專(zhuān)利名稱(chēng)：光誘導(dǎo)的棉花花色素合成調(diào)控基因GhMYBAP及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種促進(jìn)棉花及其他植物花色素合成和累積的基因。本發(fā)明還涉及該基因編碼的多肽，含有該基因的表達(dá)載體，以及該基因在促進(jìn)植物花色素合成和積累中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
花色素是一類(lèi)重要的植物非光合色素。它在自然界植物中廣泛存在，是給植物葉、 花和果實(shí)著色的主要色素。花色素主要在植物細(xì)胞的液泡中積累，具水溶性，在PH或其它因素的作用下，可使植物呈現(xiàn)從粉紅到紫色的變化?；ㄉ赝瑫r(shí)是一種重要的抗氧化物質(zhì)， 廣泛用于保健、食品等行業(yè)。正因?yàn)槿绱?，色彩不僅在園藝觀賞植物中至關(guān)重要，在糧食、纖維、蔬菜、水果等作物中也是重要的品質(zhì)性狀。利用基因工程技術(shù)，在植物中激活花色素合成，獲得有色的植物產(chǎn)品，有著廣闊的應(yīng)用前景。高等植物的花色素合成屬于苯丙烷途徑的一個(gè)支路，從苯丙氨酸到最終產(chǎn)物花色素苷是一個(gè)由多步生化反應(yīng)組成的復(fù)雜生物合成途徑。每步反應(yīng)均由不同結(jié)構(gòu)基因編碼的酶催化。遺傳學(xué)證據(jù)表明，植物花色素合成主要受I 2R3-MYB、WD40和bHLH三類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。這些轉(zhuǎn)錄因子相互作用形成復(fù)合體結(jié)合到結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子上，激活花色素生物合成途徑中一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)花色素在植物體內(nèi)的合成和累積，使植物器官或組織顯色。相對(duì)于bHLH和WD40蛋白，R2R3-MYB蛋白專(zhuān)一性更強(qiáng)，一般調(diào)控花色素合成的 Ii2R3-MTO蛋白只參與花色素合成的調(diào)控，而bHLH和WD40則可能同時(shí)參與其他生理過(guò)程(如原花色素合成和表皮毛決定等)的調(diào)控。因此，I^2R3-MYB蛋白及其編碼基因在植物花色素合成中具有中心調(diào)控作用。前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)強(qiáng)光照能誘導(dǎo)棉花葉片和莖合成花色素(圖1)。本發(fā)明利用同源克隆的方法從棉花葉片中克隆了一個(gè)I^2R3-MYB蛋白基因(GhMYBAP，Gossypium hirsutum anthocyanin promoting MYB)。表達(dá)分析表明GhMYBAP基因的表達(dá)受強(qiáng)光誘導(dǎo)， 可能與莖葉中光誘導(dǎo)的花色素合成相關(guān)(圖1)。轉(zhuǎn)基因研究表明，該基因的上調(diào)表達(dá)能夠促進(jìn)煙草和棉花體內(nèi)的花色素合成和累積，使相應(yīng)的器官和組織顯紅色(圖4、5和6)。 GhMYBAP基因的克隆和功能驗(yàn)證為棉花與其他植物的花色素基因工程調(diào)控奠定了基礎(chǔ)，利用棉花纖維特異啟動(dòng)子控制該基因的表達(dá)有可能在棉花纖維中特異合成和累積花色素，從而創(chuàng)建轉(zhuǎn)基因的彩色棉。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種促進(jìn)植物花色素合成和累積的基因。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述基因編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供含有上述基因的表達(dá)載體。本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供上述基因在農(nóng)業(yè)、林業(yè)作物育種中的應(yīng)用，用于獲得具高含量花色素的植物材料，改良植物產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和外觀品質(zhì)。
3
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明采用基因工程技術(shù)，分離出一種促進(jìn)植物花色素合成和累積的棉花花色素合成調(diào)控基因GhMYBAP，來(lái)源于棉花(Gossypium hirsutum)，其具有如SEQ ID NO. 1所示的DNA序列。此外，與SEQ ID NO. 1所示的DNA序列具有80%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列也屬于本發(fā)明的范圍。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，一種由上述基因GhMYBAP編碼的蛋白質(zhì)，其為如SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。此外，將SEQ ID NO. 2的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID N0. 2的氨基酸序列相同生物活性的由SEQ ID N0. 2衍生的蛋白質(zhì)也屬于本發(fā)明的范圍。SEQ ID NO. 1所示的DNA序列由835個(gè)堿基組成，編碼序列表中由251個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)序列SEQ ID N0. 2。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供包含上述基因的重組載體，以及包含上述重組載體的宿主細(xì)胞。所述重組載體是至少含有上述一種或多種基因以及組成型或組織特異型啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體。在一種實(shí)施方式中，將SEQ IDN0. 1基因的cDNA構(gòu)建在 CaMV35S啟動(dòng)子下游，得到植物表達(dá)載體(其結(jié)構(gòu)如圖3所示)或者用組織特異型啟動(dòng)子替換CaMV35S啟動(dòng)子而得到的植物表達(dá)載體。進(jìn)一步地，通過(guò)所述植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主而獲得的轉(zhuǎn)化體也屬于本發(fā)明的范圍。將本發(fā)明的植物表達(dá)載體利用電擊法和凍融法等方法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌即會(huì)得到含有該表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌株。本發(fā)明還提供了所述新基因GhMYBAP在促進(jìn)植物中花色素的合成和積累中的應(yīng)用，典型地是用于改良植物產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和外觀品質(zhì)。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草和轉(zhuǎn)基因棉花的分析，發(fā)現(xiàn)超量表達(dá)GhMYBAP基因能夠促進(jìn)花色素的合成和累積，花色素含量顯著提高， 相應(yīng)的組織器官呈現(xiàn)紅色(圖4、5和6)。因此該基因的表達(dá)可能在轉(zhuǎn)基因植物的組織器官中激活花色素合成，從而獲得具高含量花色素的植物材料，改良植物產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和外觀品質(zhì)。這對(duì)于農(nóng)業(yè)、林業(yè)中培養(yǎng)優(yōu)良的作物品種具有重要意義。


圖1 棉花花色素合成和GhMYBAP基因表達(dá)的光誘導(dǎo)特性A、B和C分別為陽(yáng)光直射處理(L-S)和未處理(L-W)葉片的顏色變化、花色素 (Anthocyanin)含量和GhMYBAP基因表達(dá)的變化。D、E和F分別為陽(yáng)光直射(S-S)和蔭蔽 (S-W)莖段的顏色變化、花色素含量和GhMYBAP基因表達(dá)的變化。用比色法檢測(cè)花色素含量 (Q = (A530-O. 25 X A657) XM—1，其中M為稱(chēng)取的葉片鮮重)。用定量RT-PCR方法檢測(cè)GhMYBAP 基因的相對(duì)表達(dá)水平(REL, relative expression level)。圖2 組成型啟動(dòng)子CaMV35S調(diào)控下的棉花GhMYBAP基因表達(dá)載體的構(gòu)建流程圖NPTII 新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因；⑶S β -葡萄糖酸苷酶基因；CaMV 35S 來(lái)源于花椰菜花葉病毒的植物組成性啟動(dòng)子；NosTer :Nos終止子。用于構(gòu)建植物表達(dá)載體的骨架載體為pBI121，具有CaMV 35S啟動(dòng)子調(diào)控下的NPTII基因，便于在植物遺傳轉(zhuǎn)化的過(guò)程中對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行卡那霉素(Kan)抗性的篩選。圖3 組成型啟動(dòng)子CaMV35S調(diào)控下的棉花GhMYBAP基因表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)示意圖
圖4 超量表達(dá)GhMYBAP基因促進(jìn)煙草的花色素合成A，野生型(WT)和GhMYBAP超量表達(dá)(AP-5)煙草的葉片；B，4個(gè)GhMYBAP超量表達(dá)煙草植株(AP-1，-3，-5和-7)和野生型葉片的花色素含量(Q = (A530-O. 25XA657) XM-1， 其中M為稱(chēng)取的葉片鮮重)；C，4個(gè)GhMYBAP超量表達(dá)煙草植株(AP-1，-3，-5和-7)和野生型葉片中GhMYBAP基因的相對(duì)表達(dá)水平(REL，relative expression level)。圖5 超量表達(dá)GhMYBAP基因特異促進(jìn)煙草花色素途徑的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)用定量RT-PCR方法比較了 GhMYBAP超量表達(dá)(AP_5)和野生型(WT)煙草葉片中的花色素途徑結(jié)構(gòu)基因的相對(duì)表達(dá)水平(REL，relative expressionlevel) 0發(fā)現(xiàn)屬于花色素合成支路的查兒酮合成酶(OB)、查兒酮異構(gòu)酶(CHI)、類(lèi)黃酮3-羥化酶(F3H)、二氫黃酮醇還原酶(DFR)和花色素合成酶(ANQ基因在超量表達(dá)植株中顯著上調(diào)；而屬于苯丙烷途徑共有的苯丙氨酸氨解酶(PAL)和香豆酸輔酶A連接酶(4CL)基因在超量表達(dá)植株中的表達(dá)量比野生型低。圖6 超量表達(dá)GhMYBAP基因促進(jìn)棉花的花色素合成A，非轉(zhuǎn)基因(WT)和GhMYBAP超量表達(dá)(GAP-5)的棉花愈傷組織；B，3個(gè)GhMYBAP 超量表達(dá)愈傷細(xì)胞系(GAP-2，-3和-5)和非轉(zhuǎn)基因棉花愈傷中GhMYBAP基因的相對(duì)表達(dá)水平(REL，relative expression level) ；C，3 個(gè) GhMYBAP 超量表達(dá)愈傷細(xì)胞系(GAP-2，-3 和-5)和非轉(zhuǎn)基因棉花愈傷的花色素含量⑴=(A530-O. 25XA657) XM—1，其中M為稱(chēng)取的愈傷組織鮮重)。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但以下說(shuō)明并不對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限定，任何對(duì)本發(fā)明的變形和改變，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求所定義的范圍。本發(fā)明實(shí)例中的試劑藥品未做具體說(shuō)明的均為普通市售，材料方法未做具體說(shuō)明的均參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(Sambrook和Russell，2001)。在本發(fā)明的下述實(shí)例中，所用的棉花實(shí)驗(yàn)材料為冀棉14號(hào)(Gossypiumhirsutum CV Jimian 14)，來(lái)自來(lái)自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花遺傳育種研究所。所用的煙草實(shí)驗(yàn)材料為 Nicotiana tabacum cv Samsun，為西南大學(xué)生物技術(shù)中心保存。實(shí)施例一GhMYBAP基因序列的克隆
1、CTAB法提取棉花RNA 選取約0. 5g新鮮棉花材料，在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末，裝入IOmL離心管，加入 4mL 65°C預(yù)熱的 RNA 提取液2% CTAB (ff/V) ,2% PVP (W/V)，IOOmmol/L Tris-HCl (ρΗ8. 0)，
0.5g/L Spermidine，2. Omol/L NaCl，2%巰基乙醇(V/V，使用前加入)，顛倒混勻。65°C水浴3 IOmin,期間混勻2 3次。等體積氯仿異戊醇(24 1)抽提2次(12，000r/min, 室溫，5min)。取上清，加入1/4體積1 Omol/L LiCl溶液，4°C放置2h。12，000r/min，4°C離心 lOmin，棄上清，用 400μ L SSTElmol/L NaCl,0. 5% SDS (ff/V), IOmmo 1/L Tris_HClpH8. 0，
1.Ommol/L EDTA溶解沉淀。以酸飽和酚(pH 4.5)氯仿異戊醇Q5 24 1)和氯仿異戊醇04 1)各抽提1次(12，000r/min，室溫，5min)。加2倍體積的無(wú)水乙醇， 在_70°C冰箱沉淀30min以上。12，000r/min，4°C離心lOmin，棄上清。沉淀用70%的酒精漂洗一次，風(fēng)干。加200 μ L的DEPC處理水溶解。用非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的質(zhì)量。2、cDNA合成和GhMYBAP基因cDNA序列的PCR擴(kuò)增根據(jù)擬南芥、矮牽牛、金魚(yú)草等植物的花色素調(diào)控相關(guān)Ii2R3-MTO蛋白的同源序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物 MYBAP-D (5，-AACGATGTTAARAAYTAYTGGAA-3，，R = A 或 G，Y = C 或 T， SEQ ID NO. 3)。用3' -RACE的方法擴(kuò)增棉花GhMYBAP基因的cDNA 3'-末端序列。根據(jù)3 ‘-末端序列設(shè)計(jì)兩個(gè)反向的巢式引物MYBAP-Rl (5，-GTCACTTACTATCAA TGAC-3，， SEQ ID NO. 4)和 MYBAP-R2(5，-CTGGCTATGGGTTGAACAC-3，，SEQ ID NO. 5)，用 Y-RACE 方法擴(kuò)增獲得GhMYBAP基因的cDNA 5'-末端序列。最后用根據(jù)ATG上游序列設(shè)計(jì)正向引物 MYBAP-F (5‘-CACCAAGCTAG CAAGCTAAC-3，，SEQ IDN0. 6)，與下游引物一起擴(kuò)增獲得 GhMYBAP 基因的全長(zhǎng)編碼序列。具體方法如下(1) 一鏈 cDNA 合成及 3 ‘ -RACE 擴(kuò)增從背面被陽(yáng)光直射處理(見(jiàn)實(shí)施例二)的葉片中提取總RNA。取約2 μ g葉片總 RNA為模板，用簡(jiǎn)并引物MYBAP-D和3 ‘ -RACE試劑盒(TaKaRa)提供的3 ‘ -site引物擴(kuò)增獲得棉花(ΛΜΥΒΑΡ基因的cDNA 3 ‘-末端序列。操作步驟按3 ‘ -RACE試劑盒(TaKaRa) 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。(2) Y-RACE 擴(kuò)增取20 μ g葉片總RNA用cDNA合成試劑盒(TaKaRa)合成雙鏈cDNA，并將cDNA末端平端化。具體操作均按cDNA試劑盒(TaKaRa)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。取100 μ mol/L 的接頭長(zhǎng)鏈(5，-CGGTAGGATCCCGCAGAACGACGGCCAG-3，，SEQ ID NO. 7)和接頭短鏈(5，-pCTGGCCGTCCAAGACGC-3',SEQ ID NO. 8)各 2 μ L，加入 2 μ L 10 X 退火緩沖液(lmol/L NaCl, 100mmol/LTris-HCl, 10mmol/L EDTA)和 16 μ L 蒸餾水，65°C水浴 lOmin，緩慢冷卻至室溫，即獲得接頭。 取接頭和雙鏈cDNA建立如下連接體系10 X T4DNA 連接緩沖液1 μ L雙鏈cDNA2 μ L接頭2 μ LT4DNA 連接酶1 μ L_用雙蒸水補(bǔ)足體積至10 μ L的連接體系16°C連接12h，70°C滅活lOmin。擴(kuò)增第一步為線性擴(kuò)增，25 μ L體系中含1 μ L連接產(chǎn)物，1 XPCR Buffer, 200 μ mol/L dNTPs, 1. 5mmol/L MgCl2, 200nmol/L 特異引物 MYBAP-Rl，IU TaqDNA 聚合酶(在94°C預(yù)變性時(shí)加入)。溫度循環(huán)參數(shù)為94°C預(yù)變性5min ;94°C，30S，56°C，30S， 72°C，2min30S，40個(gè)循環(huán)。取1 μ L線性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行第二步指數(shù)擴(kuò)增，除引物為接頭引物 (5 ‘ -CGGTAGGATCCCGCAGAAC-3 ‘, SEQ ID Ν0. 9)和特異引物 MYBAP-R2 外，反應(yīng)體系中其他成分同線性擴(kuò)增。反應(yīng)擴(kuò)增25 35個(gè)循環(huán)后，72°C延伸lOmin。(3)全長(zhǎng)cDNA的擴(kuò)增25 μ L 體系中含 1 μ L—鏈 cDNA，IXPCR Buffer, 200 μ mol/L dNTPs, 1. 5mmol/LMgCl2，各 200nmol/L 引物 MYBAP-F 和 MYBAP-R1，1U Taq DNA 聚合酶(在 94°C預(yù)變性時(shí)加 Λ )。溫度循環(huán)參數(shù)為，94°C 預(yù)變性 5min ；94°C，30s, 56 V，30s, 72°C，lmin30s, 35 個(gè)循環(huán)； 最后72°C延伸IOmin03、擴(kuò)增片段回收，連接，大腸桿菌轉(zhuǎn)化(1)電泳和回收將擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2% (W/V)瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分離。將目的條帶從凝膠上切下，用DNA回收試劑盒(Bioflux)回收純化目的片段，回收步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行?；厥掌卧诃傊悄z上電泳定量。(2)克隆和測(cè)序回收的片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳定量。按試劑盒說(shuō)明書(shū)，通過(guò)回收片段與克隆載體的連接、連接產(chǎn)物的大腸桿菌轉(zhuǎn)化、陽(yáng)性菌落的培養(yǎng)和質(zhì)粒酶切驗(yàn)證，將回收片段克隆到 PMD19-T(TaKaRa)載體上?；厥盏钠闻cpMD19-T (TaKaRa)載體建立如下連接體系10 X T4DNA 連接緩沖液1 μ L載體DNA片段IyL外源連接產(chǎn)物DNA片段IyLT4DNA 連接酶1 μ L_用雙蒸水補(bǔ)足體積至10 μ L的連接體系載體DNA與外源片段DNA片段摩爾比為1 3，16°C連接12h。之后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Dffia。挑白色菌落培養(yǎng)，提質(zhì)粒酶切驗(yàn)證。正確克隆寄上海英俊公司進(jìn)行序列測(cè)定。最終獲得棉花GhMYBAP基因的cDNA序列(SEQID NO. 1)。實(shí)施例二棉花花色素合成和GhMYBAP基因表達(dá)的光誘導(dǎo)特性檢測(cè)在正常生長(zhǎng)的棉花植株上選擇剛剛展開(kāi)的葉片，從中間翻折使半片葉片的葉背面朝上，并用曲別針固定，在晴天由陽(yáng)光直射葉片背面處理3天。取下葉片分別用直射處理和未處理的半片葉進(jìn)行花色素含量測(cè)定和基因表達(dá)分析。在大田種植的棉田里，選取上部被陽(yáng)光直射的枝條和下部蔭蔽的枝條比較花色素含量和GhMYBAP基因的表達(dá)分析。采用比色法測(cè)定葉片的花色素含量。取0.2g葉片，切成小塊裝入1.5mL離心管中，加入ImL酸化甲醇(1%鹽酸，80%甲醇)，室溫提取1 至材料無(wú)紅色。常溫下離心12000g, 3min。取0. 2mL,測(cè)定530nm與657nm下的吸光值(A530和A657)?？偦ㄉ豎 = (A530-O. 25XA657) XM—1，其中M為稱(chēng)取的植物組織的鮮重。用CTAB方法(見(jiàn)實(shí)施例一)提取棉花莖段和葉片的總RNA。以這些總RNA反轉(zhuǎn)錄的單鏈cDNA為模板進(jìn)行定量PCR分析。用定量RT-PCR方法分析轉(zhuǎn)基因植株中目的基因的表達(dá)。GhMYBAP 基因用引物 MYBAP-F(SEQ IDN0. 4)和 MYBAP-Rl (SEQ ID NO. 6)擴(kuò)增，用棉花 Histone 基因做內(nèi)標(biāo)，引物為 His-up (5，-GAAGCTGCAGAGGCATACC-3，，SEQ ID NO. 10)和 His-down(5，-CTACCACTACCATCATGGC-3，，SEQ ID NO. 11)。反轉(zhuǎn)錄和定量 PCR 分析均采用 TaKaRa公司的STO Green RT-PCR分析試劑盒在iCycle定量PCR儀上完成。按試劑盒和儀器說(shuō)明書(shū)進(jìn)行各步具體操作。用測(cè)得的GhMYBAP基因與Histone的起始拷貝數(shù)的比值表示目的基因GhMYBAP的相對(duì)表達(dá)水平。檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)陽(yáng)光直射處理(L-S)的葉片的顏色呈現(xiàn)紅色，花色素的含量高， GhMYBAP基因的相對(duì)表達(dá)水平高；而未經(jīng)處理(L-W)的葉片的顏色呈綠色，花色素的含量低，GhMYBAP基因的相對(duì)表達(dá)水平低(圖1，A-C)；，經(jīng)陽(yáng)光直射處理(S-S)的莖段的顏色完全呈紅色，花色素的含量高，GhMYBAP基因的相對(duì)表達(dá)水平高；而蔭蔽(S-W)的莖段的顏色完全呈綠色，花色素的含量很低，GhMYBAP基因的相對(duì)表達(dá)水平很低(圖1，D-F)。實(shí)施例三超量表達(dá)載體的構(gòu)建和煙草遺傳轉(zhuǎn)化1、超量表達(dá)載體的構(gòu)建pMD19-GhMYBAP載體在克隆GhMYBAP基因時(shí)構(gòu)建，其上的GhMYBAP片段已測(cè)序。為了在轉(zhuǎn)基因植物中超量表達(dá)GhMYBAP基因，需要GhMYBAP將基因正向插入植物表達(dá)載體中， 并用適當(dāng)?shù)膯?dòng)子啟動(dòng)表達(dá)。為此我們根據(jù)pMD19-GhMYBAP載體上的酶切位點(diǎn)和GhMYBAP 的插入方向以及植物表達(dá)載體(PBI121)上的多克隆位點(diǎn)和CaMV 35S啟動(dòng)子的方向，設(shè)計(jì)了如圖2所示的載體構(gòu)建路線。根據(jù)這個(gè)植物表達(dá)載體構(gòu)建路線，構(gòu)建了超量表達(dá)GhMYBAP 基因的植物表達(dá)載體pBIl21-GhMYBAP (圖3)。2、煙草遺傳轉(zhuǎn)化用電激法將構(gòu)建的植物表達(dá)載體質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404和煙草遺傳轉(zhuǎn)化。參考Bio-RAD MicroPulser用戶(hù)說(shuō)明書(shū)，將上述載體通過(guò)電激轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入農(nóng)桿菌 LBA4404。上述的植物表達(dá)載體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)葉盤(pán)感染的方法導(dǎo)入煙草。轉(zhuǎn)化用培養(yǎng)基及配方見(jiàn)表1。具體方法如下煙草種子用的次氯酸鈉消毒后，在MSB基本培養(yǎng)基上萌發(fā)，培養(yǎng)條件為25V、 16hr光照/Shr黑暗的光周期。約一個(gè)月后生長(zhǎng)健壯的無(wú)菌苗即可用作轉(zhuǎn)化外植體。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法。含植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌株接種于液體YEB， 280C 200rpm搖床培養(yǎng)過(guò)夜，從已搖好的菌液中重新吸取1 2mL于20 25mL液體YEB中再次活化。待菌液搖至0D600約為0. 8時(shí)，取出用YEB稀釋到OD6tltl值為0. 05 0. 2備用。表1 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草遺傳轉(zhuǎn)化用培養(yǎng)基
權(quán)利要求
1.一種分離的棉花花色素合成調(diào)控基因GhMYBAP，其核苷酸序列如SEQID NO. 1所示。
2.由權(quán)利要求1所述的基因編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQID NO. 2所示。
3.含有權(quán)利要求1所述的基因的表達(dá)載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體至少含有權(quán)利要求1所述的基因和植物組成型或組織特異性啟動(dòng)子。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體，其具有如圖3所示的結(jié)構(gòu)。
6.含有權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
7.權(quán)利要求1所述的基因在促進(jìn)植物花色素合成和累積中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1所述的基因在農(nóng)作物、林木育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種從棉花中克隆的受光誘導(dǎo)的花色素合成調(diào)控基因GhMYBAP，在植物中表達(dá)該基因可以促進(jìn)轉(zhuǎn)基因棉花和其他植物體內(nèi)花色素的合成和累積。應(yīng)用該基因及其植物表達(dá)載體可以培育高花色素含量的植物品系(種)、提高植物產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和外觀品質(zhì)。
文檔編號(hào)C12N15/29GK102154314SQ20111002078
公開(kāi)日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月18日
發(fā)明者侯磊, 宋水清, 張瑞芝, 李德謀, 羅明, 肖月華, 裴炎 申請(qǐng)人:西南大學(xué)