專利名稱：一種利用離子液體預(yù)處理提高纖維素酶解產(chǎn)糖率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于纖維素應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種利用離子液體預(yù)處理提高纖維素酶解產(chǎn)糖率的方法。
背景技術(shù)：
隨著不可再生能源資源石油、天然氣、煤礦、金屬礦藏等的急劇耗竭，能源和資源的供給與需求矛盾日益突出，新材料的開發(fā)與利用業(yè)已引起世人的關(guān)注。在自然界中存在著大量的可用的自然資源，纖維素就是一個例子。纖維素是自然界中最為豐富的可再生資源，可廣泛應(yīng)用于造紙、涂料等工業(yè)領(lǐng)域。借助生物技術(shù)將天然木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為具有高經(jīng)濟價值及社會價值的乙醇、乳酸等生物化工產(chǎn)品，是目前科學(xué)界和產(chǎn)業(yè)界研究的熱點。天然纖維素的化學(xué)結(jié)構(gòu)是由D-吡喃葡萄糖環(huán)彼此以β-1，4-糖苷鍵連接而成的螺旋狀聚合物，分子中大量的羥基基團形成了數(shù)目龐大的氫鍵，這些氫鍵和分子間范德華力使纖維素形成致密的晶體結(jié)構(gòu)，嚴(yán)重阻礙了化學(xué)試劑或生物酶與纖維素表面的有效接觸和作用，使其具有在水和普通有機溶劑中都不溶解的性質(zhì)，難以直接利用，這是纖維素開發(fā)應(yīng)用的一大障礙。而對天然木質(zhì)素進行預(yù)處理，打破其致密的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，可以實現(xiàn)纖維素的再生和功能化，促使晶態(tài)纖維素向無定形態(tài)纖維素轉(zhuǎn)化，提高纖維素與酶的有效作用面積， 最終提高其產(chǎn)糖率，是有效利用天然纖維素材料的一條重要途徑。離子液體(ionic liquids, ILs)是在室溫或稍高于室溫的溫度下呈液態(tài)的離子體系，是一種熔點接近或低于100 °c的有機鹽類，由于其獨特的物理和化學(xué)性能如空氣和水穩(wěn)定性、低蒸汽壓、與水易溶及高導(dǎo)電性等而在許多領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用，被認(rèn)為是能在許多領(lǐng)域代替易揮發(fā)的有機溶劑的綠色溶劑。2002年，有研究者首先發(fā)現(xiàn)了氯化1-丁基-3-甲基-咪唑([C^iim]Cl)離子液體是一種纖維素的優(yōu)良溶劑，引發(fā)了利用離子液體預(yù)處理纖維素的研究。有文獻選用一系列氯基和乙酸基的離子液體對木質(zhì)纖維進行預(yù)處理，結(jié)果表明所有經(jīng)過處理的纖維結(jié)晶度下降，更易和酶發(fā)生反應(yīng)。但需注意的是，預(yù)處理后在底物中殘留的離子液體會對纖維素酶活力有一定影響，還需用較系統(tǒng)的方法將其去除。纖維素酶是指能夠水解纖維素β -1，4葡萄糖苷鍵，生成葡萄糖和纖維二糖的所有酶的總稱。纖維素酶不是單一的一種酶，而是多組分的復(fù)合酶系，現(xiàn)今確定的纖維素酶主要含有三種組分內(nèi)切型β-1，4葡聚糖酶也稱Cx酶、CMC酶。它能以隨機的形式在纖維素聚合物內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)進行切割，對末端鍵的敏感性比中間鍵小。外切型β_1，4葡聚糖酶也稱Cl酶、纖維二糖水解酶或微晶纖維素酶。它能從纖維素鏈的非還原性末端切割，生成可溶的纖維二糖。纖維二糖酶也稱葡萄糖苷酶，它能水解纖維二糖和短鏈的纖維寡糖生成葡萄糖，對纖維二糖和纖維三糖的水解很快，隨著葡萄糖聚合度的增加水解速度下降， 這種酶的專一性比較差。目前，工業(yè)用纖維素酶的來源主要是好氧的絲狀真菌產(chǎn)生的纖維素酶，如木霉 (Trichoderma)、曲霉(Aspergillus)、青霉(Penicillium)等。不同來源的纖維素酶系組成含量不同，對不同來源的天然纖維素酶解效率也不同，其中以里氏木霉、康寧木霉產(chǎn)生的纖維素酶應(yīng)用最廣，其優(yōu)點是產(chǎn)量大、酶活高，易于提取和使用；缺點則是木霉屬的纖維素酶系組成不理想，萄萄糖苷酶比較缺乏。這將導(dǎo)致纖維素酶解液中纖維二糖的積累，是酶解過程效率低的重要原因之一，可以通過添加外源的葡萄糖苷酶或多菌混合培養(yǎng)產(chǎn)酶可改善酶系的組成。纖維素酶與底物的相互作用是一個比較復(fù)雜的過程。酶的催化作用是酶與底物、 產(chǎn)物相互作用的過程，纖維素酶解糖化的速度和轉(zhuǎn)化率與酶的活力、底物的性質(zhì)以及產(chǎn)物的濃度等多個因素密切相關(guān)。溫度對酶作用過程的影響非常顯著，是酶解過程要考慮的重要參數(shù)。工業(yè)纖維素酶作用的最適宜溫度一般在40°C 60°C，隨酶的來源不同而異。但酶的最適溫度不是酶的特征常數(shù)，對具體工藝中特定的酶來說，選擇最佳溫度需要實驗確定。 另一個重要的參數(shù)是PH，酸性纖維素酶的最適pH在4. 8左右，中性纖維素酶在6. 8左右，根據(jù)選用的纖維素酶種類而定。而其它酶解條件，如酶載量及固液比等，也同樣會影響酶解的效率及糖產(chǎn)率，進而影響工藝成本。近年來的相關(guān)報道主要集中在纖維素的預(yù)處理方法及酶解過程的條件優(yōu)化方面， 尋求更加有效的預(yù)處理手段及提高酶活的方法，離子液體是近年來興起的一種新型綠色纖維素溶劑，對于纖維素的開發(fā)研究有著重要的作用，而適應(yīng)其處理過的纖維素底物的纖維素酶的研究會進一步促進纖維素的應(yīng)用，其產(chǎn)物葡萄糖可應(yīng)用于降解材料乳酸、生物燃料乙醇等領(lǐng)域，具有重要的價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用離子液體預(yù)處理提高纖維素酶解產(chǎn)糖率的方法。本發(fā)明提出的利用離子液體預(yù)處理提高纖維素酶解產(chǎn)糖率的方法，首先選用不同種類的離子液體分別對不同來源的天然木質(zhì)素進行預(yù)處理，得到再生纖維素，然后在一定的酶解條件下進行酶解，并每隔一段時間進行取樣測試，觀察纖維素底物在整個酶解過程中的還原糖產(chǎn)率的變化情況及最終的糖產(chǎn)率，并與未經(jīng)預(yù)處理的天然木質(zhì)素產(chǎn)糖率相比， 研究離子液體預(yù)處理對木質(zhì)素產(chǎn)糖率的影響。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
為打破天然木質(zhì)素的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，提高纖維素酶的接觸面積及可反應(yīng)性，首先對天然木質(zhì)素進行離子液體預(yù)處理，具體步驟為
(1)將天然木質(zhì)素粉末進行干燥處理，且其粒徑控制在SOMffl 120Mffl;
(2)以離子液體為溶劑，在100 150°C、天然木質(zhì)素粉末與離子液體的質(zhì)量百分比為 5 20 %的條件下，將木質(zhì)素粉末加入到離子液體內(nèi)，施以攪拌，1 5小時內(nèi)纖維素完全溶解于離子液體中，形成天然木質(zhì)素的離子液體溶液；
(3)在木質(zhì)素的離子液體中加入去離子水進行纖維素的再生，所加入的去離子水的體積相當(dāng)于木質(zhì)素離子液體溶液體積的5 20倍，然后過濾沉淀物，將該沉淀物反復(fù)清洗 1 5次后進行冷凍干燥，得到再生纖維素；
(4)然后稱取一定量的再生纖維素，加入緩沖液，再生纖維素與緩沖液的重量比為1 5 1 :40，再按照5 30FPU/g底物的比例加入纖維素酶，進行20 80h酶解；在酶解過程中，每隔3 1 提取糖解液，并測定此時的糖產(chǎn)率，直至酶解反應(yīng)完成，并測定最終糖產(chǎn)率。本發(fā)明中，預(yù)處理過程中所使用的天然木質(zhì)纖維素為自然界中常見的固體廢棄物，包括包括玉米秸桿木質(zhì)素，稻草秸桿木質(zhì)素、玉米芯木質(zhì)素、木薯桿、稻殼或甘蔗渣等中任一種。本發(fā)明中，所使用的離子液體為1-丙烯基-3-甲基咪唑氯鹽[AMIM]C1、3_甲基-N-丁基-吡啶溴鹽[BMPy]Br、l-丁基-3-甲基咪唑氯鹽[BMIM]C1、1_乙基-3-甲基咪唑四氟硼鹽[EMIM]BF4或1- 丁基-3-甲基咪唑三氟甲基磺酸鹽[BMIM]0TF等中任一種。本發(fā)明中，在酶解過程中，所使用的緩沖液PH值與所選用的纖維素酶的適用范圍一致，以保證最大程度發(fā)揮酶活。所選用的纖維素酶為綠色木霉、里氏木霉、黑曲霉、康寧木霉或海棗曲霉等來源的纖維素酶系。本發(fā)明中，酶解過程中，攪拌速度為150 190r/min，在40 60°C內(nèi)某一恒定溫度下進行。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明能夠明顯提高木質(zhì)素的產(chǎn)糖率，有效提高纖維素酶的可及性及反應(yīng)效率，使反應(yīng)終期糖液達到可發(fā)酵水平，簡化了整個工藝過程。
具體實施例方式下面通過實施例進一步說明本發(fā)明。實施例1
離子液體[AMIM]C1預(yù)處理過的稻草秸桿纖維素的產(chǎn)糖率。(1)離子液體[AMIM]C1預(yù)處理稻草秸桿纖維素
a)將稻草秸桿纖維素在100°C下干燥處理Mh，將其粒徑公布控制在SOMffl 120Mm。b)準(zhǔn)確稱量5 g稻草秸桿和45 g離子液體[AMIM]C1，共同放入IOOml圓底燒瓶中，于130 °c密封，強烈機械攪拌池至纖維素完全溶解，此時溶液呈深棕色粘稠狀。c)停止攪拌，并將所得的纖維素離子液體溶液用5倍于其體積的去離子水反復(fù)沖洗三次，最后得到白色沉降物，即再生纖維素，過濾后將產(chǎn)物冷凍干燥48 h研磨成粉末待用，并利用減壓旋蒸回收離子液體。(2)利用里氏木酶對再生纖維素進行酶解
a)準(zhǔn)確稱量3 g再生稻草桿纖維素，置于250ml三角燒瓶中待用。再加入pH=4.8緩沖液60g，攪拌均勻后，按照15FPU/g底物的比例加入總酶活為45FPU的里氏木酶，密封后放入50°C，轉(zhuǎn)速為170轉(zhuǎn)/分的恒溫振蕩器中進行酶解。b)每隔3h，取ImL酶解液于離心管中，以5000rpm的轉(zhuǎn)速離心5min，取上清液 0. 5mL，加入0. 5mL緩沖溶液和3mL DNS溶液(自配)，在沸水中進行共熱反應(yīng)lOmin，迅速冷卻后定容至25ml蓋塞混勻。以未加入纖維素酶的同條件溶液為空白樣將分光光度計清零， 用10 mm比色杯，在分光光度計波長MOnm處測量吸光度，代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線中即可得葡萄糖含量。在反應(yīng)后期，由于糖產(chǎn)率增長變緩，取樣間隔時間延長到6 h、12 h、18 h。c) 72h后酶解反應(yīng)完成，停止反應(yīng)，并測定最終產(chǎn)糖率，其結(jié)果數(shù)據(jù)如下表所示。
時間/h3691224365472產(chǎn)糖率/%12. 8615. 4716. 0317. 0217. 3518. 1418. 5218. 98 實施例2
離子液體[BMPy]Br預(yù)處理過的稻草秸桿纖維素的產(chǎn)糖率
5(1)離子液體[BMPy] Br預(yù)處理稻草秸桿纖維素
a)將稻草秸桿纖維素在100°C下干燥處理Mh，將其粒徑公布控制在80um 120Mm。b)準(zhǔn)確稱量5 g稻草秸桿和45 g離子液體[BMPy]Br，共同放入1OOml圓底燒瓶中，于130 °c密封，強烈機械攪拌池至纖維素完全溶解，此時溶液呈深棕色粘稠狀。c)停止攪拌，并將所得的纖維素離子液體溶液用5倍于其體積的去離子水反復(fù)沖洗三次，最后得到白色沉降物，即再生纖維素，過濾后將產(chǎn)物冷凍干燥48 h研磨成粉末待用，并利用減壓旋蒸回收離子液體。(2)利用里氏木酶對再生纖維素進行酶解
a)準(zhǔn)確稱量3 g再生稻草桿纖維素，置于250ml三角燒瓶中待用。再加入pH=4.8緩沖液60g，攪拌均勻后，按照15FPU/g底物的比例加入總酶活為45FPU的里氏木酶，密封后放入50°C，轉(zhuǎn)速為170轉(zhuǎn)/分的恒溫振蕩器中進行酶解。b)每隔汕，取ImL酶解液于離心管中，以5000rpm的轉(zhuǎn)速離心5min，取上清液 0. 5mL，加入0. 5mL緩沖溶液和3mL DNS溶液(自配)，在沸水中進行共熱反應(yīng)lOmin，迅速冷卻后定容至25ml蓋塞混勻。以未加入纖維素酶的同條件溶液為空白樣將分光光度計清零， 用10 mm比色杯，在分光光度計波長MOnm處測量吸光度，代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線中即可得葡萄糖含量。在反應(yīng)后期，由于糖產(chǎn)率增長變緩，取樣間隔時間延長到6 h、12 h、18 h。c) 72h后酶解反應(yīng)完成，停止反應(yīng)，并測定最終產(chǎn)糖率，其結(jié)果數(shù)據(jù)如下表所示。
權(quán)利要求
1.一種利用離子液體預(yù)處理提高纖維素酶產(chǎn)糖率的方法，其特征在于具體步驟如下(1)將天然木質(zhì)素粉末進行干燥處理，且其粒徑控制在SOMffl 120Mffl;(2)以離子液體為溶劑，在100 150°C、天然木質(zhì)素粉末與離子液體的質(zhì)量百分比為 5 20 %的條件下，將木質(zhì)素粉末加入到離子液體內(nèi)，攪拌，1 5小時內(nèi)纖維素完全溶解于離子液體中，形成天然木質(zhì)素的離子液體溶液；(3)在木質(zhì)素的離子液體中加入去離子水進行纖維素的再生，所加入的去離子水的體積相當(dāng)于木質(zhì)素離子液體溶液體積的5 20倍，然后過濾沉淀物，將該沉淀物反復(fù)清洗 1 5次后進行冷凍干燥，得到再生纖維素，研磨成粉末待用；(4)稱取一定量的再生纖維素，加入緩沖液，再生纖維素與緩沖液的重量比為1:5 1 40，再按照5 30FPU/g底物的比例加入纖維素酶，進行20 80h酶解；(5)在酶解過程中，每隔3 1 提取糖解液，并測定此時的糖產(chǎn)率，直至酶解反應(yīng)完成，并測定最終糖產(chǎn)率。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用離子液體預(yù)處理提高纖維素酶產(chǎn)糖率的方法，其特征在于步驟(1)中所述天然木質(zhì)纖維素為玉米秸桿木質(zhì)素，稻草秸桿木質(zhì)素、玉米芯木質(zhì)素、 木薯桿、稻殼或甘蔗渣中任一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用離子液體預(yù)處理提高纖維素酶產(chǎn)糖率的方法，其特征在于步驟(2)中所述離子液體為1-丙烯基-3-甲基咪唑氯鹽、3-甲基-N- 丁基-吡啶溴鹽、 1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽、1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼鹽或1-丁基-3-甲基咪唑三氟甲基磺酸鹽中任一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用離子液體預(yù)處理提高纖維素酶產(chǎn)糖率的方法，其特征在于所述緩沖液的PH值與所選用的纖維素酶的適用范圍一致，以保證最大程度發(fā)揮酶活。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用離子液體預(yù)處理提高纖維素酶產(chǎn)糖率的方法，其特征在于步驟中所述纖維素酶為綠色木霉、里氏木霉、黑曲霉、康寧木霉或海棗曲霉中任一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用離子液體預(yù)處理提高纖維素酶產(chǎn)糖率的方法，其特征在于步驟(5)中所述酶解過程中，攪拌速度為150 190r/min，40 60°C內(nèi)某一恒定溫度下進行。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用離子液體預(yù)處理提高纖維素酶解產(chǎn)糖率的方法，本發(fā)明利用不同種類離子液體對不同來源的天然木質(zhì)素進行預(yù)處理來提高其酶解產(chǎn)糖率。首先利用離子液體對天然木質(zhì)素在一定溫度及充分?jǐn)嚢璧那闆r下進行預(yù)處理，然后將再生纖維素從混合液中提取出來，并加以干燥。以再生纖維素為底物，在一定的溫度、pH及濃度下，加入可以將其分解成還原糖的纖維素酶，最后生成為葡萄糖為主要含量的糖液。本發(fā)明能夠明顯提高木質(zhì)素的產(chǎn)糖率，有效提高纖維素酶的可及性及反應(yīng)效率，使反應(yīng)終期糖液達到可發(fā)酵水平，簡化了整個工藝過程。
文檔編號C12P19/14GK102154412SQ20111000878
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月17日
發(fā)明者任杰, 張艷娟, 袁華 申請人:同濟大學(xué)