專利名稱：用于抑制流行性乙型腦炎病毒的siRNA的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及能誘導RNA干擾的小干擾RNA(SiRNA)，特別是涉及能夠抑制流行性乙型腦炎病毒的siRNA，及其設計方法和用途。
背景技術：
流行性乙型腦炎病毒簡稱乙腦病毒，是經(jīng)蚊蟲傳播的人畜共患急性傳染病，是在全球范圍內(nèi)引起人腦炎的最嚴重的病因之一。1871年，日本首次報道了該病的流行，1935 年日本學者從病死的腦炎病人的腦組織中分離到該病毒，所以國際上將該病原體命名為日本腦炎病毒(Japanese encephalitisvirus, JEV)。據(jù)WHO統(tǒng)計，全球每年平均發(fā)病50000 例，死亡15000例。大約三分之一的患者會因此而死亡，存活的患者中有神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的患者占40% -70%,該病主要流行于亞洲、東南亞地區(qū)約20多個國家。20世紀90年代以來， 乙腦的流行區(qū)域不斷擴大，1995年巴布亞新幾內(nèi)亞及澳大利亞北部島嶼出現(xiàn)乙腦的爆發(fā)流行，1998年在澳大利亞本土出現(xiàn)乙腦病例。2005年乙腦在印度和尼泊爾爆發(fā)流行，數(shù)千人患病。我國地域廣闊，占亞洲四分之一區(qū)域，中國的乙腦發(fā)病數(shù)占全世界總發(fā)病數(shù)的80%以上，是乙腦流行大國。根據(jù)《中華人民共和國傳染病防治法》，流行性乙型腦炎屬于乙類傳染病。自1938年通過血清學實驗證實乙腦在中國流行并于1940年在北京分離到第一株乙腦病毒后，乙腦多次在我國境內(nèi)爆發(fā)。近十年來，雖然乙腦的發(fā)病數(shù)呈逐年降低的趨勢，亦未發(fā)生大流行，但每年仍有2萬-3萬的病例數(shù)。乙型腦炎同時也是一種人畜共患的自然疫源性傳染病，在動物中豬為本病的主要危害對象。據(jù)報道豬群的發(fā)病率一般為20-30%，初產(chǎn)母豬的死胎和木乃伊比例可達50% 左右。因此該病感染豬造成的主要經(jīng)濟損失是懷孕母豬發(fā)生繁殖障礙，嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展。針對乙型腦炎尚無特殊治療措施，接種疫苗依然是保護易感人群的最有效預防措施。雖然接種疫苗能有效地保護未感染人群，但對于已感染的乙腦病患者，缺乏有力的治療手段，所以，應用現(xiàn)代科技手段發(fā)展方便有效的抑制乙腦病毒感染的治療方法法就顯得尤為重要。乙腦病毒在分類上屬于黃病毒科，黃病毒屬，其基因組為單股正鏈RNA分子， 長約111Λ，分子量約為4X IO6道爾頓，沉降系數(shù)為42s。整個基因組由5’端非翻譯區(qū) (5’ -untranslated regions, UTR)，一個幾乎跨越整個基因組的單一開放閱讀框(open reading frame, 0RF)和3，端非翻譯區(qū)(3，-UTR)所構成。5，端95個核苷酸和3，端586 個核苷酸為非編碼區(qū)，從5’末端至3’末端編碼的基因順序為三個結構蛋白，包括衣殼蛋白C(Capsid)，膜蛋白M(membrane，PrM為前體)和囊膜蛋白E (envelope)，七個非結構蛋白 NSl，NS2A, NS2B，NS3，NS4A，NS4B和NS5，共編碼約；3430個氨基酸，其基因組結構見圖1。根據(jù)乙腦病毒基因組的核苷酸序列差異性，可將已鑒定的乙腦病毒毒株分為四個確定的基因型以及另外一個推測的基因型。基因1型和基因3型主要分布于中國、韓國、印度、泰國、菲律賓等大多數(shù)亞洲國家，為主要的流行基因型?；?型和基因4型主要分布于馬來西亞、印度尼西亞和北澳大利亞等國家，為地方性的基因型。RNA干擾(RNA interfering, RNAi)技術是近年來新發(fā)展起來的一種高效的、特異性強的基因阻斷技術，是一種由雙鏈RNA (dsRNA)或微RNA(microRNA，mi RNA)介導的、轉錄后mRNA水平關閉相應基因表達的序列特異性基因沉默機制。它也是體內(nèi)基因組抵御外在感染和內(nèi)部轉座的一種保護機制，廣泛存在于各種生物，如植物、真菌、昆蟲、后生動物和哺乳動物，包括人類。對外源dsRNAs來說，當dsRNAs被導入體內(nèi)后，dsRNA被Dicer切割成 21-25nt 的小干擾 RNAs (small interfering RNAs, siRNAs)。這些 siRNAs 結合 RNA 依賴性沉默復合體(RISC)后特異性降解序列上同源的靶標mRNAs。對于內(nèi)源性miRNAs來說，RNA 的源轉錄本(primary RNAtranscripts，pri-miRNAs)在細胞核內(nèi)被Drosha切割成60_70nt 的miRNA前體(miRNA precursors, pre-miRNAs)后被Exportin-5轉運至細胞質(zhì)中，在細胞質(zhì)中，pre-miRNAs被Dicer切割成成熟的miRNAs。成熟的miRNAs行使切割靶標mRNA或者抑制翻譯的作用。大多數(shù)的pri-miRNA轉錄本都以成簇的形式排列在RNA聚合酶II啟動子下，以多順反子的形式表達多個不同的miRNAs。在哺乳動物細胞中，外源導入化學合成的 21-29nt 的 siRNAs 或者短發(fā)卡 RNA (short hairpin RNA, shRNA)表達載體均能誘導 RNAi。 它的作用在基因功能研究領域和各種疾病的治療領域尤其是病毒性疾病的治療領域已顯現(xiàn)出不可估量的價值。通過RNAi技術，選擇不同的靶位點應用SiRNA抑制病毒復制與侵染已在多種病毒中公開。針對乙腦病毒，以往的研究已有報道能有效抑制乙腦病毒復制的siRNAs或者 shRNAs。但這些報道的siRNAs或者shRNAs均只針對基因3型中的某一株乙腦病毒，這一特性使其效果受到極大的限制，因為，由于乙腦病毒基因組RNA序列的多變性，針對基因三型中某一株病毒有效的siRNA很難保證在基因3型中的其它株中有效，即使能在基因3型中適用，也很難保證其能在其他三種基因型中適用。另外，長期處于RNAi抑制下的病毒會在其靶序列的位置出現(xiàn)逃逸突變，單個或兩個siRNAs很容易會由于逃逸突變的產(chǎn)生而失去效果。所以，最有效的抑制病毒復制的手段是針對乙腦病毒保守區(qū)靶序列的多條siRNAs 的聯(lián)合用藥。而這一方案在以往針對乙腦病毒的siRNAs的設計中并未涉及到。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明應用RNAi技術，通過針對乙腦病毒基因組保守區(qū)的siRNA進行乙腦病毒的抑制研究，并驗證了多個siRNA同時應用的有效性。具體地，本發(fā)明包括以下幾個方面本發(fā)明的一個方面涉及誘導RNA干擾的分子，其包括正義鏈和反義鏈，其特征在于所述正義鏈或反義鏈選自以下(1)-(5)的序列(I)SEQ ID NO :1 SEQ ID NO :9 以及 SEQ ID N0:33 SEQ IDNO :50 所示任一序列；(2)與 SEQ ID NO 1 SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :33 SEQ IDNO 50 中任一序列的同一性至少為70%的序列；(3)經(jīng)過改造的選自(1)或(2)中的序列，其是在所述序列的5’方向和3’方向、 5’方向或3’方向上添加有至多60個核苷酸的序列；(4)將選自(1)-(3)的序列按照5’ -3’方向可操作地串聯(lián)得到的序列，其中可操作地串聯(lián)的序列為1種，其拷貝數(shù)為2個或者2個以上；和
(5)將選自(1)-(3)的序列按照5’ -3’方向可操作地串聯(lián)得到的序列，其中可操作地串聯(lián)的序列為2種以上，每1種的拷貝數(shù)至少為1。其中(2)的同一性優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少84%，更優(yōu)選至少89%，更優(yōu)選至少 94%。其中( 中添加的核苷酸個數(shù)為至多50個，優(yōu)選至多40個，更優(yōu)選至多30個，更優(yōu)選至多20個，最優(yōu)選至多10個。其中(4)所述的序列為將3個、6個或9個拷貝的SEQ ID NO :2、SEQID NO 34或 SEQ ID NO 43的序列可操作地串聯(lián)得到的序列，例如為SEQID NO 51 SEQ ID NO 53所示序列；其中(5)所述的序列為將SEQ ID NO :1 4、SEQ ID NO 5 9、SEQ ID NO :1 9、SEQ ID NO 33 36、SEQ IDNO 37 41、SEQ ID NO 33 41、SEQ ID NO 42 45、SEQ ID NO 46 50或SEQ ID NO 42 50的序列可操作地串聯(lián)得到的序列，例如為SEQ IDNO 54 SEQ ID NO 56所示序列。本發(fā)明的另一方面涉及一種重組載體，其可操作地連接有本發(fā)明所述的誘導RNA 干擾的分子。本發(fā)明的還一方面涉及一種組合物，其含有本發(fā)明所述的誘導RNA干擾的分子或者重組載體，以及藥學上可接受的載體。本發(fā)明的還一方面涉及獲得抑制流行性乙型腦炎病毒的誘導RNA干擾的分子的方法，其包括(1)根據(jù)流行性乙型腦炎病毒的全基因組序列，選取在基因1型、2型、3型和4型分離株中的保守序列，作為潛在的靶序列；(2)將(1)中的潛在的靶序列與人類基因組數(shù)據(jù)庫進行比對，排除和人類基因組中其它編碼序列或表達序列標簽同源的序列，將剩余的序列作為靶序列；和(3)根據(jù)步驟(2)獲得的靶序列合成誘導RNA干擾的分子。其中所述的保守序列是指在基因1型、2型、3型和4型分離株的全基因組序列中 80%以上保守的序列，并且在基因1型和3型分離株的全基因組序列中90%以上保守的序列。在本發(fā)明的一個實施方案中，為在基因1型和3型分離株的全基因組序列中95%以上保守的序列。其中，步驟(3)中所述的靶序列選自兩種或兩種以上流行性乙型腦炎病毒蛋白的轉錄子序列。在本發(fā)明的實施方案中，其中所述兩種或兩種以上流行性乙型腦炎病毒蛋白的轉錄子序列選自(1)膜蛋白M和NSl蛋白；(2)賂2八、賂28、賂3、賂4六和賂48蛋白；或(3)膜蛋白M、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A和NS4B蛋白。本發(fā)明的還一方面涉及本發(fā)明所述的誘導RNA干擾的分子或者重組載體在制備用于抑制流行性乙型腦炎病毒基因表達的組合物中的用途。本發(fā)明的還一方面涉及本發(fā)明所述的誘導RNA干擾的分子或者重組載體在制備用于治療和/或預防流行性乙型腦炎的藥物中的用途。本發(fā)明的還一方面涉及本發(fā)明所述的誘導RNA干擾的分子在制備用于抑制流行性乙型腦炎病毒的SiRNA中的用途。本發(fā)明的還一方面涉及抑制流行性乙型腦炎病毒的SiRNA所針對的靶序列，所述靶序列用cDNA表示為以下序列中的至少一種(1) SEQ ID NO :1 SEQ ID NO 9 以及 SEQ ID NO 33 SEQ IDNO 50 所示任一序列；(2)與 SEQ ID NO :1 SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :33 SEQ IDNO 50 中任一序列的同一性至少為70 %的序列；優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少84 %，更優(yōu)選至少89 %，更優(yōu)選至少 94%。本發(fā)明的還一方面涉及SiRNA分子，其含有與本發(fā)明所述的靶序列對應或互補的 RNA序列。所述對應是指將用cDNA表示的靶序列中的T替換為U ；所述互補是指按照本領域公知的A-U、G-C、C-G、T-A原則與靶序列進行互補，得到RNA序列。在本發(fā)明中，誘導RNA干擾的分子在細胞或機體內(nèi)被轉換為實施抑制基因表達的效應siRNA分子。siRNA分子包括正義鏈和反義鏈，適用于本發(fā)明的siRNA分子可以通過本領域常用的方法制備?？梢栽隗w外制備siRNA，然后將其直接導入細胞中(例如通過轉染)。更具體地，例如可以通過化學合成、體外轉錄或由siRNA表達質(zhì)?；虿《据d體在細胞中表達，來制備本發(fā)明的的siRNA分子。在本發(fā)明的實施方案中，將SEQ ID NO 11 SEQ ID NO 28所示序列分別連接入 siRNA表達載體中，將載體導入細胞以表達siRNA分子，干擾乙腦病毒基因的表達。本發(fā)明的實施方案中，將siRNA表達載體導入細胞后，siRNA以類似于內(nèi)源性 miRNA的方式來表達，即RNA的源轉錄本在RNA聚合酶II的作用下轉錄后，在細胞核內(nèi)被 Drosha切割成60_70nt的前體后被Exportin-5轉運至細胞質(zhì)中，在細胞質(zhì)中，siRNA前體被Dicer切割成成熟的siRNA分子，成熟的siRNA分子行使切割靶標mRNA的作用。在本發(fā)明的實施方案中，根據(jù)抑制效果，挑選出抑制效果最好的、針對一種靶序列的siRNA分子，例如NS1-447，采用多拷貝，例如3個、6個、9個拷貝進行串聯(lián)，以進一步增強抑制效果。在本發(fā)明的實施方案中，將針對不同基因的、部分或全部靶序列的siRNA分子進行串聯(lián)，例如本發(fā)明中的siRNAX4，siRNAX5或siRNAX9，并在細胞中表達，實驗證明，其具有更好的抑制基因表達的效果?？梢圆捎脤⒁陨蟽煞N方法聯(lián)合應用的方式，針對多個基因、同時采用多拷貝，以增強抑制效果。在本發(fā)明中，術語“可操作地連接”是指將核酸與另外的核酸序列置于在功能上具有關系的狀態(tài)。這可以是相互連接的基因和控制序列以這樣的方式連接，使得當適當?shù)姆肿颖唤Y合到控制序列時，該基因的表達變得可行。例如，如果啟動子控制編碼序列的轉錄， 那么該啟動子將可操作性地與該序列結合。通常，術語“可操作地連接”是指被連接的DNA 序列是相鄰的，并且在分泌性前導序列的情況中，是相鄰的且在閱讀框內(nèi)。所述序列的連接是通過在適當?shù)南拗泼肝稽c上進行連接來實施的。如果所述位點不存在，可以使用根據(jù)常規(guī)方法合成的寡聚核苷酸銜接子或接頭。
在本發(fā)明中，小干擾RNA (siRNA)指包括約10_60個核苷酸(或核苷酸類似物)，能夠指引或介導RNA干擾的RNA (或RNA類似物)。siRNA包括雙鏈siRNA和單鏈siRNA，在本發(fā)明中一般是指雙鏈siRNA，包括正義鏈和反義鏈。在本發(fā)明中，靶序列除包括SEQ ID NO :1 SEQ ID NO :9所示序列以外，還包括與此序列不同的其它乙腦病毒株的全基因組序列中與SEQ IDNO :1 SEQ ID NO 9所示序列相對應的序列。在本發(fā)明中，所述同一性是指在比較的兩條序列的對應窗口中相同核苷酸所占的比例，所述窗口的大小是指15個以上核苷酸組成的窗口，優(yōu)選至少17，更優(yōu)選至少約18或 19至21-23或24- 個核苷酸的窗口，所述同一性至少70%，是指在對應窗口中至少70% 的核苷酸相同，優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少84%，更優(yōu)選至少89 %，更優(yōu)選至少94 %，例如 95%，96%，97%，98%，99%或100%。其中不同的核苷酸優(yōu)選位于序列的5'和/或3' 端，例如位于距5'和/或3'端1-4個核苷酸序列內(nèi)。在本發(fā)明中，所述抑制流行性乙型腦炎病毒基因表達，是指蛋白，DNAJP /或RNA 水平可觀察到的降低或消失，例如減少至少約50 %，60 %，70 %，80 %，90 %，95 %，99 %或更多的表達。抑制的結果可通過檢測細胞或機體的表型或生化技術而證實，所述生化技術例如為Northern雜交，基因芯片，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)，Western Blot，熒光激活細胞分選(FACS)或放射免疫試驗(RIA)等。發(fā)明的有益效果在本發(fā)明中，應用RNAi技術，通過針對乙腦病毒基因組保守區(qū)的siRNA進行乙腦病毒的抑制研究，為抑制各種不同基因型乙腦病毒復制引起的感染提供了新的途徑，也為乙腦的預防與治療提供了新的思路。有效的siRNA靶位點不僅可以作為新的化學藥物靶位點，而且siRNA可以直接作為強有效的藥物用于乙腦的預防與治療，特異性強，不易引起副反應，給藥方便、快捷。多條siRNAs的聯(lián)合用藥不僅進一步增加了其廣譜的抗乙腦病毒的效果，而且對于預防病毒的逃逸突變提供了保證。本發(fā)明目前研制和開發(fā)治療乙腦的siRNA 藥物不但具有實際可操作性而且擁有良好的應用前景。


圖 IsiRNAs 表達載體 pcDNA 6. 2-Gff/EmGFP-miR 示意2螢火蟲熒光素酶siRNAs報告質(zhì)粒載體示意3siRNAs表達載體對靶序列表達的抑制效果圖，其中NC對照為轉染無關siRNA 及熒光素酶表達載體的細胞，mock為轉染熒光素酶表達載體未轉染siRNAs表達載體的細胞，其它為轉染能表達針對PrM，NSl, NS2A, NS2B, NS3, NS4A和NS4B基因不同靶位點特異 siRNA及熒光素酶表達載體的細胞?？v坐標表示以轉錄活性內(nèi)對照的海腎熒光素酶為標準化的螢火蟲熒光素酶活性。圖4siRNAs表達框架的串聯(lián)示意5流式細胞儀檢測siRNA轉染陽性的細胞百分比，其中左圖為未轉染siRNA的細胞，右圖為轉染了 siRNA表達載體NS1-447的細胞。圖6瞬時轉染特異siRNAs表達載體對乙腦病毒SA14_14_2株基因組RNA抑制情況。其中NC為轉染陰性對照siRNA表達載體，Mock為未轉染siRNAs的對照。圖中的每一
8個數(shù)據(jù)表示三個重復實驗的平均值。圖7siRNA表達載體對病毒囊膜蛋白E蛋白表達的抑制情況圖。其中，泳道1_13 依次表示 BHK-21 細胞在轉染 PrM-54，NS1-447，NS1-630，NS1-1207，NS2A-461，NS2B-123， NS3-1112，NS4A-289，NS4B-115，siRNAs X 4，siRNAs X 5，siRNAs X 9 和 NC 對照后感染乙腦病毒SA 14-14-2囊膜蛋白E蛋白的表達情況；泳道14表示未轉染質(zhì)粒的BHK-21細胞中囊膜蛋白E蛋白的表達情況；泳道15為未轉染質(zhì)粒未感染乙腦病毒的BHK-21細胞對照。Actin 作為內(nèi)對照。圖 8 感染后 24 小時穩(wěn)定表達 NS1-447、(NS1-447) X6、siRNAsX9 禾Π NC 的 ΒΗΚ-21 細胞對乙腦病毒SA14-14-2株基因組RNA的抑制情況比較。其中，Mock為普通ΒΗΚ-21感染病毒的對照。圖中的每一個數(shù)據(jù)表示三個重復實驗的平均值。圖9穩(wěn)定表達細胞系對病毒囊膜蛋白E蛋白的抑制情況。其中，泳道1-4分別依次代表穩(wěn)定表達siRNAsX9、(NS1-447) X6、NS1_447和NC對照的細胞系對病毒囊膜蛋白E 蛋白的抑制情況，泳道5為普通BHK-21感染病毒的對照，泳道6為普通BHK-21細胞未感染病毒的對照。Actin為內(nèi)對照。圖 10 感染后 48 小時穩(wěn)定表達NS1-447、(NS1-447) X6、siRNAsX9 和 NC 的 BHK-21 細胞對乙腦病毒SA14-14-2株擴增滴度的抑制情況比較。Mock為普通BHK-21感染病毒的對照。圖中的每一個數(shù)據(jù)表示三個重復實驗的平均值。圖 11 感染后 96 小時穩(wěn)定表達NS1-447、(NS1-447) X6、siRNAsX9 和 NC 的 BHK-21 細胞的存活情況對比。Mock為普通BHK-21感染病毒的對照。Cell control為未感染病毒的BHK-21細胞。圖中的每一個數(shù)據(jù)表示三個重復實驗的平均值。圖12穩(wěn)定表達細胞系對病毒SA14、SH53以及SHlOl囊膜蛋白E蛋白的抑制情況。 圖中，泳道1-3分別依次代表穩(wěn)定表達siRNAsX9、(NS1-447) X6和NC對照的細胞系對病毒囊膜蛋白E蛋白的抑制情況，泳道4為普通BHK-21感染病毒的對照，泳道5為普通BHK-21 細胞未感染病毒的對照。Actin為內(nèi)對照。圖13感染后48小時穩(wěn)定表達siRNAsX9、(NS1-447) X6禾Π NC的ΒΗΚ-21細胞對乙腦病毒SA14、SH53以及SHlOl滴度的抑制情況。Mock為普通ΒΗΚ-21感染病毒的對照。 圖中的每一個數(shù)據(jù)表示三個重復實驗的平均值。圖14穩(wěn)定表達細胞系在SA14、SH53或者SHlOl病毒感染96小時候存活率檢測。 感染后96小時穩(wěn)定表達siRNAsX9、(NS1-447) X6和NC的BHK-21細胞的存活情況對比。 Mock為普通BHK-21感染病毒的對照。Cell control為未感染病毒的BHK-21細胞。圖中的每一個數(shù)據(jù)表示三個重復實驗的平均值。
具體實施例方式下面將結合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實施例IsiRNA靶位點的選擇分析GenBank中收錄的所有乙腦病毒的全基因組序列共計64條，其中包括34條中國分離株。使用SeqMan軟件做同源性比對，選取在80%以上全球分離株、95%以上中國分離株中保守的序列作為靶序列設計siRNAs。靶序列設計使用INVITR0GEN根據(jù)其siRNAs 表達載體提供的相應在線設計軟件進行設計(http://rnaidesiRner. invitroRen. com/rnai express/ set Option, do ？ designQption = mirna&pid = 509133211138749536)。設計完成后使用 BLAST (www, ncbi. nlnuiiik^i)，將潛在的靶序列與人類基因組數(shù)據(jù)庫進行比對，排除那些和其他編碼序列或EST同源的序列。同時設計一組陰性對照siRNAs (negative control,NC)。表1為針對乙腦病毒ft"M，NSl, NS2A, NS2B, NS3, NS4A和NS4B基因編碼區(qū)的siRNAs的靴序列。表1針對乙腦病毒基因編碼區(qū)的siRNAs的靶序列
權利要求
1.誘導RNA干擾的分子，其包括正義鏈和反義鏈，其特征在于所述正義鏈或反義鏈選自以下(1)-(5)的序列(1)SEQID NO :1 SEQ ID NO 9 以及 SEQ ID NO 33 SEQ IDNO 50 所示任一序列；(2)與SEQ ID NO :1 SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :33 SEQ IDNO 50 中任一序列的同一性至少為70%的序列；(3)經(jīng)過改造的選自⑴或(2)中的序列，其是在所述序列的5’方向和3’方向、5’方向或3’方向上添加有至多60個核苷酸的序列；(4)將選自(1)-(3)的序列按照5’-3’方向可操作地串聯(lián)得到的序列，其中可操作地串聯(lián)的序列為1種，其拷貝數(shù)為2個或者2個以上；和(5)將選自(1)-(3)的序列按照5’-3’方向可操作地串聯(lián)得到的序列，其中可操作地串聯(lián)的序列為2種以上，每1種的拷貝數(shù)至少為1。
2.權利要求1的誘導RNA干擾的分子，其中(2)的同一性優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少 84 %，更優(yōu)選至少89 %，更優(yōu)選至少94 %。
3.權利要求1的誘導RNA干擾的分子，其中( 中添加的核苷酸個數(shù)為至多50個，優(yōu)選至多40個，更優(yōu)選至多30個，更優(yōu)選至多20個，最優(yōu)選至多10個。
4.權利要求1的誘導RNA干擾的分子，其中(4)所述的序列為將3個、6個或9個拷貝的SEQ ID NO 2,SEQ ID NO 34或SEQ ID NO :43的序列可操作地串聯(lián)得到的序列，例如為 SEQ ID N0:51 SEQ ID NO :53所示序列；其中(5)所述的序列為將SEQ ID N0:1 4、 SEQ ID NO 5 9、SEQ ID NO :1 9、SEQ ID NO 33 36、SEQ ID NO 37 41、SEQ ID NO 33 41、SEQ ID NO :42 45、SEQ ID NO :46 50 或 SEQ ID NO 42 50 的序列可操作地串聯(lián)得到的序列，例如為SEQ ID N0:54 SEQ ID N0:56所示序列。
5.重組載體，其可操作地連接有權利要求1-4任一項所述的誘導RNA干擾的分子。
6 組合物，其含有權利要求1-4任一項所述的誘導RNA干擾的分子或者權利要求5的重組載體，以及藥學上可接受的載體。
7.獲得抑制流行性乙型腦炎病毒的誘導RNA干擾的分子的方法，其包括(1)根據(jù)流行性乙型腦炎病毒的全基因組序列，選取在基因1型、2型、3型和4型分離株中的保守序列，作為潛在的靶序列；(2)將(1)中的潛在的靶序列與人類基因組數(shù)據(jù)庫進行比對，排除和人類基因組中其它編碼序列或表達序列標簽同源的序列，將剩余的序列作為靶序列；和(3)根據(jù)步驟(2)獲得的靶序列合成誘導RNA干擾的分子。
8.權利要求7的方法，其中所述的保守序列是指在基因1型、2型、3型和4型分離株的全基因組序列中80%以上保守的序列，并且在基因1型和3型分離株的全基因組序列中 90%以上保守的序列，優(yōu)選為在基因1型和3型中95%以上保守的序列。
9.權利要求7的方法，其中，步驟C3)中所述的靶序列選自兩種或兩種以上流行性乙型腦炎病毒蛋白的轉錄子序列。
10.權利要求9的方法，其中所述兩種或兩種以上流行性乙型腦炎病毒蛋白的轉錄子序列選自(1)膜蛋白M和NSl蛋白；(2)NS2A、NS2B、NS3、NS4A禾口 NS4B 蛋白；或(3)膜蛋白 M、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A 和 NS4B 蛋白。
11.權利要求1-4任一項所述的誘導RNA干擾的分子或者權利要求5的重組載體在制備用于抑制流行性乙型腦炎病毒基因表達的組合物中的用途。
12.權利要求1-4任一項所述的誘導RNA干擾的分子或者權利要求5的重組載體在制備用于治療和/或預防流行性乙型腦炎的藥物中的用途。
13.權利要求1-4任一項所述的誘導RNA干擾的分子在制備用于抑制流行性乙型腦炎病毒的siRNA中的用途。
14.抑制流行性乙型腦炎病毒的siRNA所針對的靶序列，所述靶序列用cDNA表示為以下序列中的至少一種(1)SEQID NO :1 SEQ ID NO 9 以及 SEQ ID NO 33 SEQ IDNO 50 所示任一序列；(2)與SEQ ID NO :1 SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :33 SEQ IDNO 50 中任一序列的同一性至少為70%的序列；優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少84%，更優(yōu)選至少89%，更優(yōu)選至少 94%。
15.siRNA分子，其含有與權利要求14所述的靶序列對應或互補的RNA序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于抑制流行性乙型腦炎病毒的siRNA，及其設計方法和用途。具體地，本發(fā)明根據(jù)流行性乙型腦炎病毒的全基因組序列，選取在基因1型、2型、3型和4型分離株中的保守序列作為靶序列。根據(jù)靶序列設計的siRNA分子在導入細胞后，能夠有效抑制乙腦病毒基因的表達；當不同的siRNA分子串聯(lián)后導入細胞，能獲得更好的抑制效果。本發(fā)明還涉及所述的siRNA分子用于抑制流行性乙型腦炎病毒基因表達的用途以及用于制備治療和/或預防流行性乙型腦炎的藥物的用途。本發(fā)明為抑制各種不同基因型乙腦病毒引起的感染提供了新的途徑。
文檔編號C12N15/11GK102154290SQ20111000510
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月12日 優(yōu)先權日2011年1月12日
發(fā)明者吳志強, 金奇 申請人:中國醫(yī)學科學院病原生物學研究所