷酸互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成；
(P2)寡核苷酸，其由堿基長為7 50堿基長、含有序列編號I中的堿基編號102 108的喊基序列構(gòu)成，在5’末端區(qū)域具有所述喊基編號102的喊基；
(P2’ )寡核苷酸，其由與所述(P2)寡核苷酸互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成；
(P3)寡核苷酸，其由堿基長為8 50堿基長、與含有序列編號I中的堿基編號127 134的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成，在5’末端區(qū)域具有與所述堿基編號134的堿基互補(bǔ)的喊基；
(P3’ )寡核苷酸，其由與所述(P3)寡核苷酸互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成；
(P4)寡核苷酸，其由堿基長為5 50堿基長、含有序列編號I中的堿基編號123 127的喊基序列構(gòu)成，在5’末端區(qū)域具有所述喊基編號123的喊基；
(P4’ )寡核苷酸，其由與所述(P4)寡核苷酸互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成。
本發(fā)明的多態(tài)性檢測方法為c-kit基因的多態(tài)性檢測方法，其特征在于，包括使用本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針來檢測c-kit基因的多態(tài)性的步驟。
本發(fā)明的多態(tài)性檢測用試劑為用于檢測c-kit基因的多態(tài)性的試劑，其特征在于，含有本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針。
發(fā)明的效果
通過本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針，例如能夠通過Tm分析簡便并且可靠性優(yōu)良地判別c-kit基因的多態(tài)性。具體而言，例如，即使在試樣中目標(biāo)的多態(tài)性為野生型的c-kit基因和目標(biāo)的多態(tài)性為突變型的c-kit基因共存的情況下，也能夠通過進(jìn)行使用了本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針的Tm分析，來簡便并且可靠性優(yōu)良地檢測多態(tài)性的種類和突變的有無。因此，本發(fā)明例如對于含有野生型的c-kit基因和突變型的c-kit基因兩者的試樣特別有用。如此，由于通過本發(fā)明，能夠簡便并且可靠性優(yōu)良地判別c-kit基因的多態(tài)性，因此例如能夠?qū)z測結(jié)果反映到前述那樣的疾病的診斷和治療方法的選擇等中。因此，可以說本發(fā)明在醫(yī)療領(lǐng)域等中是極其有用的。


圖I是示出本發(fā)明的實(shí)施例I中的、含有野生型和突變型質(zhì)粒的反應(yīng)液的Tm分析的結(jié)果的圖2是示出本發(fā)明的實(shí)施例2中的、含有野生型和突變型質(zhì)粒的反應(yīng)液的Tm分析的結(jié)果的圖3是示出本發(fā)明的實(shí)施例3中的、含有野生型和突變型質(zhì)粒的反應(yīng)液的Tm分析的結(jié)果的圖。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明中，c-kit基因的檢測目標(biāo)的多態(tài)性例如為序列編號I所示的c-kit基因的部分序列中堿基編號108的堿基(w)和堿基編號127的堿基(d)的多態(tài)性。堿基編號108的堿基(《)中，野生型為腺嘌呤(a)，這種情況下，c-kit受體的第816位的氨基酸為天冬氨酸(D) (D816)。突變型為胸腺嘧啶(t)，這種情況下，c-kit受體的第816位的氨基酸為纈氨酸(V) (D816V)。堿基編號127的堿基(d)中，野生型為胸腺嘧啶(t)，這種情況下，c-kit受體的第822位的氨基酸為天門冬酰胺(N) (N822)。突變型為鳥嘌呤(g)或腺嘌呤(a)，在這些情況下，c-kit受體的第822位的氨基酸為賴氨酸(K) (N822K)。c_kit基因中，如果所述兩處多態(tài)性中至少一處為所述突變型，則例如可以判斷為存在急性骨髓性白血病、胃腸道間質(zhì)瘤(GIST)等癌癥疾病的可能性，另外，對于所述疾病，存在預(yù)后不良的可能性。
以下，將c-kit基因中，針對所述第816位的氨基酸的密碼子中的多態(tài)性稱為“ 816多態(tài)性”。具體而言，也將作為D816的多態(tài)性稱為“D816野生型或gac野生型”，也將作為D816V的多態(tài)性稱為“D816V突變型或gtc突變型”。以下，將c_kit基因中針對所述第822位的氨基酸的密碼子的多態(tài)性稱為“822多態(tài)性”。具體而言，也將作為N822的多態(tài)性稱為“N822野生型或aat野生型”，也將作為N822K的多態(tài)性稱為“N822K突變型、aag突變型或aaa突變型”。
c-kit基因的堿基序列例如在GenBank登錄號NG_007456中登錄為堿基編號4935 87721的序列。序列編號I的喊基序列為所述登錄號的喊基序列中的c_kit基因的部分序列，對應(yīng)于所述登錄號的喊基序列中的喊基編號80054 80293的區(qū)域。
本發(fā)明中，以下，將作為D816野生型的c-kit基因稱為“D816野生型基因”，將作為D816V突變型的c-kit基因也稱為“D816V突變型基因”。以下，也將N822野生型的c_kit基因稱為“N822野生型基因”、N822K突變型的c_kit基因稱為“N822K突變型基因”。
在本發(fā)明中，所述多態(tài)性發(fā)生的位點(diǎn)，即與序列編號I的堿基序列(正義鏈)中堿基編號108和堿基編號127的堿基、或其互補(bǔ)序列(反義鏈)中與所述正義鏈的堿基編號108和堿基編號127對應(yīng)的堿基稱為“檢測對象位點(diǎn)”。將序列編號I的序列(正義鏈)或其互補(bǔ)序列(反義鏈)中，包括所述檢測對象位點(diǎn)在內(nèi)的能夠與所述多態(tài)性檢測用探針雜交的區(qū)域稱為“雜交區(qū)域或檢測對象序列”。也將所述檢測對象位點(diǎn)為野生型的所述檢測對象序列稱為“野生型檢測對象序列”、將所述檢測對象位點(diǎn)為突變型的所述檢測對象序列稱為“突變型檢測對象序列”。將所述檢測對象序列中，與所述多態(tài)性檢測用探針完全匹配的檢測對象序列稱為“完全匹配序列”，與所述多態(tài)性檢測用探針錯(cuò)配的檢測對象序列稱為“錯(cuò)配序列”。本發(fā)明中，完全匹配是指所述檢測對象位點(diǎn)的堿基與所述多態(tài)性檢測用探針中的對應(yīng)堿基互補(bǔ)，優(yōu)選的是指所述檢測對象序列和所述多態(tài)性檢測用探針完全互補(bǔ)。本發(fā)明中，錯(cuò)配是指所述檢測對象位點(diǎn)的堿基與所述多態(tài)性檢測用探針中的對應(yīng)堿基非互補(bǔ)，優(yōu)選的是指除所述檢測對象位點(diǎn)之外，所述檢測對象序列和所述多態(tài)性檢測用探針完全互補(bǔ)。
本發(fā)明中，也將用于檢測所述816多態(tài)性(a/t)的探針稱為“816用探針”，將用于檢測所述822多態(tài)性(t/g，t/a)的探針稱為“822用探針”。也將所述檢測對象序列中，與野生型的檢測對象位點(diǎn)完全匹配的探針稱為“野生型探針”，將與所述突變型的檢測對象位點(diǎn)完全匹配的探針稱為“突變型探針”。
本發(fā)明中，以下將在擴(kuò)增c-kit基因使得到的擴(kuò)增物和本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針雜交的情況下，c-kit基因中的擴(kuò)增區(qū)域稱為“擴(kuò)增對象區(qū)域”。所述擴(kuò)增對象區(qū)域例如可以是c-kit基因的正義鏈中的區(qū)域，也可以是與其相對應(yīng)的反義鏈中的區(qū)域，也可以是兩者。本發(fā)明中，正義鏈和反義鏈例如含有正義鏈的擴(kuò)增物，反義鏈的擴(kuò)增物的意思。
本發(fā)明中，堿基序列的末端是指堿基序列的5 ’側(cè)和3 ’側(cè)的最端部的堿基。5 ’末端區(qū)域是從堿基序列的5’末端起數(shù)個(gè)堿基的區(qū)域，3’末端區(qū)域是從堿基序列的3’末端起 數(shù)個(gè)堿基的區(qū)域。所述數(shù)個(gè)堿基例如從末端起I個(gè)堿基 10個(gè)堿基，I 4個(gè)堿基，I 3個(gè)堿基，I 2個(gè)堿基。本發(fā)明中，從堿基序列的末端起第Z位的堿基(Z為正整數(shù))是指，以末端的堿基為第I位的順序，例如，從末端起第I位的堿基是末端的堿基，從末端起第2位的堿基是末端的相鄰堿基。
<多態(tài)性檢測用探針>
本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針如前所述是c-kit基因的多態(tài)性檢測用探針，其特征在于，含有下述(pi) (P4)和(pr ) (P4’)中至少一種寡核苷酸。
(Pl)寡核苷酸，其由堿基長為4 50堿基長、與含有序列編號I中的堿基編號105 108的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成，在3’末端區(qū)域具有與所述堿基編號105的堿基互補(bǔ)的喊基；
(pr )寡核苷酸，其由與所述(pi)寡核苷酸互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成；
(P2)寡核苷酸，其由堿基長為7 50堿基長、含有序列編號I中的堿基編號102 108的喊基序列構(gòu)成，在5’末端區(qū)域具有所述喊基編號102的喊基；
(P2’ )寡核苷酸，其由與所述(P2)寡核苷酸互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成；
(P3)寡核苷酸，其由堿基長為8 50堿基長、與含有序列編號I中的堿基編號127 134的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成，在5’末端區(qū)域具有與所述堿基編號134的堿基互補(bǔ)的喊基；
(P3’ )寡核苷酸，其由與所述(P3)寡核苷酸互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成；
全文摘要
本發(fā)明提供能夠簡便并且可靠性優(yōu)良地判別c-kit基因的不同多態(tài)性的探針(P1)～(P4)。(P1)寡核苷酸，由4～50堿基長、與含有序列編號1的堿基編號105～108的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成，在3’末端區(qū)域具有與所述堿基編號105的堿基互補(bǔ)的堿基；(P2)寡核苷酸，由7～50堿基長、含有序列編號1的堿基編號102～108的堿基序列構(gòu)成，在5’末端區(qū)域具有所述堿基編號102的堿基；(P3)寡核苷酸，由8～50堿基長、與含有序列編號1的堿基編號127～134的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成，在5’末端區(qū)域具有與所述堿基編號134的堿基互補(bǔ)的堿基；(P4)寡核苷酸，由5～50堿基長、含有序列編號1的堿基編號123～127的堿基序列構(gòu)成，在5’末端區(qū)域具有所述堿基編號123的堿基。
文檔編號C12N15/09GK102712922SQ20108005942
公開日2012年10月3日 申請日期2010年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月24日
發(fā)明者井口亞希, 小森真理子 申請人:愛科來株式會社