專利名稱：一株在高鹽環(huán)境中除去黃曲霉毒素B₁的嗜鹽四聯(lián)球菌的使用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株在高鹽環(huán)境中除去AFB1的嗜鹽四聯(lián)球菌，已經(jīng)于2010年4月 29日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏編號為CGMCC No. 3792，屬于微生物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
黃曲霉毒素是由黃曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)等產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，黃曲霉毒素尤其是黃曲霉毒素B1 (AFB1)具有較強(qiáng)的致癌作用，因此，各國在農(nóng)產(chǎn)品、各種食品等原料與產(chǎn)品中的含量均有嚴(yán)格的限制。自1960年發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素以來，世界各國科學(xué)家們均試圖尋求預(yù)防和除去黃曲霉毒素的有效途徑。目前除去黃曲霉毒素的方法主要有五類①堿處理方法。Mukendi報道了使用亞硫酸鈉、硫酸氫鈉、氫氧化鈉、氨等化學(xué)試劑對黃曲霉毒素去毒的研究，并分析了影響這些化合物去毒效果的各種因素。該類方法適合應(yīng)用于含水量較高的青綠、青貯飼料以及液態(tài)糧油，去毒效率高但不適合籽實、餅粕等固體飼料原料，而且處理后原料殘留有大量氨。由于該方法的設(shè)備投資大，成本高，已逐漸被淘汰。②氧化處理法。常用的氧化劑有次氯酸鈉、臭氧、過氧化氫、氯氣等。該方法具有較好的去毒效果，但是該方法的缺點在于處理效果不穩(wěn)定，飼料中維生素等營養(yǎng)成分損失嚴(yán)重，處理成本較高。③吸附劑吸附毒素。常用的吸附劑包括酵母細(xì)胞壁、硅鋁酸鹽、活性炭等。但吸附劑不能解除黃曲霉毒素的毒性， 它還可能同時吸附食品中的營養(yǎng)成分而降低營養(yǎng)物質(zhì)的利用率，而且被吸附的毒素有可能在動物胃腸道中重新釋放。④抗氧化劑處理。這類抗氧化劑包括2-叔丁基對甲酚(BHA)、 2，6-二叔丁基對甲酚(BHT)、異硫氰酸芐酯、2，2，4-三甲基-6-乙氧喹啉等。其機(jī)理是抗氧化劑能促進(jìn)大鼠體內(nèi)α-谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶-YC2亞基的表達(dá)，有效地抑制了 AFB1與機(jī)體 DNA的結(jié)合。但是抗氧化劑的去毒作用有限，不能完全消除黃曲霉毒素中毒癥，而且BHT等抗氧化劑濃度均超過常規(guī)使用量的30倍以上才顯示較好的去毒效果，這樣對動物具有一定毒害作用。⑤高溫處理法。破壞AFB1需要以上的溫度，該方法能耗高且對食品中的營養(yǎng)成分破壞大，實際應(yīng)用很少。朱新貴等在幾種食品微生物除去黃曲霉毒素作用的研究(食品科學(xué).2001,22 65 68)文中報道了乳酸菌、醋酸菌、面包酵母、釀酒酵母、米曲霉、枯草桿菌等對AFB1具有除去作用。在30°C，添加AFB1使其初始含量是10 μ g/ml，接種乳酸菌、醋酸菌和枯草芽孢桿菌的菌懸液，培養(yǎng)4 后，除去AFB1的作用明顯。乳酸菌和枯草桿菌的除去作用分別達(dá)到 82 %和86 %，培養(yǎng)60h后，其除去率分別達(dá)到88 %和89 %。但面包酵母和釀酒酵母的除去作用則不明顯。本發(fā)明的目的就是采用一株能在高鹽環(huán)境中生長繁殖，且具有除去AFB1能力的嗜鹽四聯(lián)球菌達(dá)到去除醬油、豆醬和豆瓣醬等生產(chǎn)過程中污染的AFB1的目的。本發(fā)明使用的嗜鹽四聯(lián)球菌(/feira^^ococctts A^oMiAz1S,保藏編號CGMCC No. 3792)，屬于益生菌類，安全可靠，含鹽濃度在6% -20%范圍生長繁殖良好，能有效除去被污染的醬油、豆醬等發(fā)酵醪中的AFB11
發(fā)明內(nèi)容
為了減少AFB1對人和動物的危害，減少真菌毒素對食品的污染，保證食品安全，本文通過對該菌株生物修復(fù)AFB1,應(yīng)用于生產(chǎn)實際中，AFB1的去除率達(dá)到41. 76%。本發(fā)明嗜鹽四聯(lián)球菌的形態(tài)學(xué)特征為在固體培養(yǎng)基上菌落表面光滑，濕潤，邊緣整齊，中央隆起，直徑約為1mm，乳白色。液體培養(yǎng)無菌膜，菌液渾濁且有少量沉淀，革蘭氏染色陰性，細(xì)胞呈球形，二個平面分裂形成四聯(lián)狀。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一株除去AFB1效果較好的嗜鹽四聯(lián)球菌及其在AFB1污染樣品上的應(yīng)用。本發(fā)明要求嗜鹽四聯(lián)球菌(7 halophilus)的菌齡處于為對數(shù)初期，菌體濃度在使用對象中的初始濃度為5. OX IO6 1. 5X IO7 cfu/g(ml)，以濕基計。本發(fā)明去除AFB1的具體方法為待處理的醬油醪、豆醬醅或豆瓣醬醅中接種菌齡是對數(shù)初期的嗜鹽四聯(lián)球菌(7 A^oMiAz1S)懸液，初始菌體濃度為5. OX IO6 1. 5X IO7 cfu/g(ml)，以濕基計，混勻后置于25°C 35°C，發(fā)酵10 30天。本發(fā)明具有如下優(yōu)點
本發(fā)明方法能夠在高鹽環(huán)境中有效除去AFB1，去除率達(dá)到41. 76% ；本發(fā)明使用嗜鹽四聯(lián)球菌系源于醬油醪，是東方傳統(tǒng)釀造調(diào)味品常用的微生物菌種，并經(jīng)Ames實驗等方法驗證是安全的；本發(fā)明方法是采用適合高鹽發(fā)酵調(diào)味品生產(chǎn)的耐鹽微生物菌株，去除生產(chǎn)過程中AFB1的污染，為其安全生產(chǎn)提供了一種可行、合理的方法。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施范例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例1在高鹽液態(tài)物料體系中除去AFB1
在含NaCl 6% 8%的MRS液體培養(yǎng)基中添加AFB1，使其濃度到達(dá)10ng/ml，接入處于對數(shù)初期的嗜鹽四聯(lián)球菌(7 halophilus)懸液，初始菌體濃度5. O XlO6CfuAil，未接種的樣品作對照，置于30 士 2°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72hr，取樣分析，本發(fā)明嗜鹽四聯(lián)球菌除去了樣品中 58. 05% 的 AFB115實施例2在高鹽半固態(tài)物料體系中除去AFB1
以產(chǎn)黃曲霉毒素的菌株4408 (中國科學(xué)院普通微生物研究所訂購)為出發(fā)菌株， 以蠶豆瓣為原料生產(chǎn)瓣曲，采用豆瓣醬生產(chǎn)工藝加入鹽水使其鹽分為13.5%，水分含量為 55. 0%。 將預(yù)先繁殖進(jìn)入對數(shù)初期的嗜鹽四聯(lián)球菌(7 halophihus)懸液接入瓣醅，初始菌體濃度為5. O X 106cfu/g (ml)，置于30 士 2°C培養(yǎng)箱中保溫培養(yǎng)30d，瓣醅中黃曲霉毒素B1 的除去率達(dá)35. 70%。實施例3采用本方法除去被污染樣品中的AFB1
以一定量的已污染了 AFB1的豆瓣醬為研究對象。將預(yù)先繁殖至對數(shù)初期的嗜鹽四聯(lián)球菌(7 halophihus)懸液接入污染的豆瓣醬，初始菌體濃度為5. OX 106cfU/g(ml)，模擬工廠生產(chǎn)環(huán)境，25°C 35°C下培養(yǎng)30d，AFB1的除去率達(dá)到41. 76%。
權(quán)利要求
1. 一株耐鹽性嗜鹽四聯(lián)球菌σ. A^oMiAzl5)應(yīng)用于傳統(tǒng)釀造調(diào)味品中黃曲霉毒素 B1 (AFB1)的去除，其內(nèi)容包括首先將活化的本發(fā)明菌株培養(yǎng)至菌齡為對數(shù)初期，然后分別接種于高鹽液態(tài)物料體系與半固體物料體系中，達(dá)到去除的AFB1目的，初始菌體濃度為 5. O X IO6 1.5Χ107 cfu/g (ml)，最后將本發(fā)明菌株應(yīng)用于實際生產(chǎn)中，論證該菌株實際應(yīng)用的可行性。
2.根據(jù)權(quán)利1要求本發(fā)明的液體培養(yǎng)基配方為嗜鹽四聯(lián)球菌液體培養(yǎng)基(MRS培養(yǎng)基)胰蛋白胨10. O g，牛肉膏10. O g，酵母提取物5. O g，葡萄糖20. O g，乙酸鈉5.0 g，檸檬酸二銨 2. 0 g,吐溫 80 1. 0 ml, K2HPO4 2. 0 g, MgSO4 · 7H20 0. 58 g, MnSO4 · H2O 0. 25 g, NaC160 80g,蒸餾水 1. 0 L, ρΗ6· 2 6. 4。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法獲得的嗜鹽四聯(lián)球菌(7A^oMiA^)，保藏編號為 CGMCC No. 3792。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的嗜鹽四聯(lián)球菌(7halophilus)的應(yīng)用，本發(fā)明可適用于各類傳統(tǒng)釀造產(chǎn)品中，如豆瓣、腐乳、豆豉等。
5.根據(jù)權(quán)利1要求，本發(fā)明所述的除去AFB1的方法，其特征在于用于除去AFB1的本發(fā)明菌株的菌齡為對數(shù)初期，接種到被AFB1污染的醬油醪、豆醬醅或豆瓣醬醅中的嗜鹽四聯(lián)球菌(7 A^oMiAz1S)，其初始菌體濃度分別為5. OX IO6 1.5Χ107 cfu/g (ml)，以濕基計，發(fā)酵培養(yǎng)溫度為25°C 35°C，培養(yǎng)時間為IOd 30d。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株嗜鹽四聯(lián)球菌(Tetragenococcushalophilus)，能夠在高鹽環(huán)境中有效除去黃曲霉毒素B1(AFB1)。首先將活化的本發(fā)明菌株于MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至菌齡為對數(shù)初期，然后分別應(yīng)用于已添加AFB1毒素純品的高鹽液態(tài)物料體系和已污染AFB1的高鹽半固體物料體系中，達(dá)到去除AFB1的目的；最后將本發(fā)明菌株應(yīng)用到已污染AFB1的某豆瓣醬中，模擬工廠生產(chǎn)環(huán)境，本發(fā)明菌株對AFB1的除去率達(dá)到41.76%。該發(fā)明可應(yīng)用于傳統(tǒng)釀造行業(yè)，尤其是應(yīng)用到具有高鹽環(huán)境的調(diào)味品行業(yè)，具有良好的經(jīng)濟(jì)效益和實際應(yīng)用價值。
文檔編號A23L1/015GK102239976SQ201110004940
公開日2011年11月16日 申請日期2011年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月12日
發(fā)明者劉超蘭, 周榮清, 李從虎, 黃鈞 申請人:四川大學(xué)