專利名稱：一種表達(dá)豬瘟病毒e0、e2基因的重組腺病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組腺病毒，尤其是一種能在同一腺病毒中表達(dá)豬瘟病毒EO基因和E2基因的重組腺病毒，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬瘟是一種傳染性非常強的傳染病，常給養(yǎng)豬業(yè)造成毀滅性損失。目前，免疫接種仍是豬瘟防治的主要措施，而且是根除豬瘟病和阻止野毒傳向無豬瘟病豬群的必要手段。 豬瘟疫苗無論在過去、現(xiàn)在還是將來，對控制和消滅豬瘟病都具有極其重要的作用，各國學(xué)者對豬瘟疫苗的研制和開發(fā)一直沒有放棄。傳統(tǒng)的豬瘟疫苗有滅活疫苗和弱毒疫苗，其中滅活苗免疫效力低，保護期短，激發(fā)機體產(chǎn)生免疫力的速度慢，到目前為止，組織培養(yǎng)豬瘟毒的產(chǎn)量以及滅活疫苗所造成的病毒有效抗原的損失，仍是制造滅活疫苗的二大障礙；豬瘟弱毒疫苗的廣泛應(yīng)用，對于控制豬瘟的流行起到了關(guān)鍵作用，但是弱毒疫苗也存在下列不足首先近年來豬瘟的流行特點發(fā)生了很大的變化，呈現(xiàn)周期性、波浪形的地區(qū)性散發(fā)和溫和性豬瘟病，發(fā)病后的臨床癥狀有無名高熱、癥狀不典型、持續(xù)性感染、出生仔豬先天性震顫和母豬繁殖性障礙，用傳統(tǒng)疫苗免疫常常造成免疫失敗，即使將劑量增加到750個兔體反應(yīng)(國家規(guī)定150個兔體反應(yīng))也不能預(yù)防其感染，而且有蔓延的趨勢，在妊娠早期接種疫苗還會發(fā)生疫苗毒通過胎盤感染胎兒，造成死胎或弱仔并成持續(xù)性帶毒者，產(chǎn)生新的疫源；其次，弱毒疫苗已經(jīng)沿用了近40年，豬瘟的流行形式發(fā)生了很大變化，說明豬瘟病毒的抗原性可能存在著變異，特別是近年來國內(nèi)外應(yīng)用單克隆抗體對C-株檢測，發(fā)現(xiàn)有不同的反應(yīng)模式，表明經(jīng)過多年在不同細(xì)胞上的馴化，C-株已經(jīng)產(chǎn)生變異，這種流行毒株的變化趨勢國內(nèi)外情況基本一致，流行毒往往逃避免疫，導(dǎo)致免疫失敗的嚴(yán)重后果；第三，接種弱毒疫苗還會影響到國際貿(mào)易，歐盟已禁止使用豬瘟弱毒疫苗，而采用嚴(yán)格的衛(wèi)生防疫制度， 撲殺豬瘟感染豬和血清學(xué)陽性豬來控制和消滅豬瘟，采用撲殺政策需要大量的人力、物力和巨額資金，發(fā)展中國家是難以承受的，這就促使人們研究和開發(fā)新型的豬瘟疫苗來防控本病。近年來，基因工程技術(shù)的迅猛發(fā)展，為新型豬瘟疫苗的研究和開發(fā)提供了工具，目前， 豬瘟基因工程疫苗的研制已經(jīng)成為新的研究方向和熱點。人-5型腺病毒載體與其他動物病毒載體相比，具有許多優(yōu)點首先是安全，腺病毒毒性低，基本不致病或只引起輕微的癥狀，腺病毒重組后，毒力進(jìn)一步降低，并且克服了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體因隨機整合可能導(dǎo)致插入突變的潛在風(fēng)險；其次是宿主范圍廣，腺病毒可感染多種細(xì)胞包括分裂與非分裂細(xì)胞；第三是穩(wěn)定，腺病毒粒子十分牢固，不易突變，并且容易大量制備并純化，得到高滴度的病毒，在體外可獲得IOllPfuAiL ；第四就是對于腺病毒基因組的結(jié)構(gòu)和功能目前研究得比較清楚，基因操作方便；第五是插入外源基因容量大，在基因治療構(gòu)建重組疫苗中大多采用缺失El和E3區(qū)基因的腺病毒載體，通常復(fù)制缺陷型腺病毒可容納約71Λ 81Λ的外源基因，比逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺相關(guān)病毒的容量大很多；還有就是免疫途徑簡便，腺病毒可以在消化道和呼吸道增殖，疫苗接種簡便，可口服或氣霧吸入而不需注射，并且經(jīng)口服后能產(chǎn)生局部黏膜免疫應(yīng)答，在免疫方法上比其它疫苗好，容易推廣使
非復(fù)制型腺病毒不僅更安全有效，而且以低劑量的方式產(chǎn)生抗原蛋白而不裂解細(xì)胞，故表達(dá)抗原的時間更持久，有利于激發(fā)長期的免疫反應(yīng)。目前，已經(jīng)有多種產(chǎn)品已經(jīng)上市，例如“安柯瑞——重組人5型腺病毒注射液”；“重組人Y-干擾素腺病毒注射液 (ElOB) ”;“今又生(重組人p53腺病毒注射液)”;“人禽流感重組腺病毒疫苗臨床前安全評價方法的研究”取得階段性成果；“重組腺病毒-胸苷激酶基因制劑”；另外“豬繁殖與呼吸綜合征重組腺病毒和疫苗”已經(jīng)被南京農(nóng)業(yè)大學(xué)申請專利。

發(fā)明內(nèi)容
為解決豬瘟弱毒疫苗長期接種導(dǎo)致的病毒返祖、毒力增強的現(xiàn)象和弱毒疫苗株與野毒發(fā)生重組等問題，以及豬瘟病毒E0、E2基因融合串聯(lián)表達(dá)存在的產(chǎn)量低和保護效果弱的問題，本發(fā)明提供一種能在同一腺病毒中表達(dá)豬瘟病毒E0、E2基因的重組腺病毒。本發(fā)明提供的是這樣一種表達(dá)豬瘟病毒E0、E2基因的重組腺病毒，其特征在于在腺病毒的CMV啟動子下游多克隆位點的Bgl II和KpnI酶切位點中插入豬瘟病毒EO基因， 在Bio I和^CbaI酶切位點中插入腺病毒CMV啟動子和豬瘟病毒E2基因的CMV-E2片段。所述豬瘟病毒為常規(guī)的市購病毒，豬瘟病毒的EO基因在GenBank中的登錄號為 AF058715. 1，豬瘟病毒的E2基因在GenBank中的登錄號為AY775178. 2所述腺病毒為常規(guī)的市購人-5型非復(fù)制型腺病毒。所述在腺病毒中同時分別表達(dá)豬瘟病毒E0、E2基因的重組腺病毒，包括下列構(gòu)建步驟A.從市購的豬瘟病毒和豬瘟病毒中分別擴增出EO和E2基因；B.將步驟A獲得的豬瘟病毒EO基因通過BglII和KpnI酶切位點插入至腺病毒穿梭載體pAdTrack中，形成腺病毒穿梭載體pAdTrack-EO ；C.將步驟A獲得的豬瘟病毒E2基因通過Kpn I和Not I酶切位點插入至腺病毒穿梭載體PAdTrack中，形成腺病毒穿梭載體pAdTrack-E2 ；D.將步驟C的腺病毒穿梭載體pAdTrack-E2按常規(guī)的PCR方法擴增出含有CMV啟動子的CMV-E2基因，通過Biol I和)(ba I酶切位點插入至步驟B的腺病毒穿梭載體PAdTrack-EO中的Biol I和)(ba I酶切位點中，形成重組腺病毒穿梭載體 pAdTrack-E0-CMV-E2 ；E.將步驟D的重組腺病毒穿梭載體pAdTrack-E0-CMV-E2經(jīng)RiieI酶切線性化后， 轉(zhuǎn)化到含有腺病毒骨架載體pAd-easy-Ι的大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細(xì)胞中，形成重組腺病毒骨架載體 pAd-easy-E0-CMV_E2 ；F.將重組腺病毒骨架載體pAd-eaSy-E0-CMV-E2經(jīng)I3acI線性化后，轉(zhuǎn)染人胚胎腎細(xì)胞HEK293中，包裝出重組腺病毒rAd-E0-CMV-E2。本發(fā)明具有下列優(yōu)點和效果采用上述方案獲得的重組腺病毒rAd-E0-CMV_E2，能在同一腺病毒中分別表達(dá)豬瘟病毒EO蛋白和豬瘟病毒E2蛋白，解決了 E0、E2基因融合串聯(lián)表達(dá)產(chǎn)量低和保護效果弱的問題，本發(fā)明僅通過一次免疫接種就能夠使免疫后的豬獲得對豬瘟病毒的抗體，對豬瘟具有較強的抵抗能力，生產(chǎn)成本是常規(guī)疫苗的一半，大大降低了疫苗成本。本發(fā)明提供的重組腺病毒rAd-E0-CMV-E2屬于非復(fù)制型病毒，在豬體內(nèi)不繁殖，解決了弱毒疫苗長期接種導(dǎo)致的病毒返祖，毒力增強的現(xiàn)象。本發(fā)明提供的重組腺病毒rAd-E0-CMV-E2僅含有豬瘟病毒的主要保護基因，不含病毒的其它基因，因此，本發(fā)明提供的重組腺病毒與野毒株之間不會發(fā)生重組。采用上述方案構(gòu)建獲得的重組腺病毒制成的疫苗，免疫豬后對致死量100 倍TCID5tl的豬瘟病毒強毒攻擊的保護效果為100%。既解決了豬瘟疫苗和豬瘟野毒同源重組后毒力返強的問題，也解決了弱毒疫苗生產(chǎn)成本高的問題。


圖1為ELISA檢測的豬瘟病毒抗體的水平。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。實施例A.豬瘟病毒EO基因和E2基因的擴增(I)PCR擴增引物的設(shè)計在豬瘟病毒EO基因的上、下游引物中分別加入Bgl II和Kpn I限制性內(nèi)切酶酶切位點，所述豬瘟病毒EO基因的上、下游引物分別設(shè)計為上游引物P1 5，-AAAAGATCTATGGAAAATATAACTCAATGG-3，下游引物P2 5，-CACGGTACCGTAAGGCGATAGGGCATAG-3，在豬瘟病毒E2基因的上、下游引物中分別加入Kpn I和NotI和限制性內(nèi)切酶酶切位點，所述豬瘟病毒E2基因的上、下游引物分別設(shè)計為上游引物P1 5，-AAAGGTACCATGAGGGGACAGATCGTGC-3，下游引物P2 :5，-CCC GCGCCCGCACCAGCGGCGAGTTGTTCTG-3’(2)豬瘟病毒EO基因片段的體外擴增及擴增產(chǎn)物的回收與純化將含有豬瘟病毒EO基因的pMDIS-T-EO質(zhì)粒用雙蒸水稀釋100倍，取1 μ L為模板， 用豬瘟病毒EO基因的引物擴增編碼EO蛋白的目的片段，其中PCR反應(yīng)體系如下模板IyL10XPCR 緩沖液5 μ L2. 5mmol/L dNTP5μ LEO 基因上游引物(50ymol/L)2yLEO 基因下游引物(50ymol/L)2yLEx Taq DNA 聚合酶(5U/ μ L) 1 μ L滅菌去離子水；34 μ L反應(yīng)總體系為50 μ LPCR 反應(yīng)條件95°C預(yù)變性 5min ；94°C lmin,54°C lmin，72°C lmin，共；35 個循環(huán)； 最后72°C延伸10min，4°C儲存；將PCR產(chǎn)物置于8g/L瓊脂糖凝膠，于60V電泳20min后切取目的條帶大小的片段，回收豬瘟病毒EO基因的擴增產(chǎn)物；(3)豬瘟病毒E2基因片段的體外擴增及擴增產(chǎn)物的回收與純化 將含有豬瘟病毒E2基因的pMD18-T-E2質(zhì)粒用雙蒸水稀釋100倍，取1 μ L為模板，用豬瘟病毒E2基因的引物擴增編碼E2蛋白的目的片段，其中PER反應(yīng)體系如下
模板l u L
10×PER緩沖液5 u L
2．5mm01／L dNTP5 u L
E2基因上游引物(50 u mol／L)2 u L
E2基因下游引物(50 u mol／L)2 u L
Ex Taq DNA聚合酶(5u／u L) l u L
滅菌去離子水34 u L
反應(yīng)總體系為50 u L
PER反應(yīng)條件95℃預(yù)變性5min；94℃lmin，54℃lmin，72℃lmin 30see，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min，4℃儲存；將PER產(chǎn)物置于8g／L瓊脂糖凝膠，于60V電泳20min后切取目的條帶大小的片段，回收豬瘟病毒E2基因的擴增產(chǎn)物；
B．腺病毒穿梭載體pAd／rack—E0的構(gòu)建
(1)豬瘟病毒Eo基因的PER擴增產(chǎn)物的Bgl II和Kpn工雙酶切
向1．5mL Eppendorf管中依次加入
E0基因PER產(chǎn)物15 u L
10×Buffer5 u L
Bgl II3 u L
Kpn工3 u L
H。024 u L
總體積為50M1，充分混勻后瞬時離心
以37℃水浴6h后，用8g／L瓊脂糖凝膠電泳，切下含目的條帶的凝膠回收；
(2)穿梭載體pAd／rack—CMV的Bgl II和Kpn工雙酶切
向1．5mL Eppendorf管中依次加入
pAd／rack—CMV質(zhì)粒l o u L
10×Buffer6 u L
Bgl II3 u L
Kpn工3 u L
H。038 u L
總體積為60 u L，充分混勻后，瞬時離心
以37℃水浴6h后，用8g／L瓊脂糖凝膠電泳，切下含目的條帶的凝膠回收；
(3)豬瘟病毒Eo基因與穿梭質(zhì)粒載體pAd／rack—CMV的連接
連接反應(yīng)體系
E0基因片段 4 u L
pAdTrack—CMV2 u L
10×Bufferl u L
T4DNA連接酶l u L
H。03 u L
總體積為lo u L，充分混勻后瞬時離心
16 °C水浴連接過夜；(4)豬瘟病毒EO基因和pAdTrack-CMV載體連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化和鑒定①DH5a感受態(tài)細(xì)胞的制備將_70°C甘油保種的DH5a接種于不含抗生素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)過夜， 挑取長勢良好的單菌落，接種于3mL新配置的不含抗生素的LB培養(yǎng)液中，370C 250r/min振蕩培養(yǎng)過夜，約14h;取100 μ L培養(yǎng)物，按1 100比例接種于IOOmL新鮮LB培養(yǎng)液中， 300r/min劇烈振蕩培養(yǎng)約3h，至OD6tltl為0. 6 ；無菌條件下轉(zhuǎn)移細(xì)菌培養(yǎng)物至兩個預(yù)冷的 50mL離心管中，冰浴IOmin ；4°C下1600r/min離心lOmin，棄上清，倒置離心管浙干液體，加入預(yù)冷的0. lmol/L CaCl2溶液10mL，懸浮菌體沉淀，置冰浴放置30min ；4°C下llOOr/min離心IOmin,棄上清，用2mL 0. lmol/L預(yù)冷的CaCl2 (含150mL/L甘油)重懸菌體，然后分裝于預(yù)冷的滅菌Eppendorf管中，每管100 μ L，置_70°C冰箱保存?zhèn)溆?；②重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞取一管感受態(tài)細(xì)胞置于冰水混合物上，待完全融化后，將10 μ L的連接產(chǎn)物加入管中，輕輕混勻；冰浴30min ；42°C水浴中熱激90s ；冰浴^iin ；加入800 μ L LB培養(yǎng)基，37°C 下200 250r/min振蕩培養(yǎng)Ih ；8000r/min離心lmin，棄部分上清，存留100 μ L左右的上清重懸沉淀；取100 μ L混合物均勻涂布于含卡那霉素(50 μ g/mL)的LB瓊脂平板上，待完全吹干后，37°C培養(yǎng)過夜(12 16h)；挑取單菌落于3mL含50 μ g/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜；堿裂解法提取質(zhì)粒后進(jìn)行酶切、PCR和測序鑒定；將豬瘟病毒EO基因插入至穿梭載體pAdTrack-CMV中構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為腺病毒穿梭載體PAdTrack-EO ；C.腺病毒穿梭載體pAdTrack-E2的構(gòu)建及CMV-E2片段的獲得(1)豬瘟病毒E2基因PCR擴增產(chǎn)物的Kpn I和Not I雙酶切向1. 5mL Eppendorf管中依次加入E2 基因 PCR 產(chǎn)物 15 μ LIOXBuffer5μ LKpn I3 μ LNot I3μ LH2024 μ L總體積為50 μ L，充分混勻后瞬時離心以37°C水浴他后，用8g/L瓊脂糖凝膠電泳，切下含目的條帶的凝膠回收；(2)穿梭載體 pAcTTrack-CMV 的 Kpn I 和 Not I 雙酶切向1. 5mL Eppendorf管中依次加入pAdTrack-CMV 質(zhì)粒 IOyLIOXBuffer6μ LKpn I3 μ LNot I3μ LH2O38 μ L總體積為60 μ L，充分混勻后瞬時離心以37°C水浴他后，用8g/L瓊脂糖凝膠電泳，切下含目的條帶的凝膠回收；0104](3)豬瘟病毒E2基因與穿梭質(zhì)粒載體pAdTrack-CMV的連接
0105]連接反應(yīng)體系
0106]E2基因片段 4μ L
0107]pAdTrack-CMV 2μ L
0108]IOXBuffer1 μ L
0109]T4DNA 連接酶1 μ L
0110]H2O3μ L總體積為10 μ L，充分混勻后瞬時離心16 °C水浴連接過夜；(4)豬瘟病毒E2基因和pAdTrack-CMV載體連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化和鑒定①DH5a感受態(tài)細(xì)胞的制備同步驟B的(4)①；②重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞同步驟B的(4)②；將豬瘟病毒E2基因插入至穿梭載體pAdTrack-CMV中構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為為 腺病毒穿梭載體pAdTrack-E2 ；OCMV-E2基因的獲得根據(jù)pAdTrack-E2載體中CMV啟動子的序列設(shè)計擴增CMV-E2基因的引物上游引物P1 5，-AAACTCGAGTAGTTATTAATAGTAATCAAT-3，下游引物P2 5，-CACTCTAGAACCAGCGGCGAGTTGTTCTG-3，在CMV-E2基因的上、下游引物中分別加入)(ho I,XbaI和限制性內(nèi)切酶酶切位點， 并在下游引物中引入終止密碼子；D.重組腺病毒穿梭載體pAdTrack-E0-CMV_E2的構(gòu)建(1) CMV-E2基因PCR產(chǎn)物的Xho I和Xba I雙酶切向1. 5mL Eppendorf管中依次加入CMV-E2 片段 PCR 產(chǎn)物 15 μ LIOXBuffer5μ LXho I3μ LXba I3 μ LΗ2024 μ L總體積為50 μ L，充分混勻后瞬時離心以37°C水浴他后，用8g/L瓊脂糖凝膠電泳，切下含目的條帶的凝膠回收；(2)穿梭載體 pAdTrack-EO 的 Xho I 和 Xba I 雙酶切向1. 5mL Eppendorf管中依次加入pAdTrack-EO 質(zhì)粒 10 μ LIOXBuffer6μ LXho I3 μ LXba I3μ LH2O38 μ L
總體積為60 μ L，充分混勻后瞬時離心以37°C水浴他后，用8g/L瓊脂糖凝膠電泳，切下含目的條帶的凝膠回收；(3) CMV-E2基因與穿梭質(zhì)粒載體pAdTrack_E0的連接連接反應(yīng)體系CMV-E2 基因片段 4 μ LpAdTrack-EO2μ LIOXBuffer1 μ LT4DNA 連接酶1 μ LH2O3μ L總體積為10 μ L，充分混勻后瞬時離心16 °C水浴連接過夜；(4) CMV-E2片段和pAdTrack_EO載體連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化和鑒定①DH5a感受態(tài)細(xì)胞的制備同步驟B的(4)①；②重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞同步驟B的(4)②；將CMV-E2片段插入至穿梭載體pAdTrack-EO中構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為重組腺病毒穿梭載體 pAtTTrack-E0-CMV-E2 ；E.重組腺病毒骨架載體pAdEasy-E0-CMV_E2的構(gòu)建(1)重組腺病毒穿梭載體pAdTrack-E0-CMV-E2的線性化用RiieI對穿梭載體pAdTrack-E0-CMV-E2酶切線性化，按如下所示分別加入各組分pAdTrack-E0-CMV-E2 25 μ LPmeI4μ L0. lg/L BSA10 μ LIOXBuffer 410 μ LH2O51 μ L總體積為100 μ L置37°C水浴中Mi后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收；(2)線性化的重組腺病毒穿梭載體pAdTrack-E0-CMV-E2轉(zhuǎn)化到含有腺病毒骨架載體pAdEasy-Ι的大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細(xì)胞同步驟B的(4)②；將重組后的腺病毒骨架載體命名為重組腺病毒骨架載體pAdEasy-E0-CMV-E2 ；F.重組腺病毒rAd-E0-CMV_E2的獲得(1)重組腺病毒骨架載體pAdEaSy-E0-CMV-E2的線性化、回收和純化用I^cI酶切使重組腺病毒骨架載體pAdEaSy-E0-CMV-E2線性化，酶切反應(yīng)體系為pAdeasy-E0-CMV-E2 25 μ LPac I5μ L
0. lg/L BSA10 μ LIOXBuffer 410 μ LH2O50 μ L總體積為100 μ L，置37°C水浴中他。在酶切后的產(chǎn)物中，加入2. 5體積的無水乙醇和1/10體積的3mol/L NaAc,-20°C 沉淀lh，在4°C以12000r/min離心15min，棄去上清，加入70%乙醇洗一次，自然干燥后，加入 20 μ L H2O 溶解 DNA ；(2)重組腺病毒rAd-E0-CMV_E2的獲得將線性化的重組腺病毒骨架載體pAdEasy-E0-CMV-E2轉(zhuǎn)染至人胚胎腎細(xì)胞HEK 293細(xì)胞中，具體操作按LipOfectamineTM2000產(chǎn)品說明書進(jìn)行；收獲的病毒液命名為重組腺病毒 rAd-E0-CMV-E2 ；(3)重組腺病毒rAd-E0-CMV_E2的擴增及滴度測定按照噬斑法測定rAd-E0-CMV_E2在293細(xì)胞中傳至15代時的病毒滴度。本發(fā)明獲得的重組腺病毒rAd-E0-CMV_E2經(jīng)過下列試驗1. rAd-E0-CMV-E2免疫保護性試驗(1)實驗動物分組將25頭豬隨機分為5組，第一組為rAd-E0-CMV_E2免疫組，5頭。第二組為豬瘟脾淋苗免疫組，5頭。第三組為融合表達(dá)E0-E2基因的重組腺病毒rAd-E0-E2免疫組，5頭。 第四組為非重組腺病毒免疫組，5頭。第五組為空白對照組，5頭。(2)免疫和攻毒重組腺病毒組和非重組腺病毒組的免疫劑量均為2. 4 X 109pfu (定量至2mL)，于頸部肌肉和腹部皮下多點注射；豬瘟兔化弱毒疫苗的免疫方法和劑量按照疫苗實際使用劑量進(jìn)行免疫；空白對照用培養(yǎng)重組腺病毒的DMEM培養(yǎng)液免疫，2mL/頭。所有試驗豬在免疫后的20d時用100倍TCID5tl豬瘟強毒肌肉注射、點眼、滴鼻和口服攻擊。(3)體溫檢測和臨床觀察所有試驗豬從攻毒的第1天開始測量體溫，以后每天測量體溫，觀察臨床癥狀。(4)血清抗體的檢測從免疫開始和免疫后的每個星期采集血液，收集血清，用于豬瘟抗體的檢測，另一份加入抗凝劑，用于血液中豬瘟病毒的檢測。(5)攻毒后血液中病毒存在的檢測攻毒后隔天采集抗凝全血，用RT-PCR方法檢測血液中的豬瘟病毒。(6)病理觀察在攻毒后的14天，當(dāng)所有存活豬的臨床癥狀基本消失后，全部處死并進(jìn)行剖檢， 觀察下頌淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、腹股溝淺淋巴結(jié)、腎臟、脾臟、膀胱以及心臟是否有病理變化。2.結(jié)果(1)體溫和臨床癥狀第一組(rAd-E0-CMV-E2免疫組)在免疫后沒有出現(xiàn)任何臨床癥狀，在攻毒后第4 天，5頭免疫豬中1頭豬體溫達(dá)40°C以上，持續(xù)4 左右，第7天時左右體溫恢復(fù)正常。致死保護率為100%。第二組(豬瘟脾淋苗免疫組)在攻毒后的第4天，5頭免疫豬中1頭豬體溫達(dá)40°C 以上，持續(xù)7 左右，食欲稍微下降，在第8天體溫和食欲恢復(fù)正常。致死保護率為100%。第三組(融合表達(dá)E0-E2基因的重組腺病毒rAd-E0_E2免疫組)在免疫后沒有出現(xiàn)任何臨床癥狀，在攻毒后第4天，5頭免疫豬中2頭豬體溫達(dá)40°C以上，持續(xù)7 左右，第 8天時左右體溫恢復(fù)正常。致死保護率為100%。第四組(非重組腺病毒免疫組)和第五組(空白對照組)的所有試驗豬在攻毒后第1 2天體溫升至40°C以上，病豬便秘；第3天食欲減退，精神沉郁，有些病豬發(fā)生嘔吐， 很少采食，僅少量飲水，精神高度沉郁，四肢軟弱無力，行動緩慢，搖擺不穩(wěn)，普遍拉稀，兩眼無神，有多量黏液膿性分泌物，腹下、耳和四肢內(nèi)側(cè)有出血點；第4天病豬伏臥不起，全身震顫，四肢呈游泳狀劃動，體溫一直稽留在41°C左右。第5天開始陸續(xù)死亡，至第7天全部死亡，死前體溫下降。死亡率為100%。體溫及死亡情況見表1。(2)抗豬瘟病毒和抗豬瘟病毒抗體的檢測用中國獸藥監(jiān)察所提供的豬瘟ELISA抗體檢測試劑盒對所有試驗豬的抗體水平進(jìn)行檢測。rAd-E0-CMV-E2免疫組的抗體呈上升趨勢，在攻毒前抗體OD63tl值分別達(dá)到 0. 696，攻毒后所有試驗組的抗體水平都呈明顯的上升趨勢。rAd-E0-E2免疫組的抗體水平也呈上升趨勢，但在攻毒前抗體OD63tl值分別達(dá)到0. 595。豬瘟兔化弱毒苗免疫組的抗體水平在攻毒前的OD63tl最高值為0. 713。非重組腺病毒對照組和空白對照組在攻毒前一直沒有檢測到抗體水平，但是在攻毒后臨死前能檢測到豬瘟抗體水平。圖1。表1不同疫苗免疫組CSFV強毒攻擊后體溫情況
權(quán)利要求
1.一種表達(dá)豬瘟病毒E0、E2基因的重組腺病毒，其特征在于在腺病毒的CMV啟動子下游多克隆位點的Bgl II和Kpn I酶切位點中插入豬瘟病毒EO基因，在Bio I和)(baI酶切位點中插入腺病毒CMV啟動子和豬瘟病毒E2基因的CMV-E2片段。
2.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)豬瘟病毒E0、E2基因的重組腺病毒，其特征在于所述豬瘟病毒為常規(guī)的市購病毒，豬瘟病毒的EO基因在GenBank中的登錄號為AF058715. 1，豬瘟病毒的E2基因在GenBank中的登錄號為AY775178. 2
3.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)豬瘟病毒E0、E2基因的重組腺病毒，其特征在于所述腺病毒為常規(guī)的市購人-5型非復(fù)制型腺病毒。
4.一種如權(quán)利要求1所述的表達(dá)豬瘟病毒E0、E2基因的重組腺病毒的構(gòu)建方法，其特征在于包括下列構(gòu)建步驟A.從市購的豬瘟病毒和豬瘟病毒中分別擴增出EO和E2基因；B.將步驟A獲得的豬瘟病毒EO基因通過BglII和Kpn I酶切位點插入至腺病毒穿梭載體pAdTrack中，形成腺病毒穿梭載體pAdTrack-EO ；C.將步驟A獲得的豬瘟病毒E2基因通過KpnI和Not I酶切位點插入至腺病毒穿梭載體pAdTrack中，形成腺病毒穿梭載體pAdTrack-E2 ；D.將步驟C的腺病毒穿梭載體pAdTraCk-E2按常規(guī)的PCR方法擴增出含有CMV 啟動子的CMV-E2基因，通過Biol I和)(ba I酶切位點插入至步驟B的腺病毒穿梭載體pAdTrack-EO中的Biol I和)(ba I酶切位點中，形成重組腺病毒穿梭載體 pAdTrack-E0-CMV-E2 ；E.將步驟D的重組腺病毒穿梭載體pAdTrack-E0-CMV-E2經(jīng)RiieI酶切線性化后，轉(zhuǎn)化到含有腺病毒骨架載體pAd-easy-Ι的大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細(xì)胞中，形成重組腺病毒骨架載體 pAd-easy-E0-CMV-E2 ；F.將重組腺病毒骨架載體pAd-eaSy-E0-CMV-E2經(jīng)I^cI線性化后，轉(zhuǎn)染人胚胎腎細(xì)胞 HEK293中，包裝出重組腺病毒rAd-E0-CMV-E2。
全文摘要
本發(fā)明提供一種表達(dá)豬瘟病毒E0、E2基因的重組腺病毒，其特征在于在腺病毒的CMV啟動子下游多克隆位點的Bgl II和Kpn I酶切位點中插入豬瘟病毒E0基因，在XhoI和Xba I酶切位點中插入腺病毒CMV啟動子和豬瘟病毒E2基因的CMV-E2片段。它解決了E0、E2基因融合串聯(lián)表達(dá)產(chǎn)量低和保護效果弱的問題，僅通過一次免疫接種就能夠使免疫后的豬獲得對豬瘟病毒的抗體，且生產(chǎn)成本是常規(guī)疫苗的一半，本重組腺病毒屬于非復(fù)制型病毒，在豬體內(nèi)不繁殖，解決了弱毒疫苗長期接種導(dǎo)致的病毒返祖，毒力增強的現(xiàn)象。本重組腺病毒僅含有豬瘟病毒的主要保護基因，不含病毒的其它基因，因此，與野毒株之間不會發(fā)生重組。用本重組腺病毒制成的疫苗，免疫豬后對致死量100倍TCID50的豬瘟病毒強毒攻擊的保護效果為100％。
文檔編號C12N7/01GK102181404SQ201110000978
公開日2011年9月14日 申請日期2011年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月5日
發(fā)明者孫永科, 楊玉艾 申請人:孫永科