專利名稱：具高腸毒殺蟲(chóng)活性的轉(zhuǎn)基因生防真菌及其構(gòu)建法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域的DNA重組技術(shù)和應(yīng)用，具體涉及一種利用轉(zhuǎn)基因工程技術(shù)大幅增強(qiáng)生防真菌腸毒殺蟲(chóng)活性的方法。
背景技術(shù)：
絲孢類昆蟲(chóng)病原真菌是重要的害蟲(chóng)生防真菌，一般通過(guò)體壁接觸感染致死各類害蟲(chóng)，但通常不具有經(jīng)口器攝入侵染的腸毒殺蟲(chóng)活性。真菌侵染過(guò)程包括分生孢子在昆蟲(chóng)體壁上的附著、萌發(fā)及體壁穿透，然后進(jìn)入寄主血腔并在其中快速繁殖，終因耗盡寄主營(yíng)養(yǎng)而導(dǎo)致寄主死亡。獨(dú)特的侵染方式使絲孢類生防真菌成為防治刺吸式口器害蟲(chóng)的首選生防因子。絲孢類生防真菌的成員很多，如白僵菌^^i/^ria、綠僵菌Metarhizium、棒束孢屬 Isaria (=擬青霄 PaeciJrOfflj^e1S)禾口賭階菌屬腫(=輪枝菌屬 Verticilliimi) 等昆蟲(chóng)病原真菌的菌種菌株，是支撐無(wú)公害農(nóng)業(yè)的害蟲(chóng)防治新技術(shù)及產(chǎn)品來(lái)源。目前全世界注冊(cè)登記的絲孢類真菌殺蟲(chóng)劑近200種，其主要活性成份大都是極易低成本生產(chǎn)的分生孢子，用于多種農(nóng)林害蟲(chóng)的防治。絲孢類生防真菌防治害蟲(chóng)的持效性較好，但殺蟲(chóng)速度較為緩慢，成為影響真菌殺蟲(chóng)劑應(yīng)用推廣的限制因素，也是國(guó)際上的重大技術(shù)難題之一。作為絲孢類生防真菌的典型代表，球包白僵菌穿透害蟲(chóng)體壁通常發(fā)生在接種后的48小時(shí)左右，再經(jīng)血腔內(nèi)的繁殖，一般經(jīng)歷因蟲(chóng)體大小而異的數(shù)天潛伏期才能殺死害蟲(chóng)。由于生防真菌沒(méi)有特異的腸道毒力因子，只能依賴分生孢子萌發(fā)后穿透體壁的方式感染寄主，被咀嚼式口器害蟲(chóng)攝入的大量孢子一般不能在腸道導(dǎo)致實(shí)質(zhì)性的感染。真菌殺蟲(chóng)的時(shí)滯效應(yīng)使其很難用于防治暴食性葉面害蟲(chóng)，限制著菌劑的應(yīng)用范圍。因此，有效提高球孢白僵菌對(duì)暴食性葉面害蟲(chóng)的快速毒殺能力是一重大技術(shù)挑戰(zhàn)。Vip3A是一類由蘇云金芽孢桿菌在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期分泌的、具有信號(hào)肽的殺蟲(chóng)蛋白，直接作用于昆蟲(chóng)中腸上皮細(xì)胞(主要是柱狀細(xì)胞)，誘發(fā)昆蟲(chóng)細(xì)胞凋亡和核溶解，導(dǎo)致昆蟲(chóng)死亡，對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)具有較廣譜的殺蟲(chóng)活性。然而，Vip3A殺蟲(chóng)蛋白在細(xì)胞培養(yǎng)物中的分泌量很低，加之非晶體結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性，不能像蘇云金芽孢桿菌的晶體內(nèi)毒素那樣開(kāi)發(fā)成可直接用于田間的殺蟲(chóng)劑產(chǎn)品。迄今，全球Vip3A蛋白的應(yīng)用僅限于轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)植物。新近的研究表明，利用害蟲(chóng)Vip3A腸毒蛋白改造殺蟲(chóng)真菌，使其不僅能夠經(jīng)昆蟲(chóng)體壁侵染，而且攝入腸道的真菌孢子可釋放腸毒蛋白，從而加快低齡斜紋夜蛾幼蟲(chóng)的死亡(Qin et al., 2010)。雖然將Vip3Aal蛋白基因置于構(gòu)巢曲霉的通用組成型啟動(dòng)子Plgp說(shuō)下導(dǎo)入球孢白僵菌能提高其對(duì)斜紋夜蛾低齡幼蟲(chóng)的毒殺效果，但重組菌株對(duì)三齡以上齡期幼蟲(chóng)的毒殺效果不佳(Qin et al., 2010)，說(shuō)明Plgp說(shuō)不足以啟動(dòng)外源基因在生防真菌分生孢子中的高表達(dá)。因此，有必要尋找一種超強(qiáng)啟動(dòng)子來(lái)啟動(dòng)外源殺蟲(chóng)蛋白基因的高效表達(dá)，為提升真菌殺蟲(chóng)劑的質(zhì)量和實(shí)用性提供新的技術(shù)途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種找到一種超強(qiáng)啟動(dòng)子、能建立生防真菌通常
3不具有的獨(dú)特殺蟲(chóng)機(jī)制和殺蟲(chóng)活性顯著增強(qiáng)的Vip3A殺蟲(chóng)蛋白超高表達(dá)的工程菌株構(gòu)建方法，并獲得相應(yīng)的工程菌株。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種具高腸毒殺蟲(chóng)活性的轉(zhuǎn)基因生防真菌， 該菌株m3HV8的保藏名稱為球孢白僵菌徹a^/^ria bassiana ；保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；保藏地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；保藏日期2010年12月8日，保藏編號(hào)CGMCC No. 4438。本發(fā)明還同時(shí)提供了一種具高腸毒殺蟲(chóng)活性的轉(zhuǎn)基因生防真菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟
(1)獲得內(nèi)源強(qiáng)啟動(dòng)子
利用球孢白僵菌疏水蛋白基因Aj^//的序列設(shè)計(jì)引物，克隆其N端啟動(dòng)子全長(zhǎng)序列 Vhydl (1798 bp);不同長(zhǎng)度或?qū)嵤┺D(zhuǎn)錄因子定點(diǎn)突變的啟動(dòng)子片段通過(guò)其啟動(dòng)外源報(bào)告基因(綠色熒光蛋白基因^F/7)的表達(dá)進(jìn)行定量比較，找到啟動(dòng)綠色熒光蛋白表達(dá)量最大的啟動(dòng)子片段為球孢白僵菌疏水蛋白啟動(dòng)子Vhydl的優(yōu)化片段，所述球孢白僵菌疏水蛋白啟動(dòng)子Vhydl的優(yōu)化片段作為Vhydl優(yōu)化后的強(qiáng)啟動(dòng)子核心序列，該片段攜帶3個(gè)缺一不可的轉(zhuǎn)錄因子；
(2)獲得異源殺蟲(chóng)蛋白基因
針對(duì)目標(biāo)害蟲(chóng)選擇適當(dāng)?shù)腣ip3A殺蟲(chóng)蛋白基因，構(gòu)建合適的酶切位點(diǎn)，用合成的方法獲得目標(biāo)蛋白基因Vip3Aal (Vip3A殺蟲(chóng)蛋白家族成員之一)；
(3)構(gòu)建攜帶Vip3A蛋白基因和選擇標(biāo)記基因的二元表達(dá)載體
將步驟(2)所得的目標(biāo)蛋白基因Vip3A置于步驟(1)所得的球孢白僵菌疏水蛋白啟動(dòng)子Vhydl的優(yōu)化片段以及構(gòu)巢曲霉Us/^rgiBiM nidulans)色氨酸基因的終止子ItrpC 之間；然后與生防真菌篩選標(biāo)記草丁膦抗性基因如r表達(dá)元件串聯(lián)成二元表達(dá)載體；
(4)獲得生防真菌的重組工程菌株
將步驟(3)構(gòu)建所得的二元表達(dá)載體轉(zhuǎn)入生防真菌，篩選后獲得組成型超高表達(dá) Vip3A蛋白基因的重組工程菌株——保藏名稱為球孢白僵菌徹a^/^ria bassiana的菌株 BbHV80作為本發(fā)明的具高腸毒殺蟲(chóng)活性的轉(zhuǎn)基因生防真菌的構(gòu)建方法的改進(jìn)步驟(4) 中的生防真菌為白僵菌屬Beauverin、綠僵菌屬M(fèi)etarhiziunu棒束孢屬Isaria (=擬青霉 PaeciAw^ce1S)或蠟蚧菌屬(=輪枝菌屬feriiciWiw )等昆蟲(chóng)病原真菌的菌種菌株。作為本發(fā)明的具高腸毒殺蟲(chóng)活性的轉(zhuǎn)基因生防真菌的構(gòu)建方法的進(jìn)一步改進(jìn)將步驟(3)構(gòu)建所得的二元表達(dá)載體轉(zhuǎn)入生防真菌的方法為原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化、芽生孢子轉(zhuǎn)化或電擊轉(zhuǎn)化。本發(fā)明還同時(shí)提供了上述具高腸毒殺蟲(chóng)活性的轉(zhuǎn)基因生防真菌的用途用于腸毒殺蟲(chóng)。具體的說(shuō)，本發(fā)明的工程菌株構(gòu)建方法依次通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn) 1.在大腸桿菌中擴(kuò)增并提取真菌表達(dá)質(zhì)粒PAN52-1N。2.篩選生防真菌的內(nèi)源強(qiáng)啟動(dòng)子片段
根據(jù)已知的球孢白僵菌疏水蛋白基因如^//的序列，設(shè)計(jì)引物克隆其N端啟動(dòng)子全長(zhǎng)序列Phyd1。在線分析序列結(jié)構(gòu)之后，設(shè)計(jì)多對(duì)兩端分別帶酶切位點(diǎn)Bg1II和NcoI的引物，PCR 擴(kuò)增不同片段長(zhǎng)度的啟動(dòng)子序列，形成截頭啟動(dòng)子片段。用內(nèi)切酶Bg1II和NcoI分別切開(kāi)不同片段長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物和攜帶構(gòu)巢曲霉3-磷酸甘油醛脫氫酶基因gpdA的啟動(dòng)子V卯dA 的PAN52-1N質(zhì)粒(Ying and Feng, 2006)，并將二者連接起來(lái)。由此，得到一組用不同長(zhǎng)Phyd1啟動(dòng)子序列替換奴pdA的質(zhì)粒PAN52-Phydl-x，其中χ代表不同長(zhǎng)度的VhycIl啟動(dòng)子序列t0、tl、t2、t3及t4或3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子分別定點(diǎn)突變的tl。將該組質(zhì)粒分別用NcoI 和酶切，并與相同酶切過(guò)的外源報(bào)告基因 ^Ρ、構(gòu)巢曲霉色氨酸基因終止子TirpC 和篩選標(biāo)記草丁膦抗性基因bar串聯(lián)，得PAN52-Phydl-x-eGFP-Tir/7C-bar 二元表達(dá)載體， 用于真菌轉(zhuǎn)化。利用真菌芽生孢子轉(zhuǎn)化技術(shù)(Ying and Feng, 2006)，將構(gòu)建的二元表達(dá)載體逐一轉(zhuǎn)入球孢白僵菌，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，各啟動(dòng)子片段啟動(dòng)eGFP表達(dá)的強(qiáng)度作為衡量其功能強(qiáng)弱的依據(jù)，以表達(dá)強(qiáng)度最大的啟動(dòng)子片段作為Vhydl優(yōu)化后的強(qiáng)啟動(dòng)子核心序列 {？hydl-tl)，用于目標(biāo)基因的操作。3. Vip3Aal殺蟲(chóng)蛋白基因的獲得
根據(jù)基因庫(kù)中已知的Vip3Aal蛋白基因序列設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)AfcoI和的引物，用 PCR方法擴(kuò)增目標(biāo)基因。4.超高表達(dá)Vip3Aal蛋白基因的重組菌株構(gòu)建
用內(nèi)切酶AfcoI和召a HI分別切開(kāi)vip3Aal基因的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pAN52-Phydl_tl，將 vip3Aal與質(zhì)粒連接，使其置于優(yōu)化啟動(dòng)子Vhydl-tl和構(gòu)巢曲霉色氨酸基因終止子ItrpC (Punt et al. , 1990)之間，再與篩選標(biāo)記草丁膦抗性基因力ar (Ying and Feng, 2006)串聯(lián)，構(gòu)成用于真菌轉(zhuǎn)化的二元表達(dá)載體pAN52-Phydl-tl-Vip3Aal-TtrpC-bar。運(yùn)用真菌芽生孢子轉(zhuǎn)化技術(shù)(Ying and Feng, 2006)，將所構(gòu)建的二元表達(dá)載體轉(zhuǎn)入球孢白僵菌的目標(biāo)野生菌株，篩選獲得超高表達(dá)Vip3Aal蛋白、殺蟲(chóng)效果大幅提高的重組工程菌株。在發(fā)明過(guò)程中，發(fā)明人認(rèn)為真菌疏水蛋白是一類具有強(qiáng)表面活性的分泌性小分子蛋白質(zhì)，廣泛存在于各類真菌的氣生菌絲、分生孢子、侵染結(jié)構(gòu)及子實(shí)體表面。球孢白僵菌疏水蛋白Hydl (AB038181. 1)在其生長(zhǎng)周期中均高效表達(dá)，尤其產(chǎn)生強(qiáng)疏水性的分生孢子 (Cho et al., 2007)。因此發(fā)明人推測(cè)該基因上游啟動(dòng)子序列極可能存在可特異性啟動(dòng)目標(biāo)基因在分生孢子形成階段表達(dá)的功能，因而在生防真菌的遺傳改良中具有潛在利用價(jià)值。在本發(fā)明中，內(nèi)源強(qiáng)啟動(dòng)子為球孢白僵菌疏水蛋白基因hyd1的啟動(dòng)子Phyd1(1798 bp)經(jīng)截頭和點(diǎn)變突優(yōu)化處理后的片段，長(zhǎng)度為1290 bp，能在分生孢子形成階段啟動(dòng)外源目標(biāo)基因的高表達(dá)；目標(biāo)基因?yàn)樘K云金芽孢桿菌營(yíng)養(yǎng)期分泌的Vip3A殺蟲(chóng)蛋白家族基因及其經(jīng)過(guò)修飾、融合或突變的基因。該發(fā)明的顯著技術(shù)特點(diǎn)在于，篩選具有超強(qiáng)啟動(dòng)力的蟲(chóng)生真菌內(nèi)源啟動(dòng)子Phyd1-t1的核心序列片段再將Vip3Aal蛋白的編碼基因置于該強(qiáng)啟動(dòng)子之下構(gòu)建二元真菌表達(dá)質(zhì)粒。利用芽生孢子轉(zhuǎn)化體系將真菌表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入生防真菌，篩選獲得組成型超高表達(dá)Vip3Aal蛋白的重組菌株，通過(guò)生物測(cè)定重組菌株的腸毒殺蟲(chóng)活性，證明其對(duì)暴食性葉面害蟲(chóng)的毒力得到大幅提高。該發(fā)明利用內(nèi)源強(qiáng)啟動(dòng)子特異性驅(qū)動(dòng)外源Vip3A殺蟲(chóng)蛋白在生防真菌分生孢子形成階段超高表達(dá)、從而大幅提高生防真菌工程菌株對(duì)暴食性葉面害蟲(chóng)的腸毒活性的的技術(shù)路線及其構(gòu)建方法，均系首次報(bào)道。主要參考文獻(xiàn)如下
1、 Cho EM, Kirkland BH, Holder DJ, Keyhani NO (2007) Phage display cDNA cloning and expression analysis of hydrophobins from the entomopathogenic fungus Beauveria {Cordyceps) bassiana (球孢白僵菌疏水蛋白基因的cDNA克隆與表達(dá)分析).Microbiology-SGM 153: 3438-3447。2、Punt PJ, Dingemanse MA, Kuyvenhoven A, Soede RDM, Pouwels PH, van den Hondel CAMJJ. (1990) Functional elements in the promoter region of the Aspergillus nidulans gpdA gene encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (構(gòu)巢曲霉3_磷酸甘油醛脫氫酶基因m ciA的啟動(dòng)子區(qū)域中的功能元件分析)· Gene 93: 101-109。3、Qin Y (秦毅)，Ying SH (應(yīng)盛華)，Chen Y (陳穎)，Shen ZC (沈志成)，!^eng MG (馮明光)· (2010) Integration of insecticidal protein Vip3Aal into Beauveria bassiana enhances fungal virulence to Spodoptera litura larvae by cuticle and per os infection (殺蟲(chóng)蛋白Vip3Aal植入球孢白僵菌能增強(qiáng)白僵菌對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)經(jīng)體表和攝入途徑侵染的毒力)· Applied and Environmental Microbiology 76: 4611-4618。4、Ying SH (應(yīng)盛華)，F(xiàn)eng MG (馮明光)· (2006) Novel blastospore-based transformation system for easy integration of phosphinothricin resistance and green fluorescenceprotein genes into Beauveria bassiana (基于芽生 包子的遺傳轉(zhuǎn)化新體系使草丁膦抗性基因和熒光蛋白基因易于轉(zhuǎn)入球孢白僵菌中VApplied Microbiology and Bio technology 72: 206—210。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)對(duì)利用本發(fā)明方法得到的重組工程菌株進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例1 特異性驅(qū)動(dòng)外源基因在生防真菌分生孢子形成階段超高表達(dá)的內(nèi)源強(qiáng)啟動(dòng)子篩選
根據(jù)已知的球孢白僵菌疏水蛋白基因Aj^/的序列(GenBank accession code: EF452344. 2)設(shè)計(jì)引物，克隆獲得其N端啟動(dòng)子的1798 bp的全長(zhǎng)序列Vhydl (GenBank accession code:⑶936631. 1)。根據(jù)對(duì)其特征進(jìn)行在線分析的結(jié)果，設(shè)計(jì)多對(duì)兩端分別帶酶切位點(diǎn)勒··/II (tO-F: GGAAGATCTAATTAGTCAGGCACCCTTGACGC; tl_F: GGAAGATCT CGTGCCAGTTTCTCCAAGCAACTAC； t2_F: GGAAGATCTTGTCTCTCTTTTTTTATTGT ATCT； t3_F: G GAAGATCTCCTGAAAAGGTTTTATTGCGGC； t4_F: GGAAGATCTCAACA TCAGCAGTAGATGGGCGGCT)和 Ncol (t-R: CATGCCATGGATGACGGTATTGTTTATT TGGTTG)的上下游擴(kuò)增引物。50 μ 1 指數(shù)擴(kuò)增體系具體為5 μ 1 10' PCR緩沖液，4 μ 1 25 mM MgCl2,1 μ 1 20 mM dNTP, 20 μ M上下游引物各ι μ 1，球孢白僵菌野生菌株恥觀60 (來(lái)自美國(guó)農(nóng)業(yè)部ARSEF生防真菌菌種庫(kù))50 ng/μ 基因組樣品2 μ 1, 5 U/μ 1 T^酶0.5 μ 1，蒸餾水；35. 5 μ 1。擴(kuò)增程序?yàn)?4° C 預(yù)變性5分鐘后進(jìn)入35個(gè)擴(kuò)增循環(huán)(94° C變性30秒，60° C退火30秒，72° C延伸1. 5 分鐘)，最后72° C延伸7分鐘。PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收，得到不同片段長(zhǎng)度的啟動(dòng)子序列。
6
在大腸桿菌中擴(kuò)增并提取攜帶構(gòu)巢曲霉3-磷酸甘油醛脫氫酶基因甜說(shuō)的真菌通用啟動(dòng)子 P1SP說(shuō)的表達(dá)質(zhì)粒 PAN52-1N (Punt et al.，1990; Ying and Feng, 2006)。用內(nèi)切和AfcoI分別切開(kāi)上述擴(kuò)增的球孢白僵菌疏水蛋白基因啟動(dòng)子不同片段長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒ρΑΝ52-1Ν，并進(jìn)行連接，得到一組新質(zhì)粒 pAN52-Phydl-x，其中χ代表不同序列長(zhǎng)度的啟動(dòng)子片段t0(對(duì)應(yīng)-1798 bp的全長(zhǎng)片段)、tl (對(duì)應(yīng)_1四0 bp片段)、t2 (對(duì)應(yīng)-1179 bp片段)、t3 (對(duì)應(yīng)-988 bp片段)及t4 (對(duì)應(yīng)-799 bp片段)或tl所攜帶三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子中任意一個(gè)定點(diǎn)突變后的片段(均為_(kāi)1四0 bp)。由此， 質(zhì)粒ρΑΝ52-1Ν中原有的真菌通用啟動(dòng)子!>gPdi被逐一替換為Aj^/基因的不同長(zhǎng)度或定點(diǎn)突變的啟動(dòng)子序列Vhydl-x。所獲新質(zhì)粒pAN52-Phydl-x分別用AfcoI和酶切，并與相同酶切的外源報(bào)告基因eGFP、構(gòu)巢曲霉色氨酸基因終止子TirpC和篩選標(biāo)記草丁膦抗性基因bar串聯(lián)連接， 獲得pAN52-Phydl-X-eGFP-TtrpC-bar 二元表達(dá)載體。利用真菌芽生孢子轉(zhuǎn)化技術(shù)(Ying and Feng, 2006)，將構(gòu)建的二元表達(dá)載體轉(zhuǎn)入球孢白僵菌野生菌株恥觀60，篩選出各啟動(dòng)子片段調(diào)控的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子于薩氏培養(yǎng)基(SDAY)上培養(yǎng)3天。所獲菌落菌絲碾磨后提取蛋白質(zhì)，其中eGFP蛋白的表達(dá)量通過(guò)專用儀器(熒光光譜儀JASCO FP-6500)測(cè)定熒光強(qiáng)度大小來(lái)定量評(píng)價(jià)啟動(dòng)子的強(qiáng)弱。由此找到驅(qū)動(dòng)力最強(qiáng)的啟動(dòng)子片段Vhydl-tl作為Vhydl啟動(dòng)子優(yōu)化后的強(qiáng)啟動(dòng)核心序列，其驅(qū)動(dòng)效力是通用構(gòu)巢曲霉gpdA基因啟動(dòng)子P甜說(shuō)(Punt et al., 1990)的15. 6倍，熒光顯微鏡觀察證明該核心啟動(dòng)子片段主要驅(qū)動(dòng)外源目標(biāo)基因在分生孢子形成階段超表達(dá)，產(chǎn)生熒光最強(qiáng)的分生孢子。實(shí)施例2 利用生防真菌內(nèi)源強(qiáng)啟動(dòng)子超高表達(dá)Vip3A殺蟲(chóng)蛋白的工程菌株構(gòu)建在 Vip3Aal (Vip3A 家族成員之一)殺蟲(chóng)蛋白基因(GenBank accession code:
AAC37036. 1)序列的首尾添加酶切位點(diǎn)AfcoI和SaMn，用基因合成方法獲得viP3Aal基因。在大腸桿菌中擴(kuò)增并提取新構(gòu)建的真菌表達(dá)質(zhì)粒pAN52-Phydl-tl。用內(nèi)切酶AfcoI 和Bainm分別切開(kāi)vip3Aal基因的擴(kuò)增產(chǎn)物和pAN52-Phydl_t 1，并與該質(zhì)粒連接成 pAN52-Phydl-tl-Vip3Aal，再酶切后與終止子TirpC和篩選標(biāo)記草丁膦抗性基因bar串聯(lián)連接，構(gòu)建成pAN52-Phydl-tl-Vip3A-TtrpC-bar新的二元表達(dá)載體。將此質(zhì)粒經(jīng)芽生孢子轉(zhuǎn)化體系介導(dǎo)轉(zhuǎn)入球孢白僵菌野生菌株m^860的基因組中，在含200 yg/ml草丁膦的篩選平板上隨機(jī)挑取20個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR鑒定。首先，用PCR反應(yīng)鑒定bar和viP3Aal基因是否同時(shí)存在于轉(zhuǎn)化子基因組中，擴(kuò)增引物分別為bar-F (AGAACGACGCCCGGCCG ACAT) 及 bar-R (CTGCCAGAAACCCACGTCATGC)與 Vip3Aal_F (CCTTCAGCAACCCGA ACTACGC)及 Vip3Aal-R (GCTCGCGCAGGTAGCTCTTACAG)。50 μ 1 指數(shù)擴(kuò)增體系具體為5 μ 1 10' PCR緩沖液，4 μ 1 25 mM MgCl2, 1 μ 1 20 mM dNTP, 20 μ M上下游引物各 1 μ 1，50 ng/μ 的轉(zhuǎn)化子菌株基因組2 μ 1,5 U/μ 1 7 《酶0.5 μ 1，蒸餾水35. 5 μ L·擴(kuò)增程序?yàn)?4° C 預(yù)變性5分鐘后進(jìn)入35個(gè)擴(kuò)增循環(huán)(94° C變性30秒，60° C退火30秒，72° C延伸30 秒)，最后72° C延伸7分鐘。抽取同時(shí)表達(dá)力ar和基因轉(zhuǎn)化子的RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA(按試劑盒說(shuō)明書操作)，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析儀(Mastercycler ep realplex) 上分析轉(zhuǎn)化子中vip3Aal基因的相對(duì)表達(dá)水平，篩選出Vip3Aal蛋白組成型超高表達(dá)的轉(zhuǎn)化子KdHVS (保藏號(hào)CGMCC No. 4438)，其在SDAY平板上培養(yǎng)4天的菌落中轉(zhuǎn)錄表達(dá)口>2^7基因的水平是外源Plgp說(shuō)啟動(dòng)子(Punt et al.，1990)驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)化子BbV28 (Qinet al.，2010)的相同基因轉(zhuǎn)錄水平的111. 7倍，Vip3Aal殺蟲(chóng)蛋白在菌絲和成熟分生孢子中的表達(dá)量比VgpdA轉(zhuǎn)化子分別高7. 8倍和9. 8倍。綠僵菌、棒束孢、蠟蚧菌等昆蟲(chóng)病原真菌與白僵菌同屬絲孢類害蟲(chóng)生防真菌，具有相似的生物學(xué)特性，因而上述強(qiáng)啟動(dòng)子篩選、 目標(biāo)基因的真菌二元表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)化的技術(shù)路線以及獲得超高表達(dá)Vip3A殺蟲(chóng)蛋白的工程菌株的方法原則上一致。實(shí)施例3 超高表達(dá)Vip3Aal球孢白僵菌轉(zhuǎn)化子對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)的毒力測(cè)定
將轉(zhuǎn)化子BbHV8、BbV28及野生株Bl^860的分生孢子粉分別配制成4' 106、2' IO7和 Γ IO8個(gè)孢子/ml的懸液。上述分生孢子粉的制備方法具體如下各供試菌株分生孢子粉采用稻米為基質(zhì)的固液雙相法制備，即將各菌株接種于薩氏培養(yǎng)基SDAY (4%葡萄糖，1%蛋白胨，1%酵母粉和洲瓊脂粉)斜面上，在25° C和光周期12L: 12D條件下培養(yǎng)7天至產(chǎn)孢， 再將分生孢子轉(zhuǎn)接到裝有20 ml薩氏培養(yǎng)液SDB (無(wú)瓊脂的SDAY)的三角瓶中，25° C震蕩(150 rpm/min)培養(yǎng)2天，然后將菌液按20% (ν/ν)的比列轉(zhuǎn)接到SDB培養(yǎng)液中放大培養(yǎng)。所得菌絲液按10% (v/w)的比例接入經(jīng)蒸汽滅菌至適當(dāng)熟度(約六成熟)的稻米上，混合后平攤于直徑15 cm的滅菌培養(yǎng)皿中(100 g米/皿)，于25° C和12L: 12D條件下發(fā)酵產(chǎn)孢7天，然后去皿蓋并用6層吸水紙封口在33° C下鼓風(fēng)干燥3天，將米粒上生產(chǎn)的孢子粉用200目標(biāo)準(zhǔn)篩振動(dòng)收集后，常溫真空干燥M h，干燥后的孢子粉可立即用于生測(cè)實(shí)驗(yàn)或于-20° C冰箱中保存?zhèn)溆?。用全自?dòng)噴塔在0. 7 kg/cm2的工作壓力下各菌株不同濃度的1 ml孢子懸液分別自上而下地噴到載有40頭斜紋夜蛾幼蟲(chóng)的新鮮荷葉圓片(直徑12 cm),實(shí)際接種劑量用平放于葉片旁的蓋玻片(20'20 mm)收集孢子，棉蘭染色后在顯微鏡下鏡檢孢子數(shù)來(lái)確定葉片上沉降的孢子量/mm2。將噴過(guò)孢子并載有不同齡期斜紋夜蛾幼蟲(chóng)的荷葉圓片置于直徑為15 cm的培養(yǎng)皿中，二至五齡各齡幼蟲(chóng)每濃度處理重復(fù)3次，以噴0. 02%吐溫80的處理作為空白對(duì)照。培養(yǎng)皿用PE保鮮膜封口后，在25° C和日光照12小時(shí)的培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)8天，其間每隔1 (四、五齡)或2天(二、三齡)更換噴過(guò)孢子的新鮮葉片供幼蟲(chóng)取食，每日定時(shí)記錄死亡蟲(chóng)數(shù)。所獲生測(cè)數(shù)據(jù)擬合時(shí)間一劑量一死亡率模型，計(jì)算各菌株隨處理時(shí)間而變化的劑量效應(yīng)(LC5(1、LC50)和隨孢子劑量而變化的時(shí)間效應(yīng)(LT5C1、LT5Q)。在生測(cè)中，分生孢子超高表達(dá)Vip3Aal殺蟲(chóng)蛋白的KdHVS,高濃度處理后第3天殺死100% 二齡幼蟲(chóng)，第4天殺死100%三齡幼蟲(chóng)，第8天殺四、五齡幼蟲(chóng)94%和93%。BbV28殺二、三齡幼蟲(chóng)的效果優(yōu)于野生株肋觀60，遠(yuǎn)不如BbHV8。BbV28和Bl^860的高濃度處理第3 天引起二齡幼蟲(chóng)的死亡率分別為40. 9%和17. 8%，第7天分別為97. 3%和87. 9%，但到第8 天才分別殺死三齡幼蟲(chóng)的6 和45% ；殺四齡幼蟲(chóng)的效果更差，第8天分別僅殺20%和8%。時(shí)間一劑量一死亡率模擬分析的結(jié)果表明，重組菌株KdHVS經(jīng)孢子攝入對(duì)二齡幼蟲(chóng)第3、4、5天的LC5tl分別為116，47和沈個(gè)孢子/mm2，顯示其腸毒殺蟲(chóng)活性在處理后第 2 5天比野生株肋沘60提高32 1 倍，比BbV28提高倍。BbHV8對(duì)三齡幼蟲(chóng)第4、5、6 天的LC5tl分別為615，261和147個(gè)孢子/mm2，其腸毒殺蟲(chóng)活性在處理后；Γ8天比KdMS和 Bb2860分別提高8 80倍和18 931倍。各菌株對(duì)二齡幼蟲(chóng)的LC5tl值相差顯著，BbHV8對(duì)三齡幼蟲(chóng)的LC5tl顯著低于恥\^8和恥觀60，但后二者之間差異不顯著。另外，BbHV8的LC9tl值隨著蟲(chóng)齡而增大，隨處理后時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，對(duì)二齡幼蟲(chóng)處理后3飛天的LC9tl為1M-678 孢子/mm2，對(duì)三齡幼蟲(chóng)處理后5、天的LC9tl為422 1583孢子/mm2，對(duì)四、五齡幼蟲(chóng)處理6、
8天的LC9tl分別為1032 2344和1389 3721孢子/mm2。在相同處理劑量下，與BbM8和Bl^860相比，BbHV8對(duì)二齡幼蟲(chóng)的LT5tl分別縮短 1. 5 2. 6天和2. 9 4. 2天，對(duì)三齡幼蟲(chóng)的LT50分別縮短2.廣3. 8天和3. 6 4. 6天，說(shuō)明BbHV8 殺二齡和三齡幼蟲(chóng)比BbV28快63 100%，比Bb2860快1. Γ . 6倍。在200 1400個(gè)孢子/mm2 的噴霧劑量下，BbHV8對(duì)二到四齡幼蟲(chóng)的LT9tl值為4. 6 8. 0天，增至2000個(gè)孢子/mm2時(shí)降為 2. 8^7. 3 天。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.具高腸毒殺蟲(chóng)活性的轉(zhuǎn)基因生防真菌，其特征是菌株BbHVS的保藏名稱為球孢白僵菌^^/Mria bassiana ；保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心； 保藏地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；保藏日期2010 年12月8日，保藏編號(hào)CGMCC No. 4438。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具高腸毒殺蟲(chóng)活性的轉(zhuǎn)基因生防真菌的構(gòu)建方法，其特征是包括以下步驟(1)獲得內(nèi)源強(qiáng)啟動(dòng)子利用球孢白僵菌疏水蛋白基因aj^//的序列設(shè)計(jì)引物，克隆其n端啟動(dòng)子全長(zhǎng)序列 Vhydl ；不同長(zhǎng)度或?qū)嵤┺D(zhuǎn)錄因子定點(diǎn)突變的啟動(dòng)子片段通過(guò)其啟動(dòng)外源報(bào)告基因的表達(dá)進(jìn)行定量比較，找到啟動(dòng)綠色熒光蛋白表達(dá)量最大的啟動(dòng)子片段為球孢白僵菌疏水蛋白啟動(dòng)子PAj^/的優(yōu)化片段，所述球孢白僵菌疏水蛋白啟動(dòng)子PAj^/的優(yōu)化片段作為PAj^/優(yōu)化后的強(qiáng)啟動(dòng)子核心序列，該片段攜帶3個(gè)缺一不可的轉(zhuǎn)錄因子；(2)獲得異源殺蟲(chóng)蛋白基因針對(duì)目標(biāo)害蟲(chóng)選擇適當(dāng)?shù)腣ip3A殺蟲(chóng)蛋白基因，構(gòu)建合適的酶切位點(diǎn)，用合成的方法獲得目標(biāo)蛋白基因Vip3Aal，所述Vip3A為殺蟲(chóng)蛋白家族成員之一；(3)構(gòu)建攜帶Vip3A蛋白基因和選擇標(biāo)記基因的二元表達(dá)載體將步驟(2)所得的目標(biāo)蛋白基因Vip3A置于步驟(1)所得的球孢白僵菌疏水蛋白啟動(dòng)子Vhydl的優(yōu)化片段以及構(gòu)巢曲霉Us/^rgiBiM nidulans)色氨酸基因的終止子ItrpC 之間；然后與生防真菌篩選標(biāo)記草丁膦抗性基因如r表達(dá)元件串聯(lián)成二元表達(dá)載體；(4)獲得生防真菌的重組工程菌株將步驟(3)構(gòu)建所得的二元表達(dá)載體轉(zhuǎn)入生防真菌，篩選后獲得組成型超高表達(dá) Vip3A蛋白基因的重組工程菌株——保藏名稱為球孢白僵菌^^/Mria bassiana的菌株 BbHV80
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的具高腸毒殺蟲(chóng)活性的轉(zhuǎn)基因生防真菌的構(gòu)建方法，其特征是所述步驟(4)中的生防真菌為昆蟲(chóng)病原真菌的菌種菌株，所述昆蟲(chóng)病原真菌為白僵菌屬 Beauveria>^iBlifM MetarhiziumJ^ifeM Isaria SJcifHiI^liiM Lecanicillium0
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的具高腸毒殺蟲(chóng)活性的轉(zhuǎn)基因生防真菌的構(gòu)建方法，其特征是將步驟(3)構(gòu)建所得的二元表達(dá)載體轉(zhuǎn)入生防真菌的方法為原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化、芽生孢子轉(zhuǎn)化或電擊轉(zhuǎn)化。
5.如權(quán)利要求1所述的具高腸毒殺蟲(chóng)活性的轉(zhuǎn)基因生防真菌的用途，其特征是用于腸毒殺蟲(chóng)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種具高腸毒殺蟲(chóng)活性的轉(zhuǎn)基因生防真菌，菌株BbHV8的保藏名稱為球孢白僵菌Beauveriabassiana；保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；保藏地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；保藏日期2010年12月8日，保藏編號(hào)CGMCCNo.4438。本發(fā)明還同時(shí)公開(kāi)了上述具高腸毒殺蟲(chóng)活性的轉(zhuǎn)基因生防真菌的構(gòu)建方法。本發(fā)明也同時(shí)公開(kāi)了上述具高腸毒殺蟲(chóng)活性的轉(zhuǎn)基因生防真菌的用途用于腸毒殺蟲(chóng)。
文檔編號(hào)C12N15/31GK102154127SQ201110005779
公開(kāi)日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月12日
發(fā)明者馮明光, 應(yīng)盛華, 王正亮 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)