專利名稱：逆轉(zhuǎn)朗格漢斯細(xì)胞免疫抑制的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及逆轉(zhuǎn)免疫抑制的方法。特別地，本發(fā)明涉及逆轉(zhuǎn)人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus, HPV)的免疫抑制以及治療HPV感染。
背景技術(shù)：
人乳頭瘤病毒(HPV)是性傳播的DNA病毒家族，其具有超過100種不同的基因型?；谒鼈兯l(fā)的病變譜，所述基因型分為低風(fēng)險(xiǎn)型和高風(fēng)險(xiǎn)型。低風(fēng)險(xiǎn)型主要誘導(dǎo)良性生殖道濕撫和低級別鱗狀上皮內(nèi)病變(low-grade squamous intraepithelial lesion),而高風(fēng)險(xiǎn)型與肛門生殖器癌的發(fā)生有關(guān)并且可以在> 99%的子宮頸癌中檢測到(其中在約50%的病例中發(fā)現(xiàn)HPV 16)。在美國，估計(jì)有75%的性活躍人群在其一生中染上至少一種生殖器HPV類型。盡管通過有效的帕帕尼古拉烏(Papanicolaou，Pap))涂片篩查、早期檢測和治療可以使由子宮頸癌導(dǎo)致的發(fā)病率和死亡率降低，然而在美國很多移民所來源的發(fā)展中國家中，這些措施均不易獲得。在發(fā)展中國家中，子宮頸癌仍是婦女中癌癥相關(guān)死亡的第二大原因。重要的是，由于不斷變化的人口特征，預(yù)計(jì)該疾病所造成的負(fù)擔(dān)在接下來的幾十年間將顯著增加。即使在美國，其篩查計(jì)劃已使侵襲性癌癥的整體比率降低，但是在白種非西班牙裔婦女、黑人婦女、西班牙裔婦女和經(jīng)濟(jì)上處于劣勢的婦女之間，癌癥的發(fā)生率仍存在不同。在美國，目前FDA批準(zhǔn)之HPV預(yù)防性疫苗(GARDASIL (Merck))的外顯率令人失望。在2007年，該疫苗僅施用給年齡為13-17歲女孩中的25%、年齡為18-26歲的所有女性中的10%，并且僅給與西班牙裔婦女中的1.1%。此外，該疫苗對已感染所述病毒的婦女(無論其是否已發(fā)生(前)癌性子宮頸病變)無效?？紤]到感染HPV的終生風(fēng)險(xiǎn)以及疫苗覆蓋率嚴(yán)重不足的人群將很可能繼續(xù)以驚人速度發(fā)生子宮頸疾病和其它HPV相關(guān)疾病的事實(shí)，顯然非常需要減輕病毒感染發(fā)生后產(chǎn)生之致癌作用的治療方法。HPV是非裂解性、非包膜病毒。其“早期”和“晚期”蛋白的基因組編碼區(qū)被命名為“E”和“L”。E蛋白執(zhí)行對于基因組復(fù)制來說關(guān)鍵的調(diào)節(jié)功能，其中的兩種蛋白(E6和E7)在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用，而兩種L蛋白(LI和L2)是自組裝的衣殼蛋白，其負(fù)責(zé)DNA包裝和病毒體組裝。乳頭瘤病毒感染的獨(dú)特之處在于:其生成周期與增殖中的宿主表皮或粘膜基底上皮細(xì)胞的細(xì)胞分化相關(guān)聯(lián)。HPV在其生命周期中保持在上基部(suprabasal)，因此其僅與表皮中的細(xì)胞(例如基底細(xì)胞和朗格漢斯細(xì)胞(Langerhans cells, LC)相接觸。由于其生成周期與細(xì)胞分化相關(guān)聯(lián)，因此很難在體外產(chǎn)生HPV病毒體。作為HPV病毒體的替代物，已開發(fā)了能夠攜帶報(bào)告質(zhì)粒的HPV病毒樣顆粒(virus-like particle, VLP)和HPV假病毒體(二者均是在本申請人實(shí)驗(yàn)室中建立的技術(shù))。高風(fēng)險(xiǎn)HPV的持久感染是發(fā)生子宮頸癌的主要風(fēng)險(xiǎn)因素。雖然大多數(shù)感染HPV的婦女清除了病毒，但是所花費(fèi)的時(shí)間可能在數(shù)月至數(shù)年的范圍內(nèi)。約15%的已感染高風(fēng)險(xiǎn)HPV的婦女不能引發(fā)針對HPV的有效免疫應(yīng)答，這使得病毒持續(xù)存在數(shù)十年。清除速率慢和缺乏有效免疫表明，HPV以某種方式逃脫了免疫應(yīng)答。
HPV已發(fā)展出逃避立即清除的多種逃脫機(jī)制，使病毒得以在宿主中復(fù)制和持續(xù)存在。本申請人已顯示HPV利用LC作為免疫逃脫的一種機(jī)制，顯示于圖4中。LC位于皮膚和粘膜的上皮層中，其是與HPV接觸的第一個(gè)并且是關(guān)鍵性的APC。因此，LC負(fù)責(zé)起始針對HPV感染的有效免疫應(yīng)答。一旦識(shí)別外來抗原，LC經(jīng)歷包括表型和功能變化的成熟過程，包括共刺激分子⑶80和⑶86、I類和II類MHC、趨化因子受體(例如CCR7)的上調(diào)，細(xì)胞因子和趨化因子的分泌以及向局部淋巴結(jié)的遷移。本申請人已確定，暴露于HPV16 L1L2 VLP的LC不上調(diào)共刺激分子和趨化因子受體，不分泌細(xì)胞因子和趨化因子，并且不起始針對HPV16 VLP來源之抗原的表位特異性免疫應(yīng)答。相反，髓樣DC被HPV16L1L2 VLP活化，并且一經(jīng)活化即刺激HPV特異性T細(xì)胞。攝入HPV16L1L2 VLP后，DC和LC中起始不同的胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)。當(dāng)用HPV16L1L2 VLP刺激時(shí)，在DC中，有絲分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activatedprotein kinase,MAPK)途徑被活化,而其在LC中不活化。然而,在LC中,磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)途徑被活化,引發(fā)導(dǎo)致Akt失活的信號級聯(lián)反應(yīng)。HPV16 E7特異性T細(xì)胞能夠識(shí)別并殺死暴露于HPV16 L1L2-E7嵌合型VLP (chimeric VLP,cVLP)的LC，表明cVLP內(nèi)化后，HPV肽由LC呈遞，但是HPV16 L1L2 VLP抑制LC引發(fā)免疫應(yīng)答。綜上，這些數(shù)據(jù)揭示，在不存在共刺激時(shí)，LC呈遞HPV來源的肽，因而發(fā)生耐受和免疫抑制。這繼而可以導(dǎo)致HPV持久感染以及發(fā)生癌癥的可能性增加。HPV的預(yù)防性疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生高效價(jià)的HPV中和抗體，并且已顯示在長達(dá)6.5年的隨訪中具有高效力以及穩(wěn)定水平的抗體。然而，在感染HPV的婦女中，一項(xiàng)3期試驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)經(jīng)接種組與對照組相比病毒清除加速的證據(jù)，確定性地表明基于VLP的預(yù)防性疫苗缺乏治療效力。此外，由于HPV培養(yǎng)時(shí)間長、存在幾種免疫逃避機(jī)制以及僅進(jìn)行了幾年的觀察，因此預(yù)防性疫苗對癌癥預(yù)防的持續(xù)效力仍有待確定。事實(shí)上，約三分之一的子宮頸癌是由除目前疫苗中存在之HPV以外的HPV類型引起的，這增加了難題的范圍。因此，需要花費(fèi)數(shù)十年才能夠測出針對子宮頸癌率的可計(jì) 量效果。同時(shí)，對于全世界數(shù)以億計(jì)的、目前感染了高風(fēng)險(xiǎn)HPV或者在未來幾年內(nèi)會(huì)感染的婦女來說，仍然需要治療HPV感染和相關(guān)病變的療法。手術(shù)是對患有子宮頸上皮內(nèi)腫瘤(cervicalintraepithelial neoplasia, CIN)病變之患者的標(biāo)準(zhǔn)療法，其通常據(jù)稱在一年隨訪時(shí)去除CIN病變的有效率高達(dá)90%。然而，當(dāng)監(jiān)測婦女的整個(gè)生存期時(shí)，其有效率較低。多于80%的經(jīng)歷過手術(shù)過程的婦女在如下情形下將隨后再次需要進(jìn)行第二次相關(guān)過程:手術(shù)未去除HPV感染，或者對一種HPV類型的清除激發(fā)了繼發(fā)性HPV感染的再活化。開發(fā)中的治療性疫苗旨在通過活化患者自身的細(xì)胞免疫應(yīng)答來控制惡變，以及靶向(前)癌細(xì)胞中存在的抗原。在過去的十五年中，已開發(fā)了數(shù)種候選疫苗，然而迄今為止還沒有一種癌癥疫苗得到美國食品藥品監(jiān)督管理局的批準(zhǔn)。需要防止HPV感染到達(dá)誘導(dǎo)癌癥發(fā)生階段的干預(yù)手段。這樣的干預(yù)是可行的，因?yàn)槔檬惺鄣腍PV檢測試劑盒(Digene Corp.)可以在早期檢測到HPV感染。幾條證據(jù)證實(shí)了細(xì)胞免疫系統(tǒng)在控制HPV和相關(guān)子宮頸病變的發(fā)病機(jī)制中的重要性。首先，25 40%的HPV陽性、輕微發(fā)育異常的病變自發(fā)地或者在局部活檢不久之后消退，這表明衰退可能涉及局部炎癥的誘導(dǎo)。其次，免疫缺陷與HPV感染的發(fā)生率增加有關(guān)。衰退中的HPV相關(guān)之皮膚疣和生殖器疣常常在病變處存在T淋巴細(xì)胞，這表明活躍的針對HPV的細(xì)胞介導(dǎo)之免疫應(yīng)答可能是疾病衰退的要件之一。綜上所述，這些研究表明，對HPV感染及其相關(guān)疾病的治療方案應(yīng)當(dāng)旨在誘導(dǎo)感染部位的強(qiáng)的細(xì)胞免疫。
因此，需要在婦女的整個(gè)生存期間針對HPV的有效免疫治療，以及克服HPV誘導(dǎo)之LC免疫抑制(其阻止有效治療)的方法。
發(fā)明概要本發(fā)明提供了治療人乳頭瘤病毒(HPV)的方法，其包括向感染有HPV的患者施用治療有效量的來源于原代細(xì)胞之生物制品以及誘導(dǎo)針對HPV感染之免疫應(yīng)答的步驟。本發(fā)明還提供了克服HPV誘導(dǎo)之朗格漢斯細(xì)胞(LC)免疫抑制的方法，其包括向感染有HPV的患者施用治療有效量的來源于原代細(xì)胞之生物制品以及使LC活化的步驟。

本發(fā)明提供了提高LC向淋巴結(jié)遷移的方法，其包括向感染有HPV的患者施用治療有效量的來源于原代細(xì)胞之生物制品、使LC活化以及誘導(dǎo)LC向淋巴結(jié)遷移的步驟。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生針對HPV之免疫力的方法，其包括向感染有HPV的患者施用有效量的來源于原代細(xì)胞之生物制品、產(chǎn)生針對HPV的免疫力以及防止新病變發(fā)生的步驟。


通過參考以下詳細(xì)描述并結(jié)合附圖，本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)會(huì)很容易理解。圖1是朗格漢斯細(xì)胞(LC)中表達(dá)的表型標(biāo)志物的直方圖(現(xiàn)有技術(shù))；圖2是顯示LC之⑶86表達(dá)的圖(現(xiàn)有技術(shù))；圖3是未活化LC與活化LC的示意圖；圖4是HPV誘導(dǎo)LC耐受的示意圖；圖5是LC活化實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的示意圖；圖6是暴露于HPV16和IRX-2的人LC上的表面活化標(biāo)志物上調(diào)的圖。圖7是顯示在不存在和存在HPV16時(shí)IRX-2誘導(dǎo)人LC遷移的圖。圖8是顯示暴露于IRX-2的人朗格漢斯細(xì)胞在HPV存在下較好地刺激同種異體T細(xì)胞的圖。圖9是顯示暴露于HPV之后經(jīng)IRX-2處理的人朗格漢斯細(xì)胞分泌高水平之IL_8和IP- ο的圖。發(fā)明詳述本發(fā)明一般性地提供了通過施用來源于原代細(xì)胞的生物制品(IRX-2)來治療HPV以及克服HPV誘導(dǎo)之LC免疫抑制的方法。本發(fā)明的療法有效地用于治療具有持久性HPV以及免疫系統(tǒng)不能產(chǎn)生針對HPV之有效應(yīng)答的患者。本文中使用的“有效量”是指實(shí)現(xiàn)本發(fā)明期望結(jié)果(即，在感染HPV的患者中產(chǎn)生LC免疫抑制的逆轉(zhuǎn))所需的來源于原代細(xì)胞之生物制品的量。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定應(yīng)給予特定患者的來源于原代細(xì)胞之生物制品的量?！癐RX-2”也稱為“citoplurikin”，其是來源于白細(xì)胞、來源于天然原代細(xì)胞的生物制品，其在cGMP標(biāo)準(zhǔn)下由經(jīng)植物血凝素(PHA)和環(huán)丙沙星(ciprofloxacin)刺激的純化人白細(xì)胞(單個(gè)核細(xì)胞(mononuclear))產(chǎn)生。主要的活性組分有白介素I β (IL-1 β，本文中也稱為IL-1)、白介素2(IL-2)、白介素6 (IL-6)、白介素8 (IL-8)、腫瘤壞死因子a (TNF-α )和Y-干擾素(IFN-γ)。優(yōu)選地，本發(fā)明中使用的IRX-2包括這6種關(guān)鍵性細(xì)胞因子，并且可以僅含有這6種關(guān)鍵性細(xì)胞因子。IRX-2先前還被稱為“NCM” 一天然細(xì)胞因子混合物，其在美國專利N0.6，977，072和7，153，499中定義和列出。術(shù)語“IRX-2”、“來源于原代細(xì)胞的生物制品”和“NCM”在本文中可互換使用。簡言之,在4-氨基喹諾酮(4-aminoquinolone)抗生素持續(xù)存在下以及有絲分裂原(在優(yōu)選的實(shí)施方案中為PHA)持續(xù)或間斷存在下制備IRX-2。然而，也可以使用其它有絲分裂原。所生產(chǎn)的用于向患者施用的IRX-2含有濃度為60 6，000pcg/mL(更優(yōu)選150
I,800pcg/mL)的 IL-1 β、濃度為 600 60，000pcg/mL (更優(yōu)選 3，000 12，000pcg/mL)的IL-2 以及濃度為 200 20，000pcg/mL (更優(yōu)選 1，000 4，000pcg/mL)的 IFN- Y 和 TNF- α。IRX-2 還可包含濃度為 60 6，000pcg/mL (更優(yōu)選 300 2，000pcg/mL)的 IL-6、濃度為 6000 600，000pcg/mL(更優(yōu)選 20，000 180，000pcg/mL)的 IL-8、濃度為 200 20，000pcg/mL(更優(yōu)選1，000 4，000pcg/mL)的TNF-α?？梢允褂弥亟M、天然或聚乙二醇化的細(xì)胞因子，或者IRX-2可包括重組、天然或聚乙二醇化細(xì)胞因子的混合物。IRX-2可以僅包含上述細(xì)胞因子，然而也可以包含其它細(xì)胞因子。本發(fā)明的IRX-2還可包含其它重組、天然或聚乙二醇化的細(xì)胞因子，例如幾-7、11^-12、11^-15、61 ^(濃度為100 10，00(^8/mL，更優(yōu)選500 2，000pcg/mL)以及G-CSF。制備IRX-2的方法公開于上文引用的專利文獻(xiàn)以及美國專利申請N0.12/423,601中。本發(fā)明還包括與本文公開之細(xì)胞因子相關(guān)的衍生物、片段和肽，其中所述衍生物、片段和肽保留其相應(yīng)細(xì)胞因子的生物學(xué)活性。IRX-2的多種活性細(xì)胞因子組分作用于免疫系統(tǒng)的多種細(xì)胞類型，包括T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。在H&NSCC患者的臨 床試驗(yàn)中，IRX-2顯示是安全、可耐受并具有生物學(xué)活性的，其導(dǎo)致明顯的無疾病存活和總體存活。IRX-2中生理量的細(xì)胞因子可以局部施用(例如表面施用)，提供改變LC “遭遇” HPV處微環(huán)境的機(jī)會(huì)。傳統(tǒng)上，已使用來自單核細(xì)胞條件化培養(yǎng)基的天然細(xì)胞因子混合物或者含TNF- a、IL-1 β、IL_6和PGE2之重組炎性細(xì)胞因子的混合物使DC成熟，以離體制備基于DC的癌癥疫苗。IRX-2中的生理細(xì)胞因子水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于離體DC成熟中或高劑量全身性細(xì)胞因子療法中所使用的重組細(xì)胞因子的濃度。IRX-2中低水平的細(xì)胞因子使其能夠直接注射入患者中而無顯著毒性。IRX-2還含有作為T細(xì)胞活化和增殖之關(guān)鍵介導(dǎo)物的幾種細(xì)胞因子。IRX-2同時(shí)活化DC和T細(xì)胞的能力使其尤其具有吸引力，這是因?yàn)檎沁@種免疫細(xì)胞亞組的組合協(xié)調(diào)針對感染病毒之細(xì)胞的免疫應(yīng)答。還可以將另一些化合物與IRX-2 —起施用，例如化學(xué)抑制劑、非甾體類抗炎藥(NSAID)、鋅及其組合。所述化學(xué)抑制劑可以是不具有免疫抑制性(優(yōu)選以低劑量使用)而具有免疫調(diào)節(jié)作用從而提高免疫力和/或免疫應(yīng)答(例如通過抑制體內(nèi)的免疫抑制或抑制物機(jī)制來實(shí)現(xiàn))的任何化療劑。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述化學(xué)抑制劑是抗腫瘤劑，包括但不限于烷化劑、抗代謝物和抗生素。所述化學(xué)抑制劑還可以是免疫調(diào)節(jié)劑，例如薩立多胺(thalidomide) 0所述化學(xué)抑制劑還可以采用鹽或其它復(fù)合物形式。優(yōu)選地，所述化學(xué)抑制劑是燒化劑環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide, CY)。優(yōu)選地，所述NSAID是吲哚美辛(indomethacin，IND0)，其是CoxI和CoxII 二者的抑制劑。所述NSAID還可以是布洛芬或CoxII抑制劑(例如塞來昔布(celecoxib)和羅非昔布(rofecoxib))或其組合。聯(lián)合使用所述四種組分(即化學(xué)抑制劑、NSAID、來源于原代細(xì)胞的生物制品和鋅)能夠應(yīng)對由免疫靶標(biāo)所產(chǎn)生的抑制性環(huán)境并恢復(fù)患者的細(xì)胞免疫應(yīng)答。更具體地，化學(xué)抑制劑抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；NSAID逆轉(zhuǎn)前列腺素的局部免疫抑制，來源于原代細(xì)胞的生物制品使樹突狀細(xì)胞活化、刺激T細(xì)胞并保護(hù)T細(xì)胞免于凋亡；鋅提供對于T細(xì)胞功能來說關(guān)鍵的營養(yǎng)物。這一組合作用激發(fā)了針對內(nèi)源和外源抗原的免疫應(yīng)答。更具體地，本發(fā)明提供了通過向感染有HPV的患者施用治療有效量的IRX-2以及誘導(dǎo)針對HPV的免疫應(yīng)答來治療HPV的方法。優(yōu)選地，IRX-2包含如上所述的6種關(guān)鍵性細(xì)胞因子——IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-Y。如上所述，還可包含額外的細(xì)胞因子。如上所述，還可以施用額外的化合物，例如化學(xué)抑制劑、NSAID和鋅。優(yōu)選地，通過注射將IRX-2施用至上皮中存在HPV感染處以及誘導(dǎo)免疫應(yīng)答所需的LC位置處。還優(yōu)選表面應(yīng)用至子宮頸。表面應(yīng)用的方法包括但不限于將IRX-2分散于脂質(zhì)體制劑BiphaSiXTM(HeliXBiopharma Corp., Aurora, Ontario, CA)中，隨后應(yīng)用至子宮頸上皮；使用子宮頸藥物遞送
系統(tǒng) (Cervical Drug Delivery System ) ( CytOCOTe , Inc.Chicago, IL),其中 IRX-2
吸收進(jìn)生物粘附聚合物貼劑中，然后將其粘貼至子宮頸上皮；以及通過子宮頸分離和遞送設(shè)備(例如公開于Tracy等人的美國專利N0.7，165，550中的設(shè)備)將IRX-2溶液注入子
宮頸中。一般來講，IRX-2通過使未成熟的樹突狀細(xì)胞成熟從而有效地“啟動(dòng)”免疫系統(tǒng)，刺激幼稚(naive )τ細(xì)胞的產(chǎn)生，并有效地將抗原呈遞至幼稚τ細(xì)胞。irx-2通過誘導(dǎo)針對HPV的免疫應(yīng)答從而能夠有效地治療HPV (由于HPV對LC的免疫抑制作用，HPV患者中缺乏所述免疫應(yīng)答)。針對HPV的免疫應(yīng)答通過活化LC來誘導(dǎo)。活化與未活化的LC顯示于圖3中。基本上，IRX-2能夠克服HPV對LC的免疫抑制。然后，活化的LC分泌活化T細(xì)胞和調(diào)節(jié)免疫的細(xì)胞因子，以誘導(dǎo)針對HPV的免疫應(yīng)答，從而由于免疫系統(tǒng)能夠有效地攻擊HPV而消除所有存在的病變以及抗御未來病變發(fā)作。例如，IRX-2增加LC的IL-8分泌和ILIP-1O產(chǎn)生。LC能夠活化HPV特異性⑶8+T細(xì)胞。如以下實(shí)施例中所述，LC的活化由⑶la、MHC I類分子、MHC II 類分子、CD40、CD80、CD83、CD86 和 CCR7 的上調(diào)證實(shí)。本發(fā)明還提供了通過向感染有HPV的患者施用治療有效量的IRX-2以及使LC活化從而克服HPV誘導(dǎo)的LC免疫抑制的方法。IRX-2如上所述。通過活化LC，IRX-2能夠克服由HPV所致的LC免疫抑制。因此，這樣的LC可以有效地誘導(dǎo)T細(xì)胞活化，以攻擊患者中存在的HPV。

本發(fā)明提供了通過施用治療有效量的IRX-2、使LC活化以及誘導(dǎo)LC向淋巴結(jié)遷移從而提高LC向淋巴結(jié)遷移的方法。IRX-2如上所述。在IRX-2處理后，活性LC可有效地向患者的淋巴結(jié)遷移，并在感染HPV的患者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答。由于HPV的免疫抑制，正常情況下LC不能遷移至淋巴結(jié)。然而，使用IRX-2進(jìn)行處理逆轉(zhuǎn)了該免疫抑制，使得LC能夠有效地在免疫系統(tǒng)中起作用。本發(fā)明提供了通過向感染有HPV的患者施用有效量的IRX-2、產(chǎn)生針對HPV的免疫力以及防止新病變發(fā)生從而產(chǎn)生針對HPV之免疫力的方法。IRX-2能夠使已被HPV抑制的LC活化?；罨腖C能夠產(chǎn)生針對HPV的免疫應(yīng)答。具有活躍地識(shí)別并能夠攻擊HPV的免疫系統(tǒng)使得能夠預(yù)防任何新病變的發(fā)生?；罨拿庖呦到y(tǒng)能夠有效地治療HPV以及預(yù)防未來的疾病發(fā)生。本發(fā)明具有幾個(gè)益處。由于病變主要由HPV的持久存在引起，因此誘導(dǎo)感染之免疫清除以及防止HPV傳播的干預(yù)行為對于公共衛(wèi)生來說具有重大影響。消除HPV持久存在有助于降低針對每種HPV相關(guān)癌癥所發(fā)生的衛(wèi)生保健費(fèi)用。該方法是反復(fù)篩查或昂貴手術(shù)干預(yù)的低成本替代方法，并且其成功性具有高的合理預(yù)期，這是因?yàn)槠浒邢蛄?HPV誘導(dǎo)之病變發(fā)生的原因(即，HPV持久存在及其相關(guān)的免疫逃脫)。對于任何上述實(shí)施方案，使用如下治療施用細(xì)節(jié)和/或步驟:優(yōu)選地，通過注射將所述細(xì)胞因子組合物局部應(yīng)用至被HPV感染的上皮?；蛘撸梢詫⒈景l(fā)明的細(xì)胞因子組合物注射至如下淋巴管周圍，所述淋巴管流入所治療之病變或其它病毒感染區(qū)區(qū)域的淋巴 結(jié)中。更具體地，施用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的局部淋巴管外周注射或其它注射，以提供免疫治療制備物的充分定位。在使用外源性抗原的實(shí)施方案中，外源提供的合成或提取的抗原(例如腫瘤抗原和肽(參見Bellone，1998))可以以單獨(dú)的制備物或者作為本發(fā)明細(xì)胞因子組合物的一部分施用至預(yù)先激發(fā)(pre-primed)或共激發(fā)(co-primed)的區(qū)域或遠(yuǎn)端淋巴結(jié)中?？捎衫绨┌Y或其它免疫抑制疾病引起的T細(xì)胞內(nèi)源性抑制可以通過低劑量環(huán)磷酰胺(CY)和非留體類抗炎藥(NSAID)的共施用(即與本發(fā)明的細(xì)胞因子組合物聯(lián)用)而阻斷。NSAID優(yōu)選是吲哚美辛(INDO)，但也可以使用布洛芬或CoxII抑制劑(例如塞來昔布(CELEBREX )或羅非昔布(VIOXX ))或其組合。nsaid的副作用可以用質(zhì)子抑制劑和前列腺素E類似物主動(dòng)地進(jìn)行治療。還可以加入鋅和復(fù)合維生素(可包括加入硒)作為幫助恢復(fù)T細(xì)胞免疫的試劑。優(yōu)選地,鋅的劑量是15 75mg?？梢允┯脴?biāo)準(zhǔn)的復(fù)合維生素。鋅可以是可獲得的葡糖酸鹽。本發(fā)明的細(xì)胞因子組合物可以在手術(shù)、放療、化療或其組合之前或之后施用。本發(fā)明的組合物可以在腫瘤復(fù)發(fā)期間施用，即在認(rèn)為腫瘤已經(jīng)消失或者減輕的時(shí)期后再次發(fā)生腫瘤生長的期間。IRX-2的作用機(jī)制如上文所定義，本發(fā)明的來源于原代細(xì)胞之生物制品作為佐劑起作用，即刺激或增強(qiáng)患者針對特定抗原的免疫應(yīng)答。此外，本發(fā)明的IRX-2組合物和方法特別適用于刺激T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。由本發(fā)明的組合物和方法引發(fā)的免疫應(yīng)答包括誘導(dǎo)或產(chǎn)生幼稚T細(xì)胞、使樹突狀細(xì)胞分化和成熟、使抗原正確地呈遞至T細(xì)胞(例如在淋巴結(jié)中)以及使單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活化。具體地，在癌癥患者中，由本發(fā)明的組合物和方法引發(fā)的免疫應(yīng)答包括淋巴細(xì)胞對腫瘤的浸潤、腫瘤破碎和消退以及竇組織細(xì)胞增生(存在時(shí))降低。基本上，來源于原代細(xì)胞的生物制品誘導(dǎo)免疫產(chǎn)生，并阻斷免疫破壞。來源于原代細(xì)胞之生物制品的作用機(jī)制進(jìn)一步描述于本申請人的美國專利申請N0.12/323，595中。更具體地，本發(fā)明的組合物和方法通過誘導(dǎo)產(chǎn)生幼稚T細(xì)胞從而有助于克服患者的免疫阻遏/抑制。如本文所定義地，術(shù)語“幼稚”T細(xì)胞是指新產(chǎn)生的T細(xì)胞，該T細(xì)胞尚未暴露于抗原。因此，本發(fā)明的組合物和方法補(bǔ)充或產(chǎn)生新的T細(xì)胞。由于已知樹突狀細(xì)胞在體內(nèi)產(chǎn)生適當(dāng)免疫應(yīng)答的抗原呈遞中發(fā)揮重要作用，因此對樹突狀細(xì)胞成熟具有刺激性作用的試劑將作為激發(fā)針對抗原之良好免疫應(yīng)答的佐劑起作用。本發(fā)明的細(xì)胞因子組合物促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的成熟。本發(fā)明的細(xì)胞因子組合物還通過作為單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的強(qiáng)效活化劑而提供進(jìn)一步的佐劑作用。單核細(xì)胞是體內(nèi)DC和巨噬細(xì)胞的前體，因而促進(jìn)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞活化的試劑對體內(nèi)免疫應(yīng)答具有佐劑作用。來源于原代細(xì)胞的生物制品還通過保護(hù)活化的T細(xì)胞免于凋亡從而阻斷免疫破壞。臨床和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，某些細(xì)胞因子(特別是利用共同的受體Y鏈的存活性細(xì)胞因子(survival cytokine))能夠保護(hù)活化的T細(xì)胞免于腫瘤誘導(dǎo)的死亡并增強(qiáng)其抗腫瘤活性。更具體地，有幾種方式使來源于原代細(xì)胞的生物制品保護(hù)T細(xì)胞免于凋亡。使抗凋亡信號分子(即JAK-3和磷酸化的Akt)的表達(dá)上調(diào)以及使促凋亡分子(即S0CS-2)的表達(dá)下調(diào)。使⑶8+和⑶4+T淋巴細(xì)胞中胱天蛋白酶(caspase)的活化降低以及使cFLIP的表達(dá)增加。IRX-2對抗了 PI3K/Akt存活途徑的抑制。T細(xì)胞受到保護(hù)免于外在凋亡(MV誘導(dǎo)的和FasL誘導(dǎo)的凋亡)和內(nèi)在線粒體凋亡。通過阻止JAK3、CD3- ζ和STAT5下調(diào)，抑制Akt-1/2去磷酸化以及維持Bax/Bcl-2、Bax-Bcl-xL和Bim/Mcl-1的平衡比率，從而進(jìn)一步保護(hù)免于MV誘導(dǎo)的外在調(diào)亡。還通過阻止胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-7活性的誘導(dǎo)來保護(hù)免于MV誘導(dǎo)的調(diào)亡。更具體地，阻斷胱天蛋白酶-3之經(jīng)切割活性形式的誘導(dǎo)，以及線粒體膜電勢的損失。抑制核DNA片段化。來源于原代細(xì)胞的生物制品保護(hù)免于內(nèi)在凋亡表現(xiàn)為其保護(hù)活化的T細(xì)胞免于星孢菌素(staurosporine)誘導(dǎo)的凋亡。重要的是，來源于原代細(xì)胞之生物制品的細(xì)胞因子以協(xié)同方式保護(hù)活化的T細(xì)胞免于凋亡。換言之，來源于原代細(xì)胞之生物制品中的細(xì)胞因子組合物產(chǎn)生的作用比單獨(dú)施用各細(xì)胞因子時(shí)的更強(qiáng)。 鑒于以上方面，本發(fā)明的組合物和方法通過多種作用方式刺激免疫系統(tǒng)，包括使樹突狀細(xì)胞體內(nèi)成熟(導(dǎo)致肽抗原有效呈遞)以及使單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活化和產(chǎn)生幼稚未定向T細(xì)胞?？乖恼_呈遞導(dǎo)致T和B細(xì)胞克隆擴(kuò)增，使患者體內(nèi)產(chǎn)生免疫力。在癌癥患者的情形中，上述作用導(dǎo)致例如淋巴細(xì)胞浸潤入腫瘤中(例如通過血行播散來實(shí)現(xiàn))以及腫瘤減小和/或破壞。結(jié)果是由于免疫記憶而使得存活率提高。使本發(fā)明細(xì)胞因子組合物的給藥和劑量促進(jìn)對外源或內(nèi)源抗原的最佳免疫，其中需考慮個(gè)體患者的臨床病癥、施用位點(diǎn)和方法、施用方案、患者年齡、性別和體重。因此，出于本文目的的藥學(xué)“有效量”如本領(lǐng)域已知地通過考慮這些因素來確定。所述量必須有效地促進(jìn)免疫，導(dǎo)致例如腫瘤減小、腫瘤破碎和白細(xì)胞浸潤、復(fù)發(fā)延遲或存活率提高或者癥狀改善或消除(包括T細(xì)胞數(shù)增加)。在本發(fā)明的方法中，本發(fā)明的組合物可采用多種方式施用。應(yīng)當(dāng)注意，本發(fā)明組合物中使用的細(xì)胞因子或外源抗原可以其標(biāo)準(zhǔn)形式或者作為可藥用衍生物來施用，并且可以單獨(dú)施用或者作為活性成分與可藥用載體、稀釋劑、佐劑和載劑聯(lián)用。此外，本發(fā)明的組合物可以皮內(nèi)或皮下、或者淋巴管外周或淋巴管內(nèi)、淋巴節(jié)內(nèi)或脾內(nèi)或肌內(nèi)、腹膜內(nèi)和胸內(nèi)施用。本發(fā)明的組合物還可以表面應(yīng)用至HPV感染的上皮，例如通過注入患者的子宮頸中來實(shí)現(xiàn)。接受治療的患者是溫血?jiǎng)游?，特別是哺乳動(dòng)物(包括人)?？伤幱玫妮d體、稀釋劑、佐劑和載劑以及植入載體一般是指惰性、非毒性的固體或液體填充劑、稀釋劑或包封材料，其不與本發(fā)明的活性成分發(fā)生反應(yīng)。
劑量可以是單次劑量或數(shù)天期間內(nèi)的多次劑量。當(dāng)施用本發(fā)明的組合物時(shí)，一般將其制備為單位劑量的注射用形式(例如溶液、混懸液或乳液)。適于注射的藥物制劑包括無菌水溶液或分散體系，以及用于重溶形成無菌注射用溶液或分散體系的無菌粉末。載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液態(tài)聚乙二醇等)、其合適混合物或植物油的溶劑或分散介質(zhì)?？衫缤ㄟ^使用包衣(例如卵磷脂)、通過在分散體系的情形中維持所需顆粒大小以及通過使用表面活性劑來維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。還可以使用非水性載劑(例如棉花籽油、芝麻油、橄欖油、大豆油、玉米油、葵花籽油或者花生油以及酯(例如肉豆蘧酸異丙酯))作為本發(fā)明組合物的溶劑系統(tǒng)。此外，可以添加增強(qiáng)組合物穩(wěn)定性、無菌性和等滲性的多種添加劑，包括抗微生物防腐劑、抗氧化劑、螯合劑和緩沖劑?？梢酝ㄟ^不同的抗細(xì)菌劑和抗真菌劑(例如對羥基苯甲酸酯(paraben)、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)來確保抑制微生物的作用。在很多情況下，包含等滲劑(例如糖、氯化鈉等)是理想的?？梢酝ㄟ^使用延遲吸收的試劑(例如單硬脂酸鋁和明膠)來延長注射用藥物形式的吸收。然而，根據(jù)本發(fā)明，所使用的任何載劑、稀釋劑或添加劑需要與本發(fā)明的細(xì)胞因子或外源抗原相容。可以通過將實(shí)施本發(fā)明時(shí)使用的細(xì)胞因子或外源抗原摻入所需量的合適溶劑中來制備無菌注射用溶液，其中所述溶劑含有所期望的幾種其它成分。本發(fā)明的藥物制劑可以以含有任何相容載體(例如多種載劑、添加劑和稀釋劑)的注射用制劑向患者施用，或者，本發(fā)明中使用的細(xì)胞因子和/或外源抗原可以以緩慢釋放皮下植入物或靶向遞送系統(tǒng)(例如單克隆抗體、運(yùn)載體遞送、離子電滲入療法、聚合物基質(zhì)、脂質(zhì)體和微球)的形式向患者進(jìn)行腸胃外施用?？捎糜诒景l(fā)明的遞送系統(tǒng)的實(shí)例包括公開于美國專利 N0.5，225，182,5, 169，383,5, 167，616,4, 959，217,4, 925，678,4, 487，603、4，486，194,4, 447，23 3,4, 447，224,4, 439，196 和 4，475，196 中的那些。很多其它的這種植入物、遞送系統(tǒng)和組件是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。應(yīng)當(dāng)理解，如上所討論地，本發(fā)明的組合物和方法可用于治療抗原引發(fā)的疾病，例如癌癥、感染性疾病或持久性病變。所述組合物和方法通過刺激患者體內(nèi)的免疫應(yīng)答從而促進(jìn)針對產(chǎn)生這些疾病之抗原的免疫，該免疫應(yīng)答有助于減輕或消除患者之疾病的癥狀和效應(yīng)。本發(fā)明通過參考以下實(shí)驗(yàn)例而進(jìn)一步詳細(xì)描述。除非另有指明，否則這些實(shí)施例僅出于舉例說明的目的而提供，而非旨在用于限定。因此，本發(fā)明不應(yīng)以任何方式解釋為限制于以下實(shí)施例，而應(yīng)視為包括根據(jù)本文教導(dǎo)顯見的任何及所有變化形式。實(shí)施例1產(chǎn)生人LC由于HPV僅感染人類，因此使用人免疫細(xì)胞來研究HPV與LC的相互作用。從人皮膚中分離的原代LC通過遷移過程而活化，并表達(dá)高水平的MHC和共刺激分子。因此，從人供體分離原代未活化的皮膚來源之LC以進(jìn)行有意義的體外長期和可重復(fù)性功能研究是不可行的。對于本實(shí)驗(yàn)而言，利用分化細(xì)胞因子從分離自健康供體的外周血單核細(xì)胞離體產(chǎn)生原代LC。循環(huán)單核細(xì)胞是體內(nèi)表皮LC的直接前體。本申請人等已顯示離體產(chǎn)生的LC表達(dá)與表皮LC同樣的表面標(biāo)志物(Langerin、E-鈣粘素、⑶11c、⑶la、高的MHC II類分子和胞內(nèi)Birbeck顆粒)(圖1),并且可以在體外LC研究中一致地使用。
圖1顯示人單核細(xì)胞來源的朗格漢斯細(xì)胞表達(dá)與表皮來源之朗格漢斯細(xì)胞類似的表型標(biāo)志物。未成熟的朗格漢斯細(xì)胞由粘附單核細(xì)胞在1000IU/mL GM-CSFU000IU/mL IL-4和10ng/mL TGFβ中7天分化得到。通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞中MHC II類分子(HLA-DP、DQ、DR)、CDla、CDllc、Langerin或E-鈣粘蛋白的表達(dá)(灰色陰影直方圖)。同工型對照顯示為黑色無陰影的直方圖。該數(shù)據(jù)代表獲自數(shù)個(gè)健康供體的LC。逆轉(zhuǎn)HPV免疫逃脫本申請人先前已著手研究通過靶向LC來逆轉(zhuǎn)HPV免疫逃脫的策略。LC表達(dá)多種TLR,包括TLR3、7、8和9,其識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecularpattern,PAMP)并且一經(jīng)與其配體結(jié)合即使細(xì)胞活化。出人意料的是，通過測量⑶86的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)FDA批準(zhǔn)用于外部生殖器疣的TLR7激動(dòng)劑ALDARA (咪喹莫特(Imiquimod)，Graceway Pharmaceuticals, LLC)對LC活化完全沒有作用(圖2)。這可以解釋尚未發(fā)表的觀察結(jié)果，即使用咪喹莫特治療子宮頸病變沒有效果。令人感興趣的是，TLR8活化劑(3M-002)和TLR7/8激動(dòng)劑(雷西莫特(Resiquimod))使感染HPV的LC完全活化，從而它們開始體外誘導(dǎo)HPV特異性 T細(xì)胞應(yīng)答。這些數(shù)據(jù)表明，可以通過使某些“危險(xiǎn)信號”途徑活化來逆轉(zhuǎn)HPV對LC功能的抑制。用IRX-2使人朗格漢斯細(xì)胞活化暴露于病原體或其它“危險(xiǎn)信號”后，LC從表皮遷移至引流淋巴結(jié)(draininglymph node)后能夠有效地刺激T細(xì)胞，這種能力需要其細(xì)胞表面上共刺激分子和趨化因子受體的表達(dá)。研究了 IRX-2在體外對人單核細(xì)胞來源之LC的表型成熟的作用。發(fā)現(xiàn)IRX-2處理誘導(dǎo)MHC I類分子和MHC II類分子以及共刺激分子⑶40、⑶80和⑶86、成熟標(biāo)志物CD83的上調(diào)。如先前所述進(jìn)行LC的活化。簡單地講，收獲LC，清洗，對其不處理或者用HPV16L1L2VLP以10 μ g/ΙΟ6個(gè)細(xì)胞的濃度于37°C處理I小時(shí)。孵育后，將細(xì)胞于37°C置于完全培養(yǎng)基中6小時(shí)。接著，不對細(xì)胞進(jìn)行處理，或者用IRX_2(1: 2稀釋)處理，或者用I μ g/mL LPS處理作為陽性對照。IRX-2處理后，細(xì)胞再孵育48小時(shí)。收獲細(xì)胞，清洗，染色以進(jìn)行流式細(xì)胞分析，其中對CDla、MHC I類分子、MHC II類分子、CD40、CD80、CD83、⑶86或同工型對照進(jìn)行染色。由MFI值計(jì)算處理組之間表面標(biāo)志物的變化倍數(shù)。MFI提高表明標(biāo)志物上調(diào)和LC活化。數(shù)據(jù)代表3個(gè)個(gè)體供體。IRX-2的來源是從經(jīng)植物血凝素(PHA)刺激24小時(shí)的人外周血單個(gè)核細(xì)胞中收集的上清液。利用QC試驗(yàn)測定混合物中細(xì)胞因子的水平，并根據(jù)4種關(guān)鍵細(xì)胞因子的水平將其標(biāo)準(zhǔn)化。cGMP生產(chǎn)過程得到高度一致的產(chǎn)物，各批次之間具有非常近似的細(xì)胞因子濃度。為了確保IRX-2對LC活化的一致性，使用兩個(gè)不同批次的IRX-2對LC進(jìn)行活化。如圖6所示，IRX-2處理使全部6種LC標(biāo)志物的表達(dá)均顯著增加，而與LC是否已暴露于HPV16 L1L2 VLP無關(guān)。令人感興趣的是，與對照相比，暴露于HPV16 L1L2 VLP的LC中共刺激分子⑶86的增加甚至更有效。多于95%的細(xì)胞表達(dá)⑶86，多于80%的LC表達(dá)成熟標(biāo)志物⑶83 (未顯示)。結(jié)果表明，IRX-2是LC活化和成熟的強(qiáng)效誘導(dǎo)物，并且其有效性不受LC先前暴露于HPV的影響。實(shí)施例2確定目前臨床上可用的IRX-2是否能夠使先前暴露于HPV16的LC活化是必要的。IRX-2對LC活化標(biāo)志物表達(dá)的作用報(bào)道于實(shí)施例1中。在接下來的實(shí)驗(yàn)中，通過測定細(xì)胞因子分泌、遷移和同種異體抗原(alloantigen)特異性T細(xì)胞的活化來測試IRX-2的效力。與LC類似地，APC的活化對于原代T淋巴細(xì)胞的成功相互作用和活化是必需的。炎性細(xì)胞因子能夠使APC活化，導(dǎo)致其成熟以及抗原呈遞功能的提高。IRX-2是有前景的免疫調(diào)節(jié)劑，當(dāng)局部應(yīng)用至感染HPV的上皮時(shí)，其能夠影響LC的免疫刺激能力。為了確定IRX-2是否在表型上和功能上使暴露于HPV的LC活化，對細(xì)胞因子/趨化因子分泌、遷移以及刺激同種異體抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答的能力進(jìn)行測定。這些研究確定，與TLR8激動(dòng)劑類似，IRX-2亦能夠逆轉(zhuǎn)HPV導(dǎo)致的免疫抑制。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì):當(dāng)使LC暴露于HPV16并接著暴露于IRX-2時(shí)，測定LC的T細(xì)胞共刺激標(biāo)志物的表達(dá)水平。LC由分離自健康供體的外周血單核細(xì)胞分化得到。如圖5所示，將LC暴露于HPV16病毒樣顆粒(VLP) 6小時(shí)，然后加入IRX-2額外48小時(shí)。利用熒光抗體通過流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞表面分子進(jìn)行測定。測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中免疫刺激性細(xì)胞因子和趨化因子的存在情況，以確定LC是否已活化以及是否分泌活化T細(xì)胞的細(xì)胞因子或其它免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子。通過體外遷移穿過transwell膜，測定暴露于HPV VLP和IRX-2后的LC遷移。通過在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(mixed lymphocyte reaction, MLR)中將LC與同種異體T細(xì)胞一起培養(yǎng)，評估刺激T細(xì)胞的能力。每個(gè)實(shí)驗(yàn)中利用未經(jīng)處理的LC、僅暴露于HPV VLP的LC以及僅用IRX-2處理的LC作為對照。每個(gè)實(shí)驗(yàn)利用來源于個(gè)體健康供體的LC重復(fù)至少3次。選擇HLA-A * 0201陽性的受試者，以使能夠針對已知的HPV來源之肽抗原對已明確的T細(xì)胞免疫應(yīng)答進(jìn)行測定。這些數(shù)據(jù)顯示，IRX-2能夠使暴露于HPV的LC重新獲得刺激T細(xì)胞和遷移的能力，這兩種功能對于產(chǎn)生抗病毒免疫應(yīng)答來說是必需的。產(chǎn)生人朗格漢斯細(xì)胞:
利用分化細(xì)胞因子由通過匿名健康供體的白細(xì)胞采集而分離的市售外周血單核細(xì)胞離體產(chǎn)生原代LC。首先使凍存的PBMC粘附至塑料培養(yǎng)瓶來產(chǎn)生單核細(xì)胞來源的LC。貼壁細(xì)胞在含有 1000U/mL 重組人(recombinant human, rhu) -GM-CSF> 1000U/mL rhu-1L-4和lOng/mLrhu-TGF-β I的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天，培養(yǎng)期間添料兩次。LC 遷移:利用具有5 μ m孔徑聚碳酸酯濾膜的24孔Transwell板(Corning Costar)進(jìn)行趨化因子引導(dǎo)的LC遷移。將培養(yǎng)基(含有250ng/ml rhu CCL21(R&D Systems)，或者僅為培養(yǎng)基以作為自發(fā)遷移的對照)加入下部腔室中。將未經(jīng)處理或經(jīng)上述處理的LC加入上部腔室中，并于37°C孵育4小時(shí)。利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器或自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器對遷移至下部腔室中的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，CCL21依賴性遷移計(jì)算為:CCL21存在時(shí)遷移細(xì)胞與無CCL21時(shí)遷移細(xì)胞的比率，稱為“遷移指數(shù)”。遷移指數(shù)提高表明LC功能性活化，從組織向引流淋巴結(jié)移動(dòng)(圖 7)。IRX-2處理使得對照和HVP L1L2VLP中遷移提高了 3至4倍。結(jié)果說明，IRX-2可以促進(jìn)LC向區(qū)域淋巴結(jié)遷移，甚至當(dāng)LC已暴露于HVP時(shí)?；旌狭馨图?xì)胞反應(yīng)測定:如上所述用HPV16 L1L2 VLP和IRX-2對LC進(jìn)行處理。將LC與未經(jīng)接觸的(untouched)同種異體T細(xì)胞共培養(yǎng)，所述T細(xì)胞利用MACS陰性選擇人泛T細(xì)胞分離試劑盒(MACS negative selection human pan T cell isolation kit)分離。應(yīng)答性 T 細(xì)胞(responder T cell)和刺激性 LC(stimulator LC)以 10:1 和 5:1 的 R: S 比率培養(yǎng)5天。單獨(dú)培養(yǎng)的T細(xì)胞、單獨(dú)培養(yǎng)的LC、與自體PBMC —起培養(yǎng)的T細(xì)胞以及與T細(xì)胞有絲分裂原PHA —起培養(yǎng)的T細(xì)胞用作測定對照。收獲經(jīng)放射性3H-胸腺嘧啶脈沖處理的細(xì)胞，并利用閃爍板計(jì)數(shù)器對放射性進(jìn)行計(jì)數(shù)。確定放射性cpm，并在處理組間進(jìn)行比較。增加的胸腺嘧啶摻入指示更多的T細(xì)胞增殖。暴露于HPV16 L1L2 VLP并用IRX-2刺激后T細(xì)胞增殖增加，這證實(shí)了暴露于HPV16 L1L2 VLP的LC在HPV存在下重新獲得其免疫刺激能力(圖8)。細(xì)胞因子和趨化因子分析:從用IRX-2刺激的LC中收集上清液，并對所分泌的細(xì)胞因子和趨化因子進(jìn)行測試。如上所述對LC進(jìn)行處理。IRX-2處理后36小時(shí)，清洗LC，并在收集上清液前培養(yǎng)額外的36小時(shí)。這免除了對IRX-2混合物中存在之細(xì)胞因子的測定。利用使得能夠?qū)?shù)種炎癥和T細(xì)胞刺激和趨化分析物同時(shí)進(jìn)行測定的Bio-Plex Suspension Assay System完成該測定。所測定的細(xì)胞因子和趨化因子包括IL-8、IFN-y可誘導(dǎo)蛋白10 (IFN-YlnducibleProtein 10，IP-10)、單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1、巨噬細(xì)胞炎性蛋白(MIP)-1 α、MIP-1 β和RANTES。通過比較處理組上清液中細(xì)胞因子和趨化因子的濃度，對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。Thl相關(guān)細(xì)胞因子和趨化因子的分泌增加，表示LC功能性活化，這支持了 CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的誘導(dǎo)，而抑制性細(xì)胞因子的增加表明LC的耐受或功能抑制。用IRX-2處理LC使得兩種Thl相關(guān)趨化因子IP-10和IPlO的分泌顯著增加(圖9)。這兩種趨化因子均是促炎的，已知IP-10吸引T細(xì)胞、NK細(xì)胞和單核細(xì)胞至炎癥部位。結(jié)果顯示，在IRX-2刺激下，暴露于L1L2 VLP的LC在HPV存在下重新獲得其免疫刺激能力。

結(jié)論:IRX-2在表型上和功能上使來自健康供體的人LC活化，即使在其暴露于HPV L1L2VLP之后也是如此。HPV和IRX-2處理后MHC和表面活化分子的水平增加，炎性和活化T細(xì)胞之細(xì)胞因子和趨化因子的分泌增加，進(jìn)行趨化因子引導(dǎo)之遷移的能力增強(qiáng)(圖6-9)。所有這些結(jié)果均支持本發(fā)明在克服HPV誘導(dǎo)之LC耐受以及提供HPV感染治療中的有效性。已經(jīng)以舉例說明的方式對本發(fā)明進(jìn)行了描述，應(yīng)理解，所使用的術(shù)語旨在描述詞語的本義而非限制性的。顯然，根據(jù)上述教導(dǎo)，本發(fā)明可具有多種修改和變化形式。因此，應(yīng)理解，在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)，可以以除具體描述之外的方式實(shí)踐本發(fā)明。
權(quán)利要求
1.療人乳頭瘤病毒(HPV)感染的方法，其包括如下步驟: 向感染有HPV的患者施用治療有效量的來源于原代細(xì)胞之生物制品；以及 誘導(dǎo)針對HPV的免疫應(yīng)答。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述來源于原代細(xì)胞的生物制品包括IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、TNF-a 和 IFN-Y。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述來源于原代細(xì)胞的生物制品包括濃度為60 6,000pcg/mL 的 IL-1 β、濃度為 600 60, 000pcg/mL 的 IL-2、濃度為 60 6, 000pcg/mL 的IL-6、濃度為 6000 600，000pcg/mL 的 IL-8、濃度為 200 20，000pcg/mL 的 TNF- α 以及濃度為 200 20，000pcg/mL 的 IFN- Y。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述來源于原代細(xì)胞的生物制品還包括IL-7、IL-12、IL-15、GM-CSF 和 G-CSF0
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述施用步驟還包括施用選自烷化劑、抗代謝物、抗生素和免疫調(diào)節(jié)劑的化學(xué)抑制劑，以及抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述烷化劑是環(huán)磷酰胺。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所 述施用步驟還包括施用選自吲哚美辛、布洛芬、塞來昔布、羅非昔布及其組合的NSAID，以及逆轉(zhuǎn)前列腺素所致的局部免疫抑制。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述施用步驟還包括施用鋅，以及提供T細(xì)胞功能的營養(yǎng)物。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述施用步驟進(jìn)一步限定為將所述來源于原代細(xì)胞的生物制品注射入所述患者的上皮中。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述施用步驟進(jìn)一步限定為將所述來源于原代細(xì)胞的生物制品表面應(yīng)用至所述患者的上皮。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述誘導(dǎo)步驟還包括使朗格漢斯細(xì)胞(LC)活化的步驟。
12.權(quán)利要求11的方法，其還包括所述LC分泌活化T細(xì)胞和調(diào)節(jié)免疫的細(xì)胞因子以及誘導(dǎo)針對HPV之免疫應(yīng)答的步驟。
13.權(quán)利要求12的方法，其還包括使HPV特異性⑶8+T細(xì)胞活化的步驟。
14.權(quán)利要求12的方法，其還包括提高LC的IL-8分泌和ILIP-10產(chǎn)生的步驟。
15.權(quán)利要求11的方法，其還包括檢測⑶la、MHCI類分子、MHC II類分子、⑶40、⑶80、⑶83、⑶86和CCR7的上調(diào)以及證實(shí)LC已被活化的步驟。
16.服人乳頭瘤病毒(HPV)誘導(dǎo)的朗格漢斯細(xì)胞(LC)免疫抑制的方法，其包括如下步驟: 向感染有HPV的患者施用治療有效量的來源于原代細(xì)胞之生物制品；以及 使LC活化。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述來源于原代細(xì)胞的生物制品包括IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、TNF-a 和 IFN-Y。
18.高朗格漢斯細(xì)胞(LC)向淋巴結(jié)遷移的方法，其包括如下步驟: 向感染有人乳頭瘤病毒(HPV)的患者施用治療有效量的來源于原代細(xì)胞之生物制品； 使LC活化；以及 誘導(dǎo)LC向淋巴結(jié)遷移。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述來源于原代細(xì)胞的生物制品包括IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、TNF-a 和 IFN-Y。
20.生針對人乳頭瘤病毒(HPV)之免疫力的方法，其包括如下步驟: 向感染有HPV的患者施用有效量的來源于原代細(xì)胞之生物制品； 產(chǎn)生針對HPV的免疫力；以及 防止新病變發(fā)生。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述來源于原代細(xì)胞的生物制品包括IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、TNF-a 和 IFN-Y。
22.TLR8激動(dòng)劑類似地逆轉(zhuǎn)人乳頭瘤病毒(HPV)誘導(dǎo)之朗格漢斯細(xì)胞(LC)免疫抑制的方法，其包括如下步驟: 向感染有HPV的患者施用治療有效量的來源于原代細(xì)胞之生物制品；以及 使LC活化。
23.暴露于人乳頭瘤病毒(HPV)的朗格漢斯細(xì)胞(LC)重新獲得其刺激T細(xì)胞和遷移的能力的方法，其包括如下步驟: 向感染有HPV的患者施用治療有效量的來源于原代細(xì)胞之生物制品；以及 使LC活 化。
全文摘要
通過向感染有HPV的患者施用治療有效量的來源于原代細(xì)胞之生物制品以及誘導(dǎo)針對HPV的免疫應(yīng)答來治療人乳頭瘤病毒(HPV)的方法。通過向感染有HPV的患者施用治療有效量的來源于原代細(xì)胞之生物制品以及使朗格漢斯細(xì)胞(LC)活化來克服HPV誘導(dǎo)之LC免疫抑制的方法。通過向感染有HPV的患者施用治療有效量的來源于原代細(xì)胞之生物制品、使LC活化以及誘導(dǎo)LC向淋巴結(jié)遷移來提高LC向淋巴結(jié)遷移的方法。通過向感染有HPV的患者施用有效量的來源于原代細(xì)胞之生物制品、產(chǎn)生針對HPV的免疫力以及防止新病變發(fā)生來產(chǎn)生針對HPV的免疫力的方法。
文檔編號C12P21/04GK103097543SQ201080063307
公開日2013年5月8日 申請日期2010年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月8日
發(fā)明者詹姆斯·伊根, 馬丁·卡斯特, 黛安娜·達(dá)席爾瓦, 哈維·布蘭德溫 申請人:伊爾克斯治療有限公司, 詹姆斯·伊根, 馬丁·卡斯特, 黛安娜·達(dá)席爾瓦, 哈維·布蘭德溫