專利名稱：在髓鞘堿性蛋白啟動(dòng)子的控制下表達(dá)熒光素酶(mbp-luci)的動(dòng)物模型和所述模型用于生 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用活體動(dòng)物生物成像技術(shù)制造的髓鞘堿性蛋白熒光素酶(MBP-Iuci)生物成像模型，例如用于在轉(zhuǎn)錄水平實(shí)時(shí)顯現(xiàn)及量化脫髓鞘作用/髓鞘再生活動(dòng)。
背景技術(shù)：
藥物開發(fā)的損耗率高，據(jù)聲稱僅五分之一的化合物可由開發(fā)至批準(zhǔn)(DiMasi, JA, et al, J Health Econ 22，151-185)。此外，盡管大幅增加投資，在過去三十年來引進(jìn)新藥物的速度仍保持相對(duì)固定，僅每年兩到三種新藥物進(jìn)展最終投入市場(chǎng)(LindsayMA, Nature Rev Drug Discovery,2，831-838)。
應(yīng)用于藥物開發(fā)初期階段的分子與功能性成像可提供生物活性的證據(jù)，并確認(rèn)在標(biāo)革El上的藥效。因此，投資在分子成像技術(shù)有望提升藥物開發(fā)(Rudin M, et al, Progressin Drug Res, 2005, vol 62，185-255)。分子成像技術(shù)較更常規(guī)讀數(shù)的一項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)是，它們能夠以足夠的空間與時(shí)間分辨率在完整生物體中實(shí)施，用于研究體內(nèi)生物過程。此外，這些分子成像技術(shù)允許在不同的時(shí)間點(diǎn)重復(fù)性、非侵襲性、一致性及相對(duì)自動(dòng)化地研究相同的動(dòng)物，從而增加縱向研究的統(tǒng)計(jì)效力及減少所需動(dòng)物數(shù)量與成本。MBP-Iuci模型支持增加體內(nèi)早期候選藥物篩選的生產(chǎn)力以及增加生物檢測(cè)的靈敏度。早期鉛化合物作為上市的藥品經(jīng)常不是最佳的，然而，在體內(nèi)特異性及顯著活性的檢測(cè)可導(dǎo)致優(yōu)化化學(xué)結(jié)構(gòu)，以實(shí)現(xiàn)可接受的活性水平并最小化體內(nèi)毒性，以治療特定中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。分子成像分子成像是指來自各種學(xué)科方法(例如，細(xì)胞及分子生物學(xué)、化學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、物理學(xué)、生物信息及工程學(xué))的匯集，以在活體生物中在細(xì)胞及亞細(xì)胞水平評(píng)價(jià)特定分子過程中利用與整合成像技術(shù)(Massoud T. F·，Genes Dev. 17:545-580)。基因工程的出現(xiàn)對(duì)應(yīng)用科學(xué)帶來重大變化，例如包括藥物研發(fā)路線。以相同的方式，動(dòng)物成像操作的開發(fā)及利用為臨床前研究提供新方法(Maggie A, Ciana P. Nat. Rev.Drug Discvy. 4，249-255)。由于難以實(shí)時(shí)量化生理活動(dòng)，動(dòng)物模型傳統(tǒng)上難以處理。多年來開發(fā)了新成像方法以克服此困難(例如，MRI、CT、PET)。最近，基于體內(nèi)表達(dá)熒光素酶(螢火蟲的發(fā)光酶)的生物發(fā)光成像已應(yīng)用于靶標(biāo)基因活性的非侵襲性檢測(cè)。通過結(jié)合動(dòng)物基因工程與分子成像技術(shù)，使在活體動(dòng)物中對(duì)特定分子過程進(jìn)行動(dòng)態(tài)研究成為可能。這種方法能夠潛在地影響臨床前規(guī)程，從而廣泛改變醫(yī)學(xué)的所有方面(Maggie A. Trends Pharmacolo. Sci. 25, 337)。分子成像生物發(fā)光體內(nèi)生物發(fā)光成像(BLI)是一種靈敏工具，其基于檢測(cè)來自細(xì)胞或組織的放射光。報(bào)道基因技術(shù)的應(yīng)用使得可通過體內(nèi)成像方法分析活體動(dòng)物內(nèi)特定細(xì)胞與生物過程。生物發(fā)光(活體生物酶促產(chǎn)生可見光)是許多非哺乳動(dòng)物物種中自然發(fā)生的現(xiàn)象(Contag, CH, Mol. Microbiol. 18:593-603)。熒光素酶是催化底物氧化以釋放光的光子的酶(Greer LFIII, Luminescence 17:43-74)。來自北美螢火蟲的生物發(fā)光最為廣泛應(yīng)用。螢火蟲熒光素酶基因(Iuc)的表達(dá)產(chǎn)生熒光素酶，其將底物D-熒光素轉(zhuǎn)化為非反應(yīng)性的氧化熒光素，從而導(dǎo)致放射562納米的綠光。由于哺乳動(dòng)物組織不會(huì)天然放射生物發(fā)光，體內(nèi)BLI具有相當(dāng)吸引力，因?yàn)榭僧a(chǎn)生具非常小背景信號(hào)的圖像。BLI需要使用由生物發(fā)光報(bào)道基因組成的表達(dá)盒(expression cassette)在選擇的驅(qū)動(dòng)光報(bào)道基因的基因啟動(dòng)子的控制下基因工程化細(xì)胞或組織(FIGl)。為了誘發(fā)光產(chǎn)生，通過頸內(nèi)、血管內(nèi)、腹膜內(nèi)內(nèi)或皮下注射給藥底物(例如，熒光素)。熒光素酶/熒光素放射的光能夠穿透數(shù)毫米至厘米的組織深度；然而對(duì)于每一厘米組織深度，光子強(qiáng)度減少約十倍(Contag CH Mol. Microbio. 18:593-603)。必須使用靈敏的光檢測(cè)儀器檢測(cè)體內(nèi)生物發(fā)光。該檢測(cè)器測(cè)量每一單位面積放射的光子數(shù)目。波長(zhǎng)介于400及1000納米之間的低水平光可被電荷耦合組件相機(jī)檢測(cè)，電荷耦合組件相機(jī)將撞擊娃片的光子轉(zhuǎn)換為電子(Spibey CP et al Electrophoresis 22:829-836)。軟件能夠?qū)㈦娮有盘?hào)轉(zhuǎn)換為二維圖像。軟件也能夠量化放射光線的強(qiáng)度(撞擊檢測(cè)器的放射光子的數(shù) 目)，并將這些數(shù)值轉(zhuǎn)換為假色圖形。實(shí)際數(shù)據(jù)以光子計(jì)數(shù)測(cè)量，但假色圖形使得能夠快速目視判讀。對(duì)于更細(xì)微的差異，可能需要在關(guān)注區(qū)域內(nèi)的定量測(cè)量。冷卻電荷耦合組件相機(jī)的使用降低熱噪聲，以及暗箱使熒光素酶產(chǎn)生的光可被最佳顯現(xiàn)及量化(Contag CH, Annu.Rev. Biomed. Eng. 4:235-260)。有用的是，將熒光素酶圖像疊加在其它類型圖像如自顯影照片或放射線照片上用于放射信號(hào)的解剖定位(圖2)。該軟件疊加圖像用于顯現(xiàn)及判讀。脫髓鞘疾病、少突膠質(zhì)細(xì)胞及髓鞘堿性蛋白髓鞘堿性蛋白(MBP)為正常髓鞘緊密性及功能所需。與髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG)及蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP) —起，這些蛋白質(zhì)構(gòu)成髓鞘結(jié)構(gòu)蛋白家族的成員，并由以下的髓鞘生成細(xì)胞合成在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中的少突膠質(zhì)細(xì)胞，和在周圍神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)中的許旺細(xì)胞。在發(fā)育中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，髓鞘堿性蛋白的表達(dá)與髓鞘形成時(shí)期一致。因此，在本領(lǐng)域中將髓鞘堿性蛋白視為少突膠質(zhì)細(xì)胞成熟的標(biāo)記。髓鞘堿性蛋白(與其它蛋白質(zhì)一起)的高水平表達(dá)與髓鞘精細(xì)化過程一致，在髓鞘形成的整個(gè)過程中持續(xù)，并在軸突分裂時(shí)結(jié)束(Gupta et al. Brain Res. 464:133-141)。影響髓鞘完整性的疾病導(dǎo)致在受影響的神經(jīng)元中軸突信號(hào)傳導(dǎo)受損，以及可導(dǎo)致感覺、運(yùn)動(dòng)、認(rèn)知或其它功能受損，取決于涉及的神經(jīng)元。術(shù)語脫髓鞘疾病描述該疾病的結(jié)果，而非原因，以及可由遺傳、傳染劑、自身免疫反應(yīng)及未知因素導(dǎo)致。所有這些仍為龐大未滿足醫(yī)療需求的人類病痛，常與康復(fù)療法的需求有關(guān)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的脫髓鞘疾病包括·多發(fā)性硬化(與類似疾病一起稱為自發(fā)性炎性脫髓鞘疾病) 橫貫性脊髓炎 德維克病 進(jìn)行性多病灶腦白質(zhì)病 視神經(jīng)炎 腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良
· Pelizaeus-Merzbacher 病(Pelizaeus-Merzbacher disease)·髓鞘功能障礙/喪失，也與脊髓損傷、阿爾茨海默病與帕金森病及精神分裂癥有關(guān)周圍神經(jīng)系統(tǒng)的脫髓鞘疾病包括·吉蘭-巴雷綜合征(Guillain_Barr6syndrome)及其慢性相似病,慢性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病 周圍神經(jīng)病(毒素引起、糖尿病、抗-MAG等)·夏科-馬里-圖斯病(Charcot-Marie-Tooth Disease)脫髓鞘作用的體內(nèi)模型 在開發(fā)對(duì)抗脫髓鞘疾病的臨床前候選藥物中的一般步驟是評(píng)價(jià)治療性候選藥物在動(dòng)物模型中的作用，該動(dòng)物模型概括部分或全部的脫髓鞘作用，且其具有內(nèi)源性髓鞘再生能力?？稍趧?dòng)物模型中實(shí)現(xiàn)化學(xué)誘導(dǎo)的脫髓鞘作用，以及6-8周齡的年輕成年雄性小鼠易受4-6周的O. 2%銅宗(cuprizone;雙環(huán)己酮草酰二腙)飲食造成的脫髓鞘作用影響(Ludwin SK, 1978, Lab Invest 39:597-612)。經(jīng)銅宗處理，脫髓鞘作用發(fā)生在整個(gè)腦部，但在高度集中的白質(zhì)區(qū)(胼胝體)內(nèi)最易檢測(cè)(Merkler et al, 2005, NMR Biomed18:395-403)。在開始銅宗飲食后的3周內(nèi)脫髓鞘作用明顯。以正常食物替代該飲食，在4-6 周內(nèi)允許幾乎完全髓銷再生(Matsushima et al, 2001, Brain Pathol 11:107-116)。使用淀粉樣前蛋白或比爾朔夫斯基銀浸滲法(Bielschowsky’ silver impregnation)對(duì)軸突損傷的免疫組織化學(xué)染色無法在8周齡小鼠中顯露很多軸突損傷(Merkler)。然而，在6_7月齡的小鼠中，軸突橫斷顯著增加，部分造成在老年動(dòng)物中可見的髓鞘再生下降(IrvineKA, et al,2006, J Neuroimmunol 175:69-76)。少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞在分化后取代髓鞘，以及小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞與巨噬細(xì)胞二者在銅宗飲食約4周時(shí)達(dá)到高峰，并且為有效髓鞘再生所需(Franco RJM, 2002, Nat Rev 3:705-714)。為量化髓鞘含量的變化,可收取整個(gè)大腦或亞區(qū)，并由斑點(diǎn)印跡或Western分析評(píng)價(jià)?？蛇x擇地，追蹤髓鞘喪失及修復(fù)的亞區(qū)的更高分辨率的敏銳(與縱向相對(duì))方法涉及定量立體學(xué)。例如，計(jì)算機(jī)輔助立體學(xué)工具箱(CAST)系統(tǒng)可用于評(píng)價(jià)胼胝體中的髓鞘勒克司堅(jiān)牢藍(lán)(Luxol Fast Blue)(髓鞘染劑)的變化。甲苯胺藍(lán)及電鏡術(shù)是必要的最后步驟，以確保致密髓鞘完全套住先前裸露的軸突。至于縱向評(píng)價(jià)方面，T2加權(quán)的磁共振成像提供了定量評(píng)價(jià)喂食銅宗的小鼠的胼胝體中髓鞘變化的方法(sanofi-aventisNeurology, 2008 unpublished results)。實(shí)時(shí)追蹤體內(nèi)髓鞘形成狀態(tài)的髓鞘堿性蛋白熒光素酶生物成像模型在一篇2OO3 年的論文，F(xiàn)arhadi 等人(The Journal of Neuroscience, November12，2003, 23(32) :10214-10223)報(bào)導(dǎo)，髓鞘堿性蛋白啟動(dòng)子含有調(diào)節(jié)元件一四個(gè)寬闊間隔的保守模塊M1、M2、M3及M4，范圍為0. I至0. 4千堿基對(duì)，其對(duì)髓鞘形成與髓鞘再生的時(shí)機(jī)調(diào)節(jié)非常重要(參見圖1、3及4)。他們使用半乳糖酶基因(Lac Z)為報(bào)道基因，證明當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育時(shí)，近端模塊Ml及M2在少突膠質(zhì)細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)相對(duì)低水平的表達(dá)，而上游M3區(qū)域在少突膠質(zhì)細(xì)胞整個(gè)發(fā)育過程及成熟中樞神經(jīng)系統(tǒng)中驅(qū)動(dòng)高水平的表達(dá)。而且，在脫髓鞘損傷后髓鞘再生期間的表達(dá)需要此M3區(qū)域。M4也在髓鞘化許旺細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)髓鞘堿性蛋白的表達(dá)。
目前方法使用動(dòng)物模型測(cè)定體內(nèi)髓鞘的變化十分耗時(shí)，一般花費(fèi)4至8周且需大量動(dòng)物。該髓鞘堿性蛋白脫氧核糖核酸啟動(dòng)子包含表達(dá)熒光素酶基因的所有4個(gè)特異性調(diào)節(jié)區(qū)，構(gòu)成鼠髓鞘堿性蛋白熒光素酶轉(zhuǎn)基因生物成像模型的基礎(chǔ)，所述鼠髓鞘堿性蛋白熒光素酶轉(zhuǎn)基因生物成像模型被開發(fā)以實(shí)時(shí)追蹤腦、脊髓和/或周圍神經(jīng)系統(tǒng)中髓鞘堿性蛋白(MBP)轉(zhuǎn)錄活性的變化?？蓪⑦@種嚙齒動(dòng)物轉(zhuǎn)基因模型用于選擇治療人類脫髓鞘疾病候選藥物開發(fā)的基礎(chǔ)研究的體外及體內(nèi)證明，并對(duì)現(xiàn)有模型提供多重改良〇通過生物發(fā)光非侵襲性追蹤神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘形成的變化的能力顯著降低與事后組織化學(xué)及組織表達(dá)分析相關(guān)的資源及人力需求。〇縱向研究大大增加模型對(duì)髓鞘形成的變化的靈敏度。先前的測(cè)定法必須在每一時(shí)間點(diǎn)使用單獨(dú)動(dòng)物群，如此則限制研究過程中可收集的數(shù)據(jù)點(diǎn)數(shù)量。由于需要單獨(dú)動(dòng)物群而導(dǎo)入額外變量。〇迅速處理生物成像數(shù)據(jù)，通常在同一日，因此允許調(diào)整(即，延長(zhǎng)研究期間以達(dá) 到顯著性或由于缺乏藥物的影響而提早終止)，以優(yōu)化研究設(shè)計(jì)并減少不必要的資源投資。〇動(dòng)物群及相應(yīng)的處理法均可在零時(shí)間點(diǎn)測(cè)定，其在降低每一處理群動(dòng)物數(shù)量的同時(shí)優(yōu)化研究的統(tǒng)計(jì)顯著性。可將研究數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為初始值，從而大大降低固有的生物學(xué)上的變異，同時(shí)支持對(duì)特定療法效果的更有力的結(jié)論。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種新的體內(nèi)模型，以評(píng)價(jià)治療個(gè)體對(duì)于脫髓鞘作用(例如，神經(jīng)保護(hù)、髓鞘保護(hù))與髓鞘再生(例如，修復(fù))的程度的效果。本發(fā)明的生物成像動(dòng)物及化合物篩選方法允許通過在活體動(dòng)物中產(chǎn)生相關(guān)實(shí)時(shí)高分辨率數(shù)據(jù)，來篩選和/或檢驗(yàn)藥用化合物及其它治療劑的本質(zhì)確證。此外，可獲得關(guān)于潛在毒性、ρκ/ro及治療窗的評(píng)價(jià)，從而對(duì)靈長(zhǎng)類及人類的劑量有更精準(zhǔn)預(yù)測(cè)。本發(fā)明提供對(duì)使用活體轉(zhuǎn)基因模型生物體研究髓鞘形成活動(dòng)的改良工具及方法。與其它模型相比，由于每個(gè)受試者可作為其本身縱向研究的基線對(duì)照，本發(fā)明降低所需的受試者總量。生物間差異性因此降低，從而增進(jìn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果的可信度。在本發(fā)明的各個(gè)方面，實(shí)現(xiàn)不同的優(yōu)勢(shì)。在下面的討論中描述多種用途中的數(shù)種的特點(diǎn)。通過與髓鞘堿性蛋白表達(dá)的相關(guān)性，本發(fā)明提供在活體模型生物體中監(jiān)測(cè)脫髓鞘作用和/或髓鞘再生活動(dòng)的方法。該方法可包含轉(zhuǎn)基因修飾祖細(xì)胞，以產(chǎn)生表達(dá)通過髓鞘堿性蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶基因的模型生物體。當(dāng)表達(dá)時(shí)，熒光素酶基因可起作用以在底物如熒光素的存在下產(chǎn)生光(生物發(fā)光)。通過監(jiān)測(cè)來自該生物體的生物發(fā)光，可評(píng)價(jià)髓鞘形成與脫髓鞘作用活性。成像設(shè)備及分析允許快速使生物發(fā)光及髓鞘形成活動(dòng)與生物的身體的特定部分相關(guān)聯(lián)。對(duì)于研究中樞與周圍神經(jīng)系統(tǒng)的活動(dòng)，在神經(jīng)組織中使用髓鞘的脊椎動(dòng)物生物體是特別適宜的模型生物體。哺乳動(dòng)物是在中樞與周圍神經(jīng)系統(tǒng)中使用髓鞘幫助神經(jīng)傳導(dǎo)的生物體。普通哺乳動(dòng)物模型如嚙齒動(dòng)物(例如，大鼠、小鼠)、兔、綿羊、靈長(zhǎng)動(dòng)物、天竺鼠等為適用于實(shí)踐本發(fā)明的模型生物體。生物體尺寸本質(zhì)上不是限制因素。然而，可將儀器尺寸優(yōu)化為特定生物體形狀或尺寸。
單一生物成像活動(dòng)可提供所需的信號(hào)。然而，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)提供在相同動(dòng)物上歷經(jīng)多個(gè)時(shí)間點(diǎn)重復(fù)測(cè)量并比較多個(gè)測(cè)量結(jié)果的能力。單一生物體因此作為其本身對(duì)照或基線。因此，在單一生物體中歷經(jīng)一個(gè)或多個(gè)脫髓鞘作用或髓鞘再生間隔的生物成像是可能的。此外，貫穿脫髓鞘作用或髓鞘再生間隔的成像信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化產(chǎn)生更多有力數(shù)據(jù)，其中貫穿重復(fù)間隔的成像可有效檢測(cè)歷經(jīng)一個(gè)或多個(gè)活動(dòng)在生物體中髓鞘堿性蛋白轉(zhuǎn)錄水平的變化。生物發(fā)光信號(hào)被身體組織衰減。因此，近體表的神經(jīng)組織產(chǎn)生較強(qiáng)信號(hào)。檢測(cè)器的信號(hào)可通過以下方法提高通過使更多熒光素酶反應(yīng)而產(chǎn)生較高信號(hào)輸出，例如，使用較高濃度，或增加酶活性或表達(dá)水平。使用較高靈敏度的檢測(cè)器也可改善數(shù)據(jù)收集。較高靈敏度的檢測(cè)器常需要冷卻設(shè)備以產(chǎn)生明顯信號(hào)并最小化噪聲。也使用收集數(shù)據(jù)的時(shí)間增加信號(hào)的數(shù)量。 本發(fā)明的模型生物體可為含有熒光素酶基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，所述熒光素酶基因通過髓鞘堿性蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。該動(dòng)物可為哺乳動(dòng)物，例如，用作動(dòng)物模型的任何哺乳動(dòng)物。大鼠與小鼠是普通動(dòng)物模型。當(dāng)將啟動(dòng)子活化或開啟時(shí)，在髓鞘堿性蛋白啟動(dòng)子的控制下熒光素酶基因在模型的特定目標(biāo)組織中表達(dá)。該髓鞘堿性蛋白啟動(dòng)子可含有Ml至M3，或可含有Ml至M4?？赏ㄟ^簡(jiǎn)單操作實(shí)現(xiàn)信號(hào)的改善，例如，選擇毛發(fā)造成較少衰減的模型。例如，毛發(fā)較C57/B6小鼠較少影響衰減的模型將提供較優(yōu)于C57/B6小鼠的信號(hào)。本發(fā)明也提供研發(fā)用于生物成像的模型生物體的方法。研發(fā)可通過以下方法實(shí)現(xiàn)以例如小鼠品系開始并生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，然后選擇一個(gè)或多個(gè)系，其中在出生后髓鞘形成高峰時(shí)的體內(nèi)完整小鼠成像顯現(xiàn)特異性成像(例如，中樞神經(jīng)系統(tǒng))；然后選擇一個(gè)或多個(gè)系，其中體外成像確認(rèn)在希望區(qū)域(例如，主要在腦的致密白質(zhì)區(qū))中的熒光素酶轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。然后可選擇一個(gè)或多個(gè)系，其中熒光素酶圖像強(qiáng)度與脫髓鞘作用及髓鞘再生的變化高度相關(guān)。為了改進(jìn)數(shù)據(jù)，可選擇在適當(dāng)操作期間顯示明顯組織脫髓鞘作用的一個(gè)或多個(gè)系。銅宗脫髓鞘作用模型適合用于本發(fā)明。生物成像的時(shí)機(jī)將取決于模型生物體的發(fā)育特性，例如，可考慮出生后髓鞘形成的高峰一般是約3-5周的第一代小鼠(G1 mice)而選擇時(shí)機(jī)。本發(fā)明可用于篩選可影響生物體中髓鞘活動(dòng)的化學(xué)化合物、生物制品及其它治療性物質(zhì)?；衔锟烧{(diào)節(jié)基因表達(dá)或細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間信號(hào)活動(dòng)而影響髓鞘活動(dòng)。這些僅為一些具體實(shí)例，不應(yīng)視為本發(fā)明的全部范圍，本發(fā)明的全部范圍在權(quán)利要求中表征。雖然如上述(例如，F(xiàn)arhadi)，已使用半乳糖酶報(bào)道基因充分表征髓鞘堿性蛋白激活子，但是由于用于β_半乳糖苷酶(半乳糖酶報(bào)道基因的產(chǎn)物)檢測(cè)的組織收取及固定的需要，髓鞘堿性蛋白-半乳糖酶基因模型的使用受到限制。這種方法需要與活體動(dòng)物檢測(cè)法不相容的組織化學(xué)技術(shù)。為了繞開此問題，已提出使用生物發(fā)光或熒光系統(tǒng)以開發(fā)轉(zhuǎn)基因生物成像模型，其中由大部分的髓鞘堿性蛋白啟動(dòng)子選擇性地控制熒光素酶或綠色熒光蛋白(GFP)報(bào)道基因。這種新型生物成像模型設(shè)計(jì)用于實(shí)時(shí)顯現(xiàn)與量化活體動(dòng)物(例如，小鼠)中的脫髓鞘作用和/或髓鞘再生活動(dòng)?？蓪⑦@種監(jiān)測(cè)與自動(dòng)生物成像技術(shù)結(jié)合使用。這種模型是一種有用工具，用于例如，靶標(biāo)確證(例如，當(dāng)將生物成像模型小鼠互交以敲除基因，且轉(zhuǎn)基因小鼠具有希望性狀時(shí))，以及也用于在比較及定量基礎(chǔ)上的化合物確證(例如，在模型如銅宗或?qū)嶒?yàn)性自身免疫性腦脊髓炎[EAE]中測(cè)量化合物的功效)，以決定關(guān)于靶標(biāo)選擇及化合物發(fā)展的決定性路徑。本生物成像模型(MBP-luci TG)已被開發(fā)并用于量化體內(nèi)的脫髓鞘作用/髓鞘再生活動(dòng)。本生物成像模型的優(yōu)點(diǎn)是可縱向研究，使得每個(gè)生物體可作為其本身的對(duì)照。而避免在特定時(shí)間點(diǎn)犧牲動(dòng)物?？沙掷m(xù)追蹤個(gè)體小鼠的脫髓鞘作用與髓鞘再生過程。這種生物成像方法學(xué)需要較少時(shí)間及資源來追蹤活體小鼠中的生物應(yīng)答。


圖I顯示髓鞘堿性蛋白熒光素酶轉(zhuǎn)基因模型的示意性簡(jiǎn)圖，其用于追蹤髓鞘表達(dá)的實(shí)時(shí)變化。圖2顯示該內(nèi)源性髓鞘堿性蛋白啟動(dòng)子具有4個(gè)元件，其在發(fā)育及進(jìn)入成熟期間差異地調(diào)節(jié)髓鞘堿性蛋白在少突膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)(HF Farhadi: J. Neurosc. 2003, 23(32)
，10214-10223)。M1/M2 二者調(diào)節(jié)出生后早期的轉(zhuǎn)錄本。M3涉及整個(gè)成熟期中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本調(diào)節(jié)。M4幫助許旺細(xì)胞表達(dá)髓鞘堿性蛋白轉(zhuǎn)錄本。所述髓鞘堿性蛋白熒光素酶轉(zhuǎn)基因的結(jié)構(gòu)具有兩種形式的髓鞘堿性蛋白啟動(dòng)子。121系含有M4元件，預(yù)定在腦、脊髓及周圍神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)熒光素酶。171系由較短的髓鞘堿性蛋白啟動(dòng)子(例如，缺少M(fèi)4元件)組成，主要在腦中表達(dá)熒光素酶，已由生物成像分析確認(rèn)。圖3顯示髓鞘堿性蛋白熒光素酶轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒，包括在熒光素酶表達(dá)載體中具有5千堿基對(duì)的5’端脫氧核糖核酸的髓鞘堿性蛋白啟動(dòng)子。圖4顯示髓鞘堿性蛋白熒光素酶轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒，包括在熒光素酶表達(dá)載體中具有10千堿基對(duì)的5’端脫氧核糖核酸的髓鞘堿性蛋白啟動(dòng)子。圖5顯示髓鞘堿性蛋白熒光素酶轉(zhuǎn)基因系的篩選樹的實(shí)例。圖6顯示來自第一級(jí)篩選的髓鞘堿性蛋白熒光素酶創(chuàng)始系(founders)的體內(nèi)熒光素酶圖像。該熒光素酶強(qiáng)度范圍為105(+++)至103(+)(光子/平方厘米/秒)。圖7顯示在7周㈧及10月⑶生物圖像化的模型生物體，說明腦中熒光素酶圖像隨年齡增加而減退，其與在早期出生后發(fā)育后觀察到的髓鞘形成減退有關(guān)。圖8顯示髓鞘堿性蛋白熒光素酶小鼠的體內(nèi)生物成像左方是負(fù)轉(zhuǎn)基因野生型小鼠(WT)，背景生物發(fā)光在頭顱(R0I :關(guān)注區(qū)域)中測(cè)量，相當(dāng)于2.7X103光子/秒。呈現(xiàn)在右方的是雜合髓鞘堿性蛋白熒光素酶小鼠，關(guān)注區(qū)域的生物發(fā)光相當(dāng)于1.327xl05光子/秒。呈現(xiàn)在中央的是純合髓鞘堿性蛋白熒光素酶小鼠，關(guān)注區(qū)域值為3. 2924x10s光子/秒，其大致如同預(yù)期為雜合值的兩倍。圖9顯示中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異性在時(shí)間上熒光素酶的表達(dá)。所示的來自髓鞘堿性蛋白熒光素酶轉(zhuǎn)基因小鼠的頭顱生物發(fā)光從第4周(A及*)至第8周(B及**)減退并平行于Taqman分析法(C)測(cè)定的內(nèi)源性髓鞘堿性蛋白轉(zhuǎn)錄本水平。圖1、0顯示熒光素酶在髓鞘堿性蛋白熒光素酶小鼠中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異性及亞區(qū)的表達(dá)。在切片的生物成像后，髓鞘堿性蛋白熒光素酶轉(zhuǎn)基因小鼠腦的兩個(gè)矢狀切面(A及B)顯示，腦中的胼胝體亞區(qū)含有最高生物發(fā)光信號(hào)并與銅宗損傷模型中最大的脫髓鞘作用及髓鞘再生作用有關(guān)。圖11顯示在髓鞘堿性蛋白熒光素酶模型中的生物成像及已知發(fā)生在銅宗損傷飲食中的其它生物應(yīng)答。在此施行銅宗飲食4周，導(dǎo)致在圖左方示出的生物成像及細(xì)胞變化。預(yù)期所指(箭頭)的每周生物成像平行于內(nèi)源性髓鞘堿性蛋白的表達(dá)水平變化(Matsushima GK and Morell P, Brain Pathology 11，1-10，2001)。圖12顯示應(yīng)答于持續(xù)性銅宗飲食處理，在野生型C57BL/6J小鼠中的內(nèi)源性髓鞘堿性蛋白穩(wěn)定態(tài)信使核糖核酸的變化。8周齡的小鼠在其飲食中置放銅宗達(dá)12周(實(shí)心三角)。在第二組(空心三角)中，在放置6周后移除銅宗食物，使小鼠得以在至多另外6周中復(fù)原。通過northern印跡法(northern blot)單獨(dú)測(cè)定信使核糖核酸水平的數(shù)據(jù)，并相對(duì)于三個(gè)對(duì)照的平均值繪圖(Jurevics H, et al, Journal of Neurochemistry, 2002, 82, I26-136)。圖13顯示示出的銅宗飲食對(duì)髓鞘堿性蛋白熒光素酶生物成像模型的影響。所述 成像信號(hào)可清楚模擬內(nèi)源性髓鞘堿性蛋白基因的表達(dá)模式。在喂食銅宗食物期間(由第O周至第4周)，有2-3倍的成像信號(hào)降低，而移除銅宗食物后(由第4周至第7周)，也有3-4倍的成像信號(hào)增加。圖14顯示在髓鞘堿性蛋白熒光素酶模型中的胼胝體的勒克司堅(jiān)牢藍(lán)(LFB)染色。將小鼠用銅宗或正常食物處理4周，然后二者回復(fù)至正常飲食。在第6周時(shí)，與正常飲食處理組(A)相比，可在銅宗處理的髓鞘堿性蛋白熒光素酶模型的胼胝體(B)中使用勒克司堅(jiān)牢藍(lán)染色以組織化學(xué)方式檢測(cè)到清楚脫髓鞘作用。髓鞘形成的結(jié)構(gòu)變化的組織化學(xué)測(cè)定與經(jīng)處理的髓鞘堿性蛋白熒光素酶模型的生物成像信號(hào)變化有關(guān)。圖15顯示在自發(fā)髓鞘再生期間，過氧化物酶體增生物活化受體δ (PPAR δ )激動(dòng)劑工具化合物(以下稱為’517)在171系雜合小鼠中提高熒光素酶的成像信號(hào)。將8周齡的髓鞘堿性蛋白熒光素酶小鼠(171雜合的，B6C3H品系)用含有0. 2%銅宗的飲食處理4周，然后用正常飲食(normal chow diet)處理，使髓鞘再生。然后將小鼠每日二次口服媒介物(0. 6%羧甲基纖維素鈉鹽與0. 5%聚山梨醇酯80)或30毫克/公斤的過氧化物酶體增生物活化受體S激動(dòng)劑工具化合物’517達(dá)8日，并在指定時(shí)間點(diǎn)圖像化。將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化至零周的基線信號(hào)。與媒介物組(n=12)相比，工具化合物’517(n=12)導(dǎo)致熒光素酶信號(hào)相對(duì)增加30-100%，其已被歸因于所述化合物刺激少突膠質(zhì)細(xì)胞的祖細(xì)胞分化作用的影響(例如，與體外研究結(jié)果一致)。圖16 :過氧化物酶體增生物活化受體δ激動(dòng)劑工具化合物’ 517改善在髓鞘再生期間勒克司堅(jiān)牢藍(lán)(LFB)髓鞘染色(171系雜合的，B6C3H品系)。將來自福爾馬林固定石蠟包埋的腦部的矢狀竇旁組織切片以勒克司堅(jiān)牢藍(lán)染色，用于定性評(píng)價(jià)胼胝體中的髓鞘。對(duì)每一時(shí)間點(diǎn)的染色切片進(jìn)行評(píng)分及分級(jí)，等級(jí)由O (完全髓鞘形成)至5(完全脫髓鞘)。評(píng)分系統(tǒng)如下0=正常髓鞘，無脫髓鞘作用；1=最小局部脫髓鞘；2=輕至中度局部脫髓鞘；3=中度局部廣泛性脫髓鞘；4=嚴(yán)重局部廣泛性脫髓鞘；5=嚴(yán)重?cái)U(kuò)散性脫髓鞘。在4周銅宗處理后，來自小鼠的勒克司堅(jiān)牢藍(lán)染色腦切片的組織學(xué)評(píng)價(jià)證實(shí)在171系雜合小鼠(n=5)中的胼胝體的中度至嚴(yán)重脫髓鞘作用。工具化合物’517組(n=5)與媒介物對(duì)照組(n=3)相t匕，在髓鞘再生期間從第4周至第5周的’ 517處理導(dǎo)致通過勒克司堅(jiān)牢藍(lán)在第7周時(shí)間點(diǎn)所測(cè)的可測(cè)量的髓鞘增加。盡管實(shí)驗(yàn)個(gè)體數(shù)量少，但是組織學(xué)數(shù)據(jù)支持體內(nèi)熒光素酶生物成像數(shù)據(jù)，顯示當(dāng)與媒介物對(duì)照相比時(shí)，用’ 517化合物處理的小鼠的髓鞘再生增加。圖17 :在銅宗模型中，在脫髓鞘作用期間的30毫克/公斤的雌激素受體β (ERi3)激動(dòng)劑(以下稱為‘5a)及10毫克/公斤的正對(duì)照喹硫平(Quetiapine)為保護(hù)性的。將髓鞘堿性蛋白熒光素酶171系雜合B6C3H小鼠喂食銅宗飲食4周，并口服’ 5a(10毫克/公斤或30毫克/公斤)或正對(duì)照喹硫平(QTP)。將小鼠在第O周(基線)、第3周及第4周圖像化，并將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化至第O周的基線。對(duì)于第3周及第4周的時(shí)間點(diǎn)，在10毫克/公斤，喹硫平組與媒介物對(duì)照相比呈現(xiàn)顯著成像信號(hào)增加。喹硫平處理組的結(jié)果與Yanbo Zhang等人發(fā)表的數(shù)據(jù)一致，其標(biāo)題為“喹硫平緩解C57BL/6小鼠腦中由銅宗引起的腦白質(zhì)病變(Quetiapine alleviates the cuprizone-induced white matter pathology in brain ofC57BL/6mouse)，，(Schizophrenia Research, 2008, Dec 106, 182-91)。與媒介物相比，30 毫克/公斤的化合物’ 5a在銅宗飲食第3周(趨勢(shì))及第4周(明顯)顯示信號(hào)增強(qiáng)。10毫克/公斤的’ 5a在第3及第4周無顯著效果。結(jié)果表明，該髓鞘堿性蛋白熒光素酶成像模型足以靈敏至檢測(cè)銅宗模型中的劑量依賴性變化。
圖18 :與第3及第4周的媒介物對(duì)照組相比，’ 5a (30毫克/公斤)與喹硫平(10毫克/公斤)組具有顯著較強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因活性。成像模型數(shù)據(jù)支持喹硫平及’5a 二者減弱銅宗引起的腦脫髓鞘作用及髓鞘破壞。圖19顯示在純合與雜合小鼠(B6C3H，171系)之間的銅宗模型成像信號(hào)比較。將N3代的雜合小鼠品種間互交以產(chǎn)生髓鞘堿性蛋白熒光素酶等位基因的純合小鼠。在銅宗處理期間，純合小鼠較雜合小鼠表達(dá)超過2倍的生物成像信號(hào)窗。純合子中的兩份報(bào)道基因拷貝在脫髓鞘期間(例如，銅宗飲食4周后)呈現(xiàn)超過2倍的信號(hào)降低，且在髓鞘再生期間(例如，移除銅宗飲食并回復(fù)正常飲食I周后)呈現(xiàn)2倍信號(hào)增加。雖然數(shù)據(jù)已證明171雜合系(B6C3H品系)在銅宗模型中起作用，并可檢測(cè)化合物功效，但是該模型可通過育種進(jìn)一步改良為純合性，以增加生物成像信號(hào)強(qiáng)度。由于可將小鼠群落維持為純合子，這也簡(jiǎn)化模型生產(chǎn)，并降低基因分型成本。總的來說，更大成像窗可在藥理化合物分析研究中擴(kuò)大化合物功效的檢測(cè)。圖20 :以勒克司堅(jiān)牢藍(lán)染色的來自福爾馬林固定石蠟包埋的小鼠腦的矢狀竇旁組織切片中的胼胝體(括號(hào)201中的暗縱向結(jié)構(gòu))的顯微照片表示評(píng)價(jià)髓鞘狀態(tài)的白質(zhì)區(qū)域。此區(qū)域用于胼胝體的勒克司堅(jiān)牢藍(lán)(LFB)染色的定量數(shù)字成像分析。圖21 :三種不同髓鞘堿性蛋白熒光素酶系(171系B6C3H雜合品系、121系C57BL/6雜合品系及171系B6C3H純合品系)的成像窗及組織學(xué)窗的比較。將小鼠用含有0.2%銅宗的飲食處理4周或5周。將成像數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化至第O周的基線測(cè)量值。在每一研究結(jié)束時(shí)收取小鼠腦，并以勒克司堅(jiān)牢藍(lán)(LFB)針對(duì)髓鞘染色連續(xù)石蠟切片。平均定性勒克司堅(jiān)牢藍(lán)評(píng)分(O至5)顯示在表中。171系B6C3H純合小鼠呈現(xiàn)最大成像信號(hào)降低，也證實(shí)如定性組織學(xué)所評(píng)價(jià)的最嚴(yán)重脫髓鞘作用。171系B6C3H雜合小鼠呈現(xiàn)最小成像窗，也在第4周呈現(xiàn)最少組織學(xué)脫髓鞘作用。圖22通過對(duì)喹硫平(QTP)治療應(yīng)答的示范，進(jìn)一步證實(shí)銅宗模型中171系純合小鼠的用途。將小鼠喂食銅宗飲食5周，并同時(shí)每日口服喹硫平(10毫克/公斤)。將小鼠在第O周(基線)、第3周及第5周成像。將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化至第O周基線測(cè)量值。與媒介物對(duì)照相比，喹硫平(10毫克/公斤)在第3周及第4周的時(shí)間點(diǎn)都導(dǎo)致顯著成像信號(hào)增加。結(jié)果與171系雜合小鼠獲得的結(jié)果(圖17及18) —致。數(shù)據(jù)表示，171系純合小鼠可用于評(píng)價(jià)在銅宗模型中化合物維持髓鞘表達(dá)及完整性的功效。圖23 :來自121系小鼠的體外脊髓成像。發(fā)光的覆蓋說明，將轉(zhuǎn)基因表達(dá)定位于腦與脊髓的白質(zhì)區(qū)。這進(jìn)一步支持由全動(dòng)物生物成像實(shí)驗(yàn)所得的結(jié)論。圖24 :在C57B1/6小鼠、野生型、171系雜合及171系純合小鼠中的胼胝體的勒克司堅(jiān)牢藍(lán)(LFB)染色的定量數(shù)字圖像分析。在染色載玻片的掃描數(shù)字圖像上的胼胝體人工略畫區(qū)域上，使用Aperic/色彩反卷積運(yùn)算法計(jì)算胼胝體中陽性勒克司堅(jiān)牢藍(lán)染色百分面積的量。對(duì)于每只動(dòng)物，評(píng)價(jià)一片切片。每組的動(dòng)物數(shù)量在9至10只之間變動(dòng)。對(duì)于每只動(dòng)物及各組，計(jì)算陽性勒克司堅(jiān)牢藍(lán)染色百分面積。通過配對(duì)t檢定評(píng)價(jià)各組之間的統(tǒng)計(jì)顯著性。在4周銅宗喂食后，171純合小鼠及野生C57BL/6小鼠都呈現(xiàn)嚴(yán)重脫髓鞘作用(陽性染色百分面積介于40%至60%)。相對(duì)地，171系雜合小鼠僅呈現(xiàn)輕微脫髓鞘作用(陽性染色百分面積介于65%至80%)。因此，171系純合小鼠被認(rèn)定為在銅宗引發(fā)的脫髓鞘作用模型中使用的優(yōu)選系。
具體實(shí)施例方式以下五個(gè)標(biāo)準(zhǔn)已成功連續(xù)應(yīng)用于對(duì)生物成像模型的優(yōu)化選擇依據(jù)以下方法，可由5千堿基對(duì)或10千堿基對(duì)載體轉(zhuǎn)基因操作的小鼠系產(chǎn)生具體實(shí)施方案。下述結(jié)果來自用35個(gè)轉(zhuǎn)基因系開始的一個(gè)這種篩選方法。圖5圖示總結(jié)此方法。由制備的轉(zhuǎn)基因系中，選擇這樣的系在出生后髓鞘形成高峰時(shí)(例如，3-5周第一代小鼠)的體內(nèi)全動(dòng)物(例如，小鼠)成像顯示中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異性成像。所選35個(gè)系中的6個(gè)系進(jìn)行下一選擇階段。接著，選擇這樣的系體外成像確認(rèn)，熒光素酶轉(zhuǎn)基因的表達(dá)主要在腦白質(zhì)區(qū)中。來自步驟I的6個(gè)系中的5個(gè)進(jìn)行至下一階段。然后，選擇這樣的系熒光素酶圖像強(qiáng)度與在此例中的銅宗脫髓鞘作用模型中引發(fā)的脫髓鞘作用與髓鞘再生的變化高度相關(guān)。來自步驟2的5個(gè)系中的3個(gè)進(jìn)行至下一階段。接著，選擇這樣的系在上述銅宗模型中呈現(xiàn)清楚組織學(xué)脫髓鞘作用。來自步驟3的3個(gè)系中的2個(gè)被選為優(yōu)選系。作為概念的最后驗(yàn)證，我們選擇了一個(gè)系，其中可在該生物成像模型中最理想檢測(cè)A003398711(—種過氧化物酶體增生物活化受體δ選擇性激動(dòng)劑)的功效。使用以上五個(gè)標(biāo)準(zhǔn)選出不例性的系,名為171系(B6C3品系,雜合)，并用作優(yōu)選模型。這種方法的更詳細(xì)的描述在下述實(shí)施例中描述。定義除非另有說明，本申請(qǐng)使用的術(shù)語意義如廣泛使用的科學(xué)用語，其可能異于口語
一般用法?；驊?yīng)作廣義解釋，以包括轉(zhuǎn)錄及非轉(zhuǎn)錄區(qū)。
化合物應(yīng)作廣義解釋，以包括化學(xué)化合物,例如,有機(jī)化學(xué)實(shí)體,生物化合物,例如抗體及抗原辨識(shí)片段與結(jié)構(gòu)，核酸，例如干擾性核糖核酸等。制備表達(dá)螢火蟲熒光素酶的轉(zhuǎn)基因小鼠。在這些動(dòng)物中，使報(bào)道基因-熒光素酶與髓鞘堿性蛋白啟動(dòng)子連接，從而當(dāng)啟動(dòng)髓鞘堿性蛋白表達(dá)時(shí)，驅(qū)動(dòng)熒光素酶在白質(zhì)(有髓)區(qū)如中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞中的表達(dá)。系統(tǒng)性注射(靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下)底物熒光素，由活體小鼠頭部產(chǎn)生可檢測(cè)且可計(jì)量的光信號(hào)。通過施用銅宗脫髓鞘作用模型以選擇髓鞘堿性蛋白熒光素酶系，并反復(fù)以熒光素注射這些動(dòng)物，可通過非侵襲性生物發(fā)光成像，縱向(例如，歷時(shí)2個(gè)月)連續(xù)監(jiān)測(cè)及量化脫髓鞘作用與髓鞘再生。此模型成功定量監(jiān)測(cè)銅宗引發(fā)的脫髓鞘作用及過氧化物酶體增生物活化受體S化合物引發(fā)的髓鞘再生。檢測(cè)器技術(shù)的進(jìn)步導(dǎo)致靈敏度及成像質(zhì)量的實(shí)質(zhì)改善?，F(xiàn)今由專門電荷耦合組件(CCD)相機(jī)檢測(cè)光子，當(dāng)光子撞擊硅片時(shí)，該相機(jī)將光子轉(zhuǎn)化為電子。電荷耦合組件相機(jī)在空間上將入射光子強(qiáng)度編碼為電荷分布圖，其然后經(jīng)處理而產(chǎn)生圖像。噪聲通過以下方法降低超冷卻電荷耦合組件相機(jī)及將相機(jī)安裝在暗箱中。在圖像獲取及分析期間，這些相機(jī)通常由計(jì)算機(jī)控制。第二代相機(jī)系統(tǒng)小得多，因此可裝置在實(shí)驗(yàn)室臺(tái)頂上，使得該技術(shù)對(duì)于 日常實(shí)驗(yàn)可行及實(shí)用。Xenogene公司(Xenogene Company)已將生物成像技術(shù)商業(yè)化。在現(xiàn)有成像樣式中，基于生物發(fā)光或熒光的光學(xué)技術(shù)已變得最方便及容易操作。由于來自組織的本底發(fā)光(噪聲)極低，生物發(fā)光成像(BLI)的特征在于顯著的靈敏度。迄今為止，生物發(fā)光成像已成功用于監(jiān)測(cè)生物過程，例如，在各種動(dòng)物模型中的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、腫瘤發(fā)展、基因表達(dá)及病毒感染。螢火蟲熒光素酶需要細(xì)胞內(nèi)輔因子如三磷酸腺苷用于活動(dòng)。這將其使用限于基因工程化以表達(dá)該酶的細(xì)胞。因此，許多有用的成像應(yīng)用如監(jiān)測(cè)循環(huán)因子的分布、檢測(cè)細(xì)胞外抗原表達(dá)以及標(biāo)記內(nèi)源性細(xì)胞不適用于螢火蟲熒光素酶成像。螢火蟲熒光素酶的另一缺點(diǎn)是在固定的細(xì)胞與組織樣品中缺乏替代的底物來檢測(cè)它。這使得難以結(jié)合體內(nèi)成像與顯微分析。從內(nèi)部器官放射的光的檢測(cè)靈敏度取決于數(shù)種因素，包括熒光素酶表達(dá)的水平、標(biāo)記細(xì)胞在體內(nèi)的深度(光子必須通過組織的距離)，以及檢測(cè)系統(tǒng)的靈敏度。使用非侵襲性全動(dòng)物成像監(jiān)測(cè)熒光素酶報(bào)道基因表達(dá)盒的表達(dá)已有描述(Contag, C. , U. S. Pat. No. 5, 650, 135, Jul. 22, 1997, herein incorporated byreference;Contag,P.,et al,Nature Medicine 4(2):245-247, 1998;Contag, C. , etal, OSA TOPS on Biomedical Optical Spectroscopy and Diagnostics3:220-224, 1996;Contag, C. H. , , Photochemistry and Photobiology66 (4):523-531，1997;Contag, C. H.，al, Molecular Microbiology 18 (4):593-603，1995)。這種成像一般使用至少一種光檢測(cè)儀器設(shè)備，例如電荷耦合組件(CXD)相機(jī)。髓鞘堿性蛋白基因的控制元件髓鞘堿性蛋白(MBP)是多肽家族，主要表達(dá)在神經(jīng)系統(tǒng)中，其中它們?cè)谒枨市纬芍邪缪葜匾巧Ｖ饕谵D(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)髓鞘堿性蛋白的表達(dá)，例如在分化少突膠質(zhì)細(xì)胞中。在神經(jīng)科學(xué)期刊(Journal of Neuroscience)中,Farhadi等人描述了新的調(diào)節(jié)組合元件，其在時(shí)間上控制髓鞘堿性蛋白基因的表達(dá)。Farhadi等人證實(shí)，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在髓鞘形成開始期間及隨后的各個(gè)階段使用不同的調(diào)節(jié)序列組合來控制髓鞘堿性蛋白的表達(dá)。髓鞘堿性蛋白(MBP)為正常髓鞘致密性所需，并牽涉在實(shí)驗(yàn)性及人類脫髓鞘疾病如多發(fā)性硬化(MS)中。為了進(jìn)一步促進(jìn)髓鞘生物學(xué)的理解并在活體動(dòng)物中測(cè)試髓鞘強(qiáng)化化合物，本發(fā)明使用髓鞘堿性蛋白啟動(dòng)子性質(zhì)及最靈敏的熒光素酶報(bào)道基因技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明髓鞘堿性蛋白熒光素酶模型。該模型目前允許在活體動(dòng)物中靈敏地體內(nèi)測(cè)量髓鞘基因轉(zhuǎn)錄應(yīng)答。髓鞘堿性蛋白熒光素酶報(bào)告盒的構(gòu)建以位于髓鞘堿性蛋白啟動(dòng)子M3區(qū)域中的探針篩選129SvEv細(xì)菌人工染色體基因庫(Cell&Molecular Technologies)。該探針具有507個(gè)堿基對(duì)，并由引物對(duì)(5’ -actccttaccacacttcttgcagg-3，5，_tctattgggtgatgtgtgccatc_3) (SEQ ID Nos. I 及 2)產(chǎn)生。通過Southern分析(Southern analysis),用相同探針確認(rèn)髓鞘堿性蛋白的細(xì)菌人工染色體(使用EcoRI切割7. 6K片段，和/或以BamHI切割13. 8K片段)。 將用引物組(MBP_L_SP25-gggggatccacctgggacgtagcttttgctg及 MBP_AP15_ggggtttaaactccggaagctgctgtggg) (SEQ ID Nos. 3及4)通過高保真聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增的含有Ml至M4(10K)的“長(zhǎng)段”髓鞘堿性蛋白啟動(dòng)子克隆入Invitrogen’ s xl_topo載體,產(chǎn)生中間載體(Topo MBP IOk載體)。然后將髓鞘堿性蛋白IOk啟動(dòng)子(BamHl及PmeI片段)插入至pGL3hygro neo載體(BglII及PmeI位置)中。將該最終IOK載體稱為pGL3-hygro_longMBP-Iuci (參見例如圖4)。將用引物組(MBP_S_SP25-gggggatccatccctggatgcctcagaagag及 MBP_AP15_ggggtttaaactccggaagctgctgtggg) (SEQ ID Nos. 5及6)通過高保真聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增的含有Ml至M3(5K)的“短段”髓鞘堿性蛋白啟動(dòng)子克隆入Invitrogen’s p2. l_topo載體中，產(chǎn)生中間載體(Topo MBP5k載體)。然后將髓鞘堿性蛋白5k啟動(dòng)子(BamHl及PmeI片段)插入至pGL3 hygro neo載體(BglII及PmeI位置)中。將該最終5K載體稱為pGL3-hygro-shortMBP-Iuci (參見例如圖3)。來自兩種pGL3-hygo_MBP質(zhì)粒的脫氧核糖核酸序列確認(rèn)M1、M2、M3及M4的讀序。此外，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染這些質(zhì)粒至293T細(xì)胞中得到可檢測(cè)的熒光素酶活性。動(dòng)物處理及轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生依據(jù)聯(lián)邦指導(dǎo)方針進(jìn)行所有動(dòng)物工作。使用三種不同品系的小鼠(FVB、B6C3及C57BL/6)。在吸入異氟醚(Baxter, Deerfeld, IL)麻醉的狀態(tài)下進(jìn)行成像；觀察小鼠直至完
全復(fù)原。如下產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠用Not I及BamHl酶切割pGL3-hygro-MBP10k_luci或pGL3-hygro-MBP5k-luci質(zhì)粒。然后將含有髓鞘堿性蛋白啟動(dòng)子、熒光素酶及多腺苷酸化信號(hào)的片段凝膠純化。通過標(biāo)準(zhǔn)原核注射(standard pronuclear injection)至FVB、B6C3或C57BL/6胚胎中產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠。簡(jiǎn)而言之，在原核顯微注射期間，將髓鞘堿性蛋白熒光素酶基因盒脫氧核糖核酸直接導(dǎo)入至剛剛受精的小鼠卵中。使用細(xì)針將脫氧核糖核酸注射至源自精子的大型雄性原核中。脫氧核糖核酸傾向于以許多串聯(lián)排列的拷貝的形式整合在基因組中的隨機(jī)位置，經(jīng)常在發(fā)生一次或二次細(xì)胞分裂之后。因此，所得的小鼠僅為部分轉(zhuǎn)基因。如果轉(zhuǎn)基因細(xì)胞促成生殖系，那么將產(chǎn)生一些轉(zhuǎn)基因卵或精子，且下一代小鼠將為完全轉(zhuǎn)基因。
使用螢火蟲熒光素酶基因特異性引物(聚合酶鏈反應(yīng)引物5'gaaatgtccgttcggttggcagaagc-3'及 5' ccaaaaccgtgatggaatggaacaaca-3' )(SEQ IDNos. 7及8)，通過尾部活檢脫氧核糖核酸的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)鑒定轉(zhuǎn)基因始祖小鼠及其轉(zhuǎn)基因第一代子代。使用體內(nèi)成像系統(tǒng)(IVIS 100;Xenogen, Alameda, CA)圖像化25個(gè)陽性始祖小鼠的子代，并以腦部成像信號(hào)鑒定6個(gè)轉(zhuǎn)基因系(2個(gè)FVB系及4個(gè)B6C3HF1系)。由于在此實(shí)驗(yàn)中沒有產(chǎn)生陽性腦部成像的C57 BL/6始祖，使ー個(gè)FVB系與C57 BL/6小鼠回交，得到C57 BL/6品系。隨后將B6C3 171系小鼠互交繁殖，以產(chǎn)生純合轉(zhuǎn)基因交配對(duì)。也使B6C3F1171系與C57白化系回交。表I將體內(nèi)生物發(fā)光成像用于篩選髓鞘堿性蛋白熒光素酶系。以異氟醚麻醉第一代小鼠，并通過尾靜脈或皮下注射劑量為250毫克/公斤的熒光素。熒光素注射8分鐘后，將小 鼠圖像化。以腦部成像信號(hào)鑒定6個(gè)系(圖5，2個(gè)FVB品系58及121，以及4個(gè)B6C3品系12、23、85及171)。除了 58系，其它5系在腦白質(zhì)區(qū)呈現(xiàn)體外熒光素酶成像信號(hào)。表I顯示在出生后不久通過尾部活檢聚合酶鏈反應(yīng)基因型鑒定的35個(gè)轉(zhuǎn)基因脫氧核糖核酸陽性始祖小鼠的數(shù)據(jù)。15個(gè)脫氧核糖核酸陽性始祖系產(chǎn)生MBP-IOk luci，20個(gè)脫氧核糖核酸陽性始祖系產(chǎn)生MBP-5k Iuci。在整個(gè)應(yīng)用中，將轉(zhuǎn)基因及轉(zhuǎn)基因小鼠縮寫為MBP-Iuci。表I :將髓鞘堿性蛋白熒光素酶轉(zhuǎn)基因小鼠作為6個(gè)不同的模型產(chǎn)生，以改善生物
成像應(yīng)用
模型編號(hào)I品系雜合或純合特征
538FVB121系雜合中樞神經(jīng)系統(tǒng)及脊髓表達(dá)
557B6C3H 171系雜合僅由銅宗處理調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)_
衣達(dá)
551B6C3H 171系純合僅由銅宗處理調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)
表達(dá)
556C57 BL/6J 121系雜合中樞神經(jīng)系統(tǒng)及脊薇表達(dá)
565C57白化171系純合僅由銅宗處理調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)
(C57 表達(dá)；白化可改善成像__Albino)___
595C57白化121系雜合中樞神經(jīng)系統(tǒng)及脊髓表達(dá);白化
(C57可改善成像
Albino)圖7及圖9顯示，髓鞘堿性蛋白熒光素酶生物發(fā)光良好地與中樞神經(jīng)系統(tǒng)亞區(qū)和年齡相關(guān)髓鞘形成有夫。體外成像與發(fā)光計(jì)測(cè)定在皮下注射熒光素(250毫克/公斤)10分鐘后，以ニ氧化碳對(duì)動(dòng)物施行安樂死，然后立即對(duì)分離出的器官進(jìn)行體外熒光素酶成像。將解剖的器官置于覆蓋塑料片的黑紙上并以IVIS圖像化；在解剖后20至30分鐘內(nèi)仍可檢測(cè)到強(qiáng)生物發(fā)光信號(hào)。使用LivingImage software (Xenogen Corp.)進(jìn)行圖像分析及生物發(fā)光的定量。將組織樣品置于含有抑制劑的裂解緩沖液(被動(dòng)裂解緩沖液[Promega]及少量全蛋白酶抑制劑混合液[Complete Mini Protease InhibitorCocktail, Roche, Indianapolis, IN])中。使用組織均化器將組織均化。以短暫超聲處理進(jìn)ー步均化組織。離心組織勻漿并將澄清的裂解物用于發(fā)光計(jì)測(cè)定。為了發(fā)光計(jì)測(cè)定，依廠商指示制備突光素酶測(cè)定底物(Luciferase Assay System, Promega) 0混合組織勻衆(zhòng)(20微升)及底物(100微升)(100 u I)并在發(fā)光計(jì)中測(cè)量。獲取本底發(fā)光讀數(shù)，并從發(fā)光數(shù)據(jù)扣除背景讀數(shù)。遵循廠商的規(guī)程，使用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(BCA Protein AssayKit (Pierce, Rockford, IL))測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。將姆ー蛋白質(zhì)裂解物的發(fā)光計(jì)算為姆微克蛋白質(zhì)的任意単位的光。銅宗引發(fā)的脫髓鞘作用與組織學(xué)確證 對(duì)小鼠施用銅宗4周，導(dǎo)致廣泛的胼胝體脫髓鞘作用。銅宗引發(fā)的脫髓鞘作用與顯著的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生(microgliosis)及巨卩遼細(xì)胞募集相關(guān)(Bakker and Ludwin, JNeurol Sci 78:125-37, 1987;Hiremath et al. , J Neuroimmunol 92:38-49，1998;McMahonet al. , J Neuroimmunol 130:32-45，2002),但不具有最低 T 細(xì)胞應(yīng)答(Matsushima andMorell1Brain Pathol 11:107-16, 2001) 0在此模型中髓鞘損傷位置的一致及可預(yù)測(cè)的性質(zhì)使胼胝體髓鞘形成的變化易于量化。這些變化可能由少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞的新生髓鞘形成作用造成，然而，由免疫調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)末期脫髓鞘的預(yù)防作用(Pluchino et al. , Nature436:266-71,2005)可能是另一可行的解釋。如上所述，對(duì)多個(gè)品系的髓鞘堿性蛋白熒光素酶轉(zhuǎn)基因(MBP-luci Tg)小鼠評(píng)價(jià)銅宗引發(fā)的脫髓鞘作用/髓鞘再生活動(dòng)的體內(nèi)評(píng)價(jià)值。髓鞘堿性蛋白(MBP)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶(Iuci)的表達(dá)允許在表達(dá)髓鞘堿性蛋白的轉(zhuǎn)基因(Tg)哺乳動(dòng)物的腦中體內(nèi)生物成像定量髓鞘。例如，該模型可使用在飲食中喂食0.2%銅宗的野生型C57/BL6小鼠。為了在各種化合物處理后評(píng)價(jià)髓鞘，先前的模型需要在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)最后犧牲動(dòng)物。由于需要多個(gè)動(dòng)物，動(dòng)物間的差異性是需要額外受試者(更多個(gè)體)以達(dá)到顯著性的ー項(xiàng)因素。當(dāng)通過勒克司堅(jiān)牢藍(lán)(LFB)組織化學(xué)染色評(píng)價(jià)時(shí)，飲食含0.2%銅宗4周的MBP5k-luci 171系(B6C3)小鼠在腦部胼胝體中顯示突出和顯著的脫髓鞘作用。這種脫髓鞘作用進(jìn)ー步與體內(nèi)生物成像熒光素酶信號(hào)的降低有夫。然而，MBP IO-Luci 121系小鼠的FVB品系未呈現(xiàn)可相比的脫髓鞘作用。在FVB小鼠中進(jìn)行了額外研究，試圖找出可導(dǎo)致顯著脫髓鞘作用的在飲食中銅宗的變化量及銅宗處理的變化時(shí)段的潛在制度。結(jié)果顯示，在胼胝體中，勒克司堅(jiān)牢藍(lán)評(píng)價(jià)僅有中度脫髓鞘作用。因此，優(yōu)選開發(fā)171系。不同品系對(duì)銅宗ネ旲型的影響由于其高繁殖力，常使用FVB/NJ(FVB)品系制造轉(zhuǎn)基因小鼠。而由于它們白色的相對(duì)不吸光毛色，F(xiàn)VB品系小鼠也廣泛用于轉(zhuǎn)基因生物成像模型。在FVB或其它品系中，也可去除毛發(fā)(例如通過修剪)，從而減少毛發(fā)或毛皮的吸收或散射所導(dǎo)致的信號(hào)損失。因?yàn)樵阢~宗模型中發(fā)現(xiàn)品系間差異，所以品系的選擇可影響結(jié)果。為特定目的而選擇最佳品系被視為常規(guī)優(yōu)化，例如取決于所選的測(cè)定法及設(shè)備。然而，制造轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物不被視為限制因素；而是使用特定品系及轉(zhuǎn)基因系對(duì)例如影響髓鞘形成的條件的敏感度作為改善數(shù)據(jù)質(zhì)量的選擇標(biāo)準(zhǔn)。取決于所選的髓鞘形成/脫髓鞘作用活動(dòng)，品系或遺傳背景的選擇可能影響結(jié)果。據(jù)認(rèn)為，特殊脫髓鞘作用模型在特定品系中可作用更好。如此選擇模型及品系可被視為例行測(cè)定開發(fā)的一部分。雖然銅宗喂食是研究脫髓鞘作用與髓鞘再生的優(yōu)良模型，但是在品系差異中明顯觀察到，在這種模型中存在強(qiáng)的遺傳因素。FVB 品系來自FVB品系的小鼠被選中，部分歸因于其白毛色。FVB小鼠提供適于多數(shù)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)及隨后基因分析的系統(tǒng)。例如，近交FVB品系的特征在于強(qiáng)繁殖能力及ー貫的大窩(large litters)。這降低產(chǎn)生大種群的成本及カ氣。而且，已受精FVB卵含有大而明顯的原核，方便顯微注射脫氧核糖核酸。此外，該FVB品系具有白化毛色，使其成為生物成像的首選。這些特色使FVB品系有利于研究轉(zhuǎn)基因生物成像模型。然而，當(dāng)其它品系呈現(xiàn)希望的特征時(shí)，可使用其它品系。
FVB品系小鼠在體重減輕方面對(duì)0. 2%銅宗十分敏感。每周需要補(bǔ)充2至3次正常食物/轉(zhuǎn)膠(transgel)，以避免嚴(yán)重體重減輕及毒性。此外，本發(fā)明人的經(jīng)驗(yàn)顯示，在各種銅宗喂食制度下，F(xiàn)VB品系小鼠呈現(xiàn)最小組織學(xué)脫髓鞘作用。因此，將MBP IOk-Iuci 121系(FVB品系)與C57 B1/6回交，以促進(jìn)將來的確證
及應(yīng)用。B6C3/Tac 品系B6C3雜交品系可通過以下方法產(chǎn)生將C57BL/6Ntac雌性小鼠與來自TaconicUS’ s 商業(yè)群(Taconic US’ s commercial colonies)的 C3H/HeNTac 雄性小鼠互交。它具有黒色或野鼠色(agouti)毛色。B6C3將為基因座雜合的，其中C57BL/6與C3H不同，和基因座純合的，其中它們相同。B6C3/Tac小鼠呈現(xiàn)明顯組織學(xué)脫髓鞘作用。具體地，與野生型C57BL6相比，在生物成像模型171系MBP 5k-Luci純合小鼠中的脫髓鞘作用僅為輕度較不廣泛的，差異性輕微。與C57BL6及171系MBP 5k_Luci純合小鼠相比，在171系MBP 5k_Luci雜合小鼠中的脫髓鞘作用被認(rèn)為較不嚴(yán)重，更局部性和更易變。這些結(jié)果說明，髓鞘堿性蛋白熒光素酶模型可用于測(cè)定個(gè)體、品系或品種對(duì)影響髓鞘形成的活動(dòng)的敏感性。此外，髓鞘堿性蛋白熒光素酶結(jié)構(gòu)即使在黑毛哺乳動(dòng)物中也不失去效用。BALB/cJ 品系也調(diào)研在BALB/cJ小鼠中銅宗對(duì)皮層脫髓鞘作用的影響。在這些小鼠中，皮層脫髓鞘作用僅為局部性。此外，在BALB/cJ小鼠中，皮層小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的累積明顯增加，而在C57BL/6小鼠的皮質(zhì)中無小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。因此品系的差異性可用于支持不同研究目的。C57BL/6J Jax 品系C57BL/6遺傳背景的動(dòng)物適用于許多銅宗模型研究，并在過去的三十年中已應(yīng)用于數(shù)個(gè)實(shí)驗(yàn)室。當(dāng)8周齡的C57BL/6小鼠在飲食中喂食0. 2%銅宗時(shí)，成熟少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞被特異性攻擊(無法滿足大量髓鞘支持的代謝需求)并走向細(xì)胞凋亡。緊接著是小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的募集及髓鞘吞噬作用。髓鞘基因表達(dá)的研究配合形態(tài)學(xué)研究指出，即使面臨持續(xù)代謝激發(fā)，少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的祖細(xì)胞增生并侵襲脫髓鞘區(qū)域。如果終止銅宗激發(fā)，在大概數(shù)周內(nèi)發(fā)生幾乎完全的髓鞘再生?？赏茢啵ㄟ^可溶性因子在不同細(xì)胞類型之間細(xì)胞間通訊。本發(fā)明的方法及模型可用于研究細(xì)胞間通訊活動(dòng)，例如，測(cè)定是否有假定因素涉及髓鞘形成的募集，篩選促進(jìn)募集的化合物，以及篩選抑制募集的化合物。此外，髓鞘堿性蛋白熒光素酶模型的再現(xiàn)性指出，其可允許測(cè)試操作(例如，在共有遺傳背景(common genetic background)上可獲得的基因敲除或轉(zhuǎn)基因，或干擾核糖核酸或藥物處理)，其可加速或抑制脫髓鞘作用和/或髓鞘再生的過程。髓鞘堿性蛋白熒光素酶模型的改良雖然171系(B6C3H品系，雜合子)已經(jīng)顯示在髓鞘形成/脫髓鞘作用研究中起作用，但是可將該模型通過以下方法進(jìn)ー步改良(I)繁殖成純合體型以增加生物成像信號(hào)強(qiáng)度，并減少模型生產(chǎn)及基因型成本；(2)繁殖成白化品系如C57品系，以用白毛降低成像信號(hào)衰減，和減輕多次除毛后的皮膚反應(yīng)；(3)將121系繁殖成C57 BL/6品系，以匹配內(nèi)部 研發(fā)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)銅宗模型品系。我們目前已經(jīng)證實(shí)，171系純合系比171系雜合系(每ー細(xì)胞2個(gè)報(bào)道基因基因盒拷貝)呈現(xiàn)超過兩倍的生物成像窗。其它實(shí)驗(yàn)也證實(shí)白化C57應(yīng)答于銅宗模型。成像系統(tǒng)與數(shù)據(jù)分析使用IVIS成像系統(tǒng)(Xenogen Corp.，Alameda, CA)非侵襲性測(cè)量生物發(fā)光。除非本申請(qǐng)另有說明，在腹膜內(nèi)注射熒光素(250毫克/公斤-I ；Xenogene Corp.) 10分鐘后成像,60秒采集(60-s acquisition),面元10 (binning 10)。在圖像采集期間，通過吸入 2%異氟醚(Abbott Laboratories Ltd. , Kent, United Kingdom)持續(xù)鎮(zhèn)浄小鼠。成像系統(tǒng)描述IVIS 成像系統(tǒng) 100 (IVIS Imaging System 100 (Xenogene))用于收集證實(shí)此發(fā)明的數(shù)據(jù)。Xenogen 靈敏IVIS 成像系統(tǒng) 100 系列(Xenogen’s sensitive IVIS ImagingSystem 100 Series)提供可調(diào)式矩形視野,例如，10 - 25厘米,可成像5只小鼠或2只大型大鼠，以及ー個(gè)標(biāo)準(zhǔn)微孔板。該系統(tǒng)特色為25毫米(I. 0英寸)正方形背部薄化背照式CCD(電荷耦合組件)相機(jī)，將其通過閉合循環(huán)冷卻系統(tǒng)(不具液態(tài)氮)低溫冷卻至約-90至-120° C，例如-105° C，以最小化電子背景并最大化靈敏度。電荷耦合組件相機(jī)設(shè)計(jì)用于高效率光子檢測(cè)，特別是在光譜的紅光區(qū)中。它可檢測(cè)極少量的光子，以及如同傳統(tǒng)相機(jī)一祥操作；在該寬信號(hào)范圍內(nèi)顯示圖像是Xenogen Living Image' 軟件的功能。具有六位濾光輪以分隔不同帶寬。這種光譜信息可掲示更多來源細(xì)胞的深度及分布。冷卻電荷耦合組件相機(jī)并優(yōu)化電子讀數(shù)，使得搜集的產(chǎn)生實(shí)時(shí)體內(nèi)圖像的數(shù)據(jù)具有極低噪聲。防光成像室極度防光的低背景成像室允許在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室照明環(huán)境中使用IVIS 成像系統(tǒng)100系列。上下移動(dòng)成像室中的樣品擱板以調(diào)整視野。研究者可觀看完整動(dòng)物，或聚焦于一部分以得到更多細(xì)節(jié)。加熱擱板以增進(jìn)麻醉動(dòng)物(例如，小鼠或大鼠)的幸福感。該系統(tǒng)包括動(dòng)物操作組件，例如，加熱的樣品擱板、氣體麻醉管線及Xenogen的完全氣體麻醉選件一XGI-8氣體麻醉系統(tǒng)(XGI_8Gas Anesthesia System)(在網(wǎng)頁上顯示)。較大的成像室可允許使用較大受試者或較多數(shù)量的受試者。用于體內(nèi)生物發(fā)光測(cè)定法的熒光素的制備
在實(shí)施例中使用下列材料螢火蟲D-熒光素鉀鹽1.0 克/瓶(例如，Xenogen XR-1001 或 Biosynth L-8220)不含鎂離子與鈣離子的杜爾貝科磷酸鹽緩沖鹽水(DPBS)孔徑0. 2微米的瓶ロ過濾器使用下列步驟成像制備25毫克/毫升的杜爾貝科磷酸鹽緩沖鹽水熒光素原液，并通過0. 2微米過濾器過濾消毒。分裝為5毫升儲(chǔ)存在-20° C。注射劑量為10微升/克體重。每ー小鼠的目標(biāo)是接受250毫克熒光素/公斤體重(例如，對(duì)20克的小鼠注射200微升，以遞送2. 0毫克的熒光素)。在成像之前數(shù)分鐘，皮下注射或腹膜內(nèi)注射或靜脈內(nèi)注射熒光素。任選對(duì)每個(gè)動(dòng)物模型進(jìn)行熒光素動(dòng)力學(xué)研究，以測(cè)定高峰信號(hào)窗。 3. 6髓鞘堿性蛋白熒光素酶成像方法如上所述，小鼠經(jīng)皮下注射、腹膜內(nèi)注射或靜脈內(nèi)注射250毫克/公斤的D-熒光素。在5分鐘(靜脈內(nèi)注射)或8分鐘(腹膜內(nèi)注射或皮下注射)之后，將小鼠使用IVIS100 (Xenogen)圖像化16分鐘(成像60秒并間隔60秒，共8張圖像，面元大小為8)。為了量化生物發(fā)光，定位所研究的相同圓形區(qū)域以包圍每ー小鼠的頭部區(qū)域，并使用LIVINGIMAGE軟件(2. 5版，Xenogen)將成像信號(hào)量化為平均亮度(光子/秒/平方厘米/球面度)。所研究的頭部區(qū)域在所有實(shí)驗(yàn)中保持固定面積及位置。在開始處理每ー動(dòng)物時(shí)將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為生物發(fā)光。3. 7統(tǒng)計(jì)分析對(duì)于統(tǒng)計(jì)分析,使用EverStat V5及Sigma Stat統(tǒng)計(jì)軟件包。采用組中的平均成像為平均值，并計(jì)算所有組的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SE)。當(dāng)比較兩組的平均值時(shí),進(jìn)行成對(duì)魏氏檢驗(yàn)(paired Wilcoxon test)或非成對(duì)魏氏檢驗(yàn)(unpaired Wilcoxon test)。將P〈0. 05的雙尾數(shù)值視為具統(tǒng)計(jì)顯著性。實(shí)施例轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生“長(zhǎng)段”啟動(dòng)子是一段約10千堿基對(duì)，含有Ml、M2、M3及M4，“短段”啟動(dòng)子是約5千堿基對(duì)，含有M1、M2及M3。這些啟動(dòng)子以高保真聚合酶鏈反應(yīng)方法克隆自含有髓鞘堿性蛋白基因的小鼠的細(xì)菌人工染色體(Bacterial Artificial Chromosome, BAC)。然后將姆一啟動(dòng)子片段克隆至載體中，例如克隆至pGL3-hygr0載體的多聯(lián)結(jié)位置(圖I及圖2)。將質(zhì)粒用Not I及BamHl限制酶切，以釋放髓鞘堿性蛋白熒光素酶轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒(圖3)，其被用于以標(biāo)準(zhǔn)原核顯微注射技術(shù)產(chǎn)生FVB/Tac及B6C3/Tac品系轉(zhuǎn)基因小鼠。產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因(Tg)動(dòng)物的一般策略為本領(lǐng)域所熟知，例如，如以下文獻(xiàn)所述Pinkert, C. A. (ea. ) 1994. Transgenic animal technology: A laboratory handbook.Academic Press, Inc. , San Diego, Calif. ; Monastersky G. M. and Rob I, J. M. (ed. ) (1995)Strategies in transgenic animal science. ASM Press. Wasmngton D. C.。與脫髓鞘作用/髓鞘再生活動(dòng)相關(guān)的髓鞘堿性蛋白熒光素酶轉(zhuǎn)基因信號(hào)在銅宗模型中使用被發(fā)現(xiàn)具有白質(zhì)區(qū)熒光素酶表達(dá)的MBP IOK-Iuci 121轉(zhuǎn)基因系(FVB品系)確證實(shí)驗(yàn)。如圖11中所不進(jìn)彳丁弟一項(xiàng)銅宗研究，在弟1、2及4周(0. 2%銅宗飲食)反復(fù)進(jìn)行熒光素酶成像，然后恢復(fù)至不含銅宗的正常飲食，并在第5、6及7周反復(fù)進(jìn)行熒光素酶成像(重復(fù)第I至3周)。如圖中所示，121系的熒光素酶表達(dá)明顯與銅宗引發(fā)的脫髓鞘作用和髓鞘再生時(shí)間過程相關(guān)。這與已發(fā)表的內(nèi)源性髓鞘堿性蛋白信使核糖核酸研究一致(Jurevics et al. , Journal of Neurochemistry, 2002, 82, 126-136)。FVB 品系小鼠只有ー種品系，已知對(duì)銅宗敏感(通過體重減輕看出)。通常，需要每周補(bǔ)充2至3次正常食物/轉(zhuǎn)膠，以避免此品系中的嚴(yán)重體重減輕及毒性。銅宗模型確證ー種熟知且廣泛使用的脫髓鞘作用/髓鞘再生模型是小鼠銅宗模型。此模型涉及飲食性消耗銅宗，ー種銅螯合劑(一般約0. 2%w/w,雙環(huán)己酮草酰ニ腙(CAS#370-81-0, Sigma C9012))，在粉末狀嚙齒動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室食物(powdered rodent labchow)中給藥一段時(shí)間，例如連續(xù)4至6周(參見例如,Matsushima and Morell, 2001)。已顯示銅宗對(duì)成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞具選擇性毒性。隨后轉(zhuǎn)換銅宗食物為正常食物，制造有利于復(fù)原的環(huán)境，使得在停止銅宗喂食4至6周后，小鼠將在胼胝體中呈現(xiàn)廣泛髓鞘再生。因此，銅宗模型提供完全體內(nèi)范例，以在其中研究脫髓鞘作用與髓鞘再生的情況(圖11及12)。

作為進(jìn)ー步證明，測(cè)試MBP 5k-luci 171系(B6C3品系)。這種品系也呈現(xiàn)對(duì)銅宗引發(fā)的脫髓鞘作用與髓鞘再生活動(dòng)的相關(guān)成像應(yīng)答，如圖13中所示。7只轉(zhuǎn)基因陽性小鼠以0. 2%銅宗處理6周，3只轉(zhuǎn)基因陽性小鼠以正常食物處理6周。所有7只小鼠可耐受0. 2%銅宗飲食，且平均體重減輕為15至25%。以銅宗處理(脫髓鞘作用)會(huì)有明顯成像信號(hào)降低。例如，從第0周至第4周降低43%的信號(hào)，而從第0周至第6周降低74%的信號(hào)。髓鞘堿性蛋白熒光素酶小鼠銅宗模型的組織學(xué)確證對(duì)于組織學(xué)確證，目的是在生物成像模型中證實(shí)，報(bào)道基因在銅宗處理期間的應(yīng)答與銅宗處理的小鼠胼胝體中的結(jié)構(gòu)上可檢測(cè)的脫髓鞘作用相關(guān)。通過勒克司堅(jiān)牢藍(lán)(LFB)染色顯現(xiàn)這些病理現(xiàn)象(參看圖20及24)。具體地，在最初試驗(yàn)中，以0. 2%銅宗喂食的MBP IOk-Iuci 121系(FVB品系)通過勒克司堅(jiān)牢藍(lán)染色僅測(cè)得少量脫髓鞘作用。為了使這些FVB品系小鼠產(chǎn)生明顯的組織學(xué)脫髓鞘作用，隨后使用多種喂食銅宗的制度，以試圖避免嚴(yán)重體重減輕。0. 2%、0. 175%及0. 15%銅宗劑量組出周的研究)每周需要補(bǔ)充3-4次正常食物/轉(zhuǎn)膠，以避免嚴(yán)重體重減輕及毒性。此外，進(jìn)ー步降低銅宗濃度而延長(zhǎng)處理時(shí)間。測(cè)試了銅宗濃度(0. 14%、0. 12%及0.1%)與處理時(shí)間(7周及9周)的研究，最多每周一次正常食物/轉(zhuǎn)膠補(bǔ)充。然而，所有數(shù)據(jù)顯示，在各種喂食銅宗的制度下，F(xiàn)VB品系小鼠(8周齡，體重28. 5±3克)具有較少組織學(xué)脫髓鞘作用。不選擇該FVB系作為這種研究模型初步開發(fā)的特別優(yōu)選實(shí)施方案。雖然FVB品系有益于成像，且對(duì)銅宗毒性敏感，但是體重減輕可能引入混淆變量，通過使用其它品系，可在這些初歩研究中容易地避免該變量。在其它品系中，MBP 5k-luci 171系(B6C3)小鼠(8周齡，體重25±3克)呈現(xiàn)明
顯組織學(xué)脫髓鞘作用。在6周0. 2%銅宗處理的末期收取小鼠腦部組織。所有7只銅宗處理小鼠在胼胝體區(qū)域具有明顯脫髓鞘作用，而所有3只對(duì)照小鼠在胼胝體區(qū)域呈現(xiàn)正常髓鞘形成。這些來自MBP 5K-luci 171系的數(shù)據(jù)提供了成像信號(hào)追隨銅宗引發(fā)的脫髓鞘作用期的進(jìn)ー步證據(jù)。另外的勒克司堅(jiān)牢藍(lán)定量分析(圖14)證實(shí)，在第4周時(shí)與B6C3H 171系雜合小鼠(8周齡，體重25. 5±3克)相比，髓鞘堿性蛋白熒光素酶B6C3171系純合小鼠(8周齡，體重21±3克)呈現(xiàn)更一致及稍微更嚴(yán)重的脫髓鞘作用。在橢圓形的較致密區(qū)中顯示染色的髓鞘。此外，喂食0. 2%銅宗的C57BI/6品系野生型雄性小鼠(8周齡，體重20±3克)呈現(xiàn)最嚴(yán)重及一致的脫髓鞘作用。將C57BL/6品系用作在初歩研究中描述的銅宗模型及過氧化物酶體增生物活化受體S試驗(yàn)化合物功效的正對(duì)照系。I.髓鞘堿性蛋白熒光素酶小鼠確認(rèn)過氧化物酶體增生物活化受體8選擇性激動(dòng)劑工具化合物對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘再生的正向功效將髓鞘堿性蛋白熒光素酶小鼠用于評(píng)價(jià)是否可使用這種體內(nèi)生物成像模型檢測(cè)過氧化物酶體增生物活化受體S (PPAR 6 )激動(dòng)劑工具化合物(，571)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘再生的功效。
過氧化物酶體增生物活化受體(PPAR)屬于核受體超級(jí)家族，其功能為調(diào)節(jié)目標(biāo)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。與其它轉(zhuǎn)錄因子相反，核受體的活性可通過與輕易穿透生物膜的對(duì)應(yīng)的小配體親脂分子結(jié)合而調(diào)節(jié)。盡管核受體家族的細(xì)胞信號(hào)途徑復(fù)雜，但是使用核受體作為藥物靶標(biāo)已有漫長(zhǎng)成功歷史。過氧化物酶體增生物活化受體在細(xì)胞分化、發(fā)育及代謝的調(diào)節(jié)中扮演重要角色。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)過氧化物酶體增生物活化受體具有三種由單獨(dú)基因編碼的密切相關(guān)的同エ型，一般稱為過氧化物酶體增生物活化受體a、過氧化物酶體增生物活化受體Y及過氧化物酶體增生物活化受體S，也稱為過氧化物酶體增生物活化受體 3 (J. Berger and D. E. Miller, Annu. Rev. Med. , 2002, 53, 409-435)。姆一受體亞型具有特征脫氧核糖核酸結(jié)合域(DBD)及配體結(jié)合域(LBD)，二者對(duì)于配體活化基因表達(dá)是必須的。過氧化物酶體增生物活化受體與類視色素X受體(RXR)結(jié)合為異ニ聚體。過氧化物酶體增生物活化受體S似乎在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中顯著表達(dá)；然而，它的許多功能仍未確定。然而，異常有趣的是發(fā)現(xiàn)，過氧化物酶體增生物活化受體S在嚙齒動(dòng)物少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要脂質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞)中表達(dá)(J. Granneman, et al.，J.Neurosci. Res.，1998，51，563-573)。此外還發(fā)現(xiàn)，過氧化物酶體增生物活化受體5選擇性激動(dòng)劑在小鼠培養(yǎng)物中顯著增加少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的髓鞘基因表達(dá)與髓鞘直徑(I. Salujaet al.，Glia, 2001, 33，194-204)。過氧化物酶體增生物活化受體5敲除小鼠具有整體較小的腦部尺寸，和在白質(zhì)中降低的髓鞘形成水平(Mol cell Biology 20020:5119)。此外，過氧化物酶體增生物活化受體S激動(dòng)劑在多發(fā)性硬化的實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髄炎(EAE)模型中發(fā)揮保護(hù)效果(Polak et al. , J Neuroimmunology 2005 168:65-75)。先前已經(jīng)證實(shí)，選擇性過氧化物酶體增生物活化受體5激動(dòng)劑在神經(jīng)組織中扮演功能性角色，并刺激少突膠質(zhì)細(xì)胞的祖細(xì)胞分化。SAR117145為ロ服可生物利用的可穿透腦的過氧化物酶體增生物活化受體S選擇性激動(dòng)劑，在體外以濃度依賴性形式刺激嚙齒動(dòng)物及人類少突膠質(zhì)細(xì)胞的祖細(xì)胞分化；能夠用過氧化物酶體增生物活化受體S選擇性拮抗劑阻斷這種功效。在大鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞中，髓鞘堿性蛋白表達(dá)增加之前為下游過氧化物酶體增生物活化受體靶標(biāo)Angptl4的信使核糖核酸表達(dá)增加，且此上調(diào)作用被過氧化物酶體增生物活化受體S的慢病毒短發(fā)夾核糖核酸(shRNA)敲下而阻斷。在急性脫髓鞘作用的小鼠銅宗模型中，其中小鼠被喂食2%銅宗飲食達(dá)4周，SAR117145增強(qiáng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘再生，增加Angptl4的信使核糖核酸表達(dá)，并增進(jìn)胼胝體的軸突傳導(dǎo)。Angptl4的中樞神經(jīng)系統(tǒng)活化作用伴隨腓腸肌表達(dá)增加，暗示這可作為潛在替代標(biāo)志物。這些數(shù)據(jù)證實(shí)，過氧化物酶體增生物活化受體S激動(dòng)劑可增強(qiáng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘再生與增進(jìn)軸突功能，并暗示它們用于治療脫髓鞘障礙在刺激內(nèi)源性修復(fù)過程中的潛在用途(US Patent application20070149580, USE OF PEROXISOME PROLIFERATOR ACTIVATED RECEPTOR DELTA AGONISTSFOR THE TREATMENT OF MS AND OTHER DEMYELINATING DISEASES)。在B6C3H 171系雜合小鼠中測(cè)試了過氧化物酶體增生物活化受體S激動(dòng)劑工具化合物(’517;圖15)。將8周齡小鼠用含有0. 2%銅宗的飲食處理4周，然后給予正常飲食使髓鞘再生。然后將小鼠毎日二次ロ服媒介物(0.6%羧甲基纖維素鈉鹽與0.5%吐溫80)或30毫克/公斤的過氧化物酶體增生物活化受體5激動(dòng)劑工具化合物’517達(dá)8日，并在圖中指定的時(shí)間點(diǎn)圖像化。將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化至零周的基線信號(hào)。與媒介物組(n=13)相比，在工具化合物’ 517組(n=15)中具有30-100%的相對(duì)熒光素酶信號(hào)増加，我們認(rèn)為這歸因于少突膠質(zhì)細(xì)胞的祖細(xì)胞分化作用的增進(jìn)。
在相同研究中，通過勒克司堅(jiān)牢藍(lán)(LFB)染色進(jìn)ー步組織學(xué)確認(rèn)’517的功效(圖 16)。將來自福爾馬林固定石蠟包埋的腦部矢狀竇旁組織切片用勒克司堅(jiān)牢藍(lán)染色，用于定性評(píng)價(jià)胼胝體中的髓鞘。對(duì)每ー時(shí)間點(diǎn)的染色切片進(jìn)行評(píng)分及分級(jí)，等級(jí)為0 (完全髓鞘形成)至5 (完全脫髓鞘)。評(píng)分系統(tǒng)如下0=正常髓鞘，無脫髓鞘作用；1=最小局部脫髓鞘；2=輕至中度局部脫髓鞘；3=中度局部廣泛性脫髓鞘；4=嚴(yán)重局部廣泛性脫髓鞘；5=嚴(yán)重?cái)U(kuò)散性脫髓鞘。在4周銅宗處理后，來自小鼠的勒克司堅(jiān)牢藍(lán)染色腦切片的組織學(xué)評(píng)價(jià)證實(shí)171系雜合小鼠(n=5)中的胼胝體的中度至嚴(yán)重脫髓鞘作用。工具化合物’517組(n=5)與媒介物對(duì)照組(n=3)相比，在髓鞘再生期間從第4周至第5周用’ 517處理導(dǎo)致如通過勒克司堅(jiān)牢藍(lán)在第7周的時(shí)間點(diǎn)所測(cè)的可測(cè)量的髓鞘增加。盡管實(shí)驗(yàn)個(gè)體數(shù)量少，但是組織學(xué)數(shù)據(jù)支持體內(nèi)熒光素酶生物成像的數(shù)據(jù)，顯示當(dāng)與媒介物對(duì)照相比時(shí)，用’ 517化合物處理的小鼠的髓鞘再生増加。171系雜合小鼠的第二項(xiàng)PPAR 6 517研究顯示類似結(jié)果(未顯示數(shù)據(jù)，并同樣延長(zhǎng)’ 517處理至3周)。與第一項(xiàng)研究(圖15) —致，第二項(xiàng)研究也表明，’517在髓鞘再生過程的早期恢復(fù)階段加速少突膠質(zhì)細(xì)胞的祖細(xì)胞分化(MLindner and S Heine, etal, Neuropathology and Applied Neurobiology, 34, 105-114，2008)。2.髓鞘堿性蛋白熒光素酶小鼠檢測(cè)雌激素受體P激動(dòng)劑’ 5a，或正對(duì)照化合物喹硫平對(duì)髓鞘表達(dá)的保護(hù)性功效。雌激素受體(ER)屬于類固醇核受體家族，通過特異性應(yīng)答元件直接作用于脫氧核糖核酸，并調(diào)節(jié)基因表達(dá)。雌激素受體有兩種亞型-雌激素受體a及雌激素受體3。雌激素受體a在子宮、前列腺、卵巣、骨、乳房及腦中高度表達(dá)，而雌激素受體P存在于結(jié)腸、前列腺、卵巣、骨髓及腦中。雌激素受體P的選擇性靶向作用是具有吸引力的治療方法，以避免雌激素受體a的副作用。已鑒定出雌激素受體亞型的選擇性化合物。例如，雌激素受體P (非雌激素受體a )激動(dòng)劑已顯示可體外保護(hù)少突膠質(zhì)細(xì)胞及成神經(jīng)瘤細(xì)胞免于細(xì)胞凋亡。此外，雌激素受體3或雌激素受體激動(dòng)劑改善實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髄炎，并具有保護(hù)神經(jīng)功效(保護(hù)髓鞘與軸突)?；谙惹暗倪^氧化物酶體增生物活化受體S激動(dòng)劑工具化合物’517，在銅宗模型中使用髓鞘堿性蛋白熒光素酶系分析雌激素受體3激動(dòng)劑’5a。而且，我們囊括AstraZeneca的精神分裂癥藥物喹硫平(10毫克/公斤，ロ服，毎日一次)作為正對(duì)照，基于喹硫平對(duì)銅宗引發(fā)的脫髓鞘作用的保護(hù)功效(Schizophrenia Research, 2008, Dec 106,182-91)。使用 B6CH 171 系雜合小鼠進(jìn)行兩項(xiàng)獨(dú)立研究。第一項(xiàng)研究(圖17)顯示，雌激素受體P激動(dòng)劑’ 5a及正對(duì)照喹硫平(QTP)在銅宗模型脫髓鞘作用期間是保護(hù)性的。將髓鞘堿性蛋白熒光素酶171系雜合B6C3H小鼠喂食銅宗飲食4周，并ロ服’5a (10毫克/公斤，n=12，或30毫克/公斤，n=16)或喹硫平(10毫克/公斤，n=14)。將小鼠在第0周(基線)、第3周及第4周圖像化。將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化至第0周的基線。與先前研究(圖15)類似，媒介物組導(dǎo)致49%(第3周)與45%(第4周)生物成像信號(hào)降低。對(duì)于第3周及第4周的時(shí)間點(diǎn)，在10毫克/公斤，與媒介物對(duì)照相比，喹硫平組呈現(xiàn)顯著成像信號(hào)増加。喹硫平處理組的結(jié)果與Zhang等人發(fā)表的數(shù)據(jù)ー致(Schizophrenia Research, 2008, Dec 106,182-91)。30 毫克 / 公斤的化合物’5a 在第4周顯示超過媒介物的顯著增加，但10毫克/公斤的化合物’ 5a在第3周或第4周與媒介物無顯著差別。這些結(jié)果表明，髓鞘堿性蛋白熒光素酶成像模型可用于評(píng)價(jià)在銅宗模型中的劑量依賴性保護(hù)功效。
設(shè)計(jì)進(jìn)一歩研究(圖18)，以確認(rèn)第一項(xiàng)研究的結(jié)果(圖17)，但是媒介物及30毫克/公斤’ 5a化合物處理組具有更大的組群。與第一項(xiàng)研究結(jié)果一致，當(dāng)與媒介物處理對(duì)照組(n=25)相比時(shí)，用10毫克/公斤喹硫平處理的小鼠(n=17)產(chǎn)生對(duì)銅宗引發(fā)的信號(hào)降低的統(tǒng)計(jì)上顯著的抑制作用，時(shí)間點(diǎn)為第3周(25%對(duì)比47%降低，p=0. 028)及第4周(6%增加對(duì)比25%降低)。此外，與媒介物對(duì)照組相比，30毫克/公斤的’5a (N=27)造成顯著較強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因活性，時(shí)間點(diǎn)為第3周(31%對(duì)比47%降低，p=0. 0079)及第4周(6%降低對(duì)比25% 降低，p=0. 0015)。這兩項(xiàng)研究證實(shí)，30毫克/公斤的’ 5a明顯防止在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中由銅宗飲食引發(fā)的生物成像信號(hào)降低，盡管未達(dá)到與10毫克/公斤的正對(duì)照喹硫平相同的程度(在這些實(shí)驗(yàn)中使用的條件下)。由于先前的研究已經(jīng)證實(shí)了在中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘形成程度與髓鞘堿性蛋白熒光素酶生物成像信號(hào)之間的直接關(guān)系，這些目前的結(jié)果表明，’5a及喹硫平都防止在銅宗飲食給藥期間中樞神經(jīng)系統(tǒng)的脫髓鞘作用。成像模型的數(shù)據(jù)支持’ 5a及喹硫平都減弱銅宗引發(fā)的腦部脫髓鞘作用與髓鞘破壞。3.在銅宗模型中髓鞘堿性蛋白熒光素酶系的比較制成在各種品系背景上的6個(gè)轉(zhuǎn)基因系，用于不同的生物成像應(yīng)用。比較在銅宗模型中B6C3H 171系純合及雜合小鼠的成像信號(hào)(圖19)。純合子中的兩個(gè)報(bào)道基因拷貝在脫髓鞘作用期呈現(xiàn)超過2倍的信號(hào)降低，及在髓鞘再生期呈現(xiàn)2倍信號(hào)増加。盡管已經(jīng)證實(shí)，雜合171系(B6C3H品系)在銅宗模型中起作用并可檢測(cè)化合物功效，但是預(yù)期可通過繁殖成純合體型而進(jìn)一歩改善模型以增強(qiáng)生物成像信號(hào)強(qiáng)度。由于可將小鼠群落維持為純合子，這也簡(jiǎn)化模型生產(chǎn)，并降低基因分型成本。此外，成像窗越大，模型檢測(cè)化合物引發(fā)的變化就越靈敏。圖20顯示在銅宗模型中來自三個(gè)不同系的組織學(xué)勒克司堅(jiān)牢藍(lán)數(shù)據(jù)的比較。定量勒克司堅(jiān)牢藍(lán)數(shù)據(jù)證實(shí)了 171系B6C3H的生物成像結(jié)果，純合小鼠呈現(xiàn)最嚴(yán)重的銅宗引發(fā)的脫髓鞘作用；嚴(yán)重度類似于對(duì)通常使用的野生型C57BL/6小鼠品系所觀察到的嚴(yán)重度。171系雜合小鼠呈現(xiàn)較不嚴(yán)重的脫髓鞘作用，而這些171系雜合小鼠呈現(xiàn)最少量的銅宗引發(fā)的脫髓鞘作用。在圖21中證實(shí)，具有最大生物成像信號(hào)降低的髓鞘堿性蛋白熒光素酶系也具有最大脫髓鞘作用，如通過組織學(xué)評(píng)價(jià)。通過生物成像及勒克司堅(jiān)牢藍(lán)(LFB，髓鞘染色)組織學(xué)比較三種不同髓鞘堿性蛋白熒光素酶系(171系B6C3H雜合品系、121系C57BL/6雜合品系及171系B6C3H純合品系)。將小鼠用含有0.2%銅宗的飲食處理4周或5周。將成像數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化至第0周的基線測(cè)量值。在每ー研究結(jié)束時(shí)，收取小鼠腦并將連續(xù)石蠟切片用勒克司堅(jiān)牢藍(lán)針對(duì)髓鞘染色。平均定性的勒克司堅(jiān)牢藍(lán)評(píng)分(0至5)顯示在圖21的圖表中。171系B6C3H純合小鼠呈現(xiàn)最大成像信號(hào)降低，也證實(shí)最嚴(yán)重脫髓鞘作用，如通過定性組織學(xué)分析所評(píng)價(jià)。171系B6C3H雜合小鼠呈現(xiàn)最小成像窗，也在第4周呈現(xiàn)最少組織學(xué)脫髓鞘作用。參考在喂食銅宗飲食之前的基線成像，171系B6C3H純合小鼠在喂食銅宗飲食期間具有最大生物成像信號(hào)降低。例如，在銅宗飲食3周后，171系B6C3H純合小鼠具有72%信號(hào)降低(第3周參考第0周，p〈0. 05)，而171系B6C3H雜合小鼠具有45%生物成像信號(hào)降低(參考第0周，p〈0. 05)。121系C57BL/6雜合小鼠具有最小降低的熒光素酶信號(hào)(第3周相對(duì)于第0周降低33%，p〈0. 05)。 通過用喹硫平(10毫克/公斤)處理171系B6C3H純合小鼠，進(jìn)ー步證實(shí)髓鞘堿性蛋白熒光素酶模型的靈敏度及應(yīng)答性，顯示在圖22中。與使用171系B6C3H雜合小鼠的結(jié)果(圖17及18) —致，喹硫平(10毫克/公斤)顯著防止生物成像信號(hào)降低?；谶@些結(jié)果，將171系純合小鼠認(rèn)定為用于銅宗引發(fā)的脫髓鞘作用生物成像模型的最佳系。4.髓鞘堿性蛋白熒光素酶模型的其它應(yīng)用髓鞘堿性蛋白熒光素酶小鼠具有腦部與脊髓熒光素酶的表達(dá)。如圖23中所示，發(fā)光信號(hào)主要來自腦部與脊髄的白質(zhì)區(qū)。除了已經(jīng)成功示范用于銅宗模型的來自腦部的熒光素酶成像之外，來自脊髓的熒光素酶成像信號(hào)可用于多發(fā)性硬化的實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎(EAE)模型中，或應(yīng)用為脊髄模型。
權(quán)利要求
1.監(jiān)測(cè)在活體生物中脫髓鞘作用或髓鞘再生的方法，所述方法包括 轉(zhuǎn)基因修飾所述生物，以表達(dá)通過髓鞘堿性蛋白(MBP)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶基因； 監(jiān)測(cè)來自所述生物的生物發(fā)光；及 將所述光輸出與所述生物的身體的特定部分相關(guān)聯(lián)。
2.如權(quán)利要求I的方法，其中所述模型生物為哺乳動(dòng)物。
3.如權(quán)利要求2的方法，其中所述哺乳動(dòng)物為小鼠。
4.如權(quán)利要求I的方法，其進(jìn)一步包括 在相同生物中，在不同于所述最初監(jiān)測(cè)的時(shí)間重復(fù)所述監(jiān)測(cè)； 并比較所述監(jiān)測(cè)活動(dòng)的輸出數(shù)據(jù)，以觀察在相同生物中髓鞘形成的變化。
5.如權(quán)利要求4的方法，其進(jìn)一步包括 通過脫髓鞘作用或髓鞘再生間隔的成像信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化，其中所述通過間隔的成像有效檢測(cè)歷經(jīng)所述間隔在所述生物中髓鞘堿性蛋白轉(zhuǎn)錄水平的變化。
6.轉(zhuǎn)基因生物，其含有通過髓鞘堿性蛋白(MBP)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶基因。
7.如權(quán)利要求6的轉(zhuǎn)基因生物，其中所述生物為小鼠。
8.表達(dá)熒光素酶基因的轉(zhuǎn)基因生物，所述熒光素酶基因在髓鞘堿性蛋白(MBP)啟動(dòng)子的控制之下。
9.如權(quán)利要求8的轉(zhuǎn)基因生物，其中所述模型生物為小鼠。
10.如權(quán)利要求6的轉(zhuǎn)基因生物，其中所述髓鞘堿性蛋白啟動(dòng)子包含Ml至M4。
11.如權(quán)利要求6的轉(zhuǎn)基因生物，其中所述髓鞘堿性蛋白啟動(dòng)子包含Ml至M3。
12.如權(quán)利要求I的方法，其中所述生物為哺乳動(dòng)物，且所述哺乳動(dòng)物具有白色毛發(fā)或減少的毛發(fā)。
13.如權(quán)利要求12的方法，其中所述哺乳動(dòng)物的毛發(fā)與C57/B6相比吸收較少的波長(zhǎng)范圍為530-640納米的光。
14.開發(fā)生物成像品系的方法，包括 (1)選擇一個(gè)系，其中在出生后髓鞘形成高峰時(shí)的體內(nèi)全小鼠成像呈現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異性成像； (2)選擇一個(gè)系，其中體外成像確認(rèn)熒光素酶轉(zhuǎn)基因表達(dá)主要在腦或脊髓的白質(zhì)區(qū)； (3)選擇一個(gè)系，其中熒光素酶圖像強(qiáng)度與在脫髓鞘作用模型中引發(fā)的脫髓鞘作用及髓鞘再生的變化高度相關(guān)；及 (4)選擇一個(gè)系，其作為模型呈現(xiàn)清楚的組織學(xué)脫髓鞘作用。
15.如權(quán)利要求14的方法，其中所述出生后髓鞘形成的高峰是約3-5周的第一代小鼠。
16.如權(quán)利要求14的方法，其中所述模型是銅宗脫髓鞘作用模型。
17.如權(quán)利要求I的方法，其中所述方法監(jiān)測(cè)化合物對(duì)至少一種脫髓鞘作用或髓鞘再生活動(dòng)的功效。
18.如權(quán)利要求I的方法，其中所述方法監(jiān)測(cè)基因活動(dòng)的效應(yīng)。
19.監(jiān)測(cè)髓鞘形成的改良方法，所述改良包括成像表達(dá)髓鞘堿性蛋白熒光素酶的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
20.降低髓鞘形成研究中的差異性的方法，所述方法包括在至少兩個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)監(jiān)測(cè)動(dòng)物中的髓鞘堿性蛋白控制的熒光素酶。
21.如權(quán)利要求I的方法，其中所述生物的身體的特定部分選自周圍神經(jīng)系統(tǒng)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種髓鞘堿性蛋白熒光素酶生物成像非侵襲性模型，用于顯現(xiàn)及量化體內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的脫髓鞘作用與髓鞘再生活動(dòng)。使用與螢火蟲熒光素酶報(bào)道基因偶聯(lián)的髓鞘堿性蛋白(MBP)啟動(dòng)子產(chǎn)生表達(dá)熒光素酶的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。髓鞘堿性蛋白熒光素酶生物成像模型提供了監(jiān)測(cè)髓鞘形成狀態(tài)及調(diào)節(jié)髓鞘再生的試驗(yàn)化合物的功效的方法。生物成像的優(yōu)點(diǎn)為，受試者在縱向研究中可作為自己的對(duì)照。可歷經(jīng)至少10周持續(xù)追蹤相同受試者的脫髓鞘作用及髓鞘再生過程。這種模型使得能夠標(biāo)準(zhǔn)化個(gè)別動(dòng)物成像應(yīng)答，并提供大量降低差異性的優(yōu)質(zhì)數(shù)據(jù)。此外，由于不需要在不同時(shí)間點(diǎn)犧牲動(dòng)物組群，可減少化合物功效研究所需的數(shù)量。
文檔編號(hào)C12N15/85GK102770020SQ201080064215
公開日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2010年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月17日
發(fā)明者D.溫斯托克, H.G.波利特斯, J.曹, K.D.?？浦Z米德斯, K.錢德羅斯, 應(yīng)曉優(yōu) 申請(qǐng)人:賽諾菲