專利名稱：一株高抗逆性貝氏梭菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一株能利用未脫毒木質(zhì)纖維酸解糖液的貝氏梭菌及其應用，屬于生物發(fā)酵技術領域。
背景技術：
丁醇是一種重要的C4平臺化合物，已廣泛應用于各種精細化學品的制造；并作為一種重要的具有極大潛力的新型生物燃料受到重視，聯(lián)合國國際能源署將生物丁醇列為第二代生物燃料。作為燃料，丁醇具有能量密度大、可直接用于內(nèi)燃機、運輸方便等優(yōu)點，在能源危機日益嚴峻的今天，丁醇作為燃料有著廣闊的發(fā)展前景。由于國內(nèi)產(chǎn)量不能夠滿足需要，我國已經(jīng)是世界上最大的丁醇進口國。目前，丁醇主要通過化學法合成，隨著石油資源加速枯竭和價格飛漲，發(fā)酵法生產(chǎn)丁醇又受到了廣泛的重視，已經(jīng)成為生物能源的研究熱點之一。丙酮丁醇梭菌和貝氏梭菌可直接有效利用玉米等淀粉物質(zhì)或糖蜜等原料，但這些原料的成本相對比較高，同時存在與人相爭的問題。在糧食短缺與能源危機的雙重威脅下；探索纖維質(zhì)原料生產(chǎn)燃料丁醇成為生物質(zhì)能源發(fā)展戰(zhàn)略的重要組成，也是研究的熱點之一。近年來，國內(nèi)外對纖維原料發(fā)酵產(chǎn)丁醇的研究很多，主要圍繞著菌種誘變選育、纖維原料糖液的制備、發(fā)酵工藝條件優(yōu)化和溶劑提取等發(fā)面進行。中國專利ZL95111733.5報道了通過化學誘變處理丙酮丁醇梭桿菌，利用玉米粉或高粱為底物，發(fā)酵得到總?cè)軇┊a(chǎn)量在20g/L左右，丁醇比為70%的穩(wěn)定菌株； Mermelstein等(Biotechnology and Bioengineering. 1993,42 :1053 1060)利用基因工程技術構(gòu)建了重組菌株，丁醇產(chǎn)量比出發(fā)菌株Clostridiumn acetobutylicum ATCC擬4提高了 37%。NasibQureshi 等(Biomass and Bioenergy. 2008,32 :176-183)利用貝氏梭菌 P260，在小麥秸稈中加入纖維素酶、木聚糖酶等進行同步糖化發(fā)酵，經(jīng)過533小時的連續(xù)發(fā)酵，其溶劑的產(chǎn)率為 0. 41。Annous 等(Appl. Environ. Microbiol. 1991,57 :2544-2548)利用化學誘變，得到了超級菌株BA101，單批發(fā)酵總?cè)軇┳罡呖蛇_25g/L以上；Thaddeus Ezeji 等(Bioresource Technology. 2008,99 :5915-5922)利用突變株 BA101，以 XAD_4resin 脫毒的玉米芯酸解和酶解糖液為底物發(fā)酵，總?cè)軇┊a(chǎn)量為9. 30g/L，但其不能利用未脫毒的酸解和酶解糖液發(fā)酵產(chǎn)丁醇。木質(zhì)纖維原料經(jīng)稀酸處理后，會產(chǎn)生有機酸、糠醛、酚類等抑制物，這些抑制物的除去成本較高、并對微生物生長有一定的抑制作用；ThaddeusEzeji等(B iotechnology&Bioengineering. 2007,97(6) :1460-1469)研究發(fā)現(xiàn)有機酸、糠醛等抑制物不影響丁醇的發(fā)酵，而酚類抑制物對丁醇發(fā)酵有明顯的抑制效應。目前為止，還沒有能夠直接利用未脫毒纖維酸解糖液發(fā)酵產(chǎn)丁醇的專利與文獻報道。可見，木質(zhì)纖維原料中的毒素抑制物嚴重抑制產(chǎn)丁醇梭菌的發(fā)酵性能；而菌種改良是提高菌株對抑制物的耐受性、發(fā)酵經(jīng)濟性的關鍵手段之一
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一株具有高抗逆性的貝氏梭菌，其對木質(zhì)纖維酸解糖液中抑制物的耐受性顯著提高，且發(fā)酵的溶劑產(chǎn)量高、糖轉(zhuǎn)化率高。本發(fā)明還要解決的技術問題是提供上述高抗逆性貝氏梭菌菌株的應用。為了解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案如下一株高抗逆性貝氏梭菌，其分類命名為貝氏梭菌(Clostridium beijerinckii) IB4，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，地址武漢武漢大學，郵編430072，保藏編號CCTCC NO :M 2010310，保藏日期 2010 年 11 月 23 日。上述高抗逆性貝氏梭菌(Clostridium bei jerinckii) IB4是以貝氏梭菌 (NCIMB8052)為出發(fā)菌株離子束誘變后，利用含有酚類等抑制物的刃天青平板篩選得到對抑制物耐受性高、還原力強的菌株，最后以未脫毒的玉米芯酸解糖液為底物，經(jīng)厭氧發(fā)酵篩選獲得溶劑產(chǎn)量高、糖轉(zhuǎn)化率高的貝氏梭菌目標菌株。其具體誘變篩選步驟如下a)離子束誘變將貝氏梭菌原始菌株活化培養(yǎng)，25mL的肖特厭氧瓶裝液量10 15mL，充氮氣3min，培養(yǎng)溫度33 37°C，培養(yǎng)時間12 16h，得到處于對數(shù)生長期的菌液， 將培養(yǎng)的細胞稀釋到0D_ = 0. 05 0. 1，涂布于滅菌的空培養(yǎng)皿中，用無菌空氣吹干；以 5 MKeV作為離子注入的能量，以0. 4 2. 4X IO16 ions/cm2作為誘變劑量對菌株進行離子束誘變；b)刃天青平板初篩菌株經(jīng)離子誘變后，用生理鹽水洗出，稀釋成不同濃度涂布于含抑制物和刃天青(0. 002% )的常規(guī)固體培養(yǎng)基平板上，在33 37°C溫度下厭氧培養(yǎng) 12 30h，挑選出在該平板上透明圈較大的菌落；c)玉米芯酸解糖液平板復篩將步驟b)篩選的菌株接種于25mL的肖特厭氧瓶裝液量10 15mL，充氮氣3min，33 37°C厭氧培養(yǎng)10 14h，無菌生理鹽水制成濃度OD = 0. 1的菌懸液，吸取2 μ L點滴到含抑制物和刃天青(0. 002% )的玉米芯酸解糖液平板上， 在33 37°C溫度下厭氧培養(yǎng)12 30h，挑選出透明圈明顯大于出發(fā)菌的菌落；d)厭氧瓶發(fā)酵篩選將步驟C)篩出的菌落接入種子培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度 33 37°C，厭氧培養(yǎng)培養(yǎng)時間10 16h，然后在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，接種量5% 15% (ν/ ν)，充氮氣3min，發(fā)酵溫度33 37°C，厭氧發(fā)酵發(fā)酵時間60 80h ；考察篩選出的菌落發(fā)酵產(chǎn)丁醇和總?cè)軇┑漠a(chǎn)量，同時選出丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量高的菌株。步驟a)中所述的離子誘變方法中，優(yōu)選IOKeV作為離子注入的能量， 1.6X1016ions/cm2作為誘變劑量。步驟b)和C)所采用的常規(guī)固體培養(yǎng)基、碳源為葡萄糖、淀粉和木質(zhì)纖維酸解糖液中的一種或多種；氮源為有機或無機含氮化合物，其中無機含氮化合物為乙酸銨、氯化銨中的一種或多種，有機含氮化合物為蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米漿中的一種或多種；無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽、磷酸鹽、亞鐵鹽中的一種或多種，固體培養(yǎng)基中添加瓊脂。步驟d)所采用的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中，碳源為葡萄糖、淀粉、木質(zhì)纖維酸解糖液中的一種或多種；氮源為有機或無機含氮化合物，其中無機含氮化合物為乙酸銨、 氯化銨中的一種或多種，有機含氮化合物為蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米漿中的一種或多種；無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽、磷酸鹽、亞鐵鹽中的一種或多種。生長因子為對氨基苯甲酸、維生素Bi、生物素和玉米漿中的一種或幾種的混合。
上述篩選出的高抗逆性貝氏梭菌(Clostridium bei jerinckii) IB4在生產(chǎn)丁醇中的應用。具體應用步驟如下1)平板培養(yǎng)將貝氏梭菌CCTCC NO =M 2010310接種至平板培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度33 37°C，培養(yǎng)時間12 Mh ；2)種子培養(yǎng)將平板培養(yǎng)的貝氏梭菌CCTCC NO =M 2010310接種到種子培養(yǎng)基中， IOOmL的厭氧瓶裝液量40 60mL，充氮氣3 5min，培養(yǎng)溫度33 37°C，培養(yǎng)時間12 24h ；3)發(fā)酵產(chǎn)丁醇將種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量5 15% (ν/ν)，充氮氣3 5min，發(fā)酵溫度33 37°C，發(fā)酵培養(yǎng)時間為60 80h。其中，所述的平板培養(yǎng)基包含如下質(zhì)量百分比的組分碳源0.3% 1%、氮源 0. 5% 1%、無機鹽0. 5% 0. 8%、瓊脂1. 5% 2%、其余為水；所述的碳源為葡萄糖、淀粉和纖維酸解糖液中的任意一種或多種；所述氮源為有機或無機含氮化合物，其中無機含氮化合物為乙酸銨和氯化銨中的一種或兩種的混合，有機含氮化合物為蛋白胨、酵母粉和牛肉膏中的一種或幾種的混合；所述的無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽、磷酸鹽、亞鐵鹽中的任意一種或多種。其中，所述的種子培養(yǎng)基包含如下質(zhì)量百分比的組分碳源0.5% 1%、氮源 0.5^-1 ^無機鹽0. 5 % 0. 8 %、其余為水；所述氮源為有機或無機含氮化合物，其中無機含氮化合物為乙酸銨和氯化銨中的一種或兩種的混合，有機含氮化合物為蛋白胨、酵母粉和牛肉膏中的一種或幾種的混合；所述的無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽、磷酸鹽、亞鐵鹽中的一種或多種。其中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包含如下質(zhì)量百分比的組分碳源3% 6 %、氮源 0. 1% 0.3%、無機鹽0. 1% 0.2%、生長因子0. 05 0. 1%、其余為水；所述的碳源為葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、木質(zhì)纖維酸解糖液和木質(zhì)纖維酶解糖液中的一種或多種；所述的氮源為乙酸銨、氯化銨和酵母粉中的一種或多種；所述的無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽、磷酸鹽、亞鐵鹽中的一種或多種；所述生長因子為對氨基苯甲酸、維生素Bi、生物素和玉米漿中的一種或幾種的混合。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明采用離子束誘變貝氏梭菌，利用含未脫毒的玉米芯酸解糖液的刃天青平板篩選對纖維酸解糖液中的酚類等抑制物具有較強的耐受性、并能直接利用木質(zhì)纖維酸解糖液發(fā)酵生產(chǎn)丁醇，糖轉(zhuǎn)化率高、總?cè)軇┊a(chǎn)量高的菌株。利用本發(fā)明的菌株和工藝進行發(fā)酵， 以未脫毒的玉米芯酸解糖液作為碳源，在2L發(fā)酵罐中總?cè)軇┊a(chǎn)量和丁醇產(chǎn)量分別達到了 10. 3g/L和7. lg/L，分別是出發(fā)菌株的4. 3倍和4. 4倍；具有重大的社會意義和經(jīng)濟價值。


圖1為貝氏梭菌NCIMB 8052的存活率曲線圖。
具體實施例方式根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領域的技術人員容易理解，實
5施例所描述的僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。實施例1 本實施例說明將貝氏梭菌原始菌株進行第一步離子束誘變的方法。貝氏梭菌NCIMB 8052原始菌株購于美國菌種保藏中心(ATCC)；進行第一步離子束誘變的方法如下用將貝氏梭菌NCIMB 8052原始菌株活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度33 37°C，25mL搖瓶裝液量10 15mL，充氮氣3min，培養(yǎng)時間12 18h，得到生長旺盛、菌體粗壯的菌液；取新鮮培養(yǎng)的細胞稀釋至細胞濃度0D_ = 0. 05 0. 1，涂布于滅菌的空培養(yǎng)皿中，無菌空氣吹干； 用IOKeV注入不同劑量，脈沖方式每次注入5s，間隔15s。離子注入誘變后，將菌膜洗脫下來，計算存活率。實驗結(jié)果如附圖1所示；由圖1可知，1.6X1016ions/cm2是最佳的誘變劑量。實施例2 本實例說明進一步篩選優(yōu)良貝氏梭菌的方法。其中，所使用的培養(yǎng)基配方(％為質(zhì)量百分比)(1)固體平板培養(yǎng)基酵母粉0.3%，蛋白胨0.5%，可溶性淀粉1%，乙酸銨 0.2%,氯化鈉0.2%，七水合硫酸鎂0.3%，磷酸二氫鉀0.1%，磷酸氫二鉀0.1%，七水合硫酸亞鐵0.01%，瓊脂1.5%，其余為水，pH 6。(2)刃天青平板培養(yǎng)基酵母粉0.3%，蛋白胨0.5%，乙酸銨0.2%，氯化鈉 0.2%,七水合硫酸鎂0. 3 %，磷酸二氫鉀0. 1 %，磷酸氫二鉀0. 1 %，七水合硫酸亞鐵 0.01%，瓊脂1.5%，刃天青0.002%，加入1/2 (ν/ν)的未脫毒玉米芯酸解糖液，其余為水， ρΗ 6。(3)玉米芯酸解糖液平板培養(yǎng)基酵母粉0. 3 %，蛋白胨0. 5 %，乙酸銨0. 2 %，氯化鈉0. 2 %，七水合硫酸鎂0. 3 %，磷酸二氫鉀0. 1 %，磷酸氫二鉀0. 1 %，七水合硫酸亞鐵 0. 01 %，瓊脂1. 5%，刃天青0. 002%，用未脫毒玉米芯酸解糖液配置，其余為水，ρΗ 6。(4)搖瓶發(fā)酵篩選培養(yǎng)基I 葡萄糖3%，乙酸銨0.22%，磷酸二氫鉀0.05%，磷酸氫二鉀0. 05%，七水合硫酸鎂0. 02%，一水合硫酸錳0. 001 %，七水合硫酸亞鐵0. 001 %，氯化鈉0.001 %，玉米漿0. 1%，其余為水，ρΗ 6.6。(5)搖瓶發(fā)酵篩選培養(yǎng)基II 乙酸銨0.22%，磷酸二氫鉀0.05%，磷酸氫二鉀 0.05%,七水合硫酸鎂0. 02 %，一水合硫酸錳0. 001 %，七水合硫酸亞鐵0. 001 %，氯化鈉 0. 001%，玉米漿0. 1%，未脫毒玉米芯酸解糖液(總還原糖3% )，其余為水，ρΗ 6.6。篩選步驟1、刃天青平板篩選用生理鹽水洗出經(jīng)離子束誘變的菌株，稀釋成不同濃度涂布于含有酚類抑制物 (0. 02% )和刃天青(0. 002% )的常規(guī)固體培養(yǎng)基平板上，在35°C溫度下厭氧培養(yǎng)30h，挑選可以在篩選平板上生長、菌落較大、且變色圈明顯較大的菌落30株。2、玉米芯酸解糖液平板復篩將篩選的菌株接種于25mL的肖特厭氧瓶裝液量10 15mL，充氮氣3min，35°C厭氧培養(yǎng)10 14h，無菌生理鹽水制成濃度OD = 0. 1的菌懸液，吸取2uL點滴到含有酚類抑制物(0. 15% )和刃天青(0. 002% )的玉米芯酸解糖液平板上，在35°C溫度下厭氧培養(yǎng)12 Mh，挑選出透明圈明顯大于出發(fā)菌的菌落。
最終菌株IB4和IB9顯示了較強的抑制物耐受性和還原活力。3、搖瓶發(fā)酵篩選將菌株IB4、IB9和原始菌株接入種子培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度35°C，250mL的肖特厭氧瓶裝液量lOOmL，充氮氣3min，培養(yǎng)時間12h。然后在以發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，接種量 10% (ν/ν)，發(fā)酵溫度35°C，IOOmL肖特厭氧瓶裝液量60mL，充氮氣3min，發(fā)酵時間7 后檢測各菌株的總?cè)軇┊a(chǎn)量和丁醇產(chǎn)量如表1所示表1篩選培養(yǎng)基中IB4、IB9和原始菌發(fā)酵結(jié)果
權利要求
1.一株高抗逆性貝氏梭菌，其分類命名為貝氏梭菌(Clostridium bei jerinckii) IB4, 已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號CCTCC NO =M 2010310。
2.權利要求1所述的高抗逆性貝氏梭菌在生產(chǎn)丁醇中的應用。
3.根據(jù)權利要求2所述的應用，其特征在于具體應用步驟如下1)平板培養(yǎng)將貝氏梭菌CCTCCNO =M 2010310接種至平板培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度 33 37°C，培養(yǎng)時間12 Mh ；2)種子培養(yǎng)將平板培養(yǎng)的貝氏梭菌CCTCCNO =M 2010310接種到種子培養(yǎng)基中， IOOmL的厭氧瓶裝液量40 60mL，充氮氣3 5min，培養(yǎng)溫度33 37°C，培養(yǎng)時間12 24h ；3)發(fā)酵產(chǎn)丁醇將種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量5 15%(ν/ν)，充氮氣 3 5min，發(fā)酵溫度33 37°C，發(fā)酵培養(yǎng)時間為60 80h。
4.根據(jù)權利要求3所述的應用，其特征在于所述的平板培養(yǎng)基包含如下質(zhì)量百分比的組分碳源0.3% 1%、氮源0.5% 1%、無機鹽0.5% 0.8%、瓊脂1.5% 2%、其余為水；所述的碳源為葡萄糖、淀粉和纖維酸解糖液中的一種或多種；所述氮源為有機或無機含氮化合物，其中無機含氮化合物為乙酸銨和氯化銨中的一種或兩種的混合，有機含氮化合物為蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米漿中的一種或幾種的混合；所述的無機鹽為鈉鹽、 鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽、磷酸鹽、亞鐵鹽中的一種或多種。
5.根據(jù)權利要求3所述的應用，其特征在于所述的種子培養(yǎng)基包含如下質(zhì)量百分比的組分碳源0. 5% 1(%、氮源0. 5% 1(%、無機鹽0. 5% 0. 8%、其余為水；所述的碳源為淀粉和葡萄糖的一種或兩種的混合；所述氮源為有機或無機含氮化合物，其中無機含氮化合物為乙酸銨和氯化銨中的一種或兩種的混合，有機含氮化合物為蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米漿中的一種或幾種的混合；所述的無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽、磷酸鹽、亞鐵鹽中的一種或多種。
6.根據(jù)權利要求3所述的應用，其特征在于所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包含如下質(zhì)量百分比的組分碳源3% 6%、氮源0. 0.3%、無機鹽0. 0.2%、生長因子0. 05% 0. 1%、其余為水；所述的碳源為葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、木質(zhì)纖維酸解糖液和木質(zhì)纖維酶解糖液中的一種或多種；所述的氮源為乙酸銨、氯化銨和酵母粉中的一種或多種；所述的無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽、磷酸鹽、亞鐵鹽中的一種或多種；所述生長因子為對氨基苯甲酸、維生素Bi、生物素和玉米漿中的一種或幾種的混合。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株能直接利用未脫毒木質(zhì)纖維酸解糖液發(fā)酵產(chǎn)丁醇的高抗逆性貝氏梭菌及應用。本發(fā)明公開了一株貝氏梭菌，分類命名為Clostridium beijerinckii IB4，其保藏登記號為CCTCC No.M2010310。本發(fā)明通過離子束誘變，經(jīng)含有酚類等抑制物的刃天青平板和搖瓶發(fā)酵篩選，得到的突變菌株以未脫毒的玉米芯酸解糖液作為碳源，在2L發(fā)酵罐中總?cè)軇┊a(chǎn)量和丁醇產(chǎn)量分別達到了10.3g/L和7.1g/L，分別是同等條件培養(yǎng)的出發(fā)菌株的4.3倍和4.4倍，糖轉(zhuǎn)化率為0.35；其抗逆性強、溶劑產(chǎn)量高、糖轉(zhuǎn)化率高、重復性好，是一種適合利用木質(zhì)纖維原料發(fā)酵產(chǎn)丁醇的優(yōu)良菌種。
文檔編號C12N1/20GK102174433SQ20111002010
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月18日 優(yōu)先權日2011年1月18日
發(fā)明者吳昊, 奚永蘭, 姜岷, 孫佰軍, 李志剛, 歐陽平凱, 湯艷, 郭亭, 陳可泉 申請人:南京工業(yè)大學