專利名稱：一種從動物肌肉中分離磷脂酶A₂的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種從動物肌肉中分離磷脂酶A2的方法。
背景技術(shù)：
磷脂酶A2具有多種生物學(xué)功能，如脂質(zhì)代謝、信號傳導(dǎo)以及消除炎癥等，其還與肌 肉毒素、神經(jīng)毒素和心臟毒素等有關(guān)，因此磷脂酶A2的分離純化及其性質(zhì)研究是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域 的熱點(diǎn)之一。同時因為磷脂酶A2能夠催化水解甘油磷脂Sn-2位酯鍵生成溶血磷脂(溶血磷 脂的潤濕能力、乳化穩(wěn)定性等性能優(yōu)于普通磷脂)，所以磷脂酶A2在多個產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域(如食品、 醫(yī)藥等)也有廣泛應(yīng)用。目前，國內(nèi)外研究人員對蛇毒、蜂毒、豬胰和微生物中的磷脂酶A2開展了大量的研 究，其中對蛇毒中磷脂酶A2的克隆、表達(dá)與晶體結(jié)構(gòu)模擬等都已有詳細(xì)報道，另外對蜂毒磷 脂酶A2的DNA重組及結(jié)構(gòu)也進(jìn)行了研究，但這些酶基本都屬于低分子量分泌型酶，并且對 動物源磷脂(如蛋黃卵磷脂)水解的效率普遍較低。到目前為止，可的提取磷脂酶A2量較少，不能滿足對高分子量細(xì)胞漿質(zhì)型磷脂酶 A2純品的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可大量獲取磷脂酶A2的從動物肌肉中分離磷脂酶A2的 方法。本發(fā)明方法步驟是
1)取動物瘦肉組織剁碎后加入Tris-HCl緩沖液中勻漿，形成漿液；
2)在4°C的環(huán)境溫度下，將漿液離心，取上清液，然后在上清液中加入70%飽和度的硫 酸銨進(jìn)行鹽析，然后再在4°C的環(huán)境溫度下離心，將沉淀物用Tris-HCl緩沖液溶解，取得混 合溶液；
3)將混合溶液置于透析袋中，在Tris-HCl緩沖液中進(jìn)行去鹽透析，取得去鹽的透析
物；
4)將去鹽的透析物在4°C的環(huán)境溫度下離心去除變性蛋白，取得磷脂酶A2粗品；
5)用蛋白純化系統(tǒng)純化磷脂酶A2粗品，得磷脂酶A2純品；
其特征在于所述步驟5)中，蛋白純化系統(tǒng)為采用source 15QU5X5.5 cm的離子交 換柱，用PH為8. 0、濃度為50mmol/L、流速為0. lmL/min的Tris-HCl緩沖液平衡，待紫外吸 收和電導(dǎo)基線穩(wěn)定后，再用pH為8. 0、含lmol/LNaCl的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行線性洗脫，控 制NaCl的Tris-HCl緩沖液進(jìn)入離子交換柱的流速為1. 5mL/min,開始收集濾出液，當(dāng)濾出 液的NaCl濃度達(dá)到100%停止收集；將收集的濾出液進(jìn)行超濾濃縮，取得磷脂酶A2純品。本發(fā)明采用從動物肌肉或加工后廢棄的瘦肉中提取高分子量細(xì)胞漿質(zhì)型磷脂酶 A2純品，首先進(jìn)行粗酶提取，然后使用離子交換柱對磷脂酶A2進(jìn)行純化。本發(fā)明可以滿足 對高分子量細(xì)胞漿質(zhì)型磷脂酶A2純品的需要，同時對動物源磷脂(如蛋黃卵磷脂)的水解效率也比較高，從而彌補(bǔ)了目前常用磷脂酶A2產(chǎn)品的不足。因此本發(fā)明在醫(yī)藥、食品、生化等 領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。本發(fā)明采用離子交換法從動物肌肉中分離磷脂酶A2，其優(yōu)點(diǎn)在于
(1)能夠獲得高分子量細(xì)胞漿質(zhì)型磷脂酶A2純品，普通的磷脂酶A2分子量為12-18KD， 而本方法所得的磷脂酶A2分子量為201KD，可以滿足科研和生產(chǎn)中對該類磷脂酶A2的需要。(2)分離方法快速簡潔，蛋白純化只需經(jīng)過離子交換柱即可完成。(3)對蛋黃磷脂的水解效率高30. 5%。以蛋黃卵磷脂為底物，25°C，普通磷脂酶A2 的活力為97. 6 μ mol底物/h · g蛋白，而本方法所得的磷脂酶A2的活力為127. 37 μ mol底 物/h*g蛋白。


圖1為磷脂酶A2純化的離子色譜圖。圖2為本發(fā)明所得磷脂酶A2的活性電泳圖。圖3為本發(fā)明所得磷脂酶A2的酶解產(chǎn)物的薄層層析圖。圖4為本發(fā)明所得磷脂酶A2的酶解產(chǎn)物的氣相色譜圖。
具體實施例方式一、提取具體步驟
(1)取鴨股二頭肌，剔除可見的結(jié)締組織和脂肪組織后剁碎，稱取30g，在4°C環(huán)境 溫度下，加入IOOmL、pH值為8.0、濃度為0. lmol/L的Tris-HCl緩沖液，在攪拌速度為 12000rpm/min的條件下勻漿三次(每次20s)，形成漿液。(2)在4°C環(huán)境溫度下，將漿液離心20min，取上清液，用四層紗布過濾，然后加入 70%飽和度的硫酸銨進(jìn)行鹽析。在4°C環(huán)境溫度下，取鹽析后產(chǎn)品離心20min，取沉淀物用5mL、pH值為8. 0、濃度 為0. 1 mol/L的Tris-HCl緩沖液溶解，取得混合溶液。(3)將混合溶液置于MWCO=IOK Da的透析袋中，在4°C環(huán)境溫度下，以pH為8. 0、濃 度為0. 1 mol/L的TriS-HCl緩沖液進(jìn)行透析去鹽24h，取得去鹽的透析物。(4)在4°C環(huán)境溫度下，將去鹽的透析物離心lOmin，去除變性蛋白，取得磷脂酶A2粗品。(5)每次取磷脂酶A2粗品1. OmL用蛋白純化系統(tǒng)純化，具體操作如下
取source 15QU5X5. 5 cm的離子交換柱，先將1. OmL磷脂酶A2粗品加入離子交換柱，以流速為0. lmL/min通入pH值為8. 0、濃度為50mmol/L的Tris-HCl緩沖液平衡，待紫外吸 收和電導(dǎo)基線穩(wěn)定后，再用含lmol/L NaCl的Tris-HCl緩沖液(50mmol/L，pH8. 0)線性洗 脫，控制NaCl的Tris-HCl緩沖液進(jìn)入離子交換柱的流速為1. 5mL/min,開始收集濾出液，當(dāng) 濾出液的NaCl濃度達(dá)到100%時停止收集。將收集的濾出液進(jìn)行超濾濃縮(MWCO=IOK Da),即為磷脂酶A2純品。二、鑒定分析
1、將收集的樣品進(jìn)行離子色譜分析，如圖1所示，峰7獨(dú)立，可見所得洗脫產(chǎn)物為層析純。
2、將收集的樣品與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行電泳分析，如圖2所示，樣品的分子量約為201KD， 表明獲得的7號峰已達(dá)到電泳純。3、將收集的樣品進(jìn)行酶解產(chǎn)物的薄層層析分析，如圖3所示，證明獲得的7號峰為 磷脂酶A2活性蛋白。4、將收集的樣品進(jìn) 行酶解產(chǎn)物的氣相色譜圖分析，如圖4所示，證明獲得的7號峰 為磷脂酶A2活性蛋白。
權(quán)利要求
1. 一種從動物肌肉中分離磷脂酶A2的方法，包括以下步驟1)取動物瘦肉組織剁碎后加入Tris-HCl緩沖液中勻漿，形成漿液；2)在4°C的環(huán)境溫度下，將漿液離心，取上清液，然后在上清液中加入70%飽和度的硫 酸銨進(jìn)行鹽析，然后再在4°C的環(huán)境溫度下離心，將沉淀物用Tris-HCl緩沖液溶解，取得混 合溶液；3)將混合溶液置于透析袋中，在Tris-HCl緩沖液中進(jìn)行去鹽透析，取得去鹽的透析物；4)將去鹽的透析物在4°C的環(huán)境溫度下離心去除變性蛋白，取得磷脂酶A2粗品；5)用蛋白純化系統(tǒng)純化磷脂酶A2粗品，得磷脂酶A2純品；其特征在于所述步驟5)中，蛋白純化系統(tǒng)為采用source 15QU5X5.5 cm的離子交 換柱，用PH為8. 0、濃度為50mmol/L、流速為0. lmL/min的Tris-HCl緩沖液平衡，待紫外吸 收和電導(dǎo)基線穩(wěn)定后，再用pH為8. 0、含lmol/LNaCl的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行線性洗脫，控 制NaCl的Tris-HCl緩沖液進(jìn)入離子交換柱的流速為1. 5mL/min,開始收集濾出液，當(dāng)濾出 液的NaCl濃度達(dá)到100%停止收集；將收集的濾出液進(jìn)行超濾濃縮，取得磷脂酶A2純品。
全文摘要
一種從動物肌肉中分離磷脂酶A2的方法，屬于農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)領(lǐng)域。該方法從動物肌肉或加工后廢棄的瘦肉中提取高分子量細(xì)胞漿質(zhì)型磷脂酶A2純品，首先進(jìn)行粗酶提取，然后使用離子交換柱對磷脂酶A2進(jìn)行純化，獲得的磷脂酶A2分子量約為201KD。本發(fā)明具有純化方法快速簡潔和所得磷脂酶A2對動物源磷脂的水解效率高的特點(diǎn)，在醫(yī)藥、食品、生化等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N9/16GK102134564SQ20111000335
公開日2011年7月27日 申請日期2011年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月10日
發(fā)明者劉芳, 卞歡, 張露娟, 徐為民, 王道營, 諸永志 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院