專利名稱：毒素-免疫系統(tǒng)的制作方法
毒素-免疫系統(tǒng)交叉申請(qǐng)本申請(qǐng)要求2009年12月16日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)系列No. 61/286, 899的優(yōu)先權(quán)，將其通過引用整體并入本文。
美國政府權(quán)益的聲明此工作部分由NIH資金No. Al080609資助,及美國政府在本發(fā)明中具有特定權(quán)利。背景技術(shù)：
陰性選擇標(biāo)記物和它們?cè)诳寺≥d體及克隆技術(shù)中的應(yīng)用在分子生物學(xué)領(lǐng)域具有大的價(jià)值,特別是可用于任何細(xì)胞類型的此類載體。文獻(xiàn)中的表達(dá)毒性蛋白’或“死亡基因”的多數(shù)基因，僅在原核生物系統(tǒng)中發(fā)揮功能。該基因的例包括rpsL, tetAR, pheS, t'hyA, IacY, gat.a-1, ccdB和sacB。本文公升的本發(fā)明提供在細(xì)菌和真核生物細(xì)胞中有活性的優(yōu)勢(shì)，使得本文公開的全部實(shí)施方式可作為細(xì)胞系統(tǒng)領(lǐng)域的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會(huì)利用的程度利用。抗生素抗性基因是發(fā)酵過程中使用的最常見的可選擇的標(biāo)記物，以避免無質(zhì)粒的細(xì)胞過度生長(zhǎng)培養(yǎng)物。但是抗生素是昂貴的化合物，且它們，或它們的降解產(chǎn)物，可混雜生物質(zhì)或產(chǎn)生產(chǎn)物。這些混雜是自工業(yè),醫(yī)療和調(diào)控角度無法接受的。因而’當(dāng)使用抗生素時(shí)，必需展示，最終產(chǎn)物是“無抗生素的”。殘留的抗生素水平和如果必需它們的去除的評(píng)定也是昂貴的過程。由于這些情況,工業(yè)中的當(dāng)前趨勢(shì)是在生產(chǎn)過程中完全放棄抗生素。生物學(xué)劑經(jīng)歷的增加的調(diào)控需求會(huì)在工業(yè)蛋白表達(dá)和生產(chǎn)領(lǐng)域具有大沖擊。在不遠(yuǎn)的將來，期望對(duì)基于抗生素的選擇和生產(chǎn)系統(tǒng)可為"0耐受性〃。除了抗生素本身之外，抗生素抗性基因是重要考慮?？股?抗性基因的完全缺失是唯一方式確保環(huán)境中無繁殖或抗性轉(zhuǎn)移到病原性株。發(fā)明概述在第I方面，本發(fā)明提供重組載體，其包含編碼VI型分泌輸出蛋白2(Tse2)的第I基因,其中第I基因可操作地連接于異源調(diào)控序列。在第2方面,本發(fā)明提供重組宿主細(xì)胞,其包含根據(jù)本發(fā)明的任何實(shí)施方式的重組載體。在第3方面，本發(fā)明提供用于可選擇性克隆的方法，包括在適合于Tse2由重組載體的表達(dá)或破壞的表達(dá)的條件下(如果無插入子存在)培養(yǎng)本發(fā)明的任何實(shí)施方式的重組宿主細(xì)胞，并選擇那些由于包含具有克隆進(jìn)表達(dá)載體的插入子的重組載體而生長(zhǎng)的細(xì)胞。在第4方面,本發(fā)明提供產(chǎn)生缺乏插入子的克隆載體的方法,其包括在適合于載體復(fù)制和Tse2表達(dá)的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的任何實(shí)施方式的重組宿主細(xì)胞,其中宿主細(xì)胞還表達(dá)Tse2解毒劑,并從宿主細(xì)胞分離載體。在進(jìn)一步實(shí)施方式中，解毒劑包含VI:型分泌免疫蛋白2(Tsi2)。在第5方面，本發(fā)明提供重組載體，其包含編碼Tsi2的核酸，其中核酸可操作地連接于調(diào)控序列。
在第6方面,本發(fā)明提供重組宿主細(xì)胞,其包含本發(fā)明的第5方面的任何實(shí)施方式或?qū)嵤┓绞降慕M合的重組載體。在第7方面，本發(fā)明提供宿主細(xì)胞,其在它們的基因組中包含可操作地連接于調(diào)控序列的編碼VI型分泌輸出蛋白2(TSe2)的第I重組基因。在一實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞還包含編碼Tse2的解毒劑的第2重組基因,其中第2基因可操作地連接于調(diào)控序列。在一實(shí)施方式中，編碼解毒劑的第2重組基因可,諸如在質(zhì)?；虿《局袨楦郊有汀Ｔ谶M(jìn)一步實(shí)施方式中，解毒劑包含VI型分泌免疫蛋白2(Tsi2)。在第8方面,本發(fā)明涉及試劑盒，其包含被區(qū)劃以在其中接收及保持至少一個(gè)容器的載體或容具，其中第I容器含有線性或環(huán)狀DNA分子,其包含具有至少一個(gè)Tse2基因序列的DNA片段的載體，如本文所述。在另一實(shí)施方式中，試劑盒中含有的載體具有至少一個(gè)Tsi2基因序列的DNA片段,如本文所述。在另一實(shí)施方式中，試劑盒含有一種或更多具有至少一個(gè)Tse2序列的DNA片段的載體和具有至少一個(gè)Tsi2序列的DNA片段的載體。


圖I.鑒定H1-T6SS底物的基于MS的篩選的概觀和結(jié)果。(A)銅綠假單胞菌(P. aeruginosa) HS]-1的基因組織。此工作中操作的基因以彩色顯示。T6SS的活性可通過PPPA和clpVl的缺失來調(diào)節(jié)。自特定的遺傳背景的銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)株的細(xì)胞-關(guān)聯(lián)的(細(xì)胞)及濃縮的上清(Sup)蛋白級(jí)分中Hcpl-V的蛋白印跡分析。親本株的遺傳背景在以下以印跡顯示。將針對(duì)RNA聚合酶a (a-RNAP)的抗體在此和隨后印跡中用作裝載對(duì)照。(C)pppA的缺失導(dǎo)致增加的p-Fhal-V水平。通過蛋白印跡觀察p-Fhal-V為一種或更多具有延緩的電泳運(yùn)動(dòng)性的物質(zhì)。(D) A pppA和A clpVl的比較性半-定量分泌蛋白質(zhì)組分析的Rl和R2中檢測(cè)的Cl蛋白的光譜計(jì)數(shù)比。指示以兩個(gè)重復(fù)的Hcpl的位置。虛線之內(nèi)的蛋白具有< 2倍的SC比及構(gòu)成89%的Cl蛋白。圖2. 2種VgrG-家族蛋白由retS調(diào)控及以HI-T6SS-依賴性方式分泌。(A)編碼Rl和R2中鑒定的C2蛋白的遺傳座位的概觀(綠色)。提供由Goodman等人測(cè)定的各ORF的RetS調(diào)節(jié)(Goodman et al. ,2004)。不被RetS顯著調(diào)控的基因填充灰色。(B和C)展示VgrGl-V(B)和VgrG4-V(C)的分泌的蛋白印跡分析在ApppA背景中引發(fā)且是HI-T6SS (clpVl)-依賴性的。全部印跡針對(duì)VSV^G表位(a -VSV-G)。圖3. Tse蛋白是緊密調(diào)控的H1-T6SS底物。(A) Tse分泌在被pppA的緊密負(fù)調(diào)節(jié)下且是H1-T6SS-依賴性的。用來自pPSV35的C-端VSV-G表位標(biāo)記融合表達(dá)的Tse蛋白的蛋白印跡分析(Rietsch et al.，2005)。除非另外注明，此圖中的全部印跡是a -VSV-G0(B)通過蛋白印跡分析測(cè)量的染色體-編碼的Tsel-V的HI-T6SS-依賴性分泌。(C) Hcpl分泌獨(dú)立于tse基因。對(duì)照株或缺少VgrGl和vgrG4,或3種tse基因的株中Hcpl定位的蛋白印跡分析。(D)形成關(guān)鍵H1-T6S設(shè)備復(fù)合物不需要tse基因。特定的遺傳背景中染色體-編碼的ClpVl-GFP定位通過熒光顯微鏡檢測(cè)量。TMA-DPH是用來可視化細(xì)胞位置的親脂性染料。(E) Tse蛋白的產(chǎn)生和分泌在A retS中顯著增加。來自含有在野生型或A retS背景中制備的染色體-編碼的Tse-VSV-G表位標(biāo)記融合體的株的Tse水平的蛋白印跡分析。注在用來觀察AretS中高水平的Tse分泌的條件F，分泌不可在ApppA中可視化，如在⑶中展示。
圖4. Tse2和Tsi2蛋白是毒素-免疫模塊。(A)在Tsi2缺失下,Tse2對(duì)銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)是毒性的。在非-誘導(dǎo)(-IPTG)或誘導(dǎo)(+IPTG)條件下，含有載體對(duì)照㈠或含有tse2的載體⑴的指示的銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)株的生長(zhǎng)。(B)Tse2和Tsi2物理學(xué)關(guān)聯(lián)。自含有表達(dá)tsi2 (對(duì)照)或tsi2-V的質(zhì)粒的指示的株a -VSV-G免疫沉淀之前(前)及之后(后)樣品的蛋白印跡分析。糖原合酶激酶(GSK)標(biāo)簽用于檢測(cè)Tse2 (Garcia et al. ,2006)。圖5.異源性地表達(dá)的Tse2對(duì)原核生物和真核生物細(xì)胞有毒性。(A)Tse2對(duì)釀酒酵母(S. cerevisiae)有毒性。在非-誘導(dǎo)(葡萄糖)或誘導(dǎo)(半乳糖)條件下，含有載體對(duì)照或表達(dá)指示的tse的載體的釀酒酵母(S. cerevisiae)細(xì)胞的生長(zhǎng)。(B)Tsi2阻斷釀酒酵母(S. cerevisiae)中Tse2的毒性。帶有具有指示的基因的質(zhì)粒,或空質(zhì)粒的釀酒酵母(S. cerevisiae),在非-誘導(dǎo)或誘導(dǎo)條件下生長(zhǎng)。(C，D和E)轉(zhuǎn)染的Tse2對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有顯著的效應(yīng)。流式細(xì)胞術(shù)(C)和熒光顯微鏡檢(D)用表達(dá)tse基因或tsi2的質(zhì)粒的GFP報(bào)告子共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的分析。測(cè)定指示的轉(zhuǎn)染后圓形細(xì)胞的百分率(E) (n > 500)。對(duì)照(ctrl)實(shí)驗(yàn)含有僅報(bào)告子質(zhì)粒。條形圖代表自至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均數(shù)(±SEM) 0 (F和G) tse2的表達(dá)抑制大腸埃希氏菌(E. coli) (F)和泰國伯克霍爾德氏菌(B. thailandensis) (G)的生長(zhǎng)。將大腸埃希氏菌(E. coli) (F)和泰國伯克霍爾德氏菌(B. thailandensis) (G)用通過分別用IPTG(F)或鼠李糖(G)的誘導(dǎo)性表達(dá)調(diào)控的,不含有插入子，tse2或者tse2和tsi2座位的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。在溫育I(F)或2 (G)天之后,對(duì)在固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)成像。圖6.對(duì)Tse2的免疫提供針對(duì)由H1-T6SS分泌毒素的銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)株的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。(A)由銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)的HI-T6SS分泌的Tse2不在HeLa細(xì)胞中促進(jìn)細(xì)胞毒性。用指示的銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)株或大腸埃希氏菌(E. coli)感染后由HeLa細(xì)胞的LDH釋放。分別作為高度細(xì)胞毒性和非-細(xì)胞毒性對(duì)照包括銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)株P(guān)A14和大腸埃希氏菌(E. coli)。條代表5次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值土 SEM。(B和C)在液體培養(yǎng)基(B)中或固體支持物(B和C)上指示的基因型的銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)株之間的體外生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。親本株是AretS。A clpVl和A tsi2-依賴性效應(yīng)互補(bǔ),如分別通過+clpVl及+tsi2指示(見方法)。條代表自3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均供體受體CFU比(土 SEM)。發(fā)明詳述本文引用的全部參考文獻(xiàn)通過引用整體并入本文。在本申請(qǐng)中，除非另外陳述，利用的技術(shù)可見于任何幾種熟知的參考文獻(xiàn)，諸如Molecular Cloning A LaboratoryManual (Sambrook, et al. , 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), GeneExpression Technology (Methods in Enzymology. Vol. 185, edited by D.Goeddel,1991. Academic Press, San Diego, CA),“Guide to Protein Purification，，in Methodsin Enzymology(M. P. Deutshcer, ed. , (1990)Academic Press, Inc.) ；PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis, et al. 1990. Academic Press, SanDiego, CA)， Culture of Animal Cells A Manual of Basic Technique,2nd Ed. (R.I. Freshnev. 1987. Liss, Inc. New York, NY), Gene Transfer and Expression Protocols,PP. 109-128, ed. E. .J. Murray, The Humana Press Inc.，Clifton, N. .J.)，和 Ambion 1998Catalog(Ambion, Austin, TX) 0
如本文所用，單數(shù)形式"a" , " an"和"the"包括復(fù)數(shù)個(gè)指示物,除非情景明顯另外指示。本文所用的“和”與“或”互換使用，除非另外明確陳述。本發(fā)明的任何方面的全部實(shí)施方式可組合使用，除非情景明顯另外指示。在第I方面,本發(fā)明提供重組載體，其包含編碼VI型分泌輸出蛋白2(Tse2)的第I基因，其中第I基因可操作地連接于異源調(diào)控序列。如下列例所述,細(xì)胞內(nèi)Tse2對(duì)廣范圍的原核生物和真核生物細(xì)胞有毒性。由此，Tse2可,例如，在原核生物和真核生物中陰性選擇克隆中使用。Tse2也可在使用抗生素的選擇不適合于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)使用。此系統(tǒng)的使用可避免痕量抗生素在系統(tǒng)中殘留。如本文所用基因”是任何能表達(dá)敘述的蛋白的核酸，由此包括基因組DNA,mRNA,cDNA,等。 如本文所用，“載體”可為環(huán)狀載體，諸如\載體，或線性化的載體，諸如線性化的質(zhì)粒或病毒載體。本發(fā)明也涉及載體,其包含一種或更多本發(fā)明中使用的和/或在本發(fā)明的方法中使用的核酸分子。根據(jù)本發(fā)明，任何載體可用于構(gòu)建本發(fā)明的載體。尤其是，本領(lǐng)域中知道的載體和可商購的那些(及其變體或衍生物)可根據(jù)本發(fā)明加工為包括編碼一個(gè)或更多重組位點(diǎn)的一種或更多核酸分子(或其部分)，或其突變體,片段或衍生物,用于在本發(fā)明的方法中使用。該載體可從，例如，Vector Laboratories Inc. ；Promega ；Novagen ；New England Biolabs ；Clontech ；Roche ；Pharmacia ；EpiCenter ；OriGenes TechnologiesInc. ；Stratagene ；Perkin Elmer ;Pharmingen ;and Invitrogen Corp. , Carlsbad，Calif得到。該載體可然后例如用于克隆或亞克隆目的核酸分子。特定目的載體的一般類包括原核生物和/或真核生物克隆載體,表達(dá)載體,融合載體,2-雜交體或逆轉(zhuǎn)2-雜交體載體,用于不同宿主的穿梭載體，誘變載體，轉(zhuǎn)錄載體等。其他目的載體包括病毒來源載體(Ml3載體,細(xì)菌噬菌體.\ 載體,噬菌體Pl載體,腺病毒載體,皰疹病毒載體,反轉(zhuǎn)錄病毒載體,噬菌體展示載體,組合庫載體)，高、低和可調(diào)整的拷貝數(shù)載體，具有用于在單宿主中組合使用的相容的復(fù)制子的載體(PACYC184和PBR322)和真核生物附加型復(fù)制載體(pCDM8)。特定目的載體包括原核生物表達(dá)載體,諸如pcDNA II，pSL301, pSE280, pSE380，pSE420,pTrcHisA,B和 C,pRSET A,B和 C(Invitrogen Corp. , Carlsbad,Calif.),pGEMEX-1和 pGEMEX-2(Promega, Inc.), pET 載體(Novagen, Inc.) pTrc99A, pKK223_3, pGEX 載體，pEZZ18, pRIT2T 和 pMC1871(Pharmacia, Inc.), pKK233_2 和 pKK388_l(Clontech,Inc.)和 pProEx-HT(Invitrogen Corp. , Carlsbad, Calif.)和其變體和衍生物。目標(biāo)載體也可由真核生物表達(dá)載體制得，諸如pFastBac, pFastBac HT, pFastBac雙，pSFV 和 pTet-Splice (Invitrogen Corp., Carlsbad, Calif.) pEUK-Cl, pPUR, pMAM,pMAMneo, pBIlOl, pBI121, pDR2, pCMVEBNA 和 pYACneo(Clontech), pSVK3, pSVL, pMSG,pCHllO 和 pKK232-8(Pharmacia, Inc.)，p3 ' SS, pXTl, pSG5, pPbac，pMbac, pMClneo 和p()G44(Stratagene,Inc.)和 pYES2, pAC360,pBlueBacHis A,B 和 C, pVLl392,pBsueBac111,pCDM8, pcDNAI, pZeoSV, pcDNA3pREP4, pCEP4 和 pEBVHis(Invitrogen Corp. Carlsbad,Calif.)和其變體或衍生物。其他特定目的載體包括pUC18，pUC19, pBlueScript, pSPORT,粘粒，噬菌粒，YAC(酵母人工染色體),BAC(細(xì)菌人工染色體),MAC(哺乳動(dòng)物人工染色體)，pQE70,pQE60, pQE9 (Quiagen), pBS 載體，PhageScript 載體，BlueScript 載體，pNH8A, pNH16A,pNHlSA, pNH46A(Stratagene)，pcDNA3(Invitrogen, Carlsbad, Calif.), pGEX, pTrsfus,pTrc99A, pET-5, pET-9，pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pR I: T 5 (Pharmacia), pSPORT I,PSP0RT2, pCMVSP0RT2. 0 和 pSV-SPORTl (Invitrogen Corp. , Carlsbad, Calif.)和其變體或衍生物。額外的目的載體包括pTrxFus, pThioHis, pLEX, pTrcIiis, pTrcHis2, pRSET,pB!ueBacHis2, pc!)NA3. I/His, pcDNAS. I (-)/Myc-Hi s, pSecTag, pEBVHi s, pPIC9K,pPIC3. 5K, pA0815, pPICZ, pGAPZ, pBlueBac4.5, pBlueBacHis2, pMelBac, pSinRepS,pSinHis, pIND, pIND(SPl)，pVgRXR, pcDNA2. I。pYES2, pZErOl. I, pZErO-2. 1，pCR-Blunt,pSE280, pSE380, pSE420, pVL1392, pVL1393, pCDM8，pcDNAl. 1，pcDNAl. I/Amp, pcDNA3. 1，pcDNAS. 1/Zeo, pSe, SV2, pRc/CMV2, pRc/RSV, pREP4, pREP7, pREP8, pREP9, pREPlO, pCEP4,pEBVHis, pCR3. I, pCR2. I, pCR3. I-Uni 和 pCRBac, 自 Invitrogen ；.入 gtll, pTrc99A,pKK223-3, pGEX-2T, pGEX_2TK, pGEX_4T_l， pGEX-4T_2, pGEX-4T_3, pGEX_3X, pGEX_5X_l， pGEX-5X-2, pGEX-5X-3, pEZZ18, pRIT2T, pMC1871, pSVK3, pSVL, pMSG, pCHllO, pKK232-8,PSL1180, pNEO 和 pUC4K,自 Pharmacia ;pSCREEN-Ib(+), pT7Blue(R), pT7Blue-2,pCITE-4-abc (+), pOCUS-2, pTAg, pET_32LIC, pET_30LIC, pBAC-2 cp LIC, pBACgus-2 cpLIC, pT7Blue_2 LIC, pT7Blue_2, pET_3abcd, pET_7abc, pET9abcd, pETllabcd, pET12abc,pET-14b, pET-15b, pET-16b, pET-17b-pET-17xb， pET-19b， pET-20b(+), pET-21abcd(+),pET-22b (+), pET-23abcd(+), pET-24abcd (+), pET-25b(+), pET-26b(+), pET-27b (+),pET_28abc(+), pET_29abc(+), pET_30abc(+), pET_31b(+), pET_32abc(+), pET_33b(+)，pBAC-I, pBACgus-1, pBAC4x_l, pBACgus4x_l, pBAC_3cp, pBACgus_2cp, pBACsurf-1, pig,Signal pig, pYX, Selecta Vecta-Neo, Selecta Vecta-Hyg 和 Selecta Vecta-Gpt，自Novagen ；pLexA, pB42AD, pG13T9, pAS2-1, pGAD424, pACT2, pGAD GL, pGAD GH, pGADIO,pGilda, pEZM3, pEGFP, pEGFP-1, pEGFP-N, pEGFP-C, pEBFP, pGFPuv, pGFP, p6xHis_GFP,pSEAP2-Basic, pSEAP2-Contral, pSEAP2_ 啟動(dòng)子，pSEAP2_ 增強(qiáng)子，p. P . gal-Basic,p. 0 . gal-對(duì)照，p. J3 . gal-啟動(dòng)子，p. fgal-增強(qiáng)子，pTet-Off, pTet-On, pTK-Hyg，pRetro-Off, pRetro-On, pi RESIneo, piRESIhyg, pLXSK, pLNCX, pLAPSN, pMAMneo,pMAMneo-CAT, pMAMneo-LUC, pPUR, pSV2neo, pYEX 4T-1/2/3, pYEX-Sl, pBacPAK-His,pBacPAK8/9, pAcUW31, BacPAK6, pTriplEx, 入 gtlO, 入 gtll 和 pffE15,自 Clontech ；入 ZAP II, pBK-CMV，pBK-RSV，pBluescript II KS+/-，pBluescript II SK+/-, pAD-GAL4,pBD-GAL4Cam, pSurfscript,入 FIX II,入 DASH,入 EMBL3, A EMBL4, SuperCos, pCR-ScrigtAmp, pCR-Script Cam, pCR-Script Direct, pBS+/_，pBCKS+/-, pBC SK+/-> Phagescript,pCAL-n-EK, pCAL-n, pCAL-c, pCAL-kc,pET_3abcd, pET-1labcd, pSPUTK, pESP-1,pCMVLacI,pOPRSVI/MCS, pOPI3CAT, pXTl, pSG5, pPbac, pMbac，pMClneo, pMClneo 聚 A, pOG44, p0045,pFRT. ^ GAL, pNEO. P . GAL, pRS403, pRS404, pRS405, pRS406, pRS413, pRS414, pRS415 和pRS416,自 Stratagene。特定目的2-雜交體及逆轉(zhuǎn)2-雜交體載體包括pPC86, pDBLeu, pDBTrp, pPC97,p2. 5, pGADl-3，pGADIO，pACt, pACT2, pGADGL, pGADGH, pAS2-1，pGAD424, pGBT8, pGBT9，PGAD-GAL4, pLexA, pBD_GAL4, pHISi, pHISi-1, placZi, pB42AD, pDG202, pJK202, pJG4_5,pNLexA, pYESTrp和其變體或衍生物。特定目的酵母表達(dá)載體包括pESP-1, pESP-2, pESC-His，pESC-Trp, pESC-URA,pESC-Leu(Stratagene), pRS401, pRS402, pRS411, pRS412, pRS421, pRS422 和其變體或衍生物。根據(jù)本發(fā)明的此方面的載體包括，但未限于pENTRlA, pENTR2B，pENTR3C, pENTR4,pENTR5, pENTR6, pENTR7, pENTR8, pENTR9, pENTRlO, pENTRll，pDESTl, pDEST2, pDEST’3,p:[)EST4, pDESTS, pDEST6, pDEST7, pDESTS, pDEST9, pDESTIO, pDESTll, pl)EST12. 2 (也稱之為 pDEST12)，pDEST13, pDEST14, pDEST15, pDEST16, pDEST17, pDEST18, pDEST19, pDEST20,PDEST21, pDEST22, pDEST23, pDEST24, pDEST25, pDEST26, pDEST27, pEXP501(也稱之為PCMVSP0RT6. 0)，pD0NR201，pD0NR202, pD0NR203，pD0NR204,pD0NR205,pD0NR206,pD0NR212,PD0NR212 (F)(圖 28A 28C)，p!)0NR212 (R)(圖 29A 29C), pMAB58, pMAB62, p!)EST28,PDEST29, pDEST30, pDEST31, pDEST32, pDEST33, pDEST34, pD0NR207, pMAB85, pMAB86,其中許多描述于PCT公開WO 00/52027(其整個(gè)公開通過引用并入本文)，及各這些載體的片段， 突變體，變體和衍生物。但是，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會(huì)明白，本發(fā)明也包括本文不特別指定的其他載體,其包含一種或更多本發(fā)明中使用的編碼一個(gè)或更多重組位點(diǎn)的分離的核酸分子或其部分(或其突變體，片段，變體或衍生物),且其可還包含一種或更多額外的本文所述的物理或功能核苷酸序列，其可任選地可操作地連接于一種或更多編碼一個(gè)或更多重組位點(diǎn)的核酸分子或其部分。該額外的載體可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本說明書中提供的教導(dǎo)產(chǎn)生。如本文所用,術(shù)語“細(xì)胞”是指稱原核生物或真核生物細(xì)胞,除非另外指定。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，第I基因包含編碼根據(jù)SEQ ID NO :2的銅綠假單胞菌(P. aeruginosa) Tse2氨基酸序列的核苷酸序列,或由其組成。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，第I基因包含根據(jù)SEQ ID NO 1的核苷酸序列,或由其組成。緊密相關(guān)的Tse2基因和Tse2蛋白存在于其他銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)株，具有SEQ ID NO :3 4中標(biāo)注的可變的位置。由此，在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，第I基因包含能編碼SEQ ID NO :4的氨基酸序列的核苷酸序列，或由其組成。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，第I基因包含根據(jù)SEQ ID NO 8的核苷酸序列,或由其組成。如本文所用，“Tse2”包括其功能相當(dāng)體(截短,突變體,等),其中該相當(dāng)體維持本文所述的細(xì)胞毒性活性。鑒定該功能相當(dāng)體的方法在本文公開及公開了各種該功能相當(dāng)體。例如，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，Tse2的殘基1-6和156-158對(duì)于毒性不是需要的(見下表I)。由此,在另一實(shí)施方式中,第I基因包含能編碼下列氨基酸序列的核苷酸序列SEQ ID NO 5或SEQ ID NO: 6,或由其組成。發(fā)明人還鑒定了保留毒性的一系列Tse2突變多肽。特別是，發(fā)明人顯示(見下),在保留毒性的前提下，在 SEQ ID NO 2 的第 9,10,60,119,129，130，139，140，149 和 150 位的突變是可容忍的(見下表2)。由此,在另一實(shí)施方式中，第I基因編碼通過在氨基酸殘基9,10,60,119,129,130,139,140,149和150的一個(gè)或更多的氨基酸取代,及殘基1_6的一個(gè)或更多及殘基156-158的一個(gè)或更多任選地刪除而與SEQ ID NO 2的氨基酸序列不同的突變Tse2多肽。在另一實(shí)施方式中,第I基因編碼包括一個(gè)或更多選自下列的氨基酸取代的突變 Tse2 多肽:S9A。L10A, R60A, Q119A, K129A, P129A, Q139A, L139A, R149A 和 R150Ao在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，第I基因包含能編碼下列氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IDNO :7或SEQ ID NO :8，或由其組成。調(diào)控序列是“異源”，是指其不是天然存在的Tse2調(diào)控區(qū)。如本文所用，“調(diào)控序列”是在可操作地連接的調(diào)控核酸,及含有^-個(gè)或更多用于調(diào)控下列活性(i) (iii)的"控制元件"的基因表達(dá)期間，調(diào)控或影響(i)轉(zhuǎn)錄，(ii)翻譯和/或(iii)翻譯后修飾的任何核酸序列。術(shù)語調(diào)控核酸的"控制元件"為本領(lǐng)域熟知(見，例如，Goeddel,Gene Expression Technology,Methods in E^nzymology 185,Academic Press,San Diego,Calif. ,1990)且包括,例如,轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子,轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件,轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，多聚腺苷酸化序列(位于翻譯終止密碼子的3’)，優(yōu)化翻譯起始的序列(位于編碼序列的5’)，翻譯終止序列，指導(dǎo)翻譯后修飾的序列(例如，糖基化位點(diǎn))，全部這些可用于調(diào)控可操作地連接于調(diào)控序列的基因的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)同意，調(diào)控核酸的控制元件的選擇會(huì)依賴于如下因素待轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇，蛋白期望的表達(dá)水平,等。
術(shù)語〃啟動(dòng)子"包括足以在宿主細(xì)胞中直接轉(zhuǎn)錄的任何核酸序列,包括誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，阻遏型啟動(dòng)子和組成型啟動(dòng)子。例示啟動(dòng)子包括細(xì)菌，病毒，藻類，哺乳動(dòng)物和酵母啟動(dòng)子,如本領(lǐng)域熟知。許多該啟動(dòng)子，包括誘導(dǎo)型啟動(dòng)子,可從下列供應(yīng)商商購,包括LifeTechnologies, System Biosciences 和 Promega Biosciences。在大腸埃希氏菌(E. coli)中表達(dá)的例示啟動(dòng)子包括，但未限于lac, tip, ptrc及17啟動(dòng)子。對(duì)于在真核生物細(xì)胞中表達(dá)蛋白有用的例示啟動(dòng)子包括但未限于桿狀病毒多角體蛋白，SP6,金屬硫蛋白I,苜蓿丫蚊夜蛾(Autographa californica)核多汗病毒,塞姆利基森林病毒，Tet., CMV, Gall, GallO和17啟動(dòng)子。在一實(shí)施方式中,Tse2基因可操作地連接于足以致使啟動(dòng)子_依賴性可控制的基因表達(dá)(例如,通過外部信號(hào)或劑(添加到/自重組體細(xì)胞的生長(zhǎng)培養(yǎng)基移出化合物)，或通過改變培養(yǎng)條件(溫度,pH,等)的誘導(dǎo)性或阻遏性)的啟動(dòng)子元件。例示可控制的啟動(dòng)子是醇-調(diào)控的，四環(huán)素-調(diào)控的，甾-調(diào)控的,金屬-調(diào)控的,病原體-調(diào)控的,光-調(diào)控的或溫度-調(diào)控的那些。對(duì)于用于細(xì)菌系統(tǒng)，知道許多可控制的啟動(dòng)子(Old and Primrose,1994)。常見的例包括Plae(IPTG) ,Ptae(IPTG), A Pe (Cl阻遏物的損失)，入Pl(Cl阻遏物的損失)，Ptrc(IPTG), Ptrp(IAA)0控制劑在各啟動(dòng)子之后顯示于括弧中?？煽刂频闹参飭?dòng)子的例包括根-特異性ANRI啟動(dòng)子(Zhang and Forde (1998) Science 279 :407)和光合成器官-特異性RBCS啟動(dòng)子(Khoudi et al. (1997) Gene 197 :343)。其他例示可控制的啟動(dòng)子包括 Tet-系統(tǒng)(Gossen and Bujard, PNAS USA 89 :5547-5551，1992),蛻皮素系統(tǒng)(No 等人，PNAS USA 93 :3346-3351,1.996),孕酮-系統(tǒng)(Wang et al. , Nat. Biotech 15:239-243,1997),及雷帕霉素-系統(tǒng)(Ye et al. , Science 283 :88-91,1999),阿糖-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，及鼠李糖-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。表達(dá)載體和它們的加工及分離方法為本領(lǐng)域熟知(見，例如，Maniatis等人，見上)或它們可通過供應(yīng)商獲得，例如，Invitrogen.(Carlsbad, Calif.),Promega(Madison, ffis.)和 Statagene (La Jolla, Calif.)及根據(jù)需要修飾?？缮藤彽谋磉_(dá)載體的例包括 pcDNA3 (Invitrogen), Gateway 克隆技術(shù)(Life Technologies),及pCMV-Script (Stratagene)。載體組分,調(diào)控核酸，等是一般自商業(yè)來源可利用的,或可從天然的來源(例如，動(dòng)物組織或微生物)分離或使用合成手段諸如PCR制備。組分的設(shè)置可為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員實(shí)際上期望的任何設(shè)置。本發(fā)明中使用的載體可源于產(chǎn)生作為染色體外元件可或不可獨(dú)立地復(fù)制的病毒粒子或病毒-樣粒子的病毒基因組。病毒粒子可通過感染導(dǎo)入宿主細(xì)胞。病毒載體可整合進(jìn)細(xì)胞基因組。用于轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞的病毒載體的例是SV40載體,及基于下列病毒的載體乳頭瘤病毒,腺病毒,愛潑斯坦-巴爾病毒,痘苗病毒，及反轉(zhuǎn)錄病毒，諸如Rous肉瘤病毒,或小鼠白血病病毒,諸如莫洛尼鼠白血病病毒。對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，可使用電穿孔或病毒-介導(dǎo)的導(dǎo)入。在一實(shí)施方式中，載體包含一個(gè)或更多獨(dú)特 限制酶識(shí)別位點(diǎn),其中核酸插入子克隆進(jìn)一個(gè)或更多獨(dú)特限制酶識(shí)別位點(diǎn)破壞Tse2的表達(dá)。此實(shí)施方式的載體可用作克隆媒質(zhì)，由于插入子克隆進(jìn)載體中的一個(gè)或更多限制性位點(diǎn)間斷Tse2表達(dá)及提供容易可選擇的標(biāo)記物-具有不含有插入子的載體的細(xì)胞,它們的生長(zhǎng)被Tse2表達(dá)抑制(只要它們不內(nèi)源性地表達(dá)針對(duì)Tse2的解毒劑)，而具有插入子的那些則不。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)而將一個(gè)或更多獨(dú)特限制性位點(diǎn)加工為Tse2的編碼區(qū)，使得插入子克隆進(jìn)限制性位點(diǎn)破壞Tse2的編碼區(qū)。在此實(shí)施方式中，限制性位點(diǎn)可加工為編碼區(qū)以導(dǎo)致沉默核苷酸變化，或可導(dǎo)致Tse2的氨基酸序列中一個(gè)或更多變化，只要編碼的Tse2蛋白保留細(xì)胞毒性活性。或者，一個(gè)或更多獨(dú)特限制性位點(diǎn)可位于調(diào)控區(qū)使得插入子的克隆會(huì)破壞Tse2自載體的表達(dá)。核酸序列的設(shè)計(jì)及合成和包含該序列的載體的制備在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技能水平之內(nèi)。本發(fā)明涉及新克隆和/或測(cè)序載體,其包括至少I個(gè)啟動(dòng)子核苷酸序列和編碼作為毒有活性的融合蛋白(Tse2)的至少I個(gè)核苷酸序列，所述核苷酸序列由編碼包括多個(gè)獨(dú)特克隆位點(diǎn)(MCS)的核苷酸序列和編碼Tse2的核苷酸序列的融合基因獲得。利用原核生物死亡基因ccdB的類似系統(tǒng)已描述于美國專利No. 7，176，029，及通過引用整體并入本文。用于與Tse 2融合的例不融合蛋白偶體包含，但未限于，IacZ a , GFP, RFP, His和FLAG。在一非限制性實(shí)施方式中，克隆載體含有與LacZ a的C-端或N-端融合的Tse2基因。Tse2_LacZ融合蛋白的表達(dá)受誘導(dǎo)型啟動(dòng)子,諸如Iac啟動(dòng)子控制,使得Tse2_LacZ融合蛋白的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在特定實(shí)施方式中，MCS含在LacZ基因之內(nèi)，使得DNA片段的插入破壞IacZ a -Tse2基因融合體的表達(dá)，允許僅陽性重組體生長(zhǎng)。含有非重組載體的細(xì)胞不生存。根據(jù)此實(shí)施方式的質(zhì)粒允許待克隆的雙消化的限制片段以相對(duì)Iac啟動(dòng)子的兩個(gè)方向取向。限制片段插入獨(dú)特克隆位點(diǎn)之一間斷基因融合體的遺傳信息，導(dǎo)致不具有功能的基因融合產(chǎn)物的合成。當(dāng)導(dǎo)入終止密碼子或當(dāng)在閱讀框內(nèi)制造變化時(shí)，基因融合的插入滅活應(yīng)總是發(fā)生。包含重組載體(破壞的Tse2)的細(xì)胞會(huì)是有活力的,而包含完整載體(完整Tse2)的細(xì)胞不會(huì)是有活力的。此陰性選擇,通過在固體培養(yǎng)基上簡(jiǎn)單培養(yǎng),使其可能消除包含非-重組載體的細(xì)胞(非-有活力的克隆)，及選擇重組體克隆(有活力的克隆)。在另一實(shí)施方式中，重組載體包含一個(gè)或更多側(cè)接Tse2基因的重組位點(diǎn)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，重組載體包含至少第I和第2重組位點(diǎn),它們側(cè)接可操作地連接于調(diào)控序列的編碼Tse2的第I基因,其中所述第I和第2重組位點(diǎn)不彼此重組。如本文所用，“重組位點(diǎn)”是在整合或重組的初始階段期間被定點(diǎn)重組蛋白認(rèn)識(shí)及結(jié)合的DNA的離散部分或段。例如,Cre重組酶的重組位點(diǎn)是IoxP,包含側(cè)接8bp核心序列的2個(gè)13bp倒置的重復(fù)子(作為重組酶結(jié)合位點(diǎn))的 34bp 序列。見 Sauer , B. , Curr. Opin. Biotech. 5 :521-527 (1994)。其他識(shí)別序列的例包括被重組蛋白\識(shí)別的at tB, attP，attL和attR序列。attB是含有2個(gè)9bp核心-型Int結(jié)合位點(diǎn)和7bp重疊區(qū)的約25bp序列，而attP是含有核心-型Int結(jié)合位點(diǎn)和臂-型Int結(jié)合位點(diǎn)以及用于輔助蛋白整合宿主因子(IHF) ,FIS和切除酶(Xis)的位點(diǎn)的約 240bp 序列。見 Landy , Curr. Opin. Biotech. 3 :699707 (1993)。識(shí)別序列的進(jìn)一步例包括IoxP位點(diǎn)突變體，變體或衍生物諸如loxP511(見美國專利No. 5, 851, 808) ；dif位點(diǎn)；dif位點(diǎn)突變體,變體或衍生物；psi位點(diǎn)；psi位點(diǎn)突變體,變體或衍生物；cer位點(diǎn)；及cer位點(diǎn)突變體,變體或衍生物。也見，例如，US20100267128和W 01/11058,通過引用整體并入本文。提供用于在本發(fā)明中使用的重組位點(diǎn)和重組蛋白的其他系統(tǒng)包括自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的 FLP/FRT 系統(tǒng)，解離酶家族(例如，RuvC, yi, TndX,TnpX, Tn3解離酶，Hin, Hjc, Gin, SpCCEl, ParA和Cin),及IS231和其他蘇云金芽孢桿菌(BaciIIus thuringiensis)可轉(zhuǎn)座的元件。用于在本發(fā)明中使用的其他適合的重組系統(tǒng)包括在大腸埃希氏菌(Escherichia coli)中的XerC和XerD重組酶及psi, dif及cer重組位點(diǎn)。其他適合的重組位點(diǎn)可見于美國專利No. 5, 851，808，其特別通過引用并入本文。 此實(shí)施方式可用于重組克隆，例如使用Gateway CI oning系統(tǒng)，其描述于公開的美國專利申請(qǐng)NO.US20100267128,及1998年10月23日提交的美國申請(qǐng)序列號(hào)No. 09/177，387 ;2000年3月2日提交的美國申請(qǐng)序列號(hào)No. 09/517，466 ;及美國專利No. 5, 888, 732和6，143，557,將它們?nèi)刻貏e通過引用并入本文。簡(jiǎn)言之，Gateway Cloning系統(tǒng)利用含有至少I個(gè)重組位點(diǎn)的載體，以體內(nèi)或體外克隆期望的核酸分子。在--實(shí)施方式中，系統(tǒng)利用含有自野生型(attO)位點(diǎn)突變而來的基于噬菌體A系統(tǒng)的至少2個(gè)不同定點(diǎn)重組位點(diǎn)(例如，attl和att2)的載體。各突變的位點(diǎn)對(duì)于相同的類型的其同源偶體att位點(diǎn)(即，其結(jié)合偶體重組位點(diǎn))具有獨(dú)特特異性(例如attBl與attP I,或attLl與att.Rl),且不會(huì)與其他突變體類型的重組位點(diǎn)或與野生型attO位點(diǎn)交叉-反應(yīng)。不同位點(diǎn)特異性允許期望的分子的定向克隆或連接，由此提供克隆的分子的期望的取向。使用Gateway 系統(tǒng)通過取代側(cè)接受體質(zhì)粒分子(有時(shí)稱的目標(biāo)載體).....t的att位點(diǎn)的可選擇的標(biāo)記物(例如，Tse2)克隆及亞克隆側(cè)接重組位點(diǎn)的核酸片段。然后通過Tse2敏感宿主株的轉(zhuǎn)化和對(duì)受體分子上標(biāo)記物的陽性選擇來選擇期望的克隆。Tse2對(duì)原核生物和真核生物細(xì)胞有毒性，由此Tse2敏感宿主株包括原核生物和真核生物細(xì)胞。在一實(shí)施方式中，載體含有側(cè)接一個(gè)或更多限制酶位點(diǎn)或重組位點(diǎn)的Tse2基因。重組位點(diǎn)包括,但未限于，attB, attP，attL和attR。設(shè)計(jì)此載體,使得目的DNA片段(諸如,例如,PCR產(chǎn)物)會(huì)取代位于2個(gè)側(cè)接位點(diǎn)之間的Tse2。如果目的DNA片段存在于載體中，含有載體的細(xì)胞生存，由于Tse2基因會(huì)不再存在于期望的重組載體上。如果目的基因不存在，Tse2基因會(huì)防止攜帶不期望的載體的細(xì)胞的存活。由此,僅含有具有目的DNA片段的陽性克隆的細(xì)胞會(huì)是活的，且容易選擇。在一實(shí)施方式中,載體包含Tse2基因的至少I個(gè)無活性片段,其中當(dāng)無活性片段穿過至少I個(gè)重組位點(diǎn)與包含Tse2基因的另一無活性片段的第2DNA段重組時(shí),有功能的Tse2基因被拯救。在另一實(shí)施方式中,載體含有雙選擇盒,其中載體包含編碼Tse2的第I基因,及編碼第2可選擇的標(biāo)記物的第2基因,諸如抗生素抗性基因或編碼第2毒性蛋白的第2 “死亡”基因?？股乜剐曰蚩蛇x自細(xì)菌或真核生物基因,及可促進(jìn)針對(duì)氨芐西林，卡那霉素，四環(huán)素，氯霉素和本領(lǐng)域中知道的其他的抗性。第2死亡基因可為任何適合的死亡基因,包括但不限于，rpsL, tetAR, pheS, th.yA, IacY, gata-1, ccdB和sacBo第2死亡基因也可選自原核生物或真核生物毒性基因。此雙選擇盒側(cè)翼有至少I個(gè)限制性位點(diǎn)或重組位點(diǎn),使得目的DNA片段會(huì)在期望的重組或連接事件中取代位于2個(gè)位點(diǎn)之間的雙選擇盒。如果目的DNA片段存在，含有載體的細(xì)胞生存，由于Tse2基因會(huì)不再存在于期望的重組載體上。如果目的基因不存在,載體會(huì)仍含有Tse2基因且會(huì)防止攜帶不期望的載體的細(xì)胞的存活。此雙選擇盒可由此用于任何雙陰性選擇策略,如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所期望。在一實(shí)施方式中，當(dāng)多抗生素的使用不與特定選擇設(shè)計(jì)相容時(shí)，使用Tse2基因雙陰性選擇策略。作為非限制性例,載體含有包含在至少I個(gè)啟動(dòng)子控制下的Tse2基因以及氯霉素抗性基因的雙選擇盒。使用限制酶在雙選擇盒的上游和下游切割載體。任選地,線性化的載體可經(jīng)凝膠純化，以自反應(yīng)移出切下的雙選擇盒DNA。含有目的DNA片段和適當(dāng)?shù)南拗泼肝稽c(diǎn)的DNA，諸如PCR產(chǎn)物,然后在連接反應(yīng)中與線性化的載體組合。陽性克隆會(huì)是氯霉素敏感和有活力的(Tse2陰性)，由于雙選擇盒用目的DNA片段的取代。 在另一實(shí)施方式中,載體在Tse2基因或?qū)?yīng)調(diào)控元件(例如啟動(dòng)子或增強(qiáng)子)之內(nèi)含有至少I個(gè)重組位點(diǎn)，使得期望的重組事件會(huì)破壞Tse2基因自載體的表達(dá)。應(yīng)選擇重組位點(diǎn)的位置，使得如果期望的重組事件發(fā)生，得到的Tse2基因會(huì)是無活性和含有期望的載體的細(xì)胞會(huì)生存。如果期望的重組事件不發(fā)生，Tse2基因會(huì)保持完整和含有不期望的載體的細(xì)胞會(huì)不生存。在另--實(shí)施方式中,載體在Tse2基因或?qū)?yīng)調(diào)控元件(例如啟動(dòng)子或增強(qiáng)子)之內(nèi)含有至少I個(gè)重組位點(diǎn)，使得不期望的重組事件會(huì)產(chǎn)生完整和有功能的Tse2基因，其會(huì)導(dǎo)致含有不期望的載體的細(xì)胞死亡。在另一實(shí)施方式中，Tse2基因在多載體上片段化,共享的限制酶序列或重組位點(diǎn)序列連接基因片段。設(shè)計(jì)及排列載體,使得不期望的重組事件或連接事件會(huì)導(dǎo)致不期望的質(zhì)粒上完整Tse2基因的創(chuàng)建，由此導(dǎo)致含有具有有功能的Tse2基因的不期望的載體的細(xì)胞死亡。在另一實(shí)施方式中，載體是適合于拓?fù)洚悩?gòu)酶-介導(dǎo)的克隆的載體,如描述于美國專利No. 5，766，891和7，550，295，和/或TA克隆，如公開于美國專利No. 5, 827，657,均通過引用整體并入本文。在特定實(shí)施方式中，載體適合于拓?fù)洚悩?gòu)酶或TA-介導(dǎo)的克隆線性化，使得載體經(jīng)優(yōu)化用于目的DNA片段的最有效整合。這些制備描述于參考的專利。簡(jiǎn)言之,拓?fù)洚悩?gòu)酶—介導(dǎo)的克隆依賴于如下原理,Taq聚合酶具有將單脫氧腺苷(A)添加到PCR產(chǎn)物的V端的非-模板-依賴性末端轉(zhuǎn)移酶活性。例如，自痘苗病毒的拓?fù)洚悩?gòu)酶I在特定位點(diǎn)(CCCTT)結(jié)合于雙聯(lián)DNA及在一鏈中切割磷酸二酯主鏈。自斷裂的磷酸二酯主鏈的能量通過切割的鏈的3'磷酸酯和拓?fù)洚悩?gòu)酶I的酪氨酰殘基(Tyr-274)之間形成共價(jià)鍵而保存。DNA和酶之間的磷酸-酪氨酰鍵可隨后被原切割的鏈的5'羥基攻擊，逆轉(zhuǎn)反應(yīng)及釋放拓?fù)洚悩?gòu)酶。在一實(shí)施方式中，本發(fā)明的載體包含含有單,懸伸3,脫氧胸苷(T)殘基的線性載體，有拓?fù)洚悩?gòu)酶I共價(jià)結(jié)合于載體(稱之為“活化的載體”)。此允許PCR插入子與載體連接有效。
在另一實(shí)施方式中，載體經(jīng)設(shè)計(jì)用于拓?fù)洚悩?gòu)酶或TA克隆,使得拓?fù)洚悩?gòu)酶或TA切割位點(diǎn)位于Tse2基因之內(nèi)。在此實(shí)施方式中，載體可用于缺少期望的DNA插入子的克隆的陰性選擇。進(jìn)行拓?fù)洚悩?gòu)酶或TA反應(yīng)之后，含有期望的DNA插入子的載體會(huì)具有破壞的且無活性Tse2基因，由此允許含有該載體的細(xì)胞生存。但是,如果載體不合并插入子而在切割位點(diǎn)環(huán)化,Tse2基因會(huì)改性及有活性，由此產(chǎn)生毒性Tse2蛋白及殺細(xì)胞。在進(jìn)一步實(shí)施方式中，拓?fù)洚悩?gòu)酶或TA位點(diǎn)會(huì)與限制酶位點(diǎn)和/或測(cè)序引物位點(diǎn)側(cè)接。在另一實(shí)施方式中，可組合TA或TOPO克隆策略,如公開于，例如，專利6,916, 632,其通過弓I用整體并入本文。在本發(fā)明中的另^-方面,可與本文中的任何其他實(shí)施方式組合,重組載體可包含可操作地連接于調(diào)控序列的編碼Tse2解毒劑的基因。解毒劑可為能干擾Tse2的細(xì)胞毒性活性的任何表達(dá)產(chǎn)物，包括但不限于Tse2反義構(gòu)建體，Tse2-結(jié)合適體和Tse2-結(jié)合多肽。該載體可,例如，作為其生存性可通過控制解毒劑多肽表達(dá)的條件而條件性地控制的細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記物使用。在優(yōu)選的可與本文任何其他實(shí)施方式組合的實(shí)施方式中，第2基因編碼VI型分泌免疫蛋白2(Tsi2),作為針對(duì)Tse2的解毒劑公開于隨后例。在一優(yōu)選的實(shí)施方式 中，第2基因包含可編碼根據(jù)SEQ ID NO 10的銅綠假單胞菌(P. aeruginosa) Tsi2氨基酸序列的核苷酸序列,或由其組成。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中,第2基因包含根據(jù)SEQ IDNO 9的核苷酸序列，或由其組成。緊密相關(guān)的Tsi2基因和Tsi2蛋白存在于其他銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)株中，可變的位置標(biāo)注于SEQ ID N0Uo由此,在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，第2基因包含能編碼SEQ ID NO :11的氨基酸序列的核苷酸序列，或由其組成。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，第2基因包含根據(jù)SEQ ID NO 12的核苷酸序列，或由其組成。如本文所用，“Tsi2”包括其功能相當(dāng)體(截短，突變體，等)，其中該相當(dāng)體維持它們的在細(xì)胞表達(dá)Tse2后賦予免疫的能力，如本文所述。鑒定該功能相當(dāng)體的方法在本文公開及公開了各種該功能相當(dāng)體。例如，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，Tsi2的殘基60-77可被去除而仍保留其Tse2免疫活性。由此,在進(jìn)一步實(shí)施方式中，第2基因包含能編碼SEQ ID NO 13的氨基酸序列的核苷酸序列，或由其組成。發(fā)明人還鑒定了保留Tse2免疫功能的一系列Tsi2突變多肽。特別是,發(fā)明人顯示，以下描述的具有單突變的Tsi2突變體保留Tse2免疫活性,顯示,Tsi2是易于恢復(fù)活力的,且其與Tse2的相互作用是穩(wěn)健的。由此,在另一實(shí)施方式中，第2基因包含能編碼下列氨基酸序列的核苷酸序列SEQ ID NO :10,11或13(具有I , 2，3,4，5或更多氨基酸取代)，或由其組成?？芍圃煸撊〈睦疚恢?根據(jù)SEQ ID NO :10 12編號(hào))是氨基酸殘基2,4,6,7,8,10,11,13,14,18,20,21,25,27,28,29,30,32,33,36,38,39,42,44,45,46,47,49,50,52,56,57,59 和 61。作為非限制性例，在本文實(shí)施方式中將Tsi2基因作為例示Tse2解毒劑描述。但是，此不應(yīng)被理解為以任何方式限制本發(fā)明。任何Tse2解毒劑可取代公開的實(shí)施方式，包括但不限于Tse2反義構(gòu)建體，Tse2-結(jié)合適體和Tse2-結(jié)合多肽。Tsi2基因可在任何期望的啟動(dòng)子調(diào)控控制下,包括但不限于以上對(duì)Tse2公開的那些，諸如以上公開的各種誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，以及桿狀病毒多角體蛋白，SP6,金屬硫蛋白I,苜蓿丫蚊夜蛾(Autographa cal ifornica)核多汗病毒,塞姆利基森林病毒，Tet, CMV, Gall,GallO和T7啟動(dòng)子。在一實(shí)施方式中，Tsi2基因包括在載體上，其會(huì),當(dāng)表達(dá)時(shí),給表達(dá)Tse2的細(xì)胞賦予免疫。在Tsi2缺失下表達(dá)Tse2的細(xì)胞系中，細(xì)胞會(huì)不生存。本文也提供在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下的Tsi2基因，如上所述。如果表達(dá)Tse2的細(xì)胞接收表達(dá)Tsi2基因的載體,原核生物或真核生物細(xì)胞會(huì)生存,而不表達(dá)Tsi2基因的該細(xì)胞會(huì)不生存。如本文例中所示,不束縛于任何特定機(jī)理，Tse2的Tsi2抑制的機(jī)理可能涉及蛋白物理關(guān)聯(lián)。在另一實(shí)施方式中，Tsi2基因可用作期望的重組或連接事件的標(biāo)記物。在非限制性例中，含有Tsi2基因的載體側(cè)接一個(gè)或更多重組位點(diǎn)。目的DNA片段被插入載體上的位點(diǎn)，使得片段不破壞Tsi2基因但是含在重組位點(diǎn)之內(nèi)。在另一實(shí)施方式中,拓?fù)洚悩?gòu)酶或TA位點(diǎn)包括在側(cè)接位點(diǎn)之內(nèi)，但Tsi2基因之外，以輔助DNA片段插入。含有目的DNA片段的載體然后與含有匹配重組位點(diǎn)的第2載體組合，使得陽性重組事件會(huì)將目的DNA片段和Tsi2基因移到新載體,其可然后經(jīng)選擇用于表達(dá)Tse2的細(xì)胞的存活。在另一非限制性例中,載體含有側(cè)接一個(gè)或更多限制性位點(diǎn)的Tsi2基因。目的DNA片段被插入載體上的位點(diǎn)， 使得片段不破壞Tsi2基因但是含在限制性位點(diǎn)之內(nèi)。含有目的DNA片段的載體和第2克隆載體然后用一種或更多限制酶消化,之后是連接反應(yīng)。陽性連接事件會(huì)將目的DNA片段和Tsi2基因移到第2克隆載體,其可然后經(jīng)選擇用于表達(dá)Tse2的細(xì)胞的存活。在另一實(shí)施方式中，不同抗生素抗性基因也可用在質(zhì)粒上，使得本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可采用雙選擇。在一實(shí)施方式中,載體包含無活性形式的Tsi2基因，諸如截短的形式。此載體可在，例如,拯救Tsi2基因的活性的方法中使用，使得含有有功能的Tsi2基因的載體也含有目的DNA片段(如本文所述)。有功能的Tsi 2可通過重組，整合或其他本文所述的事件或反應(yīng)拯救。載體可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的容易設(shè)計(jì)用于特定實(shí)驗(yàn)。在本發(fā)明中的另一方面,本發(fā)明在本文提供含有存在于載體上截短的或無活性形式的抗毒素(Tsi2)基因的重組載體。在非限制性例中,載體可為線性形式。為了恢復(fù)Tsi2基因的功能,將核苷酸的短序列加入待克隆的目的DNA片段的端部。此序列對(duì)應(yīng)于Tsi2基因的截短的序列,使得附接于目的DNA片段的此序列會(huì)與截短的Tsi2基因結(jié)合，由此恢復(fù)有活性的抗毒素蛋白能抵抗Tse2蛋白的作用。短序列使用一種修飾的PCR引物合并到DNA片段。此系統(tǒng)允許僅重組質(zhì)粒的陽性選擇,及允許載體中克隆的片段的正確取向的選擇，由于2種可能的取向中的僅一種會(huì)恢復(fù)有活性的Tsi2基因。在另一實(shí)施方式中，Tsi2基因的截短位于在本發(fā)明中定義的作為Tsi2解毒劑功能需要的區(qū)之內(nèi)。例如，如本文所述，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，Tsi2的殘基60-77可被去除而仍保留其Tse2免疫活性。像這樣，Tsi2的截短必需在那些殘基之外，以便產(chǎn)生無活性Tsi2蛋白。在另一實(shí)施方式中，含有截短的無活性Tsi2基因的載體是環(huán)狀的。在另一實(shí)施方式中,本發(fā)明提供重組載體,其中編碼Tsi2的基因會(huì)僅在適當(dāng)?shù)南股乜剐曰蚧蝾~外的細(xì)胞死亡基因之后是有功能的。任何抗生素抗性基因或額外的死亡基因可在此實(shí)施方式中使用。在一非限制性例中，Tsi2座位在含有共同序列的相同的質(zhì)粒上分為2部分，及在側(cè)接卡那霉素抗性基因的5’和3’區(qū)中克隆。在位于卡那霉素抗性基因之內(nèi)的限制性位點(diǎn)的消化和Tse2表達(dá)細(xì)胞用線性DNA轉(zhuǎn)化之后,完全有功能的Tsi2會(huì)通過同源重組組裝。僅含有具有有功能的Tsi2的重組質(zhì)粒的細(xì)菌或真核生物細(xì)胞可在轉(zhuǎn)化后生長(zhǎng)。此使用ccdB基因的策略的描述,見Peubez, et al. Microbial Cell Factories2010,9 :65,其通過引用并入本文。在另一實(shí)施方式中，Tsi2座位在2個(gè)或更多質(zhì)粒上分裂為2個(gè)或更多部分。在另一實(shí)施方式中，Tsi2座位在2個(gè)或更多質(zhì)粒上分裂為2個(gè)或更多部分或整合進(jìn)細(xì)胞的染色體。在另一實(shí)施方式中，載體包含一個(gè)或更多獨(dú)特限制酶識(shí)別位點(diǎn),其中核酸插入子克隆進(jìn)一個(gè)或更多獨(dú)特限制酶識(shí)別位點(diǎn)破壞Tsi2解毒劑基因的表達(dá)。此實(shí)施方式的載體可用作克隆媒質(zhì)，由于插入子克隆進(jìn)載體中的一個(gè)或更多限制性位點(diǎn)間斷Tsi2解毒劑基因表達(dá)及提供容易可選擇的標(biāo)記物。具有不含有插入子的載體的細(xì)胞生存,具有插入子的那些死。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含含有根據(jù)本文公開的任何實(shí)施方式的Tse2基因、的第I載體，及含有根據(jù)本文公開的任何實(shí)施方式的Tsi2基因的第2載體。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包含含有根據(jù)本文公開的任何實(shí)施方式的Tse2基因，及含有根據(jù)本文公開的任何實(shí)施方式的Tsi2基因的載體。在一實(shí)施方式中，載體含有Tsi2基因，使得Tsi2基因的表達(dá)的損失致使細(xì)胞非-有活力。在一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供用于本文所述的Gateway重組系統(tǒng)的一種或更多含有Tse2和Tsi2的載體。載體設(shè)計(jì)為使得如果期望的重組事件不發(fā)生,Tse2會(huì)是在載體上有活性的，而Tsi2會(huì)是無活性,且含有載體的細(xì)胞會(huì)死。如果期望的重組事件發(fā)生，載體會(huì)攜帶Tse2和Tsi2基因，將Tse2解毒劑賦予含有載體的細(xì)胞,且細(xì)胞會(huì)生存。在一實(shí)施方式中，I個(gè)載體可包含Tse2和Tsi2基因。在另一實(shí)施方式中，各基因可見于分離的載體。此策略可用于在Gateway系統(tǒng)中取代一個(gè)或更多抗生素抗性基因。在一實(shí)施方式中，載體含有Tsi2解毒劑基因。將載體轉(zhuǎn)化進(jìn)含有穩(wěn)定地整合的Tse2基因,但受無活性啟動(dòng)子控制的細(xì)胞。例如，Tse2基因受T7啟動(dòng)子控制，但整合進(jìn)缺少T7RNA聚合酶基因的細(xì)菌。核酸序列的設(shè)計(jì)及合成和包含該序列的載體的制備在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技能水平之內(nèi)。在另一實(shí)施方式中，I個(gè)載體含有Tsi2基因,及I個(gè)載體含有Tse2基因。這些載體可發(fā)現(xiàn)附加地在單細(xì)胞中。除了 Tse2的表達(dá)可需要的載體組分之外(及Tse2解毒劑，如果存在)，載體也可包括任何其他適合的控制元件,包括但不限于復(fù)制原點(diǎn)，例如,用于PCR的引物位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄和/或翻譯起始和/或調(diào)節(jié)位點(diǎn)，重組信號(hào)，復(fù)制子，其他選擇標(biāo)記物，抗生素抗性基因，等。在一實(shí)施方式中，復(fù)制序列致使載體能附加型和染色體復(fù)制，使得載體能作為染色體外單元自身-復(fù)制,且能整合進(jìn)染色體，由于可轉(zhuǎn)位的序列,諸如插入序列或轉(zhuǎn)座子的存在，由于與存在于染色體中的序列的實(shí)質(zhì)性同源性或由于非-同源重組事件。復(fù)制序列或復(fù)制子會(huì)被轉(zhuǎn)化的宿主識(shí)別及源于任何方便的來源，諸如自質(zhì)粒，病毒，宿主細(xì)胞，例如，自主復(fù)制段，獨(dú)自或與著絲粒一起，等。特定復(fù)制序列對(duì)于主題發(fā)明不是關(guān)鍵的,且可采用各種序列。便利地，可采用病毒的復(fù)制序列。在全部實(shí)施方式中,各個(gè)體核酸段可包含各種序列,其包括,但不限于適合于作為引物位點(diǎn)使用的序列(例如，引物諸如測(cè)序引物或擴(kuò)增引物可雜交，以起始核酸合成，擴(kuò)增或測(cè)序的序列)，轉(zhuǎn)錄或翻譯信號(hào)或調(diào)控序列諸如啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，Kozak序列,起始密碼子,終止信號(hào)諸如終止密碼子,復(fù)制原點(diǎn)，重組位點(diǎn)(或其部分),可選擇的標(biāo)記物，及基因或基因的部分，以創(chuàng)建蛋白融合(例如，N-端或C-端)諸如GST，GUS,GFP, YFP, CFP,麥芽糖結(jié)合蛋白，6組氨酸(IIIS6)，表位,半抗原等和其組合。用于克隆該段的載體也可包含這些功能序列(例如,啟動(dòng)子,引物位點(diǎn),等)。在包含該序列的段的組合和序列最佳克隆進(jìn)一種或更多載體之后，分子可以各種方式操作,包括靶核酸分子的測(cè)序或擴(kuò)增(即，通過使用通過整合序列導(dǎo)入的至少I個(gè)引物位點(diǎn))，靶核酸分子的突變(即，通過在靶核酸分子中或上插入，缺失或取代)，通過同源重組插入另一分子,靶核酸分子的轉(zhuǎn)錄，及自靶核酸分子或其部分的蛋白表達(dá)(即，通過由段和/或載體含有的翻譯和/或轉(zhuǎn)錄信號(hào)的表達(dá))。克隆載體可存儲(chǔ)于冷凍器，冰箱,液氮中，或以本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道的任何其他方法存儲(chǔ)。在另一方面,本發(fā)明提供重組宿主細(xì)胞,其包含本發(fā)明的任何方面的任何實(shí)施方 式或?qū)嵤┓绞降慕M合的重組載體。本文使用的術(shù)語〃宿主，"可為經(jīng)遺傳加工而表達(dá)異源Tse2 (及Tse2解毒劑,如果存在)的任何原核生物或真核生物,包括但不限于細(xì)菌(諸如大腸埃希氏菌(E. coli))，藻類，真菌(諸如酵母)，昆蟲，無脊椎動(dòng)物，植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型。該宿主的例如，見 Maniatis et al. ,Molecular Cloning A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,N. Y. (1982)。本發(fā)明的此方面的宿主細(xì)胞可，例如,在本文討論的本發(fā)明的方法中使用。在一實(shí)施方式中，細(xì)菌或真核生物細(xì)胞含有穩(wěn)定地整合進(jìn)染色體的在選擇的啟動(dòng)子控制下的Tse2基因或基因片段。在另一實(shí)施方式中，細(xì)菌或真核生物細(xì)胞含有載體中攜帶的在選擇的啟動(dòng)子控制下的Tse2基因或基因片段。在一實(shí)施方式中，細(xì)菌或真核生物細(xì)胞含有穩(wěn)定地整合進(jìn)染色體的在選擇的啟動(dòng)子控制下的Tsi2基因或基因片段。在另一實(shí)施方式中，細(xì)菌或真核生物細(xì)胞含有載體中攜帶的在選擇的啟動(dòng)子控制下的Tsi2基因或基因片段。在另一方面，本發(fā)明提供用于可選擇性克隆的方法，包括如果無插入子存在,在適合于Tse2由重組載體表達(dá)的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的另一方面的任何實(shí)施方式的重組宿主細(xì)胞，并選擇那些由于包含具有克隆進(jìn)表達(dá)載體的插入子的重組載體而生長(zhǎng)的細(xì)胞。在一實(shí)施方式中，載體包含一個(gè)或更多獨(dú)特限制酶識(shí)別位點(diǎn)，且其中核酸插入子克隆進(jìn)^-個(gè)或更多獨(dú)特限制酶識(shí)別位點(diǎn)破壞第I基因的表達(dá)，及插入子克隆進(jìn)載體中的一個(gè)或更多限制性位點(diǎn)間斷Tse2表達(dá)及提供容易可選擇的標(biāo)記物一用不含有插入子的載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,它們的生長(zhǎng)被Tse2表達(dá)抑制(只要它們不內(nèi)源性地表達(dá)針對(duì)Tse2的解毒劑)，而具有插入子的那些不。在另--實(shí)施方式中，重組載體包含一個(gè)或更多側(cè)接Tse2基因的重組位點(diǎn)。在一實(shí)施方式中，重組載體包含至少第I和第2重組位點(diǎn),它們側(cè)接可操作地連接于調(diào)控序列的編碼Tse2的第I基因,其中所述第I和第2重組位點(diǎn)不彼此重組。在此實(shí)施方式中，待克隆的核酸片段側(cè)翼有重組位點(diǎn)，通過取代側(cè)接在重組載體上的重組位點(diǎn)的Tse2可選擇的標(biāo)記物克隆/亞克隆。期望的克隆然后通過Tse2敏感宿主株的轉(zhuǎn)化,和受體分子上標(biāo)記物的任何陽性選擇來選擇。Tse2對(duì)原核生物和真核生物細(xì)胞有毒性，由此Tse2敏感宿主株包括原核生物和真核生物細(xì)胞。由于Tse2在原核生物和真核生物細(xì)胞中有毒性，該可選擇性克隆可在任何原核生物或真核生物宿主細(xì)胞中進(jìn)行,包括但不限于細(xì)菌(諸如大腸埃希氏菌(E. coli))，藻類，真菌(諸如酵母)，昆蟲，無脊椎動(dòng)物，植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型。適合于Tse2表達(dá)的細(xì)胞培養(yǎng)條件可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員基于各種因素，包括特定宿主細(xì)胞，調(diào)控序列和載體設(shè)計(jì)參照本文教導(dǎo)來確定。在另一方面,本發(fā)明提供產(chǎn)生缺乏插入子的克隆載體的方法,其包括在適合于載體復(fù)制和Tse2表達(dá)的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的第2方面的任何實(shí)施方式的重組宿主細(xì)胞，其中重組宿主細(xì)胞還表達(dá)Tse2解毒劑,并從宿主細(xì)胞分離載體。這些方法允許本發(fā)明的任何實(shí)施方式的載體的大規(guī)模產(chǎn)生。解毒劑可為能干擾Tse2的細(xì)胞毒性活性的任何表達(dá)產(chǎn)物,包括但不限于Tse2反義構(gòu)建體,Tse2-結(jié)合適體和Tse2-結(jié)合多肽。在優(yōu)選的可與本文任何其他實(shí)施方式組合的實(shí)施方式中，Tse2解毒劑包含本文公開的任何實(shí)施方式的Tsi2。適合于載體復(fù)制的細(xì)胞培養(yǎng)條件可由本領(lǐng)域技術(shù)人員基于各種因素，包括特定宿主細(xì)胞,調(diào)控序列和載體設(shè)計(jì)參照本文教導(dǎo)來確定。在另一方面,本發(fā)明提供宿主細(xì)胞,其在它們的基因組中包含可操作地連接于調(diào)控序列的編碼Tse2的第I重組基因。在一非限制性實(shí)施方式中，重組體細(xì)胞在質(zhì)粒或移動(dòng) 遺傳元件上包含編碼解毒劑(諸如Tsi2)的第2基因，并且其解毒劑性質(zhì)的選擇(即Tse2免疫)維持該元件。在另一實(shí)施方式中，重組宿主細(xì)胞在質(zhì)粒上包含編碼有功能的Tse2的第I基因,其中重組宿主細(xì)胞包含表達(dá)Tsi2的第2基因，以允許Tse2質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中繁殖。在此實(shí)施方式中，第2基因可存在于相同的或不同質(zhì)粒,另一額外-染色體元件，或整合進(jìn)染色體。第I基因和第2基因是“重組體”，其中宿主細(xì)胞不內(nèi)源性地表達(dá)Tse2或Tse解毒劑，由此Tse2表達(dá)需要Tse2的重組表達(dá),及解毒劑表達(dá)需要解毒劑的重組表達(dá)。如本文所用在其基因組中”包括染色體插入和額外-染色體元件,諸如質(zhì)粒或病毒載體。由此,在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，第I重組基因和/或第2重組基因以額外-染色體存在。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，第I重組基因和/或第2重組基因作為染色體插入子存在。在存在編碼Tse2的解毒劑的第2基因的實(shí)施方式中，第2基因可在相同的，或替代性地，在不同額外-染色體元件上，相比第I基因，或,替代性地,在基因組中連接的或未連接于第I基因。在其他實(shí)施方式中，第I和第2基因之一可為染色體插入，而第I和第2基因中的另一個(gè)可為額外-染色體元件。在第I和第2基因在相同的質(zhì)粒上的實(shí)施方式中，基因可緊密連接。在另一實(shí)施方式中,第I和第2基因在相同的質(zhì)粒且不是緊密連接的。在宿主細(xì)胞不包含編碼Tse2的解毒劑的第2重組基因的實(shí)施方式中,Tse2調(diào)控序列是優(yōu)選可控制的，以控制Tse2表達(dá)。在宿主細(xì)胞包含編碼Tse2的解毒劑的第2重組基因的例示實(shí)施方式中，Tse2調(diào)控序列可為誘導(dǎo)性的和/或解毒劑調(diào)控序列可為組成性的，以控制Tse2表達(dá)。在另一非限制性實(shí)施方式中，重組體細(xì)胞(諸如哺乳動(dòng)物細(xì)胞)在I個(gè)質(zhì)粒上包含編碼Tse2的第I基因,及在第2質(zhì)粒上包含編碼Tsi2的第2基因。在此實(shí)施方式中，Ts 12可用作導(dǎo)入表達(dá)Tse2的宿主細(xì)胞的表達(dá)載體上可選擇的標(biāo)記物,導(dǎo)入細(xì)胞，及僅表達(dá)Tsi2的細(xì)胞會(huì)能生長(zhǎng)。在一實(shí)施方式中，Tse2的調(diào)控區(qū)是誘導(dǎo)性的，且導(dǎo)入后細(xì)胞的生長(zhǎng)在誘導(dǎo)條件下發(fā)生。在此實(shí)施方式中，第2載體可還包含用于表達(dá)或其他目的的目的重組核酸。在Tse2調(diào)控元件是可控制的實(shí)施方式中，Tse2表達(dá)的控制可用于維持Tsi2質(zhì)粒和/或就其整合選擇，提供不使用抗生素制造穩(wěn)定的細(xì)胞的方式。
在另--方面,載體可提供到試劑盒中。本發(fā)明也涉及用于進(jìn)行本發(fā)明的方法,及特別用于創(chuàng)建本發(fā)明的產(chǎn)物核酸分子或本發(fā)明的其他連接的分子和/或化合物(例如，蛋白-蛋白，核酸-蛋白，等)或包含該產(chǎn)物核酸分子或連接的分子和/或化合物的支持物的試劑盒。本發(fā)明也涉及用于添加和/或移出和/或取代核酸,蛋白和/或其他分子和/或化合物，用于創(chuàng)建及使用本發(fā)明的組合庫，及用于根據(jù)本發(fā)明的方法進(jìn)行同源重組(特別基因革ElI向)的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒也可包含用于進(jìn)一步操作含有重組位點(diǎn)的分子和/或通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的化合物的其他組分。本發(fā)明的試劑盒可包含一種或更多本發(fā)明的核酸分子(特別是包含一個(gè)或更多重組位點(diǎn)和任選地包含一個(gè)或更多反應(yīng)性功能部分的開始分子)，一種或更多本發(fā)明的分子和/或化合物，一種或更多本發(fā)明的支持物和/或一種或更多本發(fā)明的載體。該試劑盒可任選地包含一種或更多額外的組分，其選自一種或更多宿主細(xì)胞(例如,2,3,4,5等)，一種或更多引導(dǎo)(例如,通過轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化)分子或化合物進(jìn)入一種或更多宿主細(xì)胞的試劑，一種或更多核苷酸，一種或更多聚合酶和/或反轉(zhuǎn)錄酶(例如，2，3,4，5,等)，一種或更多適合的緩沖劑(例如,2，3,4，5,等)，一種或更多引物(例如,2，3,4，5,7，10，12,15,20，30，50,等)，一種或更多終結(jié)劑(例如，2，3,4，5, 7，10，等)，一 個(gè)或更多用于創(chuàng)建組合庫的分子群(例如，2, 3,4, 5, 7,10,12,15, 20，30, 50,等)及一個(gè)或更多組合庫(例如,2, 3,4, 5,1,10,12,15, 20, 30, 50,等)。本發(fā)明的試劑盒也可含有進(jìn)行本發(fā)明的方法的向?qū)Щ蛄鞒?。在另一方面本發(fā)明中提供用于接合,刪除或取代核酸段的試劑盒，這些試劑盒包含至少一種選自下列的組分(I) 一種或更多重組蛋白或包含一種或更多重組蛋白的組合物,及⑵至少一種包含^-個(gè)或更多重組位點(diǎn)的核酸分子(優(yōu)選具有至少2個(gè)不同重組特異性的載體)。本發(fā)明的試劑盒也可包含一種或更多選自下列的組分(a)包含額外的重組位點(diǎn)的額外的核酸分子；(b) —種或更多具有連接酶活性的酶；(c) 一種或更多具有聚合酶活性的酶；(d) —種或更多具有反轉(zhuǎn)錄酶活性的酶；(e) —種或更多具有限制性內(nèi)切酶活性的酶；⑴一種或更多引物；(g) —種或更多核酸庫；(h) ^-種或更多支持物；⑴一種或更多緩沖劑；(j) 一種或更多去污劑或含有去污劑的溶液；(k) 一種或更多核苷酸；(I) 一種或更多終結(jié)劑；(m) —種或更多轉(zhuǎn)染試劑；(n) —種或更多宿主細(xì)胞；及(O)使用試劑盒組分的使用說明。在一實(shí)施方式中,本發(fā)明的試劑盒含有包含含有Tse2或Tsi2基因的至少一種線性化的或環(huán)狀載體的組合物。在一些實(shí)施方式中，試劑盒中含有的線性化的載體經(jīng)處理而使得載體的端對(duì)于結(jié)合于載體的另一端是抗性的。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及試劑盒包含被區(qū)劃為接收及在其中保持至少一個(gè)容器的載體或容具，其中第I容器含有線性或環(huán)狀DNA分子,其包含具有至少一個(gè)Tse2基因序列的DNA片段的載體,如本文所述。在另一實(shí)施方式中，試劑盒中含有的載體具有至少一個(gè)Tsi2基因序列的DNA片段，如本文所述。在另一實(shí)施方式中，試劑盒含有具有至少一個(gè)Tse2序列的DNA片段的載體和具有至少一個(gè)Tsi2序列的DNA片段的載體。以上公開的Tse2和Tsi2的全部實(shí)施方式和實(shí)施方式的組合可在本發(fā)明的此方面使用。實(shí)施例總述分泌系統(tǒng)的功能譜被其底物限定。在此我們分析了 Hcp分泌島-I-編碼的VI型分泌系統(tǒng)(HI-T6SS)的調(diào)節(jié)改變的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)突變體的分泌蛋白質(zhì)組。我們鑒定了此系統(tǒng)的3種底物,蛋白Tsel 3(6型,輸出為I 3),其與分泌設(shè)備共調(diào)節(jié)，及分泌的在緊密翻譯后控制F。Tse2蛋白發(fā)現(xiàn)是毒素-免疫系統(tǒng)的毒素組分，且當(dāng)在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)阻攔原核生物和真核生物細(xì)胞的生長(zhǎng)。相反，分泌的Tse2對(duì)真核生物細(xì)胞無效應(yīng)；但是，其對(duì)銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)株以依賴于細(xì)胞接觸和HI-T6SS的方式提供主要生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì),相對(duì)于缺少免疫的那些。此展示,T6SS靶向針對(duì)細(xì)菌的毒素,輔助調(diào)和T6SS和噬菌體尾和刺之間的結(jié)構(gòu)和進(jìn)化關(guān)系。引言分泌的蛋白允許細(xì)菌密切地接觸它們的周圍及其他細(xì)菌。分泌的蛋白的重要 性和多樣性被細(xì)菌已進(jìn)化以致使它們的輸出的多通路所反映(Abdallah et al. ,2007 ；Filloux, 2009)。大多-組分分泌系統(tǒng),包括III和IV型分泌，已聚焦于大量的研究,因?yàn)樵谠S多生物中，它們是特化的,用于效應(yīng)子輸出及它們具有經(jīng)針-樣設(shè)備將蛋白直接從細(xì)菌轉(zhuǎn)位到宿主細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的顯著的能力(Cainkronne and Roy, 2006)。最近描述的VI型分泌系統(tǒng)(T6SS)是另--特化的系統(tǒng),但是其生理學(xué)作用和一般機(jī)理尚不明確(Bingle et al.,
2008)。T6SS的研究指示，功能設(shè)備需要約15保守的及緊密連接的基因的產(chǎn)物，及強(qiáng)烈關(guān)聯(lián)于屬于溶血素共調(diào)節(jié)的蛋白(Hcp)家族的六聚體環(huán)形蛋白的輸出(Fil :[oux, 2009;Mougous et al. ,2006)。需要Hcp蛋白用于分泌設(shè)備的組裝,且它們與也通過T6SS輸出的纈氨酸-甘氨酸重復(fù)子(Vgr)家族蛋白相互作用。Hcp/Vgr復(fù)合物的功能尚不清楚,但是相信，蛋白是分泌設(shè)備的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組分。對(duì)Hcp和Vgr-家族蛋白的新近X-射線結(jié)晶學(xué)觀察顯示,它們分別類似于噬菌體管和尾刺蛋白(Leiman et al. , 2009 ;Pel :丨_ et al. , 2009) 這些發(fā)現(xiàn)提示思索,T6SS是進(jìn)化上,結(jié)構(gòu)上和機(jī)械上與噬菌體相關(guān)的。根據(jù)此模型,T6SS作為倒置的噬菌體尾在細(xì)菌表面組裝，Hcp/Vgr復(fù)合物形成細(xì)胞-穿刺裝置的遠(yuǎn)端。另一可注意的保守的T6S基因產(chǎn)物是ClpV, AAA+-家族ATP酶，其已假定為提供驅(qū)動(dòng)分泌設(shè)備必需的能量(Mougous et al. ,2006)。余下保守的T6S蛋白的作用知之甚少。編碼預(yù)測(cè)的附屬元件的非保守的基因也連接于多數(shù)T6SS(Bingle et al. , 2008)。在銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的 HSI-I-編碼的 T6SS (H1-T6SS)(圖 1A)中，這些基因編碼通過叉頭-關(guān)聯(lián)的結(jié)構(gòu)域蛋白，F(xiàn)hal的磷酸化狀態(tài)的變化嚴(yán)格調(diào)節(jié)分泌系統(tǒng)的活性的翻譯后調(diào)控通路的元件(Mougous et al. ,2007)。Fhal被跨膜絲氨酸-蘇氨酸Hanks-型激酶，PpkA的磷酸化,引發(fā)Hcpl分泌。PppA,PP2C_型磷酸酶,拮抗Fhal磷酸化。T6SS已連接到無數(shù)的過程，包括生物膜形成(Aschtgen et al. ,2008 ；Enos-Berlage et al. , 2005),綴合(Das et al.，2002),群體感應(yīng)調(diào)節(jié)(Weber et al.,2009),及促進(jìn)及限制毒力(FiIIoux, 2009)。銅綠假單胞菌(P. aeruginosa) H1-T6SS已牽涉慢性感染中細(xì)菌的適合度；在此分泌系統(tǒng)中保守的基因中的突變體對(duì)于在大鼠肺慢性感染模型中有效復(fù)制失效，且系統(tǒng)顯示在囊性纖維化(CF)患者感染中有活性(Mougous et al.，2006 ；Potvin et al. ,2003)。II1-T6SS也與其他慢性感染毒力因子諸如涉及生物膜形成的psl 及 pel 座位共調(diào)節(jié)(Goodman et al. , 2004 ；Ryder et al. , 2007)。明顯保守的T6SS體系結(jié)構(gòu)如何可參與該廣范圍的活性是不清楚的。分泌系統(tǒng)可對(duì)宿主細(xì)胞發(fā)揮其效應(yīng)至少I個(gè)機(jī)理已收獲自霍亂弧菌(Vibrio cholerae)的研究。此生物的T6S-關(guān)聯(lián)的VgrG-家族蛋白含有在需要胞吞和細(xì)胞間接觸的過程中轉(zhuǎn)位進(jìn)宿主細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的具有肌動(dòng)蛋白-交聯(lián)活性的結(jié)構(gòu)域(Ma et al. ,2009 ；Pukatzki et al. ,2007 ；Satchell，2009)。含有具有發(fā)病機(jī)制中的想得到的作用的非_結(jié)構(gòu)域的VgrG-家族蛋白的子集已稱“進(jìn)化的"VgrG蛋白(Pukatzki et al. ,2007)。此構(gòu)型，其中效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域大概依靠其與T6S細(xì)胞穿刺設(shè)備的融合轉(zhuǎn)位進(jìn)宿主細(xì)胞 細(xì)胞質(zhì)，引起興趣,但其可能不是通用的；多種含有T6SS的生物不編碼“進(jìn)化的”VgrG蛋白(Boyer et al. , 2009 ；Pukatzki et al.,
2009)。明白T6SS的功能的關(guān)鍵-如用任何分泌系統(tǒng)-是鑒定及表征輸出的蛋白底物。自遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)的EvpP和自豌豆根瘤菌(RhizobiumIeguminosarum)的RbsB是系統(tǒng)的建議的底物;但是，與T6S底物的預(yù)期的性質(zhì)不一致,RbsB含有N-端Sec分泌信號(hào)，及EvpP與分泌設(shè)備的組分穩(wěn)定地關(guān)聯(lián)(Bladergroen etal. , 2003 ；Pukatzki et al. , 2009 ；Zheng and Leung,2007)。在此研究中，我們鑒定了 3種蛋白，稱之為Tsel 3 (VI型分泌輸出的I 3)，其為銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)的H1-T6SS的底物。我們顯示,這些之-一,Tse2,是毒素-免疫系統(tǒng)的毒素組分，且其能阻攔各種原核生物和真核生物的生長(zhǎng)。盡管細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的毒素的混亂，我們發(fā)現(xiàn),II1-T6SS-輸出的Tse2特異性靶向細(xì)菌。在生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)Tse2的免疫以依賴于密切細(xì)胞間接觸和有功能的H1-T6SS的方式提供的明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。分泌系統(tǒng)將Tse2有效靶向細(xì)菌,而不靶向真核生物細(xì)胞的能力,提示T6S可在細(xì)菌之間遞送毒素和效應(yīng)分子中起到作用。結(jié)果HI-T6SS通態(tài)及斷態(tài)株的設(shè)計(jì)及表征在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下,H1-T6SS的活化在翻譯后水平被磷酸酶PppA強(qiáng)烈阻遏(圖1A)。我們顯示，pppA的滅活導(dǎo)致Hcpl輸出，及顯示此可反映分泌設(shè)備中“通態(tài)”的引發(fā)(Hsu et al. ,2009 ;Mougous et al. ,2007)。這些觀察導(dǎo)致預(yù)測(cè)，設(shè)備的額外的組分，及甚至分泌系統(tǒng)的底物,也在此狀態(tài)輸出。為了鑒定這些蛋白，我們尋求比較ApppA和AclpVl的分泌蛋白質(zhì)組。后者缺乏H1-T6SS ATP酶，ClpVl由此保持在“斷態(tài)”(圖1A) (Mougouset al. ，2006)。為了探查是否通態(tài)和斷態(tài)突變可調(diào)節(jié)H1-T6SS的活性，我們檢定了它們的對(duì)銅綠假單胞菌(P. aeruginosa) PAOl hep I-V中Hcpl分泌的效應(yīng)(當(dāng)存在時(shí)，-V表示指示的基因與編碼水皰性口炎病毒G表位的序列的融合)。如所預(yù)期,相對(duì)于親本株,pppA的缺失促進(jìn)了 Hcpl分泌和Fhal磷酸化(圖IB和C)。由于野生型株不分泌Hcpl至司檢測(cè)的水平，使用ApppA背景計(jì)量AclpVl的效應(yīng)。clpVl缺失向ApppA的導(dǎo)入消除了 Hcpl分泌，且此效應(yīng)完全被c:[pVl的異位表達(dá)彌補(bǔ)(圖1B)。這些數(shù)據(jù)指示，pppA和clpVl缺失分別足以活化及滅活H1-T6SS分泌系統(tǒng)。通態(tài)及斷態(tài)分泌蛋白質(zhì)組的質(zhì)量光譜測(cè)量分析接下來，我們使用了 MS和光譜計(jì)數(shù)來比較存在于通態(tài)和斷態(tài)銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)株的分泌蛋白質(zhì)組的蛋白(Liu et al. ,2004)。平均光譜計(jì)數(shù)(SC)值用于鑒定是否各蛋白在狀態(tài)之間區(qū)別分泌。我們的MS分析的結(jié)果總結(jié)于表SI。重要的是,光譜計(jì)數(shù)的總數(shù)，以兩個(gè)重復(fù)，在通態(tài)和斷態(tài)之間是可比較的。在重復(fù)實(shí)驗(yàn)之間鑒定符合我們的過濾標(biāo)準(zhǔn)的總共371種蛋白(表S2h我們將蛋白分為3組類別I (Cl ;表83和S4)-以通態(tài)和斷態(tài)存在,類別2 (C2 ’表S5)-僅以通態(tài)存在,及類別3(C3 ;表S6)-僅以斷態(tài)存在。重復(fù)之間的重疊在Cl蛋白之中最大。鑒定總共314種Cl蛋白，其中249種在重復(fù)之間共享。Cl差異的顯著級(jí)分可歸因于,在重復(fù)I(Rl)相比在重復(fù)2(R2)中，在此類別中鑒定13%更多蛋白。為了評(píng)定我們的數(shù)據(jù)組的定量組分的精確度,我們測(cè)量了 Cl蛋白內(nèi)的SC比(通態(tài)/斷態(tài))的分布(圖1D)。由于我們未預(yù)期H1-T6SS應(yīng)呈現(xiàn)對(duì)分泌蛋白質(zhì)組的全局效應(yīng)，我們被在通態(tài)和斷態(tài)之間上調(diào)對(duì)比下調(diào)的那些蛋白之間的近似的分裂(50% ±2，以兩個(gè)重復(fù))所鼓舞。此外,狀態(tài)之間的平均SC的變化低,且此值在重復(fù)中類似([Rl],I. 13±1.04 ；[R2], I. 15±0. 90)。僅30種Rl和33種R2蛋白產(chǎn)生> 2的SC比。如所預(yù)期，Hcpl在通態(tài)樣品中過度呈現(xiàn)。的確，Hcpl是在兩個(gè)數(shù)據(jù)組中最區(qū)別分 泌的蛋白(SC比[R1], 13 ； [R2] ,171)(0 1D)。斷態(tài)細(xì)胞的分泌蛋白質(zhì)組中Hcpl的存在提示制備物之內(nèi)細(xì)胞蛋白混雜的特定程度。此混雜也被許多檢測(cè)的蛋白的預(yù)測(cè)的或知道的功能所證明(表S2 S4)。Hcpl的高豐度(119SC平均)相對(duì)于平均蛋白豐度(10. 9SC)可能是貢獻(xiàn)于斷態(tài)樣品中其檢測(cè)的另一因素。接下來,我們分析了 C2蛋白-僅在通態(tài)觀察的那些。在Rl (19)和R2 (20)中鑒定類似數(shù)的這些蛋白，且這些中的5種見于兩個(gè)重復(fù)(表I)。C2對(duì)比Cl蛋白的重復(fù)性是可歸因于它們的平均SC的差異；C2蛋白的平均SC是2. 6,對(duì)比Cl中的12。在Rl和R2中鑒定的C2蛋白占C2-R1中6種最豐富的中的5種，及C2-R2中10種最豐富的中的5種。各這些蛋白缺少知道的輸出通路的分泌信號(hào)。這些蛋白的鑒定和它們的分泌的生物化學(xué)驗(yàn)證是隨后部分的主題。Rl和R2中的C3蛋白的數(shù)和豐度稍微少于對(duì)應(yīng)C2值。雖然如此,我們鑒定了在Rl和R2之間共同的3種C3蛋白(表I)。處于斷態(tài)的這些蛋白的存在可能反映通過在分泌蛋白質(zhì)組中顯現(xiàn)的H1-T6SS的活性調(diào)節(jié)導(dǎo)致的基因調(diào)節(jié)的變化。序列分析指示,各這些蛋白含有預(yù)測(cè)的信號(hào)肽(Emanuelsson et al.,2007)。[由H1-T6SS分泌2種VgrG蛋白2種VgrG-家族蛋白，開放閱讀框PA0091和PA2685的產(chǎn)物，是在Rl和R2中最豐富的C2蛋白(表I)。有趣的是，早先微陣列工作顯示,PA0091和PA2685用HSI-1通過RetS雜交體2-組分傳感器/應(yīng)答調(diào)節(jié)物蛋白協(xié)同地調(diào)控，但是未研究在H1-T6SS中這些蛋白的參與(圖 2A) (Goodman et al. 2004 ；Laskowski and Kazmierczak, 2006 ；Zolfaghar etal.，2005)。PA0091座位位于HSI-I之內(nèi)，而PA2685座位見于缺乏其他明顯的T6S元件的未連接的位點(diǎn)(圖IA和2A)。為了與之前命名法保持一致,這些基因會(huì)此后稱為VgrGl和vgrG4 (Mougous et al. ,2006)0為了確認(rèn)MS結(jié)果，我們比較了野生型細(xì)菌中的VgrGl和VgrG4向含有通態(tài)(ApppA)和斷態(tài)(AclpVl)突變的株的定位。與我們的MS發(fā)現(xiàn)一致,vgrGl-V和vgrG4-V背景中細(xì)胞和上清液級(jí)分的蛋白印跡分析指示，蛋白的分泌被PPPA強(qiáng)烈阻遏，及需要clpVl (圖2B和2C)。這些數(shù)據(jù)顯示,H1-T6SS輸出至少2種VgrG-家族蛋白。因?yàn)樯形疵靼椎脑?，VgrG4-V遷移為細(xì)胞級(jí)分中的2個(gè)主要條帶和上清液中的大量的高分子量條帶。3種HI-T6SS底物的鑒定在Rl和R2中鑒定的余下C2蛋白是由ORF PA 1844, PA2702和PA3484編碼的蛋白。有趣的是,早先研究鑒定了作為由銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)臨床分離物表達(dá)的免疫原性蛋白的PA1844的產(chǎn)物(Wehmhoner et al.，2003)。3種蛋白的生物信息學(xué)分析指示，它們不彼此或與銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)之外的蛋白共享可檢測(cè)的序列同源性。各蛋白由在于預(yù)測(cè)的具有第2假想ORF的2-基因操縱子的ORF編碼。有趣地,我們注意到，3種未連接的操縱子，如HSI-I (其包括vgrGl)和vgrG4,被RetS負(fù)調(diào)控(圖2A)?；谖覀兊姆置诘鞍踪|(zhì)組分析,我們假定，分別由PA1844, PA2702和PA3484編碼的蛋白，今后稱之為Tsel-3，是H1-T6SS的底物。為了測(cè)試此,我們?cè)谠阢~綠假單胞菌(P. aeruginosa)株的診斷小組中異位地表達(dá)時(shí)分析了蛋白的定位。各蛋白的分泌特征在這 些株中類似；相對(duì)于野生型，ApppA顯示了顯著增加的分泌水平,且分泌水平在含有額外的hep I或c IpVl缺失的ApppA株中在野生型水平或野生型水平以F (圖3A)。作為混淆因子排除蛋白的過表達(dá)，由于相關(guān)的背景中染色體-編碼的Tsel-V的分泌特征類似于異位地-表達(dá)的蛋白的分泌特征(圖3B)。最終,我們用表達(dá)clpVl的質(zhì)?；パa(bǔ)了 ApppAAclpVltsel-V 中 Tsel-V 分泌。為了作為H1-T6SS底物而非結(jié)構(gòu)組分進(jìn)一步區(qū)別Tse蛋白，我們測(cè)定了它們對(duì)T6分泌設(shè)備的核心功能的影響。對(duì)各研究的T6SS根本性的是分泌Hcp-相關(guān)的蛋白的能力。在系統(tǒng)性分析中，Hcp分泌顯示需要全部預(yù)測(cè)的核心T6SS組分,包括VgrG-家族蛋白(Pukatzki et al. , 2007 ；Zheng and Leung, 2007)。我們?cè)?ApppA hcpl-V背景中產(chǎn)生 T含有全部tse基因缺失的株,及比較了在相同的背景中，此株與缺少vgrGl和vgrG4或clpVl的株中的Hcpl分泌。蛋白印跡分析揭不，Hcpl分泌在A cIpVI和A vgrGl A vgrG4株中消除，但是其未受tse缺失影響(圖3C)。含有ClpVl的多蛋白復(fù)合物對(duì)于有功能的T6S設(shè)備是必要的(Hsu et al.，2009)。作為H1-T6SS功能的第2指示物，我們使用了熒光顯微鏡檢，以檢查含有clpVl與編碼綠熒光蛋白的序列的染色體融合的株(clpVl-GFP)中此復(fù)合物的形成(Mougous et al.，2006)。與Hcpl分泌結(jié)果一致，CIpVI-GFP定位的斑點(diǎn)外觀,其為適當(dāng)?shù)脑O(shè)備組裝的指示，不依賴于tse基因(圖3D)。另一方面,H1-T6S設(shè)備的組裝需要的基因,ppkA的缺失,破壞了 ClpVl-GFP定位。總之,這些發(fā)現(xiàn)提供證據(jù)，Tse蛋白是H1-T6SS的底物。通過Gac/Rsm通路的去阻遏引發(fā)Tse分泌早先微陣列實(shí)驗(yàn)推薦,tse基因被RetS (Gac/Rsm信號(hào)傳導(dǎo)通路的組分)緊密阻遏(Lapouge et al. , 2008)。在此通路中，RetS和2種其他傳感器激酶，LadS和GacS的活性會(huì)聚而通過小RNA-結(jié)合蛋白R(shí)smA交互調(diào)控銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)中的急性和慢性毒力通路的重疊組(Brencic and Lory, 2009 ；Goodman et al. , 2004 ;Ventre et al.,2006)。為了直接研究Gac/Rsm通路對(duì)tse表達(dá)的效應(yīng),我們監(jiān)控了含有retS缺失的株的細(xì)胞-關(guān)聯(lián)的及分泌的級(jí)分中Tse蛋白的豐度。我們的數(shù)據(jù)顯示,Gac/Rsm通路的活化顯著提升細(xì)胞Tse水平及引發(fā)它們經(jīng)H1-T6SS的輸出(圖3E)。值得注意的是，AretS中Tse蛋白的分泌遠(yuǎn)遠(yuǎn)過量于ApppA中觀察的(圖3E,比較ApppA和AretS)。
Tsi2是保護(hù)銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)免于Tse2的必要的蛋白在銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)PAOl的公開的轉(zhuǎn)座子插入庫中tse2/tsi2座位之內(nèi)的轉(zhuǎn)座子插入的缺乏提示，這些ORF對(duì)于生物的活力可為必要的(Jacobs et al.，2008)。為測(cè)試此可能性,我們嘗試產(chǎn)生tse2和tsi.2的缺失。雖然A tse2株容易構(gòu)建，tsi2對(duì)于幾種缺失方法是難辦的?；谶z傳情景和共調(diào)節(jié)(圖2A),我們假定,Tse2和Tsi2可功能性地相互作用，且對(duì)于tsi2的需求可因此依賴于tse2。兩種基因的同時(shí)缺失的成功確認(rèn)了此假說(圖4A)。我們的發(fā)現(xiàn)暗示，Tsi2保護(hù)細(xì)胞免于Tse2。為了進(jìn)一步探查此可能性，我們將tse2導(dǎo)入A tse2 A t.si2背景。tse2表達(dá)的誘導(dǎo)完全消除了 A t.se2 A tsi2的生長(zhǎng)，但是其僅對(duì)野生型細(xì)胞具有弱效應(yīng)。這些數(shù)據(jù)展示，tse2編碼能抑制銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)生長(zhǎng)的毒性蛋白，且展示，tsi2編碼同源免疫蛋白。我們基于此性質(zhì)命名了 Tsi2 (VI:型分泌免疫蛋白2)。
Tsi2可通過涉及蛋白的直接相互作用的機(jī)理,或通過蛋白拮抗地對(duì)共同通路發(fā)揮功能的間接機(jī)理阻斷Tse2的活性。為了測(cè)定是否Tse2和Tsi2物理學(xué)相互作用，我們?cè)阢~綠假單胞菌(P. aeruginosa)中進(jìn)行了共免疫沉淀研究。在Tsi2-V的沉淀物中特別鑒定Tse2,指示穩(wěn)定的Tse2-Tsi2復(fù)合物(圖4B)。這些數(shù)據(jù)提供對(duì)Tse2和Tsi2之間的功能相互作用的額外的支持，且它們提示，Tse2的Tsi2抑制的機(jī)理可能涉及蛋白物理關(guān)聯(lián)。細(xì)胞內(nèi)Tse2對(duì)廣譜原核生物和真核生物細(xì)胞有毒性銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)廣泛分散在陸生和水生環(huán)境中，且其也是具有多樣的宿主范圍的機(jī)會(huì)性病原體。像這樣，自銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)輸出的Tse2具有與一系列生物相互作用的潛力，包括原核生物和真核生物。為了研究Tse2可靶向的生物，我們?cè)谧愿饔虻拇硇缘奈锓N的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)tse2。選擇2種真核生物細(xì)胞用于我們的調(diào)查，源于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和HeLa人上皮的細(xì)胞系。包括酵母主要為了多樣性,但是這些生物也與銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)在相配的環(huán)境中相互作用，并可因此代表毒素的祀(Wargo and Hogan, 2006)。將釀酒酵母(S. cerevisiae)細(xì)胞用對(duì)各tse基因的半乳糖-誘導(dǎo)性表達(dá)質(zhì)粒,或用空對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)化(Mumberg et al. , 1995)。相對(duì)于其他tse基因和對(duì)照，tse2表達(dá)導(dǎo)致在誘導(dǎo)條件下生長(zhǎng)48小時(shí)后可觀察的集落形成單位的顯著減小(圖5A)。為了致Tse2效應(yīng)對(duì)釀酒酵母(S. cerevisiae)的特異性,我們接下來測(cè)試了是否Tsi2可阻斷Tse2_介導(dǎo)的毒性。tsi2與tse2的共表達(dá)恢復(fù)了活力至類似于對(duì)照株的水平(圖5B)。此結(jié)果暗示，Tse2對(duì)釀酒酵母(S. cerevisiae)的效應(yīng)是特異性的，且毒素可經(jīng)類似機(jī)理在細(xì)菌和酵母中作用。我們的發(fā)現(xiàn)與對(duì)酵母有毒性的銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)蛋白的早先篩選一致。Arnoldo等人發(fā)現(xiàn)的Tse2在9種銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)蛋白之中，在包括知道的毒力因子的505的庫之內(nèi)，對(duì)釀酒酵母(S. cerevisiae)最有毒性(Arnoldo et al. ,2008)。使用報(bào)告子共轉(zhuǎn)染測(cè)定在HeLa細(xì)胞中探查Tse2對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的效應(yīng)。產(chǎn)生含有tse基因的表達(dá)質(zhì)粒及與GFP報(bào)告子質(zhì)粒混合。相對(duì)于對(duì)照,報(bào)告子質(zhì)粒用tsel和tse:3的共轉(zhuǎn)染對(duì)GFP表達(dá)無沖擊；但是,tse2質(zhì)粒的包括減少了 GFP表達(dá)至背景水平(圖5C和5D)。我們也注意到用tse2轉(zhuǎn)染和對(duì)照轉(zhuǎn)染的細(xì)胞之間的形態(tài)學(xué)差異，其在圓形細(xì)胞級(jí)分中明顯(圖5E)。這些是Tse2的特定效應(yīng)，如相比對(duì)照,tsi2表達(dá)質(zhì)粒包括進(jìn)tse2/GFP報(bào)告子質(zhì)粒轉(zhuǎn)染恢復(fù)了 GFP表達(dá)及降低了圓形細(xì)胞級(jí)分。從這些研究,我們總結(jié)，Tse2在相配的真核生物細(xì)胞類型中對(duì)必要的細(xì)胞過程具有有害的效應(yīng)。接下來我們質(zhì)問了是否Tse2在除了銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)之外的原核生物中具有活性。我們測(cè)試的2種生物，大腸埃希氏菌(Escherichia coli)和泰國伯克霍爾德氏菌(Burkholderia thailandensis)。將兩種生物用加工用于tse2,或作為對(duì)照，Tse2和Tsi2的誘導(dǎo)性表達(dá)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。在各情況中，tse2表達(dá)強(qiáng)烈抑制生長(zhǎng)，且用tsi2的共表達(dá)逆轉(zhuǎn)了此效應(yīng)(圖5F和5G)。結(jié)合我們?cè)卺劸平湍?S. cerevisiae)和HeLa細(xì)胞中觀察到的效應(yīng),我們總結(jié),Tse2是當(dāng)細(xì)胞內(nèi)施用時(shí)在廣譜生物中抑制必要的細(xì)胞過程的毒素。銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)可革C向細(xì)菌但不革G向具有Tse2的真核生物細(xì)胞由于tse2表達(dá)實(shí)驗(yàn)指示，毒素可作用于真核生物(圖5A E)，我們質(zhì)問是否銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)可用HI-T6SS祀向這些細(xì)胞。我們對(duì)一組銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)株測(cè)量了向HeLa和J774細(xì)胞的細(xì)胞毒性,包括Tse2分泌過多(AretS)和非-分泌背景(AretS AclpVl)。在分析的全部條件下,我們不能觀察Tse2_促進(jìn)的細(xì)胞毒 性或?qū)?xì)胞的形態(tài)學(xué)沖擊，如在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中觀察(圖6A和數(shù)據(jù)未顯示)。此外,對(duì)檢測(cè)Tse2或哺乳動(dòng)物細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中的其他Tse蛋白的嘗試產(chǎn)生無轉(zhuǎn)位證據(jù)(數(shù)據(jù)未顯示)。我們也研究了對(duì)與銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)共培養(yǎng)的酵母的Tse2-依賴性效應(yīng)；再次，無效應(yīng)可歸因?qū)se2(圖SI)。基于我們的數(shù)據(jù),我們總結(jié),銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)不可能利用Tse2作為針對(duì)真核生物細(xì)胞的毒素。此與早先報(bào)道的結(jié)果一致,其顯示,缺少retS的株是在急性毒力-相關(guān)的表型中高度衰減的，包括巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞細(xì)胞毒性(Goodmanet al. ,2004 ；Zolfaghar et al. , 2005),及小鼠中的急性肺炎和角膜感染(Zolfaghar etal.,2006) (Laskows ki et al. ,2004)。細(xì)胞內(nèi)tse2表達(dá)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響提示我們接下來研究是否其靶可為另一原核生物細(xì)胞。為了測(cè)試此，我們?cè)陉P(guān)于它們產(chǎn)生,分泌或抵抗Tse2的能力加工的A retS背景中，用銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)株進(jìn)行了一系列體外生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)。這些株之間的競(jìng)爭(zhēng)在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行或在多孔固體支持物上過濾后進(jìn)行。既不產(chǎn)生,也不分泌Tse2,也不針對(duì)毒素免疫，沖擊了液體培養(yǎng)基中競(jìng)爭(zhēng)株的生長(zhǎng)速率(圖6B)。相反，當(dāng)細(xì)胞在固體支持物上生長(zhǎng)時(shí)觀察到依賴于tse2和tsi2的驚人的增殖優(yōu)勢(shì)。在AretS和AretSA tse2 A tsi.2之間的生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)中，今后分別稱之為供體和受體株,5小時(shí)后供體細(xì)胞是約14倍更豐富(圖6B)。此完全是Tse2介導(dǎo)的,如自供體株的tse2的缺失,或tsi2添加到受體株，消除了生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。供體株之內(nèi)的clpVl滅活確認(rèn)，Tse2_介導(dǎo)的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)需要有功能的HI-T6SS (圖6B)。重要的是,供體的總增殖在各實(shí)驗(yàn)中保持恒定,指示，Tse2抑制受體株的生長(zhǎng)。為了檢查Tse2可輔助生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的程度,我們進(jìn)行了用及不用Tse2免疫的株之間的長(zhǎng)期競(jìng)爭(zhēng)。實(shí)驗(yàn)起始于約10 I的供體-受體細(xì)胞比，提高各受體細(xì)胞會(huì)接觸供體細(xì)胞的概率。在48小時(shí)之后，Tse2供體株相對(duì)于缺少免疫的受體株顯示了顯著的104倍生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)(圖6C)。這些數(shù)據(jù)最終展示,銅綠假單胞菌(P. aeruginosa) H1-T6SS可將Tse2靶向另一細(xì)菌細(xì)胞。在液體培養(yǎng)基中對(duì)比在固體支持物上進(jìn)行的競(jìng)爭(zhēng)之間觀察到的差異提示，需要密切供體-受體細(xì)胞接觸。我們未直接展示，Tse2轉(zhuǎn)位進(jìn)受體細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)，但是其是可能解釋我們的數(shù)據(jù)，假定需要細(xì)胞接觸及Tsi2是與毒素物理學(xué)相互作用的細(xì)胞質(zhì)免疫蛋白(圖4B)。討論T6SS具有牽涉多種，明顯差異的過程。很少例外，未知這些過程中分泌系統(tǒng)的作用模式。由于T6SS體系結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)高度保守的,我們將我們的研究基于假定,T6SS的多樣的活性，包括單個(gè)生物之內(nèi)的T6SS,必需可歸因于由各系統(tǒng)以特定方式輸出的多種底物蛋白。我們的發(fā)現(xiàn)支持此模型；我們鑒定了銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)之外缺乏直系同原物，及特別需要HI-T6SS用于它們的輸出的3種T6S底物(圖I和3)。細(xì)菌基因組編碼大和多樣的陣列的毒素-免疫蛋白(TI)系統(tǒng)(Gerdes et al.,2005)。這些可為對(duì)于質(zhì)粒維持,應(yīng)激應(yīng)答,程序性細(xì)胞死亡,細(xì)胞-命運(yùn)承諾和針對(duì)其他細(xì)、菌防御重要。Tse2不同于其他TI毒素，其通過大，特化的分泌設(shè)備輸出，而許多TI系統(tǒng)毒素是不活躍地分泌的，或它們利用sec通路(Riley and Wertz, 2002)。此區(qū)別暗示,通過T6S設(shè)備分泌對(duì)于Tse2靶向關(guān)聯(lián)環(huán)境,細(xì)胞或亞細(xì)胞隔室是需要的。的確，我們顯示,通過T6S設(shè)備的Tse2靶向?qū)τ谄浠钚允潜匾?圖6)。我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，Tse2針對(duì)相配的細(xì)菌和真核生物細(xì)胞是有活性的(圖4和5)。盡管如此，我們發(fā)現(xiàn)無銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)可將Tse2革巴向真核生物細(xì)胞，包括上皮和巨噬細(xì)胞來源的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的證據(jù)(圖6A和數(shù)據(jù)未顯示)。意外地,銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)有效將毒素革E向另一細(xì)菌細(xì)胞(圖6)。這些發(fā)現(xiàn),結(jié)合隨后的新近觀察，提供對(duì)如F假說的支持，T6SS可作為細(xì)菌間相互作用通路。第I，分泌系統(tǒng)存在，且在許多非-病原性，獨(dú)居細(xì)菌中保守(Bingle et al.，2008 ；Boyer et al.，2009)。第2，有實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持噬菌體T4及的分泌設(shè)備和尾蛋白細(xì)胞外組分之間的進(jìn)化關(guān)系(Ballisteret al. , 2008 ；Leiman et al. 2009 ；Pell et al. 2009 ；Pukatzki et al. ,2007)。最終,2個(gè)新近報(bào)道牽涉了細(xì)菌間相互作用中保守的T6S組分,VgrG。沙門氏菌屬(Salmonella)基因組的生物信息學(xué)分析鑒定了帶有與細(xì)菌-靶向S-型膿菌素高度相關(guān)的C-端效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域的一組“進(jìn)化的” VgrG蛋白，及自奇好變形桿菌(Proteus mirabi I is)的VgrG蛋白顯示參與物種內(nèi)自我/非-自我識(shí)別通路(Blondel et al. ,2009 ；Gibbs et al. ,2008)。也明白，在特定實(shí)例中，T6SS已進(jìn)化為作用于真核生物細(xì)胞。在至少2個(gè)報(bào)道中，T6S設(shè)備已展示將蛋白遞送至真核生物細(xì)胞(Ma et al. ,2009 ；Suarez et al. ,2009)。而且，幾種病原性細(xì)菌的T6SS是主要毒力因子(Bingle et al. ,2008)。結(jié)合我們的發(fā)現(xiàn)，我們斷定,有2個(gè)寬組T6SS,靶向細(xì)菌的那些和靶向真核生物的那些。目前不可能排除給定T6SS可具有雙特異性。但是，我們的不能檢測(cè)真核生物細(xì)胞感染中Tse2的效應(yīng)，且Tse2分泌過多株在急性感染動(dòng)物模型中衰減(Laskowski et al.，2004 ;Zolfaghar et al. ,2006)，提示,T6S設(shè)備可為高度辨別的。在這點(diǎn)上，啟發(fā)性地認(rèn)為自細(xì)菌間相互作用通路進(jìn)化了其他分泌系統(tǒng)。假定從細(xì)菌綴合系統(tǒng)進(jìn)化了 IVA型和IVB型分泌系統(tǒng)(Burns, 2003 ；Christieet al. ,2005 ；Lawley et al. , 2003) 0這些系統(tǒng)在真核生物細(xì)胞中毒中有效,但是測(cè)量指示，底物轉(zhuǎn)位進(jìn)細(xì)菌以僅 1X10 7供體細(xì)胞的頻度發(fā)生(Luo and Isberg, 2004) 相反，Tse2通過H1-T6SS靶向細(xì)菌呈現(xiàn)許多數(shù)量級(jí)更有效,如我們的測(cè)定中的供體株能有效抑制等同量的受體細(xì)胞的凈生長(zhǎng)。宿主適應(yīng)了 IV型分泌系統(tǒng),H1-T6SS代表在革蘭氏陰性特化的分泌系統(tǒng)的細(xì)胞靶向特異性中的2個(gè)明顯的極端。此外，它們顯示，高程度的區(qū)別可在靶向真核生物和原核生物的通路之間存在。
Tse2和H1-T6SS的生理學(xué)關(guān)聯(lián)靶向細(xì)菌仍是待研究的問題。我們起始了確定物種間相互作用中這些因素的作用的研究，但是我們尚未鑒定效應(yīng)。此可為因?yàn)橛摄~綠假單胞菌(P. aeruginosa)釋放的可擴(kuò)散的抗-細(xì)菌分子支配在圖6中使用的條件下進(jìn)行的生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果(Hoffmanet al. ,2006 ；Kessler et al. , 1993 ；Voggu et al. , 2006) 0 在設(shè)計(jì)為允許這些因子的自由擴(kuò)散,及由此更緊密模擬天然的設(shè)置的未來研究中，可緩和它們的作用。有趣的是，全部測(cè)序的銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)株呈現(xiàn)出編碼t.se2和t.si2的直系同原物。此外，我們發(fā)現(xiàn)基因普遍地存在于44個(gè)隨機(jī)選擇的CF患者臨床分離物的庫之內(nèi)(圖S2)。盡管這些發(fā)現(xiàn),仍可能Tse2-介導(dǎo)的銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)間的相互作用可在天然的情景中關(guān)聯(lián)。例如,其可不是毒素或其免疫蛋白的簡(jiǎn)單存在或缺失,而是決定相互作用的結(jié)果的表達(dá)這些特性的程度和方式。在臨床分離物的當(dāng)前調(diào)查中，我們注意到H1-T6SS活化的高程度的異質(zhì)性，如通過IIcpl分泌水平判斷(Mougous et al. ,2006 ；Mougous et a!. ,2007).當(dāng)前研究中使用的野生型株不分泌Hcpl,且在此背景中，HI-T6SS不提供針對(duì)免疫-缺陷型株的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)(數(shù)據(jù)未顯示)。但是,許多臨床分離物的H1-T6SS活化狀態(tài)模擬AretS背景，由此這些株有可能能在與其他細(xì)菌的競(jìng)爭(zhēng)中使用Tse2。在此情景中，引起興趣的是，tse及IISI-I表達(dá)通過Gac/Rsm通路經(jīng)歷嚴(yán)格的調(diào)節(jié)(圖3E)。由于此通路應(yīng)答細(xì)菌信號(hào)，包括敏感株和其他假單胞菌屬(Pseudomonas)的那些(Lapouge et al. ,2008),想得到,細(xì)胞間識(shí)別可為Tse2產(chǎn)生和抗性的重要方面。Tse2的H1-T6SS-依賴性遞送的細(xì)胞間接觸需求提示，系統(tǒng)可在涉及相對(duì)固定細(xì)胞，諸如生物膜中包裹的細(xì)胞的情景中起到重要作用?；颊哂肅F的多克隆和多種微生物性肺感染,其中細(xì)菌被認(rèn)為在生物膜-樣結(jié)構(gòu)之內(nèi)，是Tse2可提供針對(duì)銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)的適合度優(yōu)勢(shì)的-一種設(shè)置(Sibley et al. , 2006 ；Singh et al. , 2000)。有趣地，銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)是特別擅長(zhǎng)適應(yīng)此環(huán)境及在此環(huán)境中競(jìng)爭(zhēng),且研究顯不，其可甚至替換既有細(xì)菌(D, Argenio et al. , 2007 ；Deretic et al.，1995 ;Hoffman etal. , 2006 ；Nguyen and Singh, 2006) (Foundation, 2007)。如果 Tse2 在 CF 感染中，在銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)的適合度中起到關(guān)鍵作用，此可解釋自CF患者的分離物中觀察到的提升的表達(dá)和H1-T6SS 的活化(Mougous et al. , 2006 ；Mougous et al. , 2007 ；Starkeyet al. ,2009 ;Yahr,2006)。實(shí)驗(yàn)過程細(xì)菌株,質(zhì)粒和生長(zhǎng)條件在此研究中使用的銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)株源于測(cè)序的株P(guān)AOl (Stoveret al. ,2000) o使銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)于37 °C生長(zhǎng)在根據(jù)需要補(bǔ)充了 30 u gm],1慶大霉素,300 U g ml,1羧芐西林，25u g ml,1依加珊，5 % w/v蔗糖，0. 5mM IPTG和40 u g mr1 X-gal (5-溴-4-氯-3-卩引哚基 -D-卩比喃半乳糖苷)的 Luria-Bertani (LB)培養(yǎng)基中。使泰國伯克霍爾德氏菌(Burkholderia thailandensis)E264和大腸埃希氏菌(Escherichia coli) BL21生長(zhǎng)在根據(jù)需要含有200 Ii g mr1甲氧節(jié)唆，50 Ii g ml-1卡那霉素,0. 2 % w/v葡萄糖，0. 2 % w/v鼠李糖和0. 5mM IPTG的LB培養(yǎng)基中。使用于與銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)綴合的大腸埃希氏菌(E. coli) SMlO生長(zhǎng)在含有15 y g mr1慶大霉素的LB培養(yǎng)基中。用于誘導(dǎo)性表達(dá)的質(zhì)粒包括用于銅綠假單胞菌(P. gaeruginosa)的 pPSV35，pPSV35CV 和 pSW196(Baynham et al. ,2006 ；Hsu et al. ,2009 ；Rietsch etal. , 2005),用于大腸埃希氏菌(E. coli)的pET29b (Novagen),用于泰國伯克霍爾德氏菌(B. thailandensis)的 pSCrhaB2 (Cardona and Valvano, 2005),及用于釀酒酵母(S. cerevisiae)的 p426-GAL-L 和 p423-GAL-L (Mumberg et al. , 1995)。如之前描述產(chǎn)生染色體融合和基因缺失(Mougous et a!. , 2006 ；Rietsch et al.，2005)。見用于特定克隆過程的補(bǔ)充性實(shí)驗(yàn)過程。分泌蛋白質(zhì)組制備使細(xì)胞在含有如在合成CF痰培養(yǎng)基中定義的19mM氨基酸的Vogel-Bonner最小培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至光學(xué)密度600nm (OD6cw) I. (KPalmer et al.,2007)。HI-T6SS活性需要氨基酸存在(數(shù)據(jù)未顯示)。蛋白如之前描述制備(Wehmhoner et' al. ,2003)。質(zhì)量光譜法
使沉淀的蛋白懸浮于100 U I的50mM NH4HCO3中的6M脲,分別用二硫蘇糖醇和碘乙酰胺還原及烷基化及，用胰蛋白酶(50 I蛋白胰蛋白酶比)消化。將得到的肽用VydacC18柱(Nest組)根據(jù)生產(chǎn)商的流程脫鹽。將樣品干燥至5 UL,重懸浮于0. 1%甲酸/5%乙腈及在LTQ-Orbitrap質(zhì)譜儀(Thermo Fisher) .....t以一式三份分析。使用Sequest搜索數(shù)據(jù)(Eng et al. ’ 1994)及用肽/蛋白Prophet確認(rèn)(Keller et al. ,2002)。使用光譜計(jì)數(shù)計(jì)算鑒定的蛋白的相對(duì)豐度(Liu et al. ,2004)。見補(bǔ)充性實(shí)驗(yàn)過程額外的MS過程。蛋白的制備和蛋白印跡如之前描述制備細(xì)胞-相關(guān)的和上清液樣品(Hsu et al. ,2009)。如之前描述進(jìn)行蛋白印跡(Mougous et al. ,2006),例外是Tse蛋白的檢測(cè)需要在含有0. 05% v/v Tween20的Tris-緩沖的鹽水(TBST)中、在5% BSA中的第一抗體溫育。使用a -GSK檢測(cè)GSK標(biāo)簽(Cell Signaling Technologies)。免疫沉淀在中-對(duì)數(shù)期通過于4°C離心(6, 000Xg,3min)收獲在適當(dāng)?shù)奶砑觿┲猩L(zhǎng)的細(xì)胞，及重懸浮于IOral的含有蛋白酶抑制物(Sigma)和溶菌酶(0. 2mg m],1)的緩沖劑I (200mM NaCl, 20mM Tris pH7. 5, 5%甘油，2mM 二硫蘇糖醇,0. I % triton)中。通過超聲處理破壞細(xì)胞，并通過于4°C離心(25，000Xg,30min)澄清得到的裂解產(chǎn)物。移出(Pre) ____匕清液物質(zhì)的樣品，并將殘留物與100 U I的a -VSV-G瓊脂糖珠(Sigma)于4°C溫育2小時(shí)。將珠用15m:[的緩沖劑I洗滌3次，并通過離心沉淀。將蛋白用SDS-PAGE裝載緩沖劑洗脫。熒光顯微鏡檢通過離心(6，000Xg,3min)收獲中-對(duì)數(shù)期培養(yǎng)，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌,及用含有0.5mM TM-DPII(Molecular Probes)的PBS重懸浮至0D6QQ5。如之前描述進(jìn)行顯微鏡檢(Hsu et al. ,2009)。顯示的全部像相同地操作。酵母毒性測(cè)定將釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) BY4742 (MAT a his3 A I leu2 A 0lys2 A 0 ura3 A 0)用含有tsel, tse2，tse’3的p426-GAL-L,或空載體轉(zhuǎn)化，并生長(zhǎng)在SC-Ura+2%葡萄糖中(Mumberg et al. , 1.995)。培養(yǎng)物用水重懸浮至0D_1. 0,并連續(xù)稀釋5倍到SC-Ura+2%葡萄糖瓊脂或SC_Ura+2 %半乳糖+2%棉子糖瓊脂。在攝影之前將板于30°C溫育2天。將tsi2基因克隆進(jìn)p423-GAL-L，并轉(zhuǎn)化進(jìn)帶有p426_GAL_L質(zhì)粒的釀酒酵母(S. cerevisiae)BY4742。使培養(yǎng)物生長(zhǎng)在SC-Ura-IIis+2%葡萄糖中。
生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定將過夜培養(yǎng)物以適當(dāng)?shù)墓w-受體比混合至在5ml LB培養(yǎng)基中約1.0X108CFU/ml的總密度。在各實(shí)驗(yàn)中，供體或受體株含有在中性噬菌體附接位點(diǎn)插入的lacZ(Vanceet a!. ,2005).此基因?qū)Ω?jìng)爭(zhēng)結(jié)果無效應(yīng)。將共培養(yǎng)物過濾到47mm 0. 2 Ii m硝酸纖維素膜(Nalgene)及放置到LB瓊脂上或以I 100接種到2ml LB(含有0.4% w/v L-阿糖,如果需要)及于37°C伴隨振搖溫育。將過濾-生長(zhǎng)的細(xì)胞重懸浮于LB培養(yǎng)基及平鋪在含有X-gal的LB瓊脂上。細(xì)胞培養(yǎng)和感染測(cè)定將HeLa細(xì)胞培養(yǎng)及維持在根據(jù)需要補(bǔ)充了 10 %胚胎牛血清(FBS)和100 U g mF1青霉素或鏈霉素的Dulbecco氏修飾的eagle培養(yǎng)基(DMEM, Invitrogen)中。于37°C在5% CO2存在下進(jìn)行溫育。使用在96-孔板中以2. 0 X IO4細(xì)胞/孔的密度接種的細(xì)胞進(jìn)行感染測(cè)定。在o/n溫育后,將孔在IXHank氏平衡的鹽溶液中洗滌和添加缺少丙酮酸鈉和抗生素的DMEM0將細(xì)菌接種物以來自O(shè)D6mL 0培養(yǎng)物的50的多重感染加入孔。溫育5小時(shí)后，使用CytoTox-One測(cè)定(Promega)測(cè)量百分率細(xì)胞毒性。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，細(xì)胞變圓測(cè)定，及流式細(xì)胞分析將HeLa細(xì)胞以2. 0 X IO5細(xì)胞/孔的密度接種于24-孔平底部板，及在o/n補(bǔ)充了10% FBS的DMEM溫育。使用陽離子脂質(zhì)體根據(jù)生產(chǎn)商的流程進(jìn)行報(bào)告子共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。將轉(zhuǎn)染的DNA的總量使用等同量的GFP報(bào)告子質(zhì)粒(空pEGFP-Nl (Clonetech)) (tse表達(dá)質(zhì)粒(源于pEGFP-Nl)之一)標(biāo)準(zhǔn)化,并指示非特異性質(zhì)?；騮si2表達(dá)質(zhì)粒。使用自以40X放大率獲取的3個(gè)隨機(jī)場(chǎng)的相差像手動(dòng)定量細(xì)胞變圓。在流式細(xì)胞術(shù)之前，將HeLa細(xì)胞洗滌2次,并重懸浮于補(bǔ)充了 0. 75% FBS的I XTOS。在BD FACscan2細(xì)胞分析儀上進(jìn)行分析，并使用FlowJo 7. 5軟件(Tree Star, Inc.)計(jì)算平均GFP強(qiáng)度。實(shí)施例2產(chǎn)生Tse2和Tsi2突變體并分別測(cè)試細(xì)胞毒性活性和針對(duì)Tse2細(xì)胞毒性的免疫的保存。測(cè)試表I中列的截短突變體的(a)如通過銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)PAOl Atse2Atsi2.中等位基因的異位表達(dá)判斷的毒性，(b)如通過a-VSV-G蛋白印跡測(cè)定的表達(dá)，及(C)通過自PAOl A retS A tse2對(duì)比PAOl A retS A tse2 A clpVl制備的濃縮的上清液中指示的蛋白的存在測(cè)定的分泌。表I中列的突變體基于銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)PAOl序列(SEQ ID NO :2)。全部截短在它們的C-端與VSV-G表位融合。表I.經(jīng)Tse2截短突變體的T6S的毒性和分泌。
存在的Tse2殘留物1 毒性2表達(dá)3 分泌47-158+++
10 158:+~:
13-158-~-
權(quán)利要求
1.重組載體,其包含編碼VI型分泌輸出蛋白2(Tse2)的第I基因,其中第I基因可操作地連接于異源調(diào)控序列。
2.權(quán)利要求I的重組載體，其中載體包含一個(gè)或更多獨(dú)特限制酶識(shí)別位點(diǎn)，且其中核酸插入子克隆進(jìn)一個(gè)或更多獨(dú)特限制酶識(shí)別位點(diǎn)破壞第I基因的表達(dá)。
3.權(quán)利要求I或2的重組載體，其中重組載體包含至少第I和第2重組位點(diǎn)，它們側(cè)接可操作地連接于調(diào)控序列的編碼Tse2的第I基因,其中所述第I和第2重組位點(diǎn)不彼此重組。
4.權(quán)利要求I 3之任一項(xiàng)的重組載體,其中第I基因包含能編碼下列氨基酸序列的核苷酸序列SEQ ID NO 2, SEQ ID NO :4, SEQ ID NO :5, SEQ ID NO :6, SEQ ID NO :7 或 SEQID NO :8。
5.權(quán)利要求I 4之任一項(xiàng)的重組載體,其中第I基因的調(diào)控序列被條件性地控制。
6.權(quán)利要求I 5之任一項(xiàng)的重組載體，其還包含可操作地連接于調(diào)控序列的編碼Tse2解毒劑的第2基因。
7.權(quán)利要求6的重組載體,其中第2基因編碼VI型分泌免疫蛋白2(Tsi2)。
8.權(quán)利要求4 8之任一項(xiàng)的重組載體，其中第2基因包含能編碼F列氨基酸序列的核苷酸序列SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11 或 SEQ ID NO :13。
9.權(quán)利要求4 6之任一項(xiàng)的重組載體,其中第2基因的調(diào)控序列被條件性地控制。
10.權(quán)利要求I 9之任一項(xiàng)的重組載體,其中載體包含質(zhì)粒。
11.權(quán)利要求I 9之任一項(xiàng)的重組載體，其中載體包含病毒核酸。
12.重組宿主細(xì)胞,其包含權(quán)利要求I 11之任一項(xiàng)的重組載體。
13.權(quán)利要求12的重組宿主細(xì)胞,其中宿主細(xì)胞是原核生物細(xì)胞。
14.權(quán)利要求12的重組宿主細(xì)胞,其中宿主細(xì)胞是真核生物細(xì)胞。
15.用于可選擇性克隆的方法，包括 如果無插入子存在，在適合于Tse2由重組載體表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求12 14之任一項(xiàng)的重組宿主細(xì)胞,并 選擇那些由于包含具有克隆進(jìn)表達(dá)載體的插入子的重組載體而生長(zhǎng)的細(xì)胞。
16.產(chǎn)生缺乏插入子的克隆載體的方法,包括 在適合于載體復(fù)制和Tse2表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求12 14之任一項(xiàng)的重組宿主細(xì)胞，其中重組宿主細(xì)胞還表達(dá)Tse2解毒劑,并 從宿主細(xì)胞分離載體。
17.權(quán)利要求16的方法,其中Tse2解毒劑包含Tsi2。
18.權(quán)利要求17的方法，其中Tsi2包含下列氨基酸序列SEQID NO :10, SEQ ID NO 11 或 SEQ ID NO: 13。
19.重組載體,其包含編碼Tsi2的核酸,其中核酸可操作地連接于調(diào)控序列。
20.權(quán)利要求19的重組載體，其中核酸包含能編碼下列氨基酸序列的核苷酸序列=SEQID NO 10, SEQ ID NO 11 或 SEQ ID NO :13。
21.宿主細(xì)胞,其在其基因組中包含可操作地連接于調(diào)控序列的編碼Tse2的第I重組基因。
22.權(quán)利要求23的宿主細(xì)胞,其還包含編碼Tse2的解毒劑的第2重組基因，其中第2基因可操作地連接于調(diào)控序列。
23.權(quán)利要求21或22的宿主細(xì)胞，其中第I重組基因和/或第2重組基因作為染色體插入存在。
24.權(quán)利要求22 24之任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中第2基因編碼Tsi2類型。
25.權(quán)利要求21 24之任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞,其中第I基因的調(diào)控序列被條件性地控制。
26.權(quán)利要求21 25之任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞,其中第2基因的調(diào)控序列被條件性地控制。
27.權(quán)利要求21 26之任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞,其中宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。
28.權(quán)利要求21 27之任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中第I基因包含能編碼下列氨基酸序列的核苷酸序列SEQ ID NO 2, SEQ ID NO :4, SEQ ID NO :5, SEQ ID NO :6, SEQ ID NO 7 或SEQ ID NO:8。
29.權(quán)利要求22 29之任--項(xiàng)的宿主細(xì)胞,其中第2基因包含能編碼下列氨基酸序列的核苷酸序列=SEQ ID NO :10, SEQ ID NO :11 或 SEQ ID NO :13。
30.權(quán)利要求I 11之任一項(xiàng)的載體,其中載體是線性的。
31.權(quán)利要求I 11之任一項(xiàng)的載體，其中載體經(jīng)處理而減少缺乏目的DNA片段的載體的形成。
32.權(quán)利要求I 11之任一項(xiàng)的載體,其中載體適合于TA或拓?fù)洚悩?gòu)酶克隆反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明提供其生存性可條件性地控制的宿主細(xì)胞，及可用于制備該宿主細(xì)胞及用于可選擇性克隆的載體。
文檔編號(hào)C12N15/86GK102741273SQ201080062504
公開日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2010年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月16日
發(fā)明者J·莫格斯 申請(qǐng)人:華盛頓大學(xué)