專利名稱：一株氧化木糖無色桿菌mg1及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株氧化木糖無色桿菌MGl及其應(yīng)用，屬微生物環(huán)境應(yīng)用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著科技的發(fā)展，合成染料被廣泛應(yīng)用于紡織、皮革、食品、日用化工等行業(yè)中。但這些染料通常含有復(fù)雜的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)、化學(xué)穩(wěn)定性高、環(huán)境可降解性低，且多數(shù)染料及其代謝中間產(chǎn)物具有致突變性、致癌性和其他毒性，這也使得染料成為重要的環(huán)境污染物之一。 作為污染源，染料的首先特點(diǎn)就是污染量大。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前世界染料年產(chǎn)量約為80 90萬噸，我國染料年產(chǎn)量達(dá)15萬噸，位居世界前列。在染料的使用過程中大約有10% 15%被直接排放到污水處理系統(tǒng)或環(huán)境中。其廢水治理率不足30%，治理合格率僅57. 6%。因此， 僅從廢水治理方面來看，染料行業(yè)的環(huán)境保護(hù)任務(wù)也是相當(dāng)艱巨的。其中的三苯甲烷類染料是以三苯甲烷為母體的一類染料，其分子結(jié)構(gòu)是中心碳原子上連有三個(gè)苯環(huán)，不同的側(cè)鏈基團(tuán)決定了不同染料結(jié)構(gòu)和一些相應(yīng)的特性。這類染料具有著色力強(qiáng)、色澤鮮艷等特點(diǎn)，因而被廣泛用于紡織、造紙、醫(yī)藥、食品和化妝品等領(lǐng)域。較常見的有孔雀綠、結(jié)晶紫、及堿性品紅。此外，它們還被廣泛用做治療皮膚病的藥劑。但體外試驗(yàn)表明，這些化合物具有有絲分裂毒性?？兹妇G在濃度低至0. lmg/L時(shí)，對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞都是高毒性的，能促進(jìn)肝臟腫瘤的形成以及導(dǎo)致小白兔和魚的異常增殖。因此，必須采取有效的措施來將染料的危害降到最低。對(duì)于染料處理，目前各國主要有物理、化學(xué)和生物的方法。但物化法的運(yùn)行成本通常較高，效率較差，且容易產(chǎn)生二次污染。生物降解染料廢水具有成本低，無二次污染，生態(tài)恢復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，已成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。生物降解處理是一種急待開發(fā)的新技術(shù)，因而篩選高效廣譜的染料脫色菌株具有重要的理論和實(shí)用價(jià)值。氧化木糖無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)是一類廣泛存在于環(huán)境中的桿狀革蘭氏陰性細(xì)菌。AchromcAacter xylosoxidans MGl是我們實(shí)驗(yàn)室從印染污水中分離篩選，并經(jīng)過馴化得到的一株高效降解孔雀綠的菌株。關(guān)于其脫色活性和相關(guān)機(jī)理尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一株氧化木糖無色桿菌MGl及其應(yīng)用，通過對(duì)一株氧化木糖無色桿菌MGl的研究，開發(fā)生物脫色劑。本發(fā)明人在開展染料脫色機(jī)理的研究中，從印染污水分離到的細(xì)菌中篩選到氧化木糖無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)MGl菌株，MGl菌株已于2010年12月15日保存于中國微生物菌種保藏委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)CGMCC N0. 4476，保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。本發(fā)明篩選到的一株氧化木糖無色桿菌MG1，其特征為短桿狀或圓棒狀，多以散在形式存在，革蘭氏陰性。在LB平板培上菌落小呈圓形，乳白色，凸起，不透明，表面濕潤，
3邊緣較整齊。同時(shí)我們的研究還發(fā)現(xiàn)，該菌株具有高效的降解三苯甲烷類染料孔雀綠和結(jié)晶紫的活性，其所具有的脫色功能主要源于胞內(nèi)酶、及胞外小分子化合物成份。巢式PCR結(jié)果顯示，該菌含有降解三苯甲烷類染料的基因tmr。甲吡酮抑制實(shí)驗(yàn)表明，細(xì)胞色素P450不參與胞內(nèi)的染料降解過程。此外，菌體本身也具有對(duì)染料進(jìn)行物理性吸附的作用。本發(fā)明通過常規(guī)的方法從自然界中進(jìn)行菌株分離、純化、培養(yǎng)，然后經(jīng)過五次馴化處理，使其具有超強(qiáng)的脫色高效性。在孔雀綠的濃度高達(dá)2000mg/L時(shí)，1小時(shí)對(duì)其脫色率可高達(dá)86 士 1 %。本發(fā)明的菌株對(duì)三苯甲烷類染料中的結(jié)晶紫有較好的脫色的作用，能夠作為制備生物脫色劑的應(yīng)用。本發(fā)明具有能擴(kuò)寬降解染料的菌種范圍，使得環(huán)境中的孔雀綠、結(jié)晶紫多了一條人工降解的途徑，降低環(huán)境污染治理成本的優(yōu)點(diǎn)。


圖1為氧化木糖無色桿菌MGl的菌落形態(tài)照片及其光鏡下的菌體。其中圖l-a為氧化木糖無色桿菌MGl的菌落形態(tài)；圖Ι-b為光鏡觀察的氧化木糖無色桿菌MGl。圖2顯示氧化木糖無色桿菌MGl在不同孔雀綠濃度下的脫色率。圖3為氧化木糖無色桿菌MGl中基因tmr的克隆和序列的比對(duì)結(jié)果。其中3_a為 PCR擴(kuò)增基因tmr的瓊脂糖電泳圖；圖3_b為基因tmr和CitrcAacter來源的同源序列比對(duì)的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下是本發(fā)明的實(shí)施例，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的篩選純化出氧化木糖無色桿菌后，用孔雀綠對(duì)其進(jìn)行多次馴化。然后測(cè)其最終的脫色活性。并對(duì)其胞內(nèi)和胞外的脫色機(jī)理進(jìn)行探究。氧化木糖無色桿菌MGl的純化、培養(yǎng)及馴化方法(以下為重量百分比)1、平板純化培養(yǎng)LB 平板培養(yǎng)基配方為0. 5 % YeastExtract, 1 % Tryptone, 1 % NaCl，1. 5-2 % Agar，pH自然。將混合菌體接種到平板培養(yǎng)基上，37°C下培養(yǎng)，獲得單菌落。2、液體擴(kuò)大培養(yǎng)LB 液體培養(yǎng)基配方為0.5% Yeast Extract, 1% Tryptone, 1% NaCl，余下的為水，PH自然。將平板上的單菌落接種進(jìn)液體培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)直到0D_為0. 50 0. 60。恒溫?fù)u床溫度為38°C，轉(zhuǎn)速為190rpm。3、菌株的馴化化培養(yǎng)基的配方為ΚΗ2Ρ040·05 %, K2HPO4O. 15 %, NaCl 0. 05 %, MgSO4 · 7Η200· 05%, NH4Cl 0. 1%，孔雀綠的濃度由50mg/L增至最后的100mg/L。每次馴化的時(shí)間為5天。馴化在38°C的恒溫?fù)u床上進(jìn)行，轉(zhuǎn)速為190rpm。氧化木糖無色桿菌MGl對(duì)孔雀綠的脫色試驗(yàn)1、不同菌株脫色能力的測(cè)試脫色培養(yǎng)基成分為0.5%YeastExtract，1 % iTryptone, 1 % NaCl，40mg/L 的孔雀綠。將經(jīng)過過夜培養(yǎng)的菌液按一定的接種量接種進(jìn)脫色培養(yǎng)基，定時(shí)測(cè)試不同菌株的脫色率，篩選出其中脫色能力最強(qiáng)的一株。2、脫色率的計(jì)算方法孔雀綠的特征性吸收波峰為617nm，脫色率就是通過紫外-可見光掃描式分光光度儀測(cè)試在最大吸收波峰處峰值的降低情況來進(jìn)行計(jì)算的。將脫色后的培養(yǎng)液離心處理 (12，000印111，2分鐘)，上清在61711111處測(cè)吸光度。脫色率的計(jì)算公式為脫色率(%) = 100 (A-B)/A其中A是未經(jīng)細(xì)菌脫色的617nm吸光度B為細(xì)菌脫色后的617nm吸光度3、外界不同環(huán)境對(duì)脫色率的影響(1)測(cè)試溫度、PH、溶氧對(duì)脫色率影響實(shí)驗(yàn)，方法如下菌種接種在含90ml LB液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中過夜培養(yǎng)，溫度38 °C，轉(zhuǎn)速190rpm，使最終菌體的0D_為0. 50 0. 60。為測(cè)試溫度對(duì)脫色率的影響，無菌接入 10ml400mg/l的孔雀綠(終濃度為40mg/l)，將培養(yǎng)物分別放入、38°C及48°C恒溫?fù)u床上進(jìn)行脫色培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速190rpm。測(cè)試PH值因素時(shí)，將接入孔雀綠(濃度同上)的培養(yǎng)物用 HCl 和 NaOH 將其最終 PH 分別調(diào)至 3. 0,4. 0,5. 0,6. 0,7. 0,8. 0,9. 0,10. 0,11. 0,12. 0，然后置于190rpm、38°C的恒溫?fù)u床上。溶氧也是影響脫色的一個(gè)因素，我們通過選擇不同轉(zhuǎn)速的搖床(Orpm、lOOrpm、190rpm)對(duì)溶氧量的影響進(jìn)行了測(cè)試，在Orpm的情況下，還分別用礦物油對(duì)脫色培養(yǎng)物采取液封和不液封兩種情形檢測(cè)其脫色率的差異。(2)不同碳源對(duì)菌體脫色影響的實(shí)驗(yàn)方法如下為了測(cè)試不同碳源下氧化木糖無色桿菌MGl對(duì)孔雀綠的降解情況，我們選擇了常用的5種碳源進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)?；A(chǔ)培養(yǎng)基是M9，配方如下12. 8g/lNa2HP04 ·7Η20，3g/lKH2P04， 0. 5g/l NaCl，1. 0g/lNH4Cl，不同的碳源分別為 5. Og/1 Yeast extracts, 10g/l Peptone, 3g/l BeefExtract, 10g/l Glucose 禾口 3g/l Beefextract 與 5g/l Peptone for Fish 的混合碳源。最后添加孔雀綠，使其終濃度為40mg/l。細(xì)菌的培養(yǎng)方式同上，之后將發(fā)酵液在 8，OOOrpm下離心10分鐘，棄去上清，沉淀的細(xì)胞在無菌條件下加入到上述的含不同碳源的 M9脫色培養(yǎng)基中，190rpm，38°C下進(jìn)行脫色培養(yǎng)。4、脫色機(jī)理的探究實(shí)驗(yàn)(1)驗(yàn)證脫色過程是否有細(xì)胞色素P450的參與(甲吡酮抑制實(shí)驗(yàn))將氧化木糖無色桿菌MGl過夜培養(yǎng)，發(fā)酵液8，500rpm、4°C離心15分鐘。沉淀用含 ImM EDTA的50mM磷酸鈉緩沖液(PH為7)吹洗懸浮，然后在冰上通過超聲將菌體破碎(超聲 5秒，停7秒，破碎時(shí)間15分鐘，48%振幅)，之后加入MgCl2使其終濃度為2mM。12，OOOrpm、 4°C離心1分鐘去掉未破碎的細(xì)胞，12，000rpm、4°C離心30分鐘將細(xì)胞膜碎片(沉淀)和可溶性物質(zhì)(上清)分開后，沉淀用含ImM EDTA的50mM磷酸鈉緩沖液吹洗懸浮，然后分別加入甲吡酮使其終濃度為IOmM (對(duì)照組不添加甲吡酮)，37°C溫浴10分鐘后，加入一定量的孔雀綠測(cè)其脫色活性。(2)脫色基因的克隆巢式PCR設(shè)計(jì)巢式PCR 的兩對(duì)引物，分別為 P1(F)5，AGTCAAATCATTGCCATCGTG 3' ；Pl (R)5' GGTTTCCTTCAGAGGGGTC 3' ；P2 (F)5' GCTCTTTATCTCAGGTCCGC 3'；
5P2 (R) 5'ACACCAGCGTTTACGAGGA 3，。PCR 50tl 的體系為模板 1 μ 1，正向引物(10 μ M) 1 μ 1， 反向引物(10 μ Μ)1 μ 1，10 X Taq Buffer 5 μ 1，dNTP Mixture(2. 5mM)4 μ 1，Taq(2. 5U/ μ 1) 1 μ 1，ddH20 37 μ 1。擴(kuò)增的條件為94°C 30秒，56V 30秒，72°C 1分鐘，總共35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增出的片段測(cè)序后在GenBank中進(jìn)行比對(duì)。(3)胞外脫色活性實(shí)驗(yàn)將細(xì)菌在含100ml LB培養(yǎng)基的250ml的三角瓶中38°C、190rpm過夜培養(yǎng)，當(dāng)OD6tltl 為0. 50時(shí)，8，OOOrpm離心10分鐘，然后再10，OOOrpm離心20分鐘以充分地去除菌體。上清中加入孔雀綠使其終濃度為40mg/l，在不同的時(shí)間段內(nèi)取樣測(cè)脫色活性。對(duì)照組為不接菌的LB和不經(jīng)離心處理的發(fā)酵液。5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果從現(xiàn)在已有的報(bào)道來看，能對(duì)孔雀綠脫色的最高濃度是500 μ mol/1 (約lS^iig/ 1)，Pseudomonas otitidis W/L3在12小時(shí)內(nèi)能降解到95%，而氧化木糖無色桿菌MGl在孔雀綠的濃度高達(dá)2000mg/L時(shí)，1小時(shí)對(duì)其脫色率可高達(dá)86士 1%。具體數(shù)據(jù)如下表。脫色的最佳條件為190rpm，38°C，PH為6時(shí)。在所測(cè)試的碳源中，最佳營養(yǎng)為Beefextract 與P印tone for Fish的混合碳源。巢式PCR結(jié)果顯示，該菌株含有三苯甲烷還原酶的基因 tmr。甲吡酮抑制實(shí)驗(yàn)證明，盡管具有如此高效的脫色率，脫色過程并沒有細(xì)胞色素P450的參與。而胞外物質(zhì)則具有很強(qiáng)的脫色活性。表氧化木糖無色桿菌MGl在不同孔雀綠濃度下的脫色率
權(quán)利要求
1.一株氧化木糖無色桿菌MGl菌株，從印染污水中分離到的細(xì)菌中篩選到，其特征在于氧化木糖無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)MGl菌株，已于2010年12月15日保存于中國微生物菌種保藏委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)CGMCC NO. 4476。
2.權(quán)利要求1所述的氧化木糖無色桿菌MGl菌株，其特征在于該菌株從自然界分離后，經(jīng)純化、培養(yǎng)、馴化后，對(duì)三苯甲烷類染料孔雀綠具有超強(qiáng)的脫色活性，且對(duì)結(jié)晶紫亦有較好的脫色的作用，能夠作為制備生物脫色劑的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株氧化木糖無色桿菌MG1及其應(yīng)用，屬微生物環(huán)境應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明通過常規(guī)的方法從從印染污水中分離到的細(xì)菌中篩選到，氧化木糖無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)MG1菌株，已于2010年12月15日保存于中國微生物菌種保藏委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)CGMCC NO.4476。本發(fā)明的氧化木糖無色桿菌菌株MG1，對(duì)三苯甲烷類染料中的孔雀綠具有超強(qiáng)的脫色高效性，在孔雀綠的濃度高達(dá)2000mg/L時(shí)，1小時(shí)對(duì)其脫色率可高達(dá)86±1％。此外，MG1菌株對(duì)結(jié)晶紫也有較好的脫色的作用，能夠作為制備生物脫色劑的應(yīng)用本發(fā)明具有能擴(kuò)寬降解染料的菌種范圍，使得環(huán)境中的孔雀綠、結(jié)晶紫多了一條人工降解的途徑，降低環(huán)境污染治理成本的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102181379SQ20111002043
公開日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月18日
發(fā)明者喬敏, 周薇, 張克勤, 王紀(jì)愛, 黃曉瑋 申請(qǐng)人:云南大學(xué)