專利名稱：利用est-ssr分子標(biāo)記構(gòu)建荔枝核心種質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及荔枝核心種質(zhì)的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
荔枝Hitchi chinensis Sonn.)為無(wú)患子科{Sapindaceae)荔枝屬 Hitchf)植物，原產(chǎn)于我國(guó)南部，是重要的熱帶亞熱帶水果，也是世界最古老的栽培果樹之一，分布于東、西半球的熱帶和亞熱帶的廣闊地區(qū)，我國(guó)荔枝主要分布在北緯18° M° 30'的熱帶亞熱帶地區(qū)，主要栽培省份是廣東、廣西、福建、海南、臺(tái)灣、云南，此外，在四川、貴州、浙江的一些特殊小氣候區(qū)也有少量種植(張展薇等，1997)。吳淑嫻等(1996)年對(duì)各地的荔枝種質(zhì)資源進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)認(rèn)為我國(guó)已發(fā)現(xiàn)的荔枝種質(zhì)達(dá)222份，現(xiàn)已增加至300多份(陳潔珍等 2003)。其中，廣東荔枝栽培面積最大，品種資源豐富，栽培品種也較多，目前，我國(guó)荔枝種質(zhì)資源保存主要是利用種質(zhì)資源圃。1988年建立的廣州荔枝圃到目前為止保存了包括廣東、 廣西、福建、四川、云南等地的野生、半野生和栽培品種等130多份種質(zhì)，是世界上最大的荔枝種質(zhì)基因庫(kù)。荔枝現(xiàn)存資源保存方式單一，各地幾乎僅采用建立資源圃進(jìn)行田間種植保存，而且資源的重復(fù)保存現(xiàn)象較嚴(yán)重；其保護(hù)力度也遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，荔枝的遺傳多樣性遭到嚴(yán)重的破壞(王艷瓊2008)。此外，由于荔枝是多年生木本植物，樹體大，作為資源保存，占地面積大， 隨著近年來遺傳資源數(shù)量的增加也給種質(zhì)資源的保存、研究與利用帶來了很大的困難。Frankel (1984)最早提出核心種質(zhì)(Core collection)即是以最小的資源份數(shù)和遺傳重復(fù)最大限度地代表該物種的遺傳多樣性。核心種質(zhì)的構(gòu)建能有效解決資源的重復(fù)保存，且由于資源數(shù)量大給育種工作者帶來的困難也能隨之解決。傳統(tǒng)的核心種質(zhì)的是用農(nóng)藝學(xué)和形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)來構(gòu)建的，但這些表型數(shù)據(jù)不能準(zhǔn)確的反應(yīng)群體固有的遺傳變異及材料間的遺傳關(guān)系(Gu et al，2005)，與表型數(shù)據(jù)相比，DNA 分子標(biāo)記數(shù)據(jù)能直接反映出DNA序列水平上的變化，是構(gòu)建核心種質(zhì)的有效特征數(shù)據(jù)(李銀霞等2007)。目前，核心種質(zhì)已成為國(guó)際遺傳資源研究的熱點(diǎn)，在水稻等許多一年生作物上得至丨J 廣泛應(yīng)用(Chandra 2002 ；Amalraj 2006 Juneja 2006 ；Ronfort 2006 ；Upadhyaya 2007)，在園藝作物花卉郁金香(Raamsdonk 2000)、梅花(明軍2005)和蠟梅(趙冰2007) 等上也有報(bào)道，在果樹上，僅在蘋果(Hokanson 1998)、果梅(高志紅等2008)、柚類(劉勇 2006)和桃(李銀霞等2007)上有少量報(bào)道?，F(xiàn)階段，缺乏荔枝核心種質(zhì)與分子指紋的構(gòu)建方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供荔枝核心種質(zhì)與分子指紋的構(gòu)建方法。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是 荔枝核心種質(zhì)的構(gòu)建方法，包括以下步驟1)選取荔枝的嫩葉，按品種提取其基因組DNA，得到荔枝的基因組DNA樣品；
2)根據(jù)荔枝的EST序列，搜索荔枝的EST-SSR，設(shè)計(jì)EST-SSR引物；
3)使用EST-SSR引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增荔枝的基因組DNA；
4)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，得到其等位基因的存在數(shù)據(jù)；
5)對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，構(gòu)建核心種質(zhì)。優(yōu)選的，PCR的擴(kuò)增程序?yàn)?94°c,4min ；94°C，Imin ；50°C, Imin ；72°C，2min ；35 個(gè)循環(huán)；72°C，10min ；4°C，完成擴(kuò)增。本發(fā)明方法中，EST-SSR標(biāo)記的引物形成和實(shí)驗(yàn)操作過程簡(jiǎn)單，易操作，擴(kuò)增譜帶清晰，結(jié)果穩(wěn)定，適合于分析荔枝資源之間的遺傳多樣性，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建的核心種質(zhì)幾乎代表了原種質(zhì)全部的遺傳多樣性，有很好的代表性，對(duì)荔枝種質(zhì)管理、新種質(zhì)收集及種質(zhì)繁殖更新具有現(xiàn)實(shí)意義，更重要的是促進(jìn)了荔枝種質(zhì)資源利用的深入，從而提高荔枝種質(zhì)資源的利用效率。


圖1是三種相似系數(shù)下抽取不同樣品數(shù)保留的等位基因數(shù)。圖2是三種系數(shù)下構(gòu)建的核心種質(zhì)與原種質(zhì)的主坐標(biāo)圖。圖3是9個(gè)EST-SSR標(biāo)記的多態(tài)性類型分類簡(jiǎn)圖。圖4 6分別是使用EST-SSR標(biāo)記EST-21、EST-29、EST_30對(duì)96份荔枝種質(zhì)資源進(jìn)行PCR產(chǎn)物的電泳分析圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步說明本發(fā)明。1材料與方法 1.1植物材料
本實(shí)驗(yàn)所采用的96個(gè)荔枝品種均取自廣東省農(nóng)科院果樹研究所的國(guó)家荔枝資源圃， 取樣時(shí)，挑選枝條生長(zhǎng)健壯，且葉片無(wú)病蟲害的嫩葉，放入保鮮袋，然后用冰盒盛放，取完后迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，放在_80°C的超低溫冰箱儲(chǔ)藏備用。1.2 方法
1. 2. 1 DNA的提取
采用改進(jìn)的SDS法(陳亮等，1997)(陳亮，陳大明，高其康等.茶樹基因組DNA提純與鑒定，茶葉科學(xué)，1997，17 (2) 172-176)提取基因組DNA0用PERKIN ELMER PTP6型紫外分光光度計(jì)測(cè)定其在230nm，260nm, 280nm處的紫外吸收光譜，根據(jù)OD26tl值算出樣品中DNA的濃度，并結(jié)合0. 8%瓊脂糖凝膠電泳判斷DNA的質(zhì)量和濃度。為了最終實(shí)驗(yàn)的方便和統(tǒng)一， 將每種樣品的DNA稀釋成大約IOng/ μ L，_20°C保存?zhèn)溆谩?.2.2引物的設(shè)計(jì)與退火溫度的確定
從荔枝cDNA文庫(kù)測(cè)序所得的EST序列，應(yīng)用SSRIT (simple sequence repeat identification tool)軟件在線(http://www. gramene. org/db/markers/ssrtool)搜索 EST-SSR，應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件I^rimer Premier 5. 0設(shè)計(jì)引物，由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。參考不同引物的Tm值，采用梯度PCR確定相應(yīng)的退火溫度。選用10個(gè)品種的基因組DNA對(duì)能擴(kuò)出目的條帶的引物進(jìn)行多態(tài)性篩選，選擇多態(tài)性高、重現(xiàn)性好的引物作為以后全部96份資源擴(kuò)增的核心引物。1. 2. 3 PCR擴(kuò)增與電泳檢測(cè)
本實(shí)驗(yàn)采用 25 μ 1 反應(yīng)體系CldH2O 17.5“1，8吐€61~(含]\%2+)2.5“1，(1^138 0. 5μ 1, Taq DNA聚合酶0. 5 μ 1，primer各1 μ 1，模板DNA 2 μ 1.優(yōu)化的荔枝SSR-PCR的擴(kuò)增反應(yīng)程序:94°C,4min ；94°C, Imin ；50°C, Imin ；72°C，2min ；35cycles ；72°C, IOmin ；4°C，完成擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物，先在2. 5%的瓊脂糖凝膠電泳上進(jìn)行檢測(cè)，然后再在8%的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，銀染檢測(cè)。最后用數(shù)碼相機(jī)拍照，保存。1. 2. 4數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)、處理和分析
數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)SSR是一種共顯性標(biāo)記，根據(jù)其擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳膠上出現(xiàn)譜帶的位置和頻率，將不同材料某位點(diǎn)存在的等位基因記為1，不存在的記為0。數(shù)據(jù)的處理和分析所有記錄的數(shù)據(jù)均錄入計(jì)算機(jī)，然后利用NTSYS 2. IOe生物學(xué)軟件進(jìn)行相似性數(shù)據(jù)分析，相似系數(shù)采用Dice、SM和Jaccard系數(shù)進(jìn)行UPGMA聚類。1. 2. 5核心種質(zhì)的構(gòu)建
利用相似系數(shù)Dice、SM和Jaccard估測(cè)遺傳距離，用NTSYSpc-2. IOe軟件進(jìn)行 UPGMA聚類分析，根據(jù)Hu等(2000)的多次聚類方法(Hu J, Zhu J，Xu H M. Methods of constructing core collections by stepwise clustering with three sampling strategies based on the genotypic values of crops. Theoretical and Applied Genetics, 2000，101:沈4力68)，利用張春雨等(2009)提出的位點(diǎn)優(yōu)先取樣策略(張春雨，陳學(xué)森，張艷敏等.采用分子標(biāo)記構(gòu)建新疆野蘋果核心種質(zhì)的方法.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)[J]，2009， 42(2) :597-604)構(gòu)建核心種質(zhì)。1. 2. 6核心種質(zhì)的評(píng)價(jià)與確認(rèn)
通過P0PGENE 1.32來計(jì)算等位基因數(shù)(A)、Nei，s基因多樣度(He)、香農(nóng)信息指數(shù) (Ho)，用SPSS 13. 0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和計(jì)算核心種質(zhì)相對(duì)于原種質(zhì)的保留率來確認(rèn)其代表性，然后采用柱坐標(biāo)軸分析法來確認(rèn)核心種質(zhì)。2結(jié)果與分析
2. 1 EST-SSR的特點(diǎn)與多態(tài)性
從3391條荔枝EST序列中，篩選出305條含有SSR，比例為8. 99%，而陳海梅(2005)在小麥上得到比例為1.34%，說明荔枝的EST序列中含有豐富的SSR。根據(jù)以上SSR序列共設(shè)計(jì)了 100對(duì)EST-SSR引物對(duì)，有62對(duì)在荔枝上有擴(kuò)增產(chǎn)物，有30對(duì)引物能96個(gè)荔枝樣品上擴(kuò)出清晰，多態(tài)性高的條帶，共擴(kuò)出284條帶，不同引物的擴(kuò)增條帶在3 18條，平均9. 47， 其中有282條為多態(tài)性帶，多態(tài)率高達(dá)99. 30 %。2. 2遺傳多樣性分析
用EST-SSR標(biāo)記對(duì)96份荔枝資源進(jìn)行擴(kuò)增，其遺傳多樣性見表1.從表看出，每對(duì)引物的Nei，s基因多樣度范圍0. 186 0. 396，香農(nóng)信息指數(shù)范圍0. 318 0. 558，由此說明96 份荔枝資源有豐富的遺傳多樣性。表1 EST-SRR標(biāo)記下96份荔枝資源的遺傳多樣性
權(quán)利要求
1.荔枝核心種質(zhì)的構(gòu)建方法，包括以下步驟1)選取荔枝的嫩葉，按品種提取其基因組DNA，得到荔枝的基因組DNA樣品；2)根據(jù)荔枝的EST序列，搜索荔枝的EST-SSR，設(shè)計(jì)EST-SSR引物；3)使用EST-SSR引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增荔枝的基因組DNA；4)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，得到其等位基因的存在數(shù)據(jù)；5)對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，構(gòu)建核心種質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的荔枝核心種質(zhì)的構(gòu)建方法，其特征在于PCR的擴(kuò)增程序?yàn)?94°C，4min ；94°C, Imin ；50°C, Imin ；72°C，2min ；35 個(gè)循環(huán)；72°C, IOmin ；4°C，完成擴(kuò)增。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的荔枝核心種質(zhì)的構(gòu)建方法，其特征在于使用的EST-SSR引物為 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :18、SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :47、SEQ ID NO :48、SEQ ID NO :49、SEQ ID NO :50、SEQ ID NO :55、SEQ ID NO :56、SEQ ID NO :59、 SEQ ID NO :60。
全文摘要
本發(fā)明公開了荔枝核心種質(zhì)的構(gòu)建方法，包括以下步驟選取荔枝的嫩葉，按品種提取其基因組DNA，得到荔枝的基因組DNA樣品；根據(jù)荔枝的EST序列，搜索荔枝的EST-SSR，設(shè)計(jì)EST-SSR引物；使用EST-SSR引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增基因組DNA；對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，得到其等位基因的存在數(shù)據(jù)；對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，構(gòu)建核心種質(zhì)。本發(fā)明方法EST-SSR標(biāo)記的引物形成和實(shí)驗(yàn)操作過程簡(jiǎn)單，易操作，擴(kuò)增譜帶清晰，結(jié)果穩(wěn)定，適合于分析荔枝資源之間的遺傳多樣性，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建的核心種質(zhì)幾乎代表了原種質(zhì)全部的遺傳多樣性，有很好的代表性，對(duì)荔枝種質(zhì)管理、新種質(zhì)收集及種質(zhì)繁殖更新具有現(xiàn)實(shí)意義，更重要的是促進(jìn)了荔枝種質(zhì)資源利用的深入，從而提高荔枝種質(zhì)資源的利用效率。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102174510SQ20111000182
公開日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2011年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月6日
發(fā)明者向旭, 孫清明, 李志強(qiáng), 歐良喜, 蔡長(zhǎng)河, 袁沛元, 邱燕萍, 陳潔珍 申請(qǐng)人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所