專利名稱:耐熱型甲酸脫氫酶基因及其編碼的多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種甲酸脫氫酶,尤其涉及一種耐熱型甲酸脫氫酶基因及其編碼的多肽和制備方法。
背景技術(shù):
甲酸脫氫酶(formate dehydrogenase,FDH,ECl. 2. 1. 2)催化甲酸生成 CO2 和 H2O,同時(shí)將NAD+還原為NADH。細(xì)菌來(lái)源的NAD+依賴型甲酸脫氫酶由2個(gè)相同的亞基組成, 對(duì)甲酸和NAD+具有高度的專一性。甲酸脫氫酶主要應(yīng)用于輔酶NADH的酶耦聯(lián)法再生系統(tǒng)中。甲酸/甲酸脫氫酶再生體系具有以下優(yōu)點(diǎn)1)作為再生底物的甲酸價(jià)格低廉;2)甲酸脫氫酶來(lái)源分布較廣,在細(xì)菌、真菌、植物中均有分布;3)甲酸脫氫酶的催化產(chǎn)物(X)2易于從體系中去除,不會(huì)干擾目標(biāo)產(chǎn)物的分離;4)反應(yīng)體系中低濃度甲酸不會(huì)影響其他酶活性。但是目前也存在著活性較低,熱穩(wěn)定性不好,酶價(jià)格昂貴等缺點(diǎn),限制了其使用范圍。 工業(yè)界唯一一例大規(guī)模生產(chǎn)過(guò)程中用到甲酸脫氫酶的即是德國(guó)Degussa公司利用來(lái)源于 Candida boidinii 的 FDH 生產(chǎn) L-亮氨酸。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足,提供一種耐熱型甲酸脫氫酶基因及其編碼的多肽和制備方法。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的
一種耐熱型甲酸脫氫酶基因,它具有SEQ ID NO. 1的核苷酸序列以及它的突變形式,所述突變類型包括缺失、無(wú)義、插入、錯(cuò)義。一種上述耐熱型甲酸脫氫酶基因編碼的多肽,它具有SEQ ID No. 2中的氨基酸序列。本發(fā)明的有益效果是,本發(fā)明涉及ifeciBm sp.的耐熱型甲酸脫氫酶基因的分離及表達(dá)。以甲酸脫氫酶保守序列為基礎(chǔ),克隆分離了耐熱型甲酸脫氫酶基因。該基因?qū)τ谥苽溆糜谏a(chǎn)耐熱型甲酸脫氫酶的轉(zhuǎn)基因微生物或動(dòng)植物,并回收獲得該基因編碼的酶有用。Bacillus sp.保存于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC),保藏編號(hào)CGMCC No. 4271,分類命名芽孢桿菌 {Bacillus sp.)。
具體實(shí)施例方式首先,本發(fā)明提供了分離的,編碼耐熱型甲酸脫氫酶活性的多肽的多聚核苷酸分子,該核苷酸分子是從feciBm sp.中分離到的,具有SEQ. ID NO. 1的核苷酸序列,它編碼具有401個(gè)氨基酸的多肽,推測(cè)分子量為44. 07 kDa。本發(fā)明還涉及一種重組載體,該載體包含本發(fā)明的分離的核苷酸分子,以及包含有重組載體的宿主細(xì)胞。同時(shí),本發(fā)明包括構(gòu)建該重組載體和宿主細(xì)胞的方法,以及用重組工程技術(shù)生產(chǎn)耐熱型甲酸脫氫酶的方法。本發(fā)明進(jìn)一步地提供了一種分離的耐熱型甲酸脫氫酶或多肽,具有SEQ. ID NO. 2 氨基酸序列,或至少70%相似,更佳地,至少具有90%,95%,99%的相同。在本發(fā)明中,“分離的” DNA是指該DNA或片斷已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來(lái),還指該DNA或片斷已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。在本發(fā)明中,“耐熱型甲酸脫氫酶基因”指編碼具有耐熱型甲酸脫氫酶活性的多肽的核苷酸序列,如SEQ. ID NO. 1的核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指該序列中有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于公知的密碼子的簡(jiǎn)并性,所以與SEQ ID NO. 1核苷酸序列同源性低至約70%的簡(jiǎn)并序列也能編碼出 SEQ ID NO. 2所述的氨基酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括能在中度嚴(yán)謹(jǐn)條件下,更佳地在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO. 1的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括與SEQ ID NO. 1核苷酸序列同源性至少70%,較佳地至少80%,更佳地至少90%,最佳地至少95%的核苷酸序列。在本發(fā)明中,“分離的”蛋白的多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20%,較佳地至少50%,更佳地至少80%,最佳地至少90% (按干重或濕重計(jì))。純度可以用任何合適的方法進(jìn)行測(cè)量,如用柱層析,PAGE或HPLC法測(cè)量多肽的純度。分離的多肽基本上不含天然狀態(tài)下的伴隨其的組份。在本發(fā)明中,“耐熱型甲酸脫氫酶”指具有耐熱型甲酸脫氫酶活性的SEQ ID N0. 2 序列的多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括SEQ ID N0. 2序列的變異體,這些變異體具有與天然甲酸脫氫酶相同的功能。這些變異體包括(但不限于)若干個(gè)氨基酸的缺失,插入和/或取代,以及在 C末段和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸,也可以是不影響序列的修飾形式上的差異。例如,為本領(lǐng)域所公知的,用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí),通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如,在C末段和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。 該術(shù)語(yǔ)還包括耐熱型甲酸脫氫酶的活性片斷和活性衍生物。在本發(fā)明中,可選用本領(lǐng)域已知的各種載體,如市售的各種質(zhì)粒,粘粒,噬菌體及反轉(zhuǎn)錄病毒等。在生產(chǎn)本發(fā)明的耐熱型甲酸脫氫酶時(shí),可以將耐熱型甲酸脫氫酶基因序列可操作低連于表達(dá)調(diào)控序列,從而形成耐熱型甲酸脫氫酶表達(dá)載體。表達(dá)載體含有復(fù)制起始點(diǎn)和表達(dá)調(diào)控序列,啟動(dòng)子,增強(qiáng)子和必要的加工信息位點(diǎn)。表達(dá)載體還必須含有可供選擇的標(biāo)記基因,如a)提供對(duì)抗生素或其它毒性物質(zhì)(氨芐青霉素,卡那霉素,氨甲蝶呤等)的抗性的蛋白質(zhì)或b)互補(bǔ)營(yíng)養(yǎng)缺陷型蛋白質(zhì)或c)提供復(fù)合培養(yǎng)基中沒(méi)有的必需營(yíng)養(yǎng)成分的蛋白質(zhì)。各種不同宿主的合適標(biāo)記基因是本領(lǐng)域中所熟知或生產(chǎn)廠商說(shuō)明書著名的。這些表達(dá)載體可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的重組DNA技術(shù)制備,如可參考Sambrook等人,1989 或 Ausubel 等人,1992。重組表達(dá)載體可以用本領(lǐng)域熟知的方法引入宿主細(xì)胞,這些方法包括電轉(zhuǎn)化法, 氯化鈣法,基因槍法等。將外源重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的過(guò)程稱為“轉(zhuǎn)化”。通過(guò)培養(yǎng)宿主細(xì)胞,誘導(dǎo)所需蛋白的表達(dá),并通過(guò)本領(lǐng)域所熟知的蛋白分離技術(shù),如柱層析等得到所需的蛋白質(zhì)。也可采用固相技術(shù)等人工合成該蛋白質(zhì)。在本發(fā)明中,術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核細(xì)胞如大腸
4桿菌,枯草桿菌等。常用的真核細(xì)胞如酵母細(xì)胞,或各種動(dòng)植物細(xì)胞。本發(fā)明的耐熱型甲酸脫氫酶基因全長(zhǎng)序列或其片斷通??梢杂肞CR擴(kuò)增法,重組法,或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法,可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列來(lái)設(shè)計(jì)引物,用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法制備的ifeciBm sp.的DNA為模極,擴(kuò)增而得到有關(guān)序列。一旦獲得了有關(guān)序列,就可以將其克隆入有關(guān)載體,再轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞,然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到大批量的有關(guān)序列。下面結(jié)合具體實(shí)施例,進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解,這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法,通常按照常規(guī)條件,例如Sambrook等人,分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1 耐熱型甲酸脫氫酶基因的克隆
耐熱型甲酸脫氫酶基因的克隆采用簡(jiǎn)并PCR和TAIL-PCR進(jìn)行。首先培養(yǎng)ifeciBm sp.,使用LB培養(yǎng)基于30度培養(yǎng)M小時(shí)后收集菌體,提取總DNA。根據(jù)GenBank中公布的已知細(xì)菌來(lái)源的NAD+依賴型甲酸脫氫酶同源基因序列設(shè)計(jì)其保守區(qū)之間的簡(jiǎn)并引物,以提取的總DNA為模版,進(jìn)行簡(jiǎn)并PCR。將簡(jiǎn)并PCR獲得的約350 bp DNA進(jìn)行測(cè)序。以此350 bp DNA序列為基礎(chǔ),設(shè)計(jì)TAIL-PCR引物。隨后以feciBm sp.基因組DNA為模板,分別對(duì)上下游進(jìn)行三輪TAIL-PCR,以獲得甲酸脫氫酶基因全長(zhǎng)。將簡(jiǎn)并PCR和TAIL-PCR獲得的序列通過(guò)Vector NTI 9. O中的Contig Express進(jìn)行拼接,得到甲酸脫氫酶基因的全長(zhǎng)序列 (SEQ ID NO. 1)。實(shí)施例2 耐熱型甲酸脫氫酶表達(dá)載體的構(gòu)建
根據(jù)實(shí)施例中基因注釋得到的甲酸脫氫酶全長(zhǎng)編碼序列(SEQ ID N0. 1),設(shè)計(jì)能擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物,并在正反引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn),以便構(gòu)建表達(dá)載體。^XBaciIlus sp.的DNA為模板,擴(kuò)增耐熱型甲酸脫氫酶基因全長(zhǎng)。在保證閱讀框正確的前提下重組至表達(dá)載體pET28a (Novagen)中,再將重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中(轉(zhuǎn)化方法為CaCl2法或電轉(zhuǎn)化法),以抗生素標(biāo)記法篩選(本例中為卡那霉素抗性)陽(yáng)性的重組菌DH5 α -pET28a-FDH0挑取單菌落的工程菌DH5 α -pET28a-FDH于4 ml含 30 μ g/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中振搖培養(yǎng)37° C過(guò)夜,提取重組質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化至表達(dá)載體大腸桿菌BL21(DE!3)感受態(tài)細(xì)胞中,以抗生素標(biāo)記法篩選(本例中為卡那霉素抗性)陽(yáng)性的重組高效表達(dá)菌BL21-pET28a-FDH。實(shí)施例3 重組耐熱型甲酸脫氫酶的表達(dá)和純化
挑取單菌落的工程菌BL21-pEI^8a-FDH于4 ml含30 μ g/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中振搖培養(yǎng)37° C過(guò)夜,按1 :100的濃度吸取培養(yǎng)液于新的LB培養(yǎng)基(含30μ g/ml卡那霉素) 中培養(yǎng)約3小時(shí),至0D600達(dá)0. 5后,加入IPTG至終濃度0. 5 mmol/L,繼續(xù)于37° C分別培養(yǎng)0,1,2,3小時(shí)。取培養(yǎng)時(shí)間不同的1 ml菌液離心,在細(xì)菌沉淀物中加入裂解液(2XSDS 上樣緩沖液50 μ 1,蒸餾水45 μ 1,二巰基乙醇5 μ 1),懸浮細(xì)菌沉淀,沸水浴中煮5分鐘, 12000 rpm離心1分鐘,上清加入12% SDS-PAGE膠中電泳。染色后觀察預(yù)期分子量大小的蛋白量隨IPTG誘導(dǎo)時(shí)間增加而增加的菌株即為表達(dá)所需蛋白的工程菌。按上述方法誘導(dǎo)表達(dá)所需蛋白的工程菌后,將細(xì)菌離心沉淀,按每100 ml菌加入 8 ml Binding Buffer,超聲破碎后,15000 rpm離心30分鐘后取上清,加入2 ml Ni-NTA樹
5(Invitrogen), 30° C振搖結(jié)合30分鐘,靜置沉淀,棄上清,沉淀用10 ml Wash Buffer 洗滌2次后,上2 ml層析柱,然后用Elution Buffer洗脫目的蛋白,以1 ml為單位分管收集,合并酶活最高的幾管。洗脫的上清添加50%的甘油后保存于-80° C,并進(jìn)行SDS-PAGE 電泳,檢測(cè)純化效果。在45 kDa處的蛋白質(zhì)條帶即為甲酸脫氫酶。
實(shí)施例4 重組耐熱型甲酸脫氫酶性質(zhì)的測(cè)定
將純化后的甲酸脫氫酶分別測(cè)定其最適反應(yīng)溫度、最適反應(yīng)PH、溫度穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、底物譜和動(dòng)力學(xué)研究。
權(quán)利要求
1.一種耐熱型甲酸脫氫酶基因,其特征在于它具有SEQ ID NO. 1的核苷酸序列以及它的突變形式,所述突變類型包括缺失、無(wú)義、插入、錯(cuò)義。
2.—種權(quán)利要求1所述耐熱型甲酸脫氫酶基因編碼的多肽,其特征在于它具有SEQ ID No. 2中的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種耐熱型甲酸脫氫酶基因及其編碼的多肽和制備方法,本發(fā)明以Bacillussp.為基礎(chǔ),克隆分離了耐熱型甲酸脫氫酶基因,該基因?qū)τ谥苽溆糜谏a(chǎn)耐熱型甲酸脫氫酶的轉(zhuǎn)基因微生物或動(dòng)植物,并回收獲得該基因編碼的酶有用。另外,本發(fā)明還提供了具有耐熱型甲酸脫氫酶活性的多肽的氨基酸序列及功能等同體。同時(shí),本發(fā)明還提供了制備,分離,純化具有耐熱型甲酸脫氫酶活性的多肽的方法。
文檔編號(hào)C12N9/02GK102296079SQ20111002049
公開日2011年12月28日 申請(qǐng)日期2011年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月18日
發(fā)明者丁海濤, 劉丹鳳, 李澤麗, 杜怡青, 趙宇華 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)