專(zhuān)利名稱(chēng)：一種利用重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體涉及ー種利用重組大腸桿菌高效發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的方法。
背景技術(shù)：
谷胱甘肽(GSH)是ー種具有重要生理功能的由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸組成的三肽。谷胱甘肽廣泛分布于動(dòng)物、植物、微生物中，參與蛋白質(zhì)和核糖核酸的合成，氧及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸，維持內(nèi)源酶的活力，體內(nèi)三羧酸循環(huán)及糖代謝，清除體內(nèi)過(guò)多自由基等。 臨床上谷胱甘肽用于抗輻射、抗腫瘤、抗氧中毒、抗衰老和協(xié)調(diào)內(nèi)分泌的治療。此外谷胱甘肽也被用作食品添加剤，用來(lái)延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期和強(qiáng)化食品中的氨基酸成分。谷胱甘肽主要的生產(chǎn)方法有提取法、化學(xué)合成法、發(fā)酵法和酶法。其中發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽將菌體培養(yǎng)和谷胱甘肽合成在一個(gè)過(guò)程中完成，能有效解決谷胱甘肽合成時(shí)ATP 供應(yīng)的問(wèn)題，相關(guān)的報(bào)道和應(yīng)用較多，發(fā)酵水平也在逐漸提高，采用的菌株主要為酵母菌， 如釀酒酵母和假絲酵母，或基因工程菌，如大腸桿菌和畢赤酵母等。利用基因工程方法構(gòu)建GSH高產(chǎn)菌株的研究，主要是將來(lái)源于大腸桿菌或釀酒酵母的谷氨?；腚装彼岷铣擅?(GCS)和谷胱甘肽合成酶(GS)基因在宿主菌中過(guò)量表達(dá)，是提高發(fā)酵法生產(chǎn)水平的主要途徑。例如陳堅(jiān)等(Letters in Applied Microbiology (2006) 43: 211 - 214)在大腸桿菌中過(guò)量表達(dá)大腸桿菌中的GCS和GS，重組菌JM109 (pVB03)的GSH生產(chǎn)水平可以達(dá)到 34. 8 mg /gSI菌體；陳少欣等(Bioprocess Biosystem Engineering (2009) 32:729 — 735)在畢赤酵母中表達(dá)釀酒酵母中的GCS和GS，用重組菌畢赤酵母GS115 (pGAPZHGSH)進(jìn)行高密度發(fā)酵，菌體濃度達(dá)98. 15g (干重)/L，GSH的濃度達(dá)到4. 15 g/L，單位菌體生產(chǎn)水平為42 mg/g干菌體。許善峰等構(gòu)建了既包含谷胱甘肽合成酶，同時(shí)又表達(dá)半胱氨酸合成相關(guān)酶系的甲醇酵母。金大勇等進(jìn)ー步開(kāi)發(fā)了該菌株的發(fā)酵エ藝，發(fā)酵88小時(shí)GSH的濃度達(dá)到6. 58 g/L,菌體濃度大于3000D。以上生產(chǎn)方法的周期較長(zhǎng)，單位菌體的生產(chǎn)水平仍然偏低，需要進(jìn)ー步提高生產(chǎn)強(qiáng)度和單位菌體生產(chǎn)水平。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種反應(yīng)快、谷胱甘肽的產(chǎn)量和得率高的利用重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的方法。為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明公開(kāi)以下技術(shù)方案一種利用重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的方法，包括以下階段
(1)通過(guò)分批培養(yǎng)或補(bǔ)料分批培養(yǎng)大量獲得表達(dá)外源性雙功能谷胱甘肽合成酶的重組大腸桿菌細(xì)胞，所述雙功能谷胱甘肽合成酶指同時(shí)具有Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶活性的蛋白；
(2)過(guò)量表達(dá)階段(1)所述雙功能谷胱甘肽合成酶；(3)加入L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸三種前體氨基酸實(shí)現(xiàn)谷胱甘肽的高效發(fā)酵法生產(chǎn)。階段(1)中所述重組大腸桿菌為BL21/pEI^8a_gshF 或者 JM109/pTrc99a_gshF。階段(3)中三種前體氨基酸的加入方式為一次性加入、多次分批加入或緩慢流加。發(fā)酵過(guò)程中使用的發(fā)酵碳源為葡萄糖、乳糖、甘油和乙酸中的ー種或幾種。該重組大腸桿菌菌株可通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行高密度培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)雙功能谷胱甘肽合成酶的高表達(dá)，如斜面培養(yǎng)活化菌種、種子培養(yǎng)，采用各種培養(yǎng)基進(jìn)行高密度發(fā)酵，包括基本培養(yǎng)基或復(fù)合培養(yǎng)基。通過(guò)補(bǔ)料培養(yǎng)基或底物流加提高菌體密度，并對(duì)溫度、PH、溶氧等進(jìn)行控制。本發(fā)明的技術(shù)思路如下
(1)種子培養(yǎng)斜面種子(斜面培養(yǎng)基一蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10 g/L、瓊脂20 g/L)活化后接入種子培養(yǎng)基(蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化鈉10 g/L)，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。(2)發(fā)酵和產(chǎn)物合成種子培養(yǎng)液以2-10%的接種比例接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，開(kāi)始分批培養(yǎng)，發(fā)酵溫度28 37°C，攪拌轉(zhuǎn)速300 lOOOrpm，通氣量0. 5 2wm，pH6. 0 8. 0， DO 10%以上，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速及通氣量維持發(fā)酵液的溶氧水平不低于10%，在碳源消耗完后，向發(fā)酵培養(yǎng)基中流加補(bǔ)料培養(yǎng)基。菌體達(dá)到較高濃度后過(guò)量表達(dá)雙功能合成酶，當(dāng)其活性達(dá)到足夠高后，添加三種前體氨基酸，其濃度為10 60 mmol/L。繼續(xù)培養(yǎng)至單位體積谷胱甘肽不再増加。(3)谷胱甘肽分析發(fā)酵液加入10%的三氯乙酸，混合均勻，4°C放置一小時(shí)，離心取上清液，采用HPLC方法測(cè)定谷胱甘肽。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在干本發(fā)明利用表達(dá)外源雙功能谷胱甘肽合成酶的重組大腸桿菌菌株發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽，不僅具有高GSH合成能力，而且不受GSH反饋抑制，具有反應(yīng)快、谷胱甘肽的產(chǎn)量和得率高、細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間和生產(chǎn)周期短、單位菌體谷胱甘肽生產(chǎn)水平高的優(yōu)點(diǎn)。該重組大腸桿菌采用發(fā)酵法直接生產(chǎn)GSH的方法，避免了采用生物轉(zhuǎn)化法時(shí)需供應(yīng)ATP 的問(wèn)題，有利于降低谷胱甘肽的生產(chǎn)成本。


圖1為實(shí)施例1的PCR產(chǎn)物電泳圖。圖2為重組大腸桿菌JM109/pTrc99A_gshF的構(gòu)建。圖3為重組大腸桿菌BL21/pEI^8a_gshF的構(gòu)建。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說(shuō)明，實(shí)施例的作用僅是解釋而非限定本發(fā)明。實(shí)施例1 雙功能谷胱甘肽合成酶的基因克隆。以嗜熱鏈球菌Mi^ptococcus thermophilus基因組DNA為模板，利用引物 CGGCGAATTCACGATGACATTAAACCA 和 GGCAAGCTTTTAAGTTTGACCAGCCACT，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度為2. 31Λ左右的DNA片斷(基因序列號(hào)為⑶138096)。PCR產(chǎn)物電泳圖如圖1所示。實(shí)施例2 表達(dá)外源性雙功能谷胱甘肽合成酶的重組大腸桿菌的構(gòu)建。
將實(shí)施例1中PCR擴(kuò)增的gshF基因片斷和表達(dá)載體pTrc99A用限制性?xún)?nèi)切酶 EcoR I , Hind III于37°C酶切過(guò)夜，電泳回收目的條帶，兩片段在T4連接酶的作用下， 16°C連接反應(yīng)12小吋，得到pTrc99A-gshF質(zhì)粒。并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，獲得重組大腸桿菌 JM109/pTrc99A-gshF (圖 2)。將質(zhì)粒pTrc99A-gshF和質(zhì)粒pET28a用EcoR I和Hind III在37°C酶切過(guò)夜，電泳回收，連接酶切好的目的片斷gshF與載體片斷pEU8a，16°C過(guò)夜，得pET28a-gshF。將重組質(zhì)粒pET28a-gshF轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21，獲得重組大腸桿菌BL21/pEI^8a-gshF (圖3)。實(shí)施例3 自誘導(dǎo)培養(yǎng)基發(fā)酵。所用菌株為BL21/pEI^8a-gshF，由實(shí)施例2所述方法構(gòu)建。將過(guò)夜培養(yǎng)的種子培養(yǎng)液以5%的接種量接入到裝有3L復(fù)合培養(yǎng)基(蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、50 mM磷酸緩沖液PH 7. 6、氯化銨50 mM、硫酸鈉5 mM、硫酸鎂2 mM、0. 2 mL微量元素、甘油20 g/ L、葡萄糖0.6 g/L、α-乳糖2 g/L)的5L發(fā)酵罐中，發(fā)酵溫度為30°C，通過(guò)控制空氣流量和轉(zhuǎn)速，維持溶氧在20%以上。流加氨水控制pH 7.0。菌體OD為30吋，添加三種氨基酸， 繼續(xù)培養(yǎng)2小吋，谷胱甘肽含量為3. 20 g/L，單位菌體生產(chǎn)水平為MO mg/g干菌體，生產(chǎn)強(qiáng)度為 165 mg/L/h。實(shí)施例4 葡萄糖為碳源發(fā)酵。所用菌株同實(shí)施例3。將過(guò)夜培養(yǎng)的種子培養(yǎng)液以5%的接種量接入到裝有3L基本培養(yǎng)基(葡萄糖5 g，磷酸氫ニ鈉15.12 g，磷酸ニ氫鉀3 g，氯化銨2-5 g，硫酸鎂0.5 g， 氯化鈉0.5 g，氯化鈣0.011 g，0. 2mL微量元素，1%維生素Bl 0.2 mL)的5L發(fā)酵罐中，發(fā)酵溫度為37で。證開(kāi)始流加補(bǔ)料培養(yǎng)基(葡萄糖500 g/L，硫酸鎂25 g/L)，控制殘?zhí)腔緸榱?，通過(guò)控制空氣流量和轉(zhuǎn)速，維持溶氧在10%以上。流加氨水控制pH 7.0。發(fā)酵10 小吋，添加誘導(dǎo)物IPTG，濃度為1 mmol/L。菌體OD為45吋，添加三種氨基酸，繼續(xù)培養(yǎng)3 小吋，谷胱甘肽含量為3. 40 g/L，單位菌體生產(chǎn)水平為226 mg/g干菌體，生產(chǎn)強(qiáng)度為262 mg/L/hο實(shí)施例5 葡萄糖為碳源發(fā)酵。除分批階段添加蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L外，其他條件與實(shí)施例4相同。 谷胱甘肽含量為4. 50 g/L，單位菌體生產(chǎn)水平為218 mg/g干菌體，生產(chǎn)強(qiáng)度為285 mg/L/ h。實(shí)施例6 甘油為碳源發(fā)酵。除用甘油替代葡萄糖，其他條件與實(shí)施例4相同。谷胱甘肽含量為3. 00 g/L，単位菌體生產(chǎn)水平為236 mg/g干菌體，生產(chǎn)強(qiáng)度為182 mg/L/h。實(shí)施例7 葡萄糖和甘油為碳源發(fā)酵。除在流加階段用甘油替代葡萄糖，其他條件與實(shí)施例4相同。谷胱甘肽含量為 3.10 g/L，單位菌體生產(chǎn)水平為206 mg/g干菌體，生產(chǎn)強(qiáng)度為194 mg/L/h。實(shí)施例8 葡萄糖和甘油為碳源并以乳糖誘導(dǎo)。除在流加階段用甘油替代葡萄糖，添加誘導(dǎo)物用乳糖代替IPTG，濃度為5g/L，其他條件與實(shí)施例4相同。谷胱甘肽含量為3. 30 g/L，單位菌體生產(chǎn)水平為210 mg/g干菌體，生產(chǎn)強(qiáng)度為185 mg/L/h。實(shí)施例9 乙酸為碳源發(fā)酵。
除用乙酸替代葡萄糖，其他條件與實(shí)施例4相同。谷胱甘肽含量為3. 05 g/L，単位菌體生產(chǎn)水平為218 mg/g干菌體，生產(chǎn)強(qiáng)度為152 mg/L/h。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.ー種利用重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的方法，其特征在干，包括以下階段(1)通過(guò)分批培養(yǎng)或補(bǔ)料分批培養(yǎng)大量獲得表達(dá)外源性雙功能谷胱甘肽合成酶的重組大腸桿菌細(xì)胞，所述雙功能谷胱甘肽合成酶指同時(shí)具有Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶活性的蛋白；(2)過(guò)量表達(dá)階段(1)所述雙功能谷胱甘肽合成酶；(3)加入L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸三種前體氨基酸實(shí)現(xiàn)谷胱甘肽的高效發(fā)酵法生產(chǎn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ー種利用重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的方法，其特征在于，階段(1)中所述重組大腸桿菌為BL21/pEI^8a-gshF或者JM109/pTrc99a_gshF。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ー種利用重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的方法，其特征在于，階段(3)中三種前體氨基酸的加入方式為一次性加入、多次分批加入或緩慢流加。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ー種利用重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的方法，其特征在干，發(fā)酵過(guò)程中使用的發(fā)酵碳源為葡萄糖、乳糖、甘油和乙酸中的ー種或幾種。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種利用重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的方法，包括以下階段(1)通過(guò)分批培養(yǎng)或補(bǔ)料分批培養(yǎng)大量獲得表達(dá)外源性雙功能谷胱甘肽合成酶的重組大腸桿菌細(xì)胞，所述雙功能谷胱甘肽合成酶指同時(shí)具有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶活性的蛋白；(2)過(guò)量表達(dá)階段(1)所述雙功能谷胱甘肽合成酶；(3)加入L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸三種前體氨基酸實(shí)現(xiàn)谷胱甘肽的高效發(fā)酵法生產(chǎn)。本發(fā)明利用表達(dá)外源雙功能谷胱甘肽合成酶的重組大腸桿菌菌株發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽，不僅具有高GSH合成能力，而且不受GSH反饋抑制，具有反應(yīng)快、谷胱甘肽的產(chǎn)量和得率高、生產(chǎn)周期短的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12R1/19GK102586369SQ201110003488
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2011年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月10日
發(fā)明者葉勤, 張松, 李娓, 李志敏 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)