專利名稱：一種抑制耐藥基因盒整合的siRNA序列的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及SiRNA雙鏈序列，具體為一種抑制耐藥基因盒整合的SiRNA序列。
背景技術：
整合子是細菌基因組中的可移動遺傳物質，具有特異重組位點，可將許多耐藥基因盒(resistance gene cassette)整合在一起，從而形成多重耐藥。基因盒是一種可動遺傳因子(mobile genetic element)，目前發(fā)現(xiàn)了超過60種基因盒，它們均為抗菌耐藥基因盒。一個整合子可捕獲一個或多個耐藥基因盒?；蚝性谡厦傅拇呋拢梢员徽系秸献拥膯幼酉掠蔚腶ttl位點上。整合酶在整合子中起重要作用，整合酶可以催化耐藥基因盒的整合和剔除，使得耐藥基因盒在不同的整合子中進行重新的組合。一個基因盒可以含有一個或者多個耐藥基因。同時，一個整合子內可以含有多個耐藥基因盒，所以一個整合子的結構可以介導多種耐藥性。由于整合子結構存在于多種細菌中，特別是致病菌和臨床菌株，整合酶使得不同耐藥基因在同種細菌和不同細菌中傳播從而逐漸增強了細菌的耐藥性并且利于細菌向耐藥的方向進化。在位于整合子5'保守區(qū)域的啟動子的作用下，整合子中的耐藥基因盒得以表達。在啟動子的作用下，耐藥基因基因盒的表達不僅依賴啟動子的強弱，而且與距離啟動子的遠近有關。當基因盒直接位于5'保守末端時，表達水平最強，而下游的基因盒表達水平較弱，且同一個基因盒在同一個整合子不同位點表達水平均不同。在抗生素的選擇壓力下，由于整合子的整合作用，細菌能夠捕獲外來的耐藥基因， 該系統(tǒng)在整合酶的催化下，將耐藥基因盒整合到自身上，并加以表達。同時由于整合酶的催化整合作用及基因盒的可動性，使得耐藥基因在畜禽與畜禽，畜禽與人類，人類與人類之間的病原菌上廣泛的傳播，這不僅為畜禽業(yè)的養(yǎng)殖帶來巨大的損失，同時給人類的健康帶來嚴重的威脅。一旦某些細菌對新抗生素產(chǎn)生抗性基因，這些抗性基因通過整合子的傳遞，就會形成對新抗生素的普遍抗性。這種方式獲得的耐藥性機率高，形成后也較穩(wěn)定，是引起耐藥性散播的主要原因。因此，對整合酶及耐藥基因盒的表達調控因子進行研究，尋找沉默其基因表達的方法對控制和解決整合子引起的耐藥問題具有重大意義?；虺聊饕l(fā)生在兩種情況一種是轉錄水平上的基因沉(TGS)；另一種是轉錄后基因沉默(PTGQ。RNA干擾是指雙鏈RNA(dsRNA)在細胞內特異性地誘導與之同源互補的mRNA的降解，使相應基因的表達關閉，從而引發(fā)基因轉錄后水平沉默的現(xiàn)象。雖然在不同的有機體內有著細節(jié)性的差別，RNAi的作用機制是高度保守的，通常包含兩個階段: 1)起始階段內源性或外源性dsRNA被酶識別并切割成為片斷大小在21-23nt的小干擾 RNA(siRNA) ；2)效應階段siRNA與核酸酶復合物結合，形成RISC(RNA誘導沉默復合體)， 后者具有核酸內切酶活性，特異性的降解siRNA通過堿基互補原則識別的同源靶mRNA。整合子在細菌耐藥基因的水平轉移過程中起著相當重要的作用。RNAi是一種非常有用的基因敲除(gene knockout)方法，具有高特異性、高速性、高穩(wěn)定性、高效性等優(yōu)點。因此，采用 RNAi技術來沉默整合酶可以在一定程度上阻斷細菌耐藥基因的傳播，防止細菌耐藥性的繼續(xù)發(fā)展。同時，通過RNAi技術干擾整合子中耐藥基因的表達，從而減弱細菌的耐藥性，這在臨床治療和新型藥物的研究開發(fā)具有重要意義。RNAi的研究主要集中在真核生物基因功能調節(jié)及基因功能研究方面，此外，在醫(yī)學領域用于基因治療、抑制有害基因的表達、抗病毒治療(HIV等)、腫瘤癌癥的緩解和消除等方面。國內目前尚未見siRNA技術用于原核生物的報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明就是為了解決如今日益嚴峻的整合子所導致的耐藥性問題，利用RNA干擾技術而設計了一種siRNA序列，將其導入耐藥菌菌株沉默和干擾整合子系統(tǒng)中整合酶基因對耐藥基因盒的捕獲及耐藥基因的表達。整合酶整合效率檢測方法對siRNA的干擾效率進行評估。最終達到通過siRNA控制和消除整合子引起的病原微生物耐藥問題。達到降低整合子整合耐藥基因盒的效率的目的。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的一種抑制耐藥基因盒整合的siRNA序列，該序列為下述序列中的任意一條或一條以上siRNAl 靴序列 GCACATGCGTGTAAATCAT正義鏈(5‘ -3' )5' -GCACAUGCGUGUAAAUCAU dTdT-3‘反義鏈(3' -5' )3' -dTdT CGUGUACGCACAUUUAGUA-5‘
siRNA2 靴序列 GCTGAAAGGTCTGGTCATA正義鏈(5' -3' )5' -GCUGAAAGGUCUG⑶CAUA dTdT-3‘反義鏈(3' -5' )3' -dTdT CGACUUUCCAGACCAGUAU-5‘上述序列中，最適宜的用于抑制耐藥基因盒整合的siRNA序列為 siRNAl siRNAl 靶序列 GCACATGCGTGTAAATCAT正義鏈(5' -3' )5' -GCACAUGCGUGUAAAUCAU dTdT-3‘反義鏈(3‘ -5' )3' -dTdT CGUGUACGCACAUUUAGUA-5‘本發(fā)明所提供的抑制耐藥基因盒整合的siRNA序列由靶序列、正義鏈和反義鏈組成，它的靶序列由19個核苷酸組成，正義鏈序列和反義鏈序列均由21個核苷酸組成，正義鏈序列的方向從左至右為5'端至3'端，反義鏈從左至右為3'端至5'端。自5'端的第 1至第19位均為核糖核苷酸，第20位至第21位的核苷酸均為脫氧核糖核苷酸。本發(fā)明是以已經(jīng)檢測的整合子介導的耐藥病原菌株為基礎，通過生物信息學的方法分析整合酶和耐藥基因空間結構，設計相關小分子干擾RNA(SiRNA)干擾整合酶及耐藥基因盒啟動子至翻譯起始位點部分，分別干擾整合酶基因和耐藥基因的表達。在一定條件下將設計的siRNA導入耐藥菌株沉默和干擾整合子中整合酶基因對耐藥基因盒的捕獲及耐藥基因的表達。通過RT-PCR定量相關mRNA、細菌耐藥性檢測和整合酶整合效率檢測等方法對siRNA的干擾效率進行評估。最終通過本發(fā)明所提供的siRNA雙鏈序列可達到控制和消除整合子引起的細菌耐藥問題。 本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有如下優(yōu)點和有益效果本發(fā)明針對整合酶I上的基因序列設計合成一組siRNA，篩選出二對(siRNAl和 siRNA2)。該序列能有效抑制耐藥基因盒的整合，從而顯著降低耐藥性的傳播。


圖1 整合實驗示意圖 驗證能否發(fā)生整合實驗，上引物設計在R388的整合酶intl 1基因上游 (889bp-908bp)處，下引物設計在重組質粒pGC系列的耐藥基因盒上游，因為引物設計在兩個質粒上，如果成功發(fā)生整合，PCR擴增片段就會產(chǎn)生。圖2:接合實驗示意3 =RT-PCR得到不同樣品mRNA表達量的差別的相對量1號樣品是空白組，2號樣品是經(jīng)scramble RNA處理，3號樣品是經(jīng)siRNAl處理， 4號樣品是經(jīng)siRNA2處理。圖4 =RT-PCR絕對定量的標準曲線。線A指的是整合了的R388，線B指的是總R388 的拷貝數(shù)曲線。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步具體詳細描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。實施例1 SiRNA序列的設計流程如下本實驗siRNA 設計以在線(http://jura. wi. mit. edu/bioc/siRNAext/home. php) 設計軟件為工具，以第一類整合酶全基因(1014bp)為靶基因，在線設計了 2對siRNA。所選取的siRNA序列中的A、G、C、U表示腺嘌呤核糖核苷酸、鳥嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸和尿嘧啶核糖核苷酸，T表示胸腺嘧啶脫氧核糖核苷酸。合成的兩對siRNA如下siRNAl :si-intl (68-87)靴序列 GCACATGCGTGTAAATCAT正義鏈(5‘ -3' )5' -GCACAUGCGUGUAAAUCAU dTdT-3‘反義鏈(3‘ -5' )3' -dTdT CGUGUACGCACAUUUAGUA-5‘siRNA2 :si-intl (239-258)靴序列 GCTGAAAGGTCTGGTCATA正義鏈(5‘ -3' )5' -GCUGAAAGGUCUG⑶CAUA dTdT-3‘反義鏈(3‘ -5' )3' -dTdT CGACUUUCCAGACCAGUAU-5‘實施例2兩對RT-PCR弓丨物設計用primer premier設計軟件，根據(jù)引物設計原則，以整合酶I (HQ 323314. 1)為目的基因設計合成一對引物。引物int-U 5' -GGCTTCGTGATGCCTGCTT-3 ‘和引物int_D 5' -CCGTGGTTCTGGGTTTTTGC-3 ‘。這對引物設計在R388質粒中intll片段上，用于檢測總整合子的拷貝數(shù)(即包括整合了耐藥基因盒后的R388質粒以及未整合入耐藥基因盒的 R388質粒)。同樣，用primer premier設計軟件，設計一對引物，上游引物IntIb 5 ‘ -ACGAACCCAGTTGACATAAG-3 ‘設計在 R388 質粒上 int11 片段上，下游引物 aadAc 5' -TCGATGACGCCAACTAC-3'設計在pGC質粒的addAl基因盒上。此對引物用于檢測共整合子(即整合了耐藥基因盒后的R388質粒)的拷貝數(shù)。實施例3質粒提取將重組質粒pl84-2 (PGC) addAl和R388與E. coli共培養(yǎng)得到含有pl84_2addA質 coli和含有pR388的E. coli。本實驗中所用到的重組質粒R388和pl84_2addA，是
從澳大利亞悉尼Macquarie大學購買。將含有R388質?；D到E. Coli中形成供體菌，含有來源于食源性沙門氏菌的耐藥基因盒pl84-2addA重組質粒分別化轉到E. Coli DH5 α中形成受體菌，轉化過程如圖2所示。將含有pl84-2addA質粒的E. coli和含有pR388的E. coli過夜培養(yǎng)，然后各取 IOOul混合后，放入Iml LB中共培養(yǎng)，并開始添加siRNA，每過一個小時添加一次siRNA。培養(yǎng)8個小時之后。用由廣州東盛生物科技有限公司的高純度質粒小提試劑盒(貨號m012) 提取質粒DNA。具體步驟如下(1)先用1. 5ml離心管收集l_5ml菌液。12000rpm離心lmin，棄上清。(2)加入 250ul溶液I/RNase A混合液，漩渦劇烈振蕩直至菌體完全重新懸浮。(3)室溫靜置Hmin 后，加入250ul溶液II，輕柔地反復顛倒混勻5-6次。(4)再室溫放置l-2min，使菌體充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。( 加入350ul溶液III，立即輕柔地反復顛倒混勻5-6 次。此時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12000rpm室溫離心lOmin，收集上清。將上清置于DNA純化柱中，靜置l_2min。12000rpm離心lmin，棄濾液。(6)加入500ul溶液PB，12000rpm離心lmin,棄濾液。(7)加入500ul溶液W, 12000rpm離心lmin,棄濾液。(8)加入500ul溶液W，12000rpm離心lmin，棄濾液。(9) 12000rpm離心3min，以徹底去除純化柱中殘留的液體。將DNA純化柱置于新的離心管中。向純化柱中央處，懸空滴加50-100ul溶液Eluent， 室溫放置anin。12000rpm離心lmin，管底即為高純度質粒DNA。實施例4相對定量RT-PCR確定siRNA具有抑制整合酶的作用，同時比較siRNAl和siRNA2 對整合酶的抑制效率。將含有pl84-2addA質粒的E. coli和含有pR388的E. coli過夜培養(yǎng)，然后各取 400ul混合后，將4支試管裝有Iml LB,并分別向每支試管加入上述混合菌液200ul (各 IOOul)。開始向上述4支試管中分別添加水、scramble RNA、siRNAl、siRNA2，每過一個小時添加一次。共培養(yǎng)8個小時之后。提取質粒DNA。進行RT-PCR。RT-PCR 用的是 ABI 公司的 Power Sybr Green RNA-to-CTTMl-Step Kit 進行提取，反應體系Power Sybr Green RT-PCR Mix (2X)25. Oul, RT EnzymeMix (125 X )0. 4ul, lOumol/L 兩個引物(Intlb 和 aadAc)各 2ul，模板 2ul，然后加滅菌超純水使體積達到50ul。反應條件設置PCR反應條件，第一個循環(huán)為48°C，30min, 95°C，IOmin ；后40個循環(huán)為 95°C，15s ；60°C,lmin ；融解曲線，95°C變性 15s ；60°C退火 15s ；95°C，15s。點擊運行， 進行PCR反應，反應結束，保存文件，打開分析軟件，儀器自動分析試驗結果。得到圖3所示結果。結果顯示scramble RNA，siRNAl，siRNA2以及空白組中整合酶mRNA表達量的差另|J?？瞻捉M 中的整合酶mRNA表達量最高，其次是scramble RNA, siRNA2對整合酶mRNA表達有一些抑制作用，從圖2可以看出siRNAl對整合酶mRNA的表達有明顯的抑制作用。與空白組相比，抑制效率高達近60%。因而選取siRNAl進行RT-PCR絕對定量實驗，確定siRNAl 對整合效率的影響。實施例5RT-PCR絕對定量確定SiRNA對整合酶的抑制率。從siRNAl處理過的含有質粒的大腸桿菌，提取質粒。進行RT-PCR的絕對定量。首先進行標準曲線的制作。標準品的量是根據(jù)260nm的吸光度值并用DNA或 RNA的相對分子質量來轉換成其拷貝數(shù)確定。RT-PCR用的是ABI公司的Power Sybr Green RNA-to-CTTMl-Step Kit 進行提取，反應體系Power Sybr Green RT-PCR Mix (2Χ) 25. Oul，RT Enzyme Mix (125X) 0. 4ul，lOumol/L 兩個引物(int_U 和 int-D)各 2ul，模板2ul，然后加滅菌超純水使體積達到50ul。反應條件設置PCR反應條件，第一個循環(huán)為48°C，30min, 95°C，IOmin ；后40個循環(huán)為 95°C，15s ；60°C,lmin ；融解曲線，95°C變性 15s ；60°C退火 15s ；95°C，15s。點擊運行， 進行PCR反應。反應結束，保存文件。根據(jù)標準品的量與所得結果進行比較，繪制出標準曲線。如圖4。然后RT-PCR絕對定量檢測siRNAl整合率。同樣，RT-PCR 用的是 ABI 公司的 PowerSybr Green RNA-to-CTTMl-St印Kit 進行提取，反應體系Power Sybr Green RT-PCR Mix (2 X) 25. Oul，RT Enzyme Mix (125 X) 0. 4ul，lOumol/L兩個引物(Intlb和aadAc)各2ul，模板2ul，然后加滅菌超純水使體積達到50ul。反應條件設置PCR反應條件，第一個循環(huán)為48°C，30min, 95°C，IOmin ；后40個循環(huán)為 95°C，15s ；60°C,lmin ；融解曲線，95°C變性 15s ；60°C退火 15s ；95°C，15s。點擊運行， 進行PCR反應，反應結束，保存文件，打開分析軟件，儀器自動分析試驗結果。如果aadAl耐藥基因盒未整合入R388中，引物IntIb和引物aadA。則無法擴增，反之則可以檢測到擴增產(chǎn)物，因而可以通過絕對定量PCR得到拷貝數(shù)。熒光定量PCR絕對定量檢測結果顯示經(jīng)過scramble siRNA處理樣品的耐藥基因盒整合效率為6.9X10_5，而用siRNAl處理過的樣品的耐藥基因盒整合效率為3.9X10_6。 說明siRNAl可以起到抑制耐藥基因盒整合的作用。綜上所述，本發(fā)明所述siRNAl序列可以有效抑制耐藥基因盒的整合率，從而顯著降低以整合子的方式進行的耐藥性傳播。上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種抑制耐藥基因盒整合的SiRNA序列，其特征在于，該序列為下述序列中的任意以一條或一條以上siRNAl 正義鏈(5‘ -3' )5' -GCACAUGCGUGUAAAUCAU dTdT-3‘ 反義鏈(3‘ -5' )3' -dTdT CGUGUACGCACAUUUAGUA-5‘ siRNA2 正義鏈(5‘ -3' )5' -GCUGAAAGGUCUG⑶CAUA dTdT-3‘ 反義鏈(3‘ -5' )3' -dTdT CGACUUUCCAGACCAGUAU-5‘。
2.根據(jù)權利要求1所述的抑制耐藥基因盒整合的siRNA序列，其特征在于，該序列為 siRNAl 正義鏈(5‘ -3' )5' -GCACAUGCGUGUAAAUCAU dTdT-3‘ 反義鏈(3‘ -5' )3' -dTdT CGUGUACGCACAUUUAGUA-5‘。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抑制耐藥基因盒整合的siRNA序列，該序列為siRNA1正義鏈(5′-3′)5′-GCACAUGCGUGUAAAUCAU dTdT-3′，反義鏈(3′-5′)3′-dTdT CGUGUACGCACAUUUAGUA-5′；siRNA2正義鏈(5′-3′)5′-GCUGAAAGGUCUGGUCAUA dTdT-3′，反義鏈(3′-5′)3′-dTdTCGACUUUCCAGACCAGUAU-5′。本發(fā)明所提供的siRNA雙鏈序列可以抑制整合酶作用，整合酶的作用是催化耐藥基因盒的捕獲和整合，因此本發(fā)明所提供的siRNA雙鏈序列能顯著地降低整合酶整合效率。
文檔編號C12N15/113GK102154291SQ201110006968
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月13日 優(yōu)先權日2011年1月13日
發(fā)明者沈會平, 石磊, 閻鶴 申請人:華南理工大學