專利名稱：miRNA用于診斷、預(yù)防、治療和追蹤涉及巨自噬異常的疾病的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具體miRNA (微小RNA)家族——hsa-miR-376——或產(chǎn)生用于阻斷它們的miRNA抑制劑用于減弱、抑制或刺激自噬的用途。
本發(fā)明尤其涉及hsa-miR_376b或相關(guān)序列和所述miRNA的miRNA抑制劑通過(guò)控制自噬相關(guān)基因表達(dá)在治療至少一種涉及自噬異常的疾病的過(guò)程中或后用于診斷、預(yù)防、治療和追蹤的用途，以及其方法。
背景技術(shù)：
自噬的特征在于將大量的細(xì)胞質(zhì)、蛋白質(zhì)和細(xì)胞器隔離在雙層膜或多層膜的小泡(vesicle)中、遞送至細(xì)胞自身的溶酶體/空泡系統(tǒng)并隨后被該系統(tǒng)降解(Kim等人，2002)。在非缺失(non-deprived)條件下該生物學(xué)現(xiàn)象在所有類型的細(xì)胞(從酵母到哺乳動(dòng)物)中以低本底水平發(fā)生，以執(zhí)行維持穩(wěn)態(tài)的功能例如蛋白質(zhì)降解和細(xì)胞器周轉(zhuǎn)(turnover)。在導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)激的條件(例如營(yíng)養(yǎng)物或生長(zhǎng)因子耗盡)下，自噬被快速上調(diào)，以提供用于能量產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)的原料(building block)和底物的另一來(lái)源(Kim等人，2002)。
雖然在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織中進(jìn)行了初始的基于形態(tài)學(xué)的研究，但是調(diào)節(jié)自噬的基因是在酵母中發(fā)現(xiàn)的。從酵母中克隆了至少30種ATG (自噬)基因(曾稱為APG基因、AUT基因和/或CVT基因)，它們的蛋白質(zhì)產(chǎn)物在自噬過(guò)程的多個(gè)階段——包括小泡去核、膨脹、自曬小泡融合到晚期內(nèi)體/溶酶體以及貨物(cargo)降解-起作用，(Gozuacik和Kimchi2004, 0hsumi2001)。已經(jīng)克隆了這些基因中一些基因的哺乳動(dòng)物同源基因，并且它們的功能確實(shí)在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中得以保留(Mizushima等人，2002)。
與酵母模型相似，哺乳動(dòng)物自噬途徑通過(guò)多種蛋白復(fù)合體的作用進(jìn)行。例如Atgl/Ulkl-2蛋白復(fù)合體將來(lái)自生長(zhǎng)因子信號(hào)和營(yíng)養(yǎng)狀況傳感器Torcl復(fù)合體的信號(hào)傳遞至自噬途徑(Vellai T等人，2009)。所述復(fù)合體中關(guān)鍵蛋白mTor的失活可導(dǎo)致對(duì)自噬的刺激。自噬小泡形成中另一個(gè)重要事件是通過(guò)自噬小泡成核中心(稱為隔離膜)中的Vps34磷酸肌醇3-激酶復(fù)合體產(chǎn)生并積累磷脂酰肌醇3-磷酸(Furuya N.等人，2005)。Vps34復(fù)合體活性由多種蛋白(包括Becl inl)開啟。作為自噬途徑中的關(guān)鍵蛋白之一，BeclinlmRNA水平和蛋白質(zhì)水平在自噬激活過(guò)程中通常被上調(diào)(Rami等人，2008)，并且在多種系統(tǒng)中敲除或敲低該蛋白可抑制自噬。
兩種泛素樣綴合系統(tǒng)在自噬小泡生物發(fā)生中起作用。第一種由Atgl2系統(tǒng)組成，其中Atgl2以泛素化樣的方式綴合到Atg5 (Mizushima等人，1998)。所述綴合反應(yīng)由El樣酶(稱為Atg7)激活A(yù)tgl2起始。然后，通過(guò)Atg7將Atgl2轉(zhuǎn)移到E2樣酶(稱為AtglO)(Shintani等人，1999 ；Tanida等人，1999)。最后，通過(guò)Atgl2羧基末端的甘氨酸與Atg5蛋白中間部位的賴氨酸殘基之間的共價(jià)鍵將Atgl2綴合到Atg5。所述Atgl2/Atg5綴合在形成和穩(wěn)定包含Atgl2/Atg5和Atgl6的更大蛋白復(fù)合體中起作用(Mizushima等人，1999 ；Mizushima等人,2003a)。Atgl6 (哺乳動(dòng)物中的Atgl6L)具有通過(guò)其卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域同型寡聚體化的能力。Atgl2/Atg5/Atgl6復(fù)合體可作為E3樣酶用于第二泛素化樣反應(yīng)。在第二反應(yīng)中，AtgS (或者哺乳動(dòng)物的LC3)被綴合到脂質(zhì)分子一磷脂酰乙醇胺(PE) (Ichimura等人，2000)。為發(fā)生該綴合反應(yīng)，必須在其翻譯時(shí)通過(guò)剪切Atg8/LC3蛋白的部分羧基末端對(duì)其進(jìn)行加工。負(fù)責(zé)該加工反應(yīng)的蛋白酶是Atg4蛋白(Atg4a-c)(Kirisako等人，2000)。Atg4剪切Atg8/LC3使得羧基末端的甘氨酸暴露。在El樣蛋白Atg7和E2樣蛋白Atg3起作用后，Atg8/LC3蛋白羧基末端的甘氨酸綴合到PE的氨基。該綴合導(dǎo)致了另外的細(xì)胞質(zhì)/周圍膜結(jié)合形式的Atg8/LC3,以與膜緊密結(jié)合(Kirisako等人，1999)。所述脂化反應(yīng)是可逆的，Atg4蛋白酶也起泛素去綴合酶的作用，其能夠剪切AtgS/LC3和PE之間的酰胺鍵，使得Atg8/LC3再循環(huán)。Atg9蛋白再循環(huán)和與蛋白質(zhì)例如Atgl8和Atg2的相互作用因兩者在脂質(zhì)分子轉(zhuǎn)運(yùn)中可能的作用而也被認(rèn)為是自曬小泡成核和延伸中的重要事件(Reggiori F等人，2004)。

通過(guò)上述蛋白復(fù)合體的協(xié)調(diào)作用，自噬小泡成核、它們的膜被延伸、貨物被募集、并形成雙層膜自噬體。自噬體與晚期內(nèi)體或溶酶體融合形成自溶酶體。特異性因子參與了該步驟。Vps復(fù)合體和Rab GTP酶蛋白參與對(duì)融合位點(diǎn)進(jìn)行組織。然后，SNARE蛋白(SNAP作為可溶性NSF附著蛋白受體)(Darsow T.1997)形成復(fù)合體，該復(fù)合體可作為兩個(gè)細(xì)胞器之間的橋。膜融合形成自溶酶體，所述貨物被遞送到所述溶酶體結(jié)構(gòu)內(nèi)。在溶酶體/液泡的內(nèi)腔中，首先脂肪酶例如Atgl5降解剩余的自噬膜，然后所述貨物被溶酶體裂解酶分解(Kim等人，2007)。所述小泡降解后，形成的原料被送到胞質(zhì)溶膠中繼續(xù)使用。特定的溶酶體膜蛋白在該過(guò)程中起作用，包括溶酶體膜蛋白LAMP-1和LAMP-2。自噬還在多種疾病中起關(guān)鍵作用，所述疾病包括肝和肌肉病癥、神經(jīng)退行性疾病、心臟病、衰老、肌病、自身免疫性疾病和炎性疾病、感染性疾病、缺血性疾病、免疫缺陷、糖尿病、軸突損傷、溶酶體貯積病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腎病和癌癥(Mizushima等人，2008 ；Cuervo A.M.2004)。在神經(jīng)退行性疾病的情況下，已經(jīng)表明自噬在消除積累的異常蛋白以恢復(fù)穩(wěn)態(tài)中起作用和/或其可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞死亡(Gozuacik和Kimchi2004, Shintani和Klionsky2004)o在癌癥中，自噬及可能的自噬性細(xì)胞死亡是重要的腫瘤抑制機(jī)制，該機(jī)制在腫瘤形成過(guò)程中失活(Gozuacik和Kimchi2004, 0hsumi2001)。相矛盾的是,取決于腫瘤的類型，在快速生長(zhǎng)和有缺陷的血管化作用引起的缺血狀態(tài)下，自噬還可能在腫瘤細(xì)胞存活中起作用。此外，自噬構(gòu)成對(duì)抗細(xì)胞內(nèi)寄生生物(包括細(xì)菌和病毒)的重要的細(xì)胞防御系統(tǒng)(Shintani和Klionsky2004)。因此，對(duì)自噬機(jī)制以及其與病理狀況的關(guān)系的研究是最為重要的。近來(lái)的研究直接涉及疾病(例如癌癥和克羅恩氏病)中的一些自噬相關(guān)蛋白。例如，Beclinl是眾所周知的癌癥相關(guān)自噬基因的實(shí)例。在小鼠中Beclinl的雜合缺失可導(dǎo)致自發(fā)的和誘導(dǎo)的腫瘤形成速率的提高。在40-75%的乳腺癌和卵巢癌中觀察到了 Beclinl單等位基因缺失(Aita等人，1999)。在人乳腺上皮癌細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)內(nèi)源Beclinl蛋白低水平表達(dá)。因此，該蛋白的減少表達(dá)可能促進(jìn)了乳腺惡性腫瘤的發(fā)生/發(fā)展(Liang等人，1999)。在子宮頸鱗癌和上皮卵巢癌細(xì)胞中也觀察到Beclinl表達(dá)減少(Wang等人2006 ；ffang等人2007)。在人腦腫瘤中基于Beclinl蛋白和mRNA表達(dá)水平的研究顯示在人腦腫瘤中Beclinl被下調(diào)(Miracco等人,2007)。另一個(gè)研究揭示在結(jié)腸癌細(xì)胞系中依賴于mRNA和蛋白表達(dá)水平Beclinl基因抑制腫瘤生長(zhǎng)(Koneri等人，2007)。已發(fā)現(xiàn)自噬蛋白Atgl6L和IRGM的基因中的異常與克羅恩氏病(一種炎性腸病)相關(guān)(Palomino-Morales RJ等人，2009)。其他研究表明，Atgl6L或Atg5缺陷的腸含有異常的帕內(nèi)特細(xì)胞，導(dǎo)致在克羅恩氏病個(gè)體中觀察到的粘膜防御異常(Cadwell K等人，2008)。miRNA是控制多種基礎(chǔ)生物學(xué)過(guò)程(例如細(xì)胞增殖、干細(xì)胞分裂和細(xì)胞凋亡)的基因表達(dá)的負(fù)調(diào)節(jié)因子中的一個(gè)(Ambros，V.，2004)。miRNA通過(guò)改變mRNA轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性和/或通過(guò)核糖體阻斷蛋白翻譯而起作用(Lewis, B.P.等人,2005)。miRNA作為初級(jí)miRNA(pr1-miRNA)從miRNA基因簇中合成。初級(jí)miRNA的大小為幾百個(gè)核苷酸到幾千個(gè)核苷酸不等。在細(xì)胞核中，Drosha和Pasha/DGCR8對(duì)初級(jí)miRNA加工產(chǎn)生約60-70個(gè)堿基長(zhǎng)的miRNA前體(pre-miRNA), miRNA前體由具有側(cè)翼序列的莖環(huán)結(jié)構(gòu)組成。通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白5(exporting5)和Ran-GTP轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)后,miRNA前體被Dicer蛋白加工產(chǎn)生約22個(gè)核苷酸的小RNA雙鏈體。然后，所述miRNA雙鏈體(雙鏈miRNA)的前導(dǎo)鏈被裝載至RNA-誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)中。然后，被成熟miRNA引導(dǎo)的RISC會(huì)通過(guò)通常存在于其3’UTR區(qū)的miRNA-結(jié)合位點(diǎn)靶向mRNA，導(dǎo)致其翻譯抑制或降解。通過(guò)這種方式，miRNA可調(diào)節(jié)其靶基因和蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯，并協(xié)調(diào)生理和病理事件。目前為止，只有一 篇公開的研究描述了哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中miRNA和自噬之間的關(guān)系。在該研究中，Zhu等人證明了 Beclinl基因和miR_30a之間的直接相互作用(Zhu等人2009)ο對(duì)miRNA-自噬關(guān)系的更好理解將有助于控制包括自噬異常的疾病。使用miRNA作為潛在治療靶的部分原因如下:.miRNA是有機(jī)分子和天然的反義互作子(interactor)；-miRNA表達(dá)譜可用于診斷疾病狀態(tài)，不受調(diào)節(jié)的miRNA會(huì)有利于疾病的發(fā)生和發(fā)展；.miRNA具有通過(guò)同時(shí)協(xié)調(diào)數(shù)個(gè)基因的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)和調(diào)整生物學(xué)和病理學(xué)過(guò)程的能力；.模擬人疾病的小鼠模型顯示miRNA在不同的疾病中起到重要作用，并且可用作治療分子(Melnikova 12007)；.它們的小尺寸(長(zhǎng)度為22-24個(gè)核苷酸)，并且它們的有機(jī)性質(zhì)使得它們對(duì)于藥物開發(fā)非常有吸引力。如果搜索相關(guān)領(lǐng)域的專利文獻(xiàn)，可得到數(shù)個(gè)關(guān)于miRNA和疾病的申請(qǐng)。例如，編號(hào)為US20100113577的美國(guó)專利申請(qǐng)公開了 miR145核酸特異性結(jié)合內(nèi)源IRS-1的3’UTR，以此壓抑或抑制結(jié)腸細(xì)胞增殖。因此，該核酸可用于治療結(jié)腸癌。另外，編號(hào)為US20100010073的專利申請(qǐng)描述了微小RNA (miRNA)用于診斷、預(yù)防和/或治療心臟病的用途。此外，美國(guó)專利申請(qǐng)US20100048674中提到，miR_181a通過(guò)協(xié)調(diào)地抑制Notch和pre_TCR途徑的負(fù)調(diào)節(jié)因子而支持Notch和pre-TCR途徑之間的活性信號(hào)傳遞的能力使得miR_181a可用作急性T淋巴細(xì)胞白血病的治療靶。但是，所有這些申請(qǐng)并未公開miRNA和自噬之間的任何疾病治療相關(guān)性
發(fā)明內(nèi)容
本申請(qǐng)?zhí)峁┝诉@樣的發(fā)現(xiàn)，即第一次證明通過(guò)具體的miRNA家族或其抑制劑在多種水平上調(diào)節(jié)自噬途徑。
所述具體的miRNA家族是hsa-miR-376家族。miR-376家族由人染色體14q32的miRNA簇區(qū)(稱為Dlkl/Gtl2區(qū))編碼。miR-376同源基因也存在于小鼠中，位于小鼠12號(hào)染色體的遠(yuǎn)端(Kircher M等人，2008和Seitz H等人，2004)。miR_376RNA在多種胚胎組織和成體組織中表達(dá)(Seitz H等人，2004和Poy M N等人，2004)。
本發(fā)明的主要目的是阻斷細(xì)胞中的自噬。因此，可診斷、預(yù)防或治療由過(guò)度自噬引起的疾病。在另一方面，本發(fā)明的另一方面是通過(guò)以本發(fā)明主題的miRNA的抑制劑來(lái)抑制所述miRNA以控制由細(xì)胞自噬缺陷引起的疾病發(fā)生。
本發(fā)明尤其涉及miRNA及所述miRNA的抑制劑在治療至少一種涉及自噬異常的疾病的過(guò)程中或后通過(guò)控制自噬相關(guān)基因表達(dá)用于診斷、預(yù)防、治療和追蹤的用途，以及其方法。


圖1.hsa_miR-376b過(guò)表達(dá)可阻斷自曬
A.miRNA篩選的建立。上圖:在96-孔板系統(tǒng)中以miRNA分別地瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞。每種miRNA測(cè)試兩個(gè)重復(fù)。通過(guò)以EBSS代替完全培養(yǎng)基來(lái)誘導(dǎo)饑餓。下圖:饑餓2小時(shí)后觀察到的GFP-LC3點(diǎn)形成百分比。對(duì)于每種條件，計(jì)數(shù)150-200個(gè)細(xì)胞。GFP-LC3點(diǎn)陽(yáng)性細(xì)胞百分比的圖形顯示表明饑餓(STV)后是對(duì)照水平的2倍；但是這種增加被miRNA過(guò)表達(dá)抑制(n=4)。
B.miR-376b減弱自噬相關(guān)的LC3-1I形成。游離LC-1形式減少和LC3-1I形式積累表明饑餓(STV)后對(duì)照miRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(CNT)中自噬被激活。相反地，miR-376b過(guò)表達(dá)導(dǎo)致該過(guò)程逆轉(zhuǎn)并導(dǎo)致自噬被抑制，這由非饑餓下存在較高水平的LC3-1和相對(duì)較低水平的LC-1I反映，并在饑餓(STV)狀態(tài)下以更顯著地方式反映。
圖2.miR-376b 靶向 MCF-7 乳腺癌細(xì)胞中的 Atg4c 和 Beclinl。
A.推定的Atg4c的3’ UTR和Beclinl的3’ UTR中的miR_376b結(jié)合序列(miR反應(yīng)元件，MRE)(經(jīng)SANGER算法鑒定)的示意圖。
B.定量 PCR (qPCR)分析對(duì)照(CNT)或 miR_376b (miR_376b)轉(zhuǎn)染的 MCF-7 細(xì)胞中Atg4c和Beclinl的mRNA水平。在非饑餓和饑餓狀況下，miR-376b表達(dá)后Atg4c (左)和Beclinl (右)的mR NA水平都顯著降低(n=3)。使用GAPDH mRNA水平將qPCR數(shù)據(jù)歸一化。
C和D.miR-376b表達(dá)后Atg4c和Beclinl蛋白水平下降。
C.非饑餓或饑餓(STV)的對(duì)照(CNT)或miR-376b轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(miR_376b)的免疫印跡。β_肌動(dòng)蛋白被用作上樣對(duì)照。
D.使用ImageJ軟件對(duì)C中免疫印跡進(jìn)行的光密度分析(對(duì)于Beclinl，n=5 ;對(duì)于Atg4C, n=3)。
圖3.miR-376b 革巴向 Huh_7 肝癌細(xì)胞中的 Atg4c 和 Beclinl。
A.定量 PCR (qPCR)分析對(duì)照(CNT)或 miR-376b 轉(zhuǎn)染的(miR-376b)Huh-7 細(xì)胞中的Atg4c和BeclinlmRNA水平。在非饑餓和饑餓狀態(tài)下miR_376b表達(dá)后Atg4c (左)和Beclinl (右)的mRNA水平都顯著降低(n=3)。使用GAPDH mRNA水平將qPCR數(shù)據(jù)歸一化。
B和C.miR-376b表達(dá)后Atg4c和Beclinl的蛋白水平下降。
B.非饑餓或饑餓(STV)的對(duì)照(CNT)或miR-376b轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(miR_376b)的免疫印跡。β_肌動(dòng)蛋白被用作上樣對(duì)照。
C.使用ImageJ軟件對(duì)C中的免疫印跡進(jìn)行光密度分析(對(duì)于Beclinl和Atg4C，都 n=3)。
圖4.推定的miR-376-結(jié)合位點(diǎn)參與了所觀察到的miRNA對(duì)Atg4c和Beclinl的效應(yīng)。
A.表示克隆至pGL3載體中螢火蟲螢光素酶報(bào)告基因3’ UTR中的Atg4c MRE (上序列)或其突變形式(下序列)的示意圖。
B.表示克隆至pGL3載體中螢火蟲螢光素酶報(bào)告基因3’ UTR中的BeclinlMRE (上序列)或其突變形式(下序列)的示意圖。
C.來(lái)自以野生型或突變Atg4c螢光素酶構(gòu)建體和對(duì)照(CNT)或miR-376(miR-376)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的提取物中歸一化的螢光素酶活性。
D.來(lái)自以野生型或突變的Beclinl螢光素酶構(gòu)建體和對(duì)照(CNT)或miR-376(miR-376)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的提取物中歸一化的螢光素酶活性。相對(duì)于共轉(zhuǎn)染的海腎螢光素酶活性將螢光素酶活性歸一化。
圖 5.針對(duì)內(nèi)源 miR_376b 的抗 miRNA (antagomir)導(dǎo)致 Atg4c 和 BeclinlmRNA 水平的增加。曲線圖表不對(duì)照(CNT)antagomir或針對(duì)miR_376b的antagomir (antagomir)轉(zhuǎn)染的非饑餓(No-STV)細(xì)胞中的Atg4c (左)和Beclinl (右)的mRNA水平的柱狀圖。結(jié)果以相對(duì)于GAPDH mRNA水平的倍數(shù)變化表示。
圖6.自噬中miR_376b作用的示意圖。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明涉及是miR-376家族成員的至少一種miRNA (微小核糖核酸)或所述miRNA的至少一種抑制劑在治療至少一種涉及自噬異常的疾病的過(guò)程中或后單獨(dú)地或與其他常規(guī)疾病治療物相結(jié)合用于診斷、預(yù)防、治療和追蹤的用途。
本發(fā)明還涉及自噬控制方法以在治療至少一種涉及自噬異常的疾病的過(guò)程中或后提供診斷、預(yù)防、治療和追蹤。所述方法的步驟如下:
.提供是miR-376家族成員的至少一種miRNA或者是所述家族成員的miRNA的至少一種抑制劑至發(fā)生所述自噬的細(xì)胞，和
.借助所述miRNA或其抑制劑抑制或起始自噬。
當(dāng)所述疾病是源自過(guò)度自噬時(shí)，所述方法包括如下步驟:
.提供過(guò)量的是所述miR-376家族成員的至少一種miRNA至發(fā)生所述過(guò)度自曬的細(xì)胞或生物體，
抑制至少一種自噬相關(guān)的基因，
.通過(guò)將所述基因保持在控制下來(lái)抑制過(guò)度自噬。
如果疾病源自自噬缺失或缺陷，則所述方法包括如下步驟:
.提供過(guò)量的是所述miR-376家族成員的miRNA的至少一種抑制劑至具有自噬缺陷的細(xì)胞，
.抑制所述 miRNA,
.阻止自噬相關(guān)基因的抑制，
.借助所述自噬相關(guān)基因起始自噬。
上文中，所述miRNA的長(zhǎng)度是12個(gè)核苷酸到170個(gè)核苷酸。所述miRNA是裸的合成RNA或者化學(xué)修飾的合成RNA。如果是后者，用于修飾的化學(xué)基團(tuán)選自:磷硫?；?、硼烷憐酸基、2’-O-甲基、2’-氣基、2’-O-甲氧基乙基(2’-0-M0E)、2’-O-氛基丙基(2’-0-ΑΡ)、2’ _0_ _.甲基氣基乙基(2’ _0_DMA0E )、2’ _0_ _.甲基氣基丙基(2’ -O-DMAP) >2' _0_ _.甲基氣基乙氧基乙基(2’ -O-DMAEOE^P 2’ -O-N-甲基乙酰胺基(2’ -O-NMA)、PEG、末端反向的dT堿基、氟代-β -d-阿糖核酸(FANA或4’ -S-FANA形式)或者阿糖核酸(ANA)修飾物、月桂酸加成物、石膽酸和膽固醇衍生物及它們的組合。
所提及的miR-376家族的miRNA包括SEQ ID NO:1和No:2所示的核苷酸序列的初級(jí)miRNA、miRNA前體、成熟miRNA、miRNA種子序列、dsmiRNA及其片段或變體。所述miRNA優(yōu)選是miR-376b，或具有與所述miRNA (例如SEQ ID NO: 2)的21個(gè)連續(xù)核苷酸至少約70%相同的序列的RNA中任一序列的RNA互補(bǔ)物。
在另一方面,所述miRNA抑制劑是祀向所述miR-376家族的miRNA的至少一種核酸分子(例如antagomir)。miRNA抑制劑分子長(zhǎng)度介于12個(gè)核苷酸和30個(gè)核苷酸之間，并包含與初級(jí)miRNA、miRNA前體、成熟miRNA、miRNA種子序列、dsmiRNA及其片段或變體的連續(xù)的5’到3’序列至少70%互補(bǔ)的5’到3’序列。
所述miRNA抑制劑包含選自以下的修飾:2’ -脫氧、2’ -脫氧_2’ -氟代、2’ -O-甲基、2’ -O-甲氧基乙基(2’ -O-MOE )、2’ -O-氨基丙基(2’ -O-AP )、2’ -O- 二甲基氨基乙基(2’ -O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’ -O-DMAP)、2’-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’ -O-DMAEOE)和2’ -O-N-甲基乙酰胺基(2’ -O-NMA), PEG、末端反向的dT堿基、氟代-β -d-阿糖核酸(FANA或4’ -S-FANA形式)或者阿糖核酸(ANA)修飾物、月桂酸加成物、石膽酸和膽固醇衍生物及它們 的組合。
miRNA及其抑制劑優(yōu)選由分離的核酸編碼。編碼所述miRNA的DNA分子、miRNA前體分子或抗miRNA也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。所述核酸可選自RNA、DNA或核酸類似物分子例如糖修飾的或骨架修飾的核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸。但是，應(yīng)注意，其他核酸類似物例如肽核酸(PNA)或鎖核酸(LNA)也是適合的。所述分離的核酸可被整合到載體中，所述載體選自質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒、病毒和人工染色體。
被所述miRNA抑制的自卩遼相關(guān)基因是Beclinl(Atg6)和Atg4C中的至少一個(gè)。所述需要診斷、預(yù)防或治療的疾病選自神經(jīng)退行性疾病、癌癥、心臟病、肝病、衰老、肌病、自身免疫性疾病、炎性疾病、感染性疾病、缺血性疾病、免疫缺陷、糖尿病、軸突損傷、溶酶體貯積病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病。下述的實(shí)驗(yàn)步驟及所得結(jié)果證明了對(duì)癌細(xì)胞(特別是乳腺癌和肝癌)的具體效應(yīng)。
當(dāng)所述miRNA旨在用于疾病組織時(shí)，其可以在脂質(zhì)體、基于聚合物的納米顆粒、膽固醇綴合物、環(huán)糊精絡(luò)合物、聚乙烯亞胺聚合物、蛋白復(fù)合體中或者被整合到病毒或病毒樣顆粒中經(jīng)靜脈、皮下、肌肉、鼻、腹膜內(nèi)、陰道、直腸、口腔、眼內(nèi)或鞘內(nèi)給予。
實(shí)驗(yàn)步驟
為揭示miRNA對(duì)自噬的調(diào)節(jié)，通過(guò)使用GFP融合的Atg8/LC3 (GFP-LC3)作為自噬標(biāo)記物在MCF-7乳腺癌細(xì)胞中進(jìn)行無(wú)偏篩選。在補(bǔ)充有10%胎牛血清(FCS)和抗生素(青霉素 / 鏈霉素)的 Dulbecco 改良的 Eagle 培養(yǎng)基(DMEM,Biological Industries)中在 37°C和5%C02下培養(yǎng)MCF-7乳腺癌細(xì)胞。然后，以所述GFP-LC3標(biāo)記物質(zhì)粒與攜帶443人miRNA或?qū)φ説TR(人端粒酶mRNA)之一的質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞。在培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基的細(xì)胞中，GFP融合的LC3顯示出分散的細(xì)胞質(zhì)/核染色。在通過(guò)使用無(wú)任何添加物的平衡緩沖溶液(EBSS)提供自噬刺激例如血清、氨基酸和葡萄糖饑餓之后，在細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)了 GFP-LC3點(diǎn)，這反映出LC3蛋白到自噬小泡的募集。將雙鏈體的人miRNA轉(zhuǎn)染到細(xì)胞，選擇可持續(xù)阻斷饑餓誘導(dǎo)的GFP-LC3點(diǎn)形成的miRNA (圖1-A),從而自曬被選擇。具體地，選擇了 miRNA之一，因?yàn)槠淇赡茏钄嘤绅囸I誘導(dǎo)的自噬。該miRNA被稱為miR-376miRNA家族的hsa_miR-376b (或簡(jiǎn)稱為miR_376b)。隨后，在MCF-7乳腺癌細(xì)胞中的進(jìn)行的測(cè)試證實(shí)了表明該miRNA具有自噬抑制效應(yīng)的初始篩選結(jié)果(圖1-A和圖1-B)。為揭示與自噬調(diào)節(jié)相關(guān)的潛在miR-376靶，將公眾可獲得的生物信息學(xué)工具的組合選擇不同的方法用于預(yù)測(cè)miRNA結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)使用TargetScan (Lewis 等人，2005) (http://genes.mit.edu/targetscan/)、microT (Maragkakis M 等人，2009)、MirGator (http://genome.ewha.ac.kr/miRGator/miRGator.html)>miRGen (Megraw M 等人,2006)、PITA (Probability ofInteraction by Target Accessibility) (Kertesz 等人，2007)和 miRanda(http://cbi0.mskcc.0rg/cg1-bin/rnirnaviewer/mirnaviewer.pi)算法確定預(yù)測(cè)的 miRNA 祀，每種所述算法具有搜索miRNA和靶之間相互作用的不同模式例如進(jìn)化保守度、能量、可達(dá)性等。生物信息學(xué) 分析表明，Beclinl和Atg4C基因是可能的miR_376b的靶。為證實(shí)Beclinl和Atg4C的確是miR_376b的靶，對(duì)它們的表達(dá)進(jìn)行了 qPCR測(cè)試和免疫印跡分析。將MCF7乳腺癌細(xì)胞以編碼miR-376b或?qū)φ説TR的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染并在完全培養(yǎng)基(DMEM+10%FCS )或饑餓培養(yǎng)基(Earl平衡鹽溶液，EBSS )中培養(yǎng)。通過(guò)qPCR測(cè)試分析Beclinl和Atg4C mRNA水平。如圖2-B中所示(Beclinl和Atg4C)，過(guò)表達(dá)miR_376b (而不是所述對(duì)照miRNA)下調(diào)了在完全培養(yǎng)基或饑餓培養(yǎng)基中培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞中的兩種自噬蛋白的mRNA水平。為檢查蛋白水平是否受到miRNA表達(dá)的影響，使用針對(duì)Beclinl或Atg4C的特異性抗體進(jìn)行免疫印跡(圖2-C和圖2-D)。這些免疫印跡分析證明，兩種自噬蛋白的蛋白水平也都受miR-376b過(guò)表達(dá)的影響。為證明該miRNA效應(yīng)不是細(xì)胞類型特異性的，在Huh_7肝癌細(xì)胞系中進(jìn)行了相似的qPCR和免疫印跡分析。與MCF-7細(xì)胞中的結(jié)果類似，在miR_376b轉(zhuǎn)染的Huh_7細(xì)胞中，Beclinl和Atg4c的mRNA水平(圖3-A)顯著下降。在mir_376b轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，Beclinl和Atg4c (圖3-B和圖3-C)蛋白量下降，但在以對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中未下降。所有這些結(jié)果表明，miR-376b通過(guò)調(diào)節(jié)自噬途徑中兩個(gè)關(guān)鍵蛋白Beclinl和Atg4c的表達(dá)阻斷了自卩遼。miR_376b通過(guò)影響兩種蛋白的mRNA水平發(fā)揮該效應(yīng)。Beclinl和Atg4c蛋白水平的下降可能是對(duì)mRNA水平的該效應(yīng)的結(jié)果,但是我們無(wú)法排除該miRNA對(duì)蛋白翻譯的可能的疊加影響。由于miRNA種子區(qū)與其在3’ UTR區(qū)的對(duì)應(yīng)序列(種子配對(duì)序列)之間的部分堿基配對(duì)而形成的穩(wěn)定相互作用對(duì)miRNA功能至關(guān)重要。將數(shù)個(gè)去穩(wěn)定的突變引入BECLIN13’ UTR或ATGC3’ UTR的推定miRNA結(jié)合位點(diǎn)的種子配對(duì)序列，并將這些突變的miR-376結(jié)合位點(diǎn)或野生型序列克隆到PGL3哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中螢光素酶cDNA的3’ -UTR區(qū)(分別圖4-A和圖 4-B)。
轉(zhuǎn)染到細(xì)胞時(shí)，螢光素酶活性與本底水平相比上升數(shù)個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)。與含有野生型BECLIN1 (圖4-C)3’ -UTR或ATG4C (圖4_D)3’ -UTR的螢光素酶構(gòu)建體共表達(dá)時(shí)，miR_376b能夠顯著減少螢光素酶表達(dá)(通過(guò)歸一化的螢光素酶活性測(cè)量)。
與之形成鮮明對(duì)比的是，融合突變的BECLIN13’ -UTR或ATG4C3’ -UTR的螢光素酶構(gòu)建體沒(méi)有對(duì)miR-376b的效應(yīng)。這些結(jié)果表明，miR-376b對(duì)自噬蛋白表達(dá)的效應(yīng)是直接的并且需要在BECLIN13’ -UTR區(qū)和ATG4C3’ -UTR區(qū)發(fā)現(xiàn)的miRNA-結(jié)合序列。
為測(cè)試沉默內(nèi)源miRNA是否會(huì)影響B(tài)eclinl和Atg4c水平,設(shè)計(jì)了針對(duì)miR_376b^ antagomir ο antagomir
以miR-376b或?qū)φ誥ntagomir在完全培養(yǎng)基或饑餓培養(yǎng)基中孵育細(xì)胞，使用qPCR檢查Beclinl或Atg4c (圖5)的mRNA水平antagomir_376b轉(zhuǎn)染導(dǎo)致兩種自卩遼蛋白的mRNA增加，在饑餓后該效應(yīng)更顯著。這些結(jié)果表明，內(nèi)源miR-376b控制細(xì)胞的Beclinl和Atg4c的水平。
事實(shí)上，Beclinl是關(guān)鍵的自噬蛋白，數(shù)個(gè)相互獨(dú)立研究組的報(bào)告表明，Beclinl敲除或敲低明顯地阻斷 由多種刺激激活的自噬。如上所述，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，廣泛表達(dá)的蛋白Beclinl結(jié)合hVps34/III類PI3K并調(diào)節(jié)自卩遼(Liang X H等人，1999 ；Furuya N等人，2005)。此外，已表明Beclinl可結(jié)合Bcl_2家族成員(例如Bcl-2、Bcl_XL)，并且Bcl_2蛋白和Beclin的水平之間的平衡被表明可影響自曬的激活(Pattingre S等人,2005)。該蛋白的下調(diào)或未結(jié)合Bcl-2的Beclin的比例的改變可干擾起始階段的自曬體形成(HamasakiM,Yoshimori T2010)。
在另一方面，Atg4c/自噬因子3屬于在Atg8/LC3和其他Atg8樣蛋白(即GATE-16、GABARAP)的加工和脂肪化中起作用的半胱氨酸蛋白酶的家族(Atg4a、b、C)。Atg4蛋白在人組織中廣泛表達(dá)(Marino G.等人2003)。Atg4蛋白還是自噬和自噬小泡流的重要調(diào)節(jié)物(Shouval R等人,2007)。與此相一致的是，Atg4c敲除與自卩遼抑制相關(guān)(Marino G等人，2007)。
上述觀察結(jié)果證明了 miR_376b在限制自噬活性方面的潛能。miR_376b通過(guò)導(dǎo)致Beclinl和Atg4c的mRNA和蛋白質(zhì)水平降低實(shí)現(xiàn)該功能。事實(shí)上，miR376b通過(guò)直接作用于Beclinl和Atg4c的mRNA來(lái)影響B(tài)eclinl和Atg4c的水平，因?yàn)檫@些基因的3’ UTR含有有功能的特異性結(jié)合位點(diǎn)，它們的突變可降低所述miRNA效應(yīng)的幅度。此外，所述miRNA的抑制劑(antagomir)能夠抑制相關(guān)miRNA的效應(yīng)并增加其靶的水平。因此，使用miR_376b(或其衍生物)或抗miRNA (antagomir等)有可能提供調(diào)節(jié)和操控自曬用于醫(yī)療目的的可能性，從而提供新的診斷、治療和追蹤方法，并且/或者改進(jìn)目前對(duì)具有自噬異常的上述疾病的方案。
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序列
權(quán)利要求
1.miR-376家族成員的至少一種miRNA (微小核糖核酸)或所述miRNA的至少一種抑制劑在治療至少一種涉及自噬異常的疾病的過(guò)程中或后單獨(dú)地或與其他常規(guī)疾病治療物相結(jié)合用于診斷、預(yù)防、治療和追蹤的用途。
2.權(quán)利要求1的用途，其特征在于:在出現(xiàn)具有過(guò)度自噬的疾病情況下，將所述miRNA用于阻斷自噬。
3.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的用途，其特征在于:將所述miRNA用于抑制至少一種自噬相關(guān)基因以抑制自嗤。
4.權(quán)利要求1的用途，其特征在于:在所述疾病來(lái)自自噬缺失或缺陷的情況下，將所述miRNA抑制劑用于激活自噬。
5.權(quán)利要求1或4的用途，其特征在于:將所述miRNA抑制劑用于抑制miRNA_376家族的至少一種miRNA以起始自噬。
6.一種自噬控制方法，用于在治療至少一種涉及自噬異常的疾病的過(guò)程中或后提供診斷、預(yù)防、治療和追蹤，其特征在于所述方法包括以下步驟: 提供是miR-376家族成員的至少一種miRNA或者是所述家族成員的miRNA的至少一種抑制劑至發(fā)生所述自噬的細(xì)胞，和 借助所述miRNA或其抑制劑抑制或起始自噬。
7.權(quán)利要求6的方法，其特征在于:在所述疾病源自過(guò)度自噬的情況下，該方法包括以下步驟: 提供過(guò)量的是所述miR-376家族成員的至少一種miRNA至發(fā)生所述過(guò)度自噬的細(xì)胞或生物體， 抑制至少一種自曬相關(guān)的基因， 通過(guò)將所述基因保持在控制下來(lái)抑制過(guò)度自噬。
8.權(quán)利要求6的方法，其特征在于:在所述疾病源自自噬缺失或缺陷的情況下，該方法包括以下步驟: 提供過(guò)量的是miR-376家族成員的miRNA的至少一種抑制劑至自噬缺失或缺陷的細(xì)胞， 抑制所述miRNA, 阻止自嗤相關(guān)基因的抑制， 借助所述自曬相關(guān)基因起始自曬。
9.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的自噬相關(guān)基因，其為Beclinl和Atg4c中的至少一種。
10.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的miRNA，其長(zhǎng)度為12個(gè)核苷酸到170個(gè)核苷酸。
11.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的miRNA，其中所述miRNA包括SEQID NO:1所示的核苷酸序列，或具有與來(lái)自所述SEQ ID NO:1的初級(jí)miRNA、miRNA前體、成熟miRNA、miRNA種子序列、dsmiRNA及其片段或變體的21個(gè)連續(xù)核苷酸至少約70%相同的序列RNA中任一序列的RNA互補(bǔ)物。
12.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的miRNA，其中所述miRNA是裸的合成RNA。
13.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的miRNA，其中所述miRNA是化學(xué)修飾的合成RNA。
14.權(quán)利要求13的miRNA,其中以選自以下的化學(xué)基團(tuán)修飾所述合成的RNA:磷硫酸基、砸燒憐酸基、2’-O-甲基、2’-氣基、2’-O-甲氧基乙基(2’_0_Μ0Ε)、2’-O-氛基丙基(2’ -O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’ -O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’ -O-DMAP)、2’-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)和2’-0-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)、PEG、末端反向的dT堿基、氟代-β -d-阿糖核酸(FANA或4’ -S-FANA形式)或者阿糖核酸(AM)修飾物、月桂酸加成物、石膽酸和膽固醇衍生物及它們的組合。
15.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的miRNA，其中所述miRNA是miR_376b。
16.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的miRNA,將所述miRNA在脂質(zhì)體、基于聚合物的納米顆粒、膽固醇綴合物、環(huán)糊精絡(luò)合物、聚乙烯亞胺聚合物或蛋白復(fù)合體中給予。
17.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的miRNA，所述miRNA經(jīng)靜脈、皮下、肌肉、鼻、腹膜內(nèi)、陰道、直腸、口腔、眼內(nèi)或鞘內(nèi)直接給予生物體的疾病組織。
18.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的miRNA抑制劑，其中所述miRNA抑制劑至少是核酸分子。
19.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的miRNA抑制劑，其中所述miRNA抑制劑的長(zhǎng)度介于12個(gè)核苷酸和30個(gè)核苷酸之間。
20.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的miRNA抑制劑，其中所述miRNA抑制劑包括與初級(jí)miRNA、miRNA前體、成熟miRNA、miRNA種子序列、dsmiRNA及其片段或變體的連續(xù)的5’到3’序列至少70%互補(bǔ)的序列。
21.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的miRNA抑制劑，其中所述miRNA抑制劑包括選自以下的修飾:2’ -脫氧、2’ -脫氧_2’ -氣代、2’ -O-甲基、2’ -O-甲氧基乙基(2’ -O-MOE)、2’ -O-氣基丙基(2’ -O-AP)、2’ -O- 二甲基氨基乙基(2’ -O-DMAOE)、2’ _0_ 二甲基氨基丙基(2’ -O-DMAP),2’ -O- 二甲基氨基乙氧基乙基(2’ -O-DMAEOE)和2’ -O-N-甲基乙酰胺基(2’ -O-NMA), PEG、末端反向的dT堿基、氟代-β -d-阿糖核酸(FANA或4’ -S-FANA形式)或阿糖核酸(AM)修飾物、月桂酸加成物、石膽酸和膽固醇衍生物及它們的組合。
22.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的疾病，所述疾病選自:神經(jīng)退行性疾病、癌癥、心臟病、肝病、衰老、肌病、自身免疫性疾病、炎性疾病、感染性疾病、缺血性疾病、免疫缺陷、糖尿病、軸突損傷、溶酶體貯積病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病。
23.權(quán)利要求22的疾病，其中所述疾病是乳腺癌或肝癌。
全文摘要
本發(fā)明涉及是hsa-miR-376家族成員的至少一種miRNA(微小核糖核酸)或所述miRNA的至少一種抑制劑通過(guò)作用于自噬相關(guān)基因和蛋白質(zhì)在治療至少一種涉及自噬異常的疾病的過(guò)程中或后用于診斷、預(yù)防、治療和追蹤的用途；以及其方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103221542SQ201080070195
公開日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2010年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月27日
發(fā)明者D·古瑞斯克, G·科爾克馬茲 申請(qǐng)人:薩班哲大學(xué)