專利名稱：恥垢分枝桿菌il-17a及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)菌株及其制備方法， 尤其涉及一種表達IL-17A的重組恥垢分枝桿菌及其制備方法。
背景技術：
免疫佐劑又稱非特異性免疫增生劑，是ー種與抗原同時或預先注射于機體、能夠增強機體免疫應答或改變免疫應答類型的輔助物資，其可以增加抗原表面積，使抗原易于被巨噬細胞吞噬、改變抗原物理性狀，延長抗原作用時間、增強輔助T細胞的作用、刺激致敏淋巴細胞的分裂和漿細胞的產(chǎn)生、提高機體初次和再次免疫應答抗體的滴變、以及改變抗體產(chǎn)生類型和遲發(fā)型變態(tài)反應，并使其增強；因此，免疫佐劑在疾病的預防方面有著及其重要的作用。鋁鹽佐劑是第一個被批準用于人的佐劑，主要功能為緩釋作用，同時也具備對免疫細胞的激活作用，但是鋁鹽佐劑與某些抗原混合注射后會引起局部炎癥反應，甚至形成肉芽腫。弗氏佐劑是ー種含有分枝桿菌成分的佐劑，具有較強的免疫增強效應，是應用最廣泛的試驗用佐劑，由于弗氏佐劑注射部位強烈的副反應，因此該佐劑目前只用于實驗目的的免疫研究。細胞因子作為新型免疫佐劑已經(jīng)在臨床應用，IL-2、IFN-γ等重組卡介苗已成功應用于淺表性膀胱癌的治療研究，如中國專利CN100360668C公開的ー種分泌腫瘤壞死因子-α重組卡介苗，以及中國專利CN1710072A公開的分泌人白介素_2重組卡介苗，均能夠有效預防和治療淺表性膀胱腫瘤；中國專利CN100374M8C公開還公開了ー種重組干擾素卡介苗菌株，在増加免疫效果的同時，還可以減少BCG用量，降低毒副作用。但是，BCG生長緩慢的特性為轉(zhuǎn)基因過程帶來諸多不便。恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)是具有與BCG相似抗原的分枝桿菌， 也是常用的細胞免疫佐劑，同BCG相比，恥垢分枝桿菌具有生長快、非致病性的特點，其應用范圍更為廣泛。目前已有多種細胞因子在恥垢分枝桿菌中得到表達，如表達TNF-α的重組恥垢分枝桿菌應用于膀胱癌，并獲得較好的增強免疫應答效果(Int. J. Cancer, 2004, 112(4) :653-660)；如專利CN1339583A公開的重組恥垢分枝桿菌，含有人結核桿菌熱休克蛋白70啟動子cDNA，也可用來治療膀胱腫瘤；專利CN101875913A公開了ー種結核分枝桿菌Ag85B和ESAT-6融合蛋白的重組恥垢分枝桿菌(CCTCC N0:M2010097)可用于預防和治療結核?。挥秩绫磉_IL-2和GLS的重組恥垢分枝桿菌可以增強小鼠抗肺結核菌感染的免疫應答(Vaccine, 2007, 25 (4) :638-648)。但是表達 IL-17A (白介素-17A，hterleukin 17A) 的重組恥垢分枝桿菌尚未見有報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種表達IL-17A(SEQUENCE No. 4)的重組恥垢分枝桿菌 (Mycobacterium smegmatis) IL-17A，通過穿梭表達載體構建了一種表達IL-17A的重組恥垢分枝桿菌，并制備該重組恥垢分枝桿菌疫苗，使重組疫苗刺激固有免疫和獲得性免疫應答能力得到加強，提高免疫保護效カ。本發(fā)明恥垢分枝桿菌IL-17A已保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號為CGMCC NO. 4446，保藏日期2010年12月10日，保藏地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號；其中，表達IL-17A基因的大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達載體在所述恥垢分枝桿菌 IL-17A中表達。本發(fā)明所述恥垢分枝桿菌制備方法如下
步驟1，依據(jù)IL-17A基因序列設計擴增引物，經(jīng)PCR擴增得到IL-17A基因表達片段，然后將所述IL-17A基因表達片段克隆至載體，獲得重組載體；
步驟2，電轉(zhuǎn)化所述重組載體至恥垢分枝桿菌，得到所述恥垢分枝桿菌IL-17A。優(yōu)選地，在所設計的上游引物在IL-17A基因上游引入I酶切位點；使所設計的下游引物在IL-17A基因下游引入Z/i/7d III酶切位點。其中，所述擴增引物由5’端至3’端寡核苷酸序列優(yōu)選為 上游引物CAGGGATCCGCGGCTACAGTGAAGGC(SEQUENCE No. 1)；
下游引物:AGTAAGCTTTTAGGCTGCCTGGCGGACAAT (SEQUENCE No. 2)。其中，所述上游引物中GGATCC(下劃線部分)為BamW I酶切位點；所述下游引物中AAGCTT (下劃線部分)為Η η III酶切位點。其中，所述載體優(yōu)選為大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達載體(SEQUENCE No. 3)。本發(fā)明還提供了所述恥垢分枝桿菌IL-17A在制備增強非特異性抗感染免疫的藥物、疫苗或免疫佐劑中的應用。本發(fā)明還提供了所述恥垢分枝桿菌IL-17A在制備獲得性免疫的藥物、疫苗或免疫佐劑中的應用。其中，優(yōu)選為在制備預防和控制因過敏性哮喘或呼吸道感染導致的哮喘氣道損傷藥物中的應用，尤其是在制備治療和預防兒童過敏性哮喘藥物中的應用。并進一歩優(yōu)選為在制備預防和控制因肺炎支原體(mycoplasma pneumoniae, MP)感染導致的炎癥損傷的藥物中的應用。綜上所述，本發(fā)明提供了一種表達IL-17A的重組的恥垢分枝桿菌IL-17A及其制備方法，并提供了所述恥垢分枝桿菌IL-17A在制備藥物中的應用。IL-17A是ー種調(diào)節(jié)固有免疫和獲得性免疫的重要因子，通過促進趨化因子、炎癥細胞因子表達等多種途徑參與病原體感染的防御和清除過程；且在喚醒免疫接種后T細胞記憶效應方面具有重要的意義。因此構建表達IL-17A的分枝桿菌疫苗有助于增強疫苗接種激發(fā)的非特異性抗感染能力，有助于預防微生物感染導致的哮喘急性加劇；而且外源性IL-17A在低劑量時主要表現(xiàn)為抑制嗜酸性細胞募集和抑制Th2反應，動物實驗顯示外源性IL-17A劑量低于2. 5μ g/kg時幾乎不加重哮喘小鼠中性粒細胞募集；而IL-17A抑制 TNF- α誘導RANTES表達的能力是其激活TNF- α誘導IL_6、IL_8分泌的6倍，因此低劑量表達IL-17A的分枝桿菌疫苗在預防哮喘中具有明顯的優(yōu)勢。恥垢分枝桿菌與結核分枝桿菌(Mycobacterium Tuberculosis)具有高度同源性， 可作為抗結核藥物的替代菌種，并且恥垢分枝桿菌為快生菌和非致病性菌，有著更好的應用前景。
本發(fā)明所述恥垢分枝桿菌IL-17A具有恥垢分枝桿菌和IL-17A的雙重作用，使得重組后的分枝桿菌促進非特異性抗感染免疫和抑制過敏原介導的氣道免疫炎癥損傷的作用得到顯著的增強，尤其在預防和控制過敏性哮喘或呼吸道感染導致的哮喘氣道損傷中能夠起到重要的作用。


圖1為恥垢分枝桿菌與本發(fā)明恥垢分枝桿菌IL-17A生長曲線圖； 圖2為WB鑒定IL-17A在本發(fā)明恥垢分枝桿菌IL-17A中的表達結果圖3為pMFA41-mIL-17a重組質(zhì)粒在Λ smegmatis表達的PCR鑒定及酶切鑒定結果。
具體實施例方式本發(fā)明提供了一種表達重組白介素-17A的恥垢分枝桿菌菌株IL-17A，與已有恥垢分枝桿菌區(qū)別在于表達IL-17A基因的大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達載體在恥垢分枝桿菌中表達。其制備方法如下
步驟1，依據(jù)已知IL-17A基因序列設計擴增引物，并在上下游引物中分別引入I 酶切位點和がifld III酶切位點；經(jīng)PCR反應得到IL-17A基因表達片段；將所述IL-17A基因表達片段克隆至載體(如大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達載體，PMFA41載體)，獲得重組載體；其中，IL-17A基因序列的獲取和提純可根據(jù)現(xiàn)有技術進行操作，操作條件在下面內(nèi)容中介紹，在此不再贅述。步驟2，恥垢分枝桿菌培養(yǎng)和制備感受態(tài)細胞，電轉(zhuǎn)化所述重組載體至恥垢分枝桿菌，得到所述恥垢分枝桿菌IL-17A。本發(fā)明所述恥垢分枝桿菌IL-17A已保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心， 保藏號為 CGMCC NO. 4446。下面以小鼠白介素17-A、大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達載體PMFA41、和恥垢分枝桿菌I smegmatis mc2155菌株為例，通過具體的實施例對本發(fā)明恥垢分枝桿菌IL-17A及其制備方法進行具體介紹，以更好的理解本發(fā)明，但下述實施例并不限制本發(fā)明范圍。實驗材料小鼠，I5we^maii1S mc2155 (美國科羅拉多州立大學微生物系分枝桿菌研究室)，pMD 18_T載體(TaKaRa公司)，pET28a載體(Novagen公司)，大腸桿菌^: coli、 T0P10 (市場購得)，PMFA41載體(自制)。步驟1，依據(jù)IL-17 A基因序列設計擴增引物，經(jīng)PCR反應得到IL_17 A基因表達片段；并將所述IL-17 A基因表達片段克隆至載體，獲得重組載體；
1. 1.小鼠脾細胞的制備與培養(yǎng)
6周齡雌性BALB/c小鼠的脾臟放入培養(yǎng)基中，并在200目不銹鋼細胞篩中輕輕研壓，制備細胞懸液。取細胞懸液移入離心管中，1640培養(yǎng)基洗滌、lOOOr/min離心三次；棄上清，加入紅細胞裂解液進行裂解，然后加入1640培養(yǎng)基輕輕振蕩混勻，低溫離心機水平轉(zhuǎn)子離心 IOmin(1000r/min)。棄上清，加入10%胎牛血清及雙抗(青霉素100U/ml，鏈霉素100U/ml)制成細胞懸液，接種于細胞培養(yǎng)板，加入PHA-P刺激細胞活化，培養(yǎng)M小時收獲細胞。
1. 2.小鼠IL-17A基因的擴增
Trizol法抽提小鼠脾細胞總RNA，然后制備cDNA。其中cDNA制備方法如下RNA在65°C 下預變性5分鐘，立即置于冰上冷卻；然后進行逆轉(zhuǎn)錄反應，逆轉(zhuǎn)錄反應體系如下
權利要求
1.一種恥垢分枝桿菌(Mycobacterium柳嘆腳む、)IL-17A，其特征在于，表達IL-17A 基因的大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達載體在恥垢分枝桿菌IL-17A中表達；該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO. 4446。
2.一種如權利要求1所述的恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumむ)IL-17A的制備方法，其特征在干，步驟如下步驟1，依據(jù)IL-17 A基因序列設計擴增引物，經(jīng)PCR克隆IL-17 A成熟蛋白編碼基因片段；將所述IL-17 A基因片段克隆至大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達載體，獲得重組載體；步驟2，電轉(zhuǎn)化所述重組載體至恥垢分枝桿菌，得到所述恥垢分枝桿菌IL-17A。
3.根據(jù)權利要求2所述的制備方法，其特征在干，所述設計引物過程中，使所設計的上游引物在IL-17A基因上游引入I酶切位點；使所設計的下游引物在IL-17A基因下游引入がi/ d III酶切位點。
4.根據(jù)權利要求3所述的制備方法，其特征在干，步驟1中所述擴增引物如下 上游引物5，-CAGGGATCCGCGGCTACAGTGAAGGC-3’ ；下游引物5，-AGTAAGCTTTTAGGCTGCCTGGCGGACAAT-3‘；其中所述上游引物中GGATCC為I酶切位點；所述下游引物中AAGCTT為がi/ d III 酶切位點。
5.根據(jù)權利要求2所述的制備方法，其特征在干，步驟2中所述電轉(zhuǎn)化過程，電轉(zhuǎn)化儀的電擊參數(shù)為電壓2. 5kv,電容25 μ F、電阻1000 Ω。
6.根據(jù)權利要求2所述的制備方法，其特征在干，所述電轉(zhuǎn)化后產(chǎn)物在卡那霉素的LBG 瓊脂培養(yǎng)基上篩選和培養(yǎng)。
7.一種如權利要求1所述的恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis) IL-17A在制備增強非特異性抗感染免疫、或制備獲得性免疫的藥物、疫苗或免疫佐劑中的應用。
8.根據(jù)權利要求7所述的應用，其特征在干，應用于制備預防和控制因過敏性哮喘的藥物、或呼吸道感染導致的哮喘氣道損傷藥物。
9.根據(jù)權利要求8所述的應用，其特征在干，所述哮喘氣道損傷為因肺炎支原體感染導致的呼吸道炎癥損傷。
10.根據(jù)權利要求7所述的應用，其特征在干，所述藥物為預防和控制兒童過敏性哮喘的藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種恥垢分枝桿菌IL-17A，其中，表達IL-17A基因的大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達載體在恥垢分枝桿菌IL-17A中表達；該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO.4446。本發(fā)明所述恥垢分枝桿菌IL-17A具有恥垢分枝桿菌和IL-17A的雙重作用，使得重組后的分枝桿菌促進非特異性抗感染免疫和抑制過敏原介導的氣道免疫炎癥損傷的作用得到顯著的增強，尤其在預防和控制過敏性哮喘或呼吸道感染導致的哮喘氣道損傷中能夠起到重要的作用。
文檔編號C12N15/09GK102586161SQ20111000916
公開日2012年7月18日 申請日期2011年1月17日 優(yōu)先權日2011年1月17日
發(fā)明者吳良霞, 張建華, 范小勇, 郝春莉, 郭盛, 陳凌 申請人:上海市第六人民醫(yī)院