專利名稱：一種β-淀粉酶的高效制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及巴斯德畢赤酵母基因工程菌生產β-淀粉酶的方法，屬于酶工程和生物工程技術領域。
背景技術：
β -淀粉酶(EC 3. 2. 1. 2)，S卩(1 — 4) - α -葡聚糖麥芽水解酶，是一種外切酶，它從淀粉非還原端開始，按麥芽糖單位依次水解，同時發(fā)生沃爾登轉位反應，使產物由α _型轉變?yōu)樾望溠刻?。該酶不能水解淀粉分支處的?1，6糖苷鍵，淀粉的分解會在1，6鍵前的2 3個葡萄糖殘基處停止，所以分解直鏈淀粉的產物主要是麥芽糖，分解支鏈淀粉的產物主要是麥芽糖和大分子的極限糊精。淀粉酶廣泛存在于大麥、小麥、玉米、大豆、甘薯等高等植物中，一些微生物也能生產β-淀粉酶。β-淀粉酶在糧食加工、食品制造、發(fā)酵工業(yè)和醫(yī)藥等工業(yè)中具有重要的應用價值。該酶廣泛應用于啤酒，飴糖，高麥芽糖漿，結晶麥芽糖醇等以麥芽糖為產物的制糖工藝， 主要用于進一步提高麥芽糖的糖化率和產出率；β “淀粉酶還可用于發(fā)酵工業(yè)的淀粉液化以及紡織、印染退漿等。此外，該酶臨床上用作消化酶，用于食欲不振、消化不良、胃黏膜炎寸。張劍等研究了黃豆粉中淀粉酶的提取工藝條件，分別討論了表面活性劑、還原劑等對黃豆粉中β “淀粉酶提取量的影響，并通過正交試驗進一步優(yōu)化了提取條件，最終產量提高29.8%。王慧超等從發(fā)芽蠶豆提取β-淀粉酶，以1.0 g/L Na2SO4為還原劑， 以PH 6. 5磷酸鉀緩沖液為提取緩沖液，提取發(fā)芽蠶豆β-淀粉酶效果較好。曾英等提供了高活力淀粉酶的制備工藝，脫脂豆粉浸提液經超濾濃縮、二次沉淀及沉淀凍融處理， 得到性能優(yōu)良的產品。江蘇省農業(yè)科學院農產品加工研究所、湖北省農產品加工工程技術研究中心、沈陽農業(yè)大學食品學院、合肥工業(yè)大學等研究了從黃豆粉、甘薯中提取β “淀粉酶的方法，但是僅局限于實驗室。鄭州金土地能源科技有限公司首次提出從甘薯細胞中提取β-淀粉酶的生產路線，原料經清洗、破碎、漿渣分離、吸濾、吸附脫色、過濾、膜分離得到 β-淀粉酶。從植物中提取的淀粉酶具有酶活力高、耐熱性較好、作用PH值范圍廣等特點，但該β -淀粉酶生產工藝受原料、產地、氣候和人口資源等條件影響制約。目前，我國微生物發(fā)酵生產的β-淀粉酶活力低，耐熱性差，成本高，研究相對較少。本專利利用的巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)具有高表達、高穩(wěn)定、表達蛋白的后加工產物易純化等獨特的優(yōu)點，構建產β “淀粉酶的基因重組畢赤酵母，通過對其高密度發(fā)酵具有良好的工業(yè)應用價值。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的之一是提供一種產β -淀粉酶的菌株。本發(fā)明目的之二是提供高效分泌表達紅薯β -淀粉酶的巴斯德畢赤酵母基因工程菌的構建方法。本發(fā)明 目的之三是提供利用巴斯德畢赤酵母基因工程菌發(fā)酵制備β “淀粉酶的方法。本發(fā)明一種高效分泌表達β -淀粉酶的巴斯德畢赤酵母基因工程菌的構建及其發(fā)酵生產方法，主要是通過反轉錄PCR方法克隆來源于紅薯的β -淀粉酶基因，然后插入含有不同分泌信號肽的畢赤酵母表達質粒中，獲得不同的重組質粒，將重組質粒導入巴斯德畢赤酵母宿主中篩選獲得基因工程菌。含有不同信號肽的基因工程菌，包括PPIC9K自身α 因子引導序列信號肽Α、酸性磷酸脂酶基因信號肽B、蔗糖酶基因信號肽C和Killer毒素基因信號肽D，均能有效介導β -淀粉酶蛋白從胞內分泌至發(fā)酵液中。為實現(xiàn)本發(fā)明的技術目的，本發(fā)明采取以下技術方案一種產β-淀粉酶的菌株， 分類命名為巴斯德畢赤酵母RYP 20110110,已保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號 CCTCC NO: M 2011014。所述巴斯德畢赤酵母CCTCC NO =M 2011014，其構建步驟
(1)利用Trizol試劑提取紅薯的總RNA；
(2)以總RNA為模板，在反轉錄引物oligdT-18和逆轉錄酶的作用下，合成一鏈cDNA；
(3)根據(jù)已公布的紅薯淀粉酶基因序列設計一對引物，所用引物為 BBA-F 5‘ -aagatctccatggctccaatccccggt-3‘，
BBA-R 5‘ -aagatctgctcctccttcaccttcag-3‘；
以一鏈cDNA為模板PCR擴增，獲得擴增含完整β -淀粉酶基因ΒΒΑ，連入Teasy載體獲得Teasy-BBA。以Teasy-BBA質粒為模板，PCR擴增含完整β -淀粉酶基因開放閱讀框序列的目的基因OBBA或去除信號肽編碼區(qū)的β -淀粉酶基因28ΒΒΑ ； 所述PCR擴增0ΒΒΑ，所用引物為 OBBA-F 5‘ -atggctccaatccccggt-3‘， OBBA-R 5‘ -tcaatcaaacgggtttgagccatc-3‘； 所述PCR擴增28BBA，所用引物為 28BBA-F 5‘ -gtaatgctcccgttgggagttgt-3‘， 28BBA-R: 5‘ -tcaatcaaacgggtttgagccatc-3‘；
(4)將目的基因OBBA和巴斯德畢赤酵母分泌表達載體分別用i^/II和進行雙酶切過夜，酶切產物純化后用T4 DNA連接酶在;T5°C反應1Γ16 h，獲得連接反應物；
或將目的基因28BBA與經免aBI酶切過夜、純化后的巴斯德畢赤酵母分泌表達載體用 T4 DNA連接酶連接，3 5°C反應14 16 h，獲得連接反應物；
所述的巴斯德畢赤酵母分泌表達載體是指PPIC9K-A，及其自身分泌信號肽A被酸性磷酸脂酶信號肽B、蔗糖酶信號肽C、Killer毒素信號肽D所置換后的巴斯德畢赤酵母分泌表達載體 PPIC9K-B、pPIC9K-C、pPIC9K_D ；
所述信號肽A、B、C、D均由上海生工生物科技有限公司合成，限制性內切酶ife"/II、 Bamm和免aBI購自上海晶美生物技術有限公司；
(5)將連接反應物轉化宿主菌五cWiJM109感受態(tài)細胞，涂布含50 yg/mL氨芐青霉素的LB平板，挑選陽性克隆，并進行培養(yǎng)后提取小量質粒用5^1進行酶切驗證，得到按正確方向插入目的基因的重組表達質粒；重組表達質粒包括pPIC9K-A-0BBA、pPIC9K-B-0BBA、pPIC9K-C-0BBA、pPIC9K-D-0BBA、 PPIC9K-A-28BBA、pPIC9K_B_28BBA、pPIC9K_C_28BBA、和 pPIC9K_D_28BBA ；
(6)將步驟(5)所得重組表達質粒用SWII進行酶切線性化，36 38°C反應4 h，然后將酶切產物純化，以電穿孔法轉化巴斯德畢赤酵母宿主菌GS115或KM71，涂布MD培養(yǎng)基平板， 挑取單菌落，通過菌落PCR方法鑒定陽性克隆，即獲得具有目的基因的巴斯德畢赤酵母基因工程菌，通過酶活檢驗篩選得到酶活最高的轉化子，即含重組質粒PPIC9K-A-0BBA的巴斯德畢赤酵母KM71，其保藏編號為CCTCC NO: M 2011014 ；
所述電穿孔法轉化參照Irwitrogen公司的《畢赤酵母轉化手冊》進行，其條件是電壓為1500 V，時間為5 ms,電阻為200 Ω ；MD培養(yǎng)基組分以質量濃度計為2%葡萄糖，1. 34% YNB, 2%瓊脂粉，用蒸餾水補足100% ；
步驟(6 )所述PCR擴增，轉化pPIC9K- (A/B/C/D) -OBBA時所用引物為OBBA-F和0BBA-R， 轉化 pPIC9K-(A/B/C/D)-28BBA 時所用引物為 28BBA-F 和 28BBA-R。上述構建方法步驟(1)中所述的Trizol試劑、步驟(2)中所述的反轉錄引物 ο 1 igdT-18、步驟(3 )中所述的Teasy載體、步驟(4 )中所述的限制酶分別為BgIU和Ba·， 均來源于上海生工生物工程技術服務有限公司試劑公司。上述步驟(3)中所述的β-淀粉酶基因為植物來源的β-淀粉酶基因或經過突變、重排、缺失等方法獲得的淀粉酶基因，與來自紅薯的淀粉酶基因的DNA序列一致性大于等于70%、蛋白質序列一致性大于等于70%。上述步驟(4)所述酶切產物的純化可以采用PCR產物回收試劑盒或其它分子克隆中常用的純化方法。上述構建方法步驟(6)中所述的畢赤酵母宿主菌，是指GS115或ΚΜ71，較佳的是 Pichia pasiorisGSllS，更佳的是/7ZcAia pasiorisKMil。所述菌株均從 Invitrogen 公司購買。用所述菌株CCTCC NO: M 2011014高效制備β -淀粉酶的方法，采用重組巴斯德畢赤酵母RYP 20110110 CCTCC NO: M 2011014作為生產菌株，經高密度發(fā)酵產β -淀粉酶， 所得發(fā)酵液經超濾微濾后凍干得到β-淀粉酶酶粉，步驟為
(1)種子培養(yǎng)將在4°C保藏的CCTCCNO: M 2011014菌接入種子培養(yǎng)基中，在 28 30°C、搖床轉速為15(T250 r/min的條件下培養(yǎng)24 36 h，培養(yǎng)液用做種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基；
所述的種子培養(yǎng)基的組成以質量濃度計為1%酵母膏，2%蛋白胨，19Γ4%甘油，用蒸餾水補足100% ；
(2)發(fā)酵培養(yǎng)按照69TlO%的體積比將步驟(1)的種子液接種到裝有10L發(fā)酵培養(yǎng)基的15 L發(fā)酵罐中，在28 30°C、ρΗ 5. 5 6. 0，搖床轉速為150 250 r/min的條件下培養(yǎng)，定時取樣檢測甘油濃度，當甘油濃度下降到低于0. 5%時，轉入甲醇誘導培養(yǎng)階段；
所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成以質量濃度計為1%酵母膏，2%蛋白胨，1%甲醇，用蒸餾水補足 100% ；
(3)甲醇誘導培養(yǎng)由步驟(2)獲得的發(fā)酵培養(yǎng)液，當甘油濃度下降到低于0.5%時，開始流加甲醇，流速為1 mL/min ；再通過控制溶氧來控制甲醇流加，當系統(tǒng)溶氧< 20%時，停止流加甲醇，該步驟培養(yǎng)時間為8(T100 h，獲得發(fā)酵液；(4)離心收集步驟(3)的發(fā)酵液，4°C下8000g離心10 min，收集上清液；所述發(fā)酵液酶活可達500 U/mL ；
(5)微濾將步驟(4)的上清液用0.45 μ m陶瓷膜微濾機進行微濾，收集濾液；
(6)超濾將步驟(5)的濾液用超濾膜過濾，獲得β-淀粉酶濃縮酶液；
(7 )凍干將步驟(6 )的濃縮酶液進行冷凍干燥，獲得粉末狀β -淀粉酶制品； 上述步驟(5)中所述的陶瓷膜材質為柱狀氧化鋁材質，上清液的流速可以通過調節(jié)陶瓷膜外端的回流閥控制，從而將膜端的壓力控制于0. 0Γ0. 02 MPa，此時的流速為0. 2^0. 4 L/min ；
上述步驟(6)中所述的超濾膜為卷式超濾膜，其材質為聚醚砜，截留分子量為10 kD，超濾膜的溫度可以通過調節(jié)冷卻水的循環(huán)速度來進行控制；
上述步驟(7)中所述的冷凍干燥條件是冷阱溫度維持在-50°C左右，凍干設備是美國 Labcon 公司，型號是 FreeZone 12 L。上述步驟(3)中所述發(fā)酵液酶活可達500 U/mL (酶活定義為50°C時每min分解淀粉生成1 mg麥芽糖定義為1 U)。

上述發(fā)酵生產制備的β-淀粉酶的蛋白濃度達到了；Γ6 g/L，酶活可達2000 U/g。本發(fā)明采用畢赤酵母為宿主菌株，構建分泌表達紅薯淀粉酶的基因工程菌株，通過優(yōu)化載體中的分泌信號肽提高基因工程菌株的發(fā)酵水平，可實現(xiàn)大宗酶制劑 β-淀粉酶的高效制備。本發(fā)明的有益效果(1)本發(fā)明所得畢赤酵母基因工程菌株淀粉酶分泌表達水平高；(2)本發(fā)明淀粉酶酶活水平高，熱穩(wěn)定性好；(3)本發(fā)明方法生產的β-淀粉酶質量高，成本低，適宜于工業(yè)化生產。生物材料樣品保藏一種產β-淀粉酶的菌株，分類命名為巴斯德畢赤酵母RYP 20110110，已保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC NO: M 2011014，保藏日期 2011年1月11日。


圖1利用α因子信號肽序列的β -淀粉酶分泌表達質粒PPIC9K-A-0BBA物理圖
■i並曰ο圖2利用α因子信號肽序列的β -淀粉酶分泌表達質粒PPIC9K-A-28BBA物理圖
■i並曰ο
具體實施例方式實施例1 Trizol法提取的紅薯RNA
(1)將紅薯清洗干凈，切成小碎塊，在液氮中磨成粉末，將大約5(T100 mg樣本轉入1. 5 mL離心管，加入1 mL Trizol試劑，顛倒混勻充分懸浮樣本于試劑中。(2)懸浮液室溫放置5 min后加入0. 2 mL氯仿，劇烈震蕩離心管15秒，室溫放置 5 min，然后 4°C，12000 rpm 離心 10 min。(3)小心吸取上層水相于一新的離心管，加入0. 5 mL異丙醇，混勻后室溫放置10 min,然后 4°C, 12000 rpm 離心 10 min。
(4)棄去上清液，加入1 mL的75%乙醇清洗沉淀，4°C，12000 rpm離心5 min。(5)棄去上清液，室溫干燥沉淀5 10 min。加入50 μ L無RNase水，室溫放置 5^10 min使RNA充分溶解，凝膠電泳檢測RNA質量。實施例2 cDNA的合成和β -淀粉酶基因的擴增 (1)逆轉錄合成cDNA
反應體系(20 μ L) 1 μ g RNA，反轉錄引物 10 mM oligdT-18 1 μ L, 5XBuffer 4 μ L，IOM dNTPs 1 μ L，M-MLV反轉錄酶1 μ L，剩余體積用無RNase水補齊。反應條件反應管中先加入RNA和反轉錄引物，無RNase水補齊體積10 yL,70°C, 5 min，冰上放置5 min ；再加入剩余試劑，無RNase水補齊體積20 μ L，42°C，60 min。(2) PCR擴增含完整β -淀粉酶基因ΒΒΑ，所用引物為 BBA-F 5' -aagatctccatggctccaatccccggt-3‘
權利要求
1.一種產β-淀粉酶的菌株，分類命名為巴斯德畢赤酵母RYP 20110110，已保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC NO =M 2011014。
2.權利要求1所述巴斯德畢赤酵母CCTCCNO =M 2011014的構建方法，其特征在于構建步驟為(1)利用Trizol試劑提取紅薯的總RNA；(2)以總RNA為模板，在oligdT-18和逆轉錄酶的作用下，合成一鏈cDNA；(3)根據(jù)已公布的紅薯淀粉酶基因序列設計一對引物，所用引物為 BBA-F 5‘ - aagatctccatggctccaatccccggt-3‘，BBA-R 5‘ -aagatctgctcctccttcaccttcag -3‘；以一鏈cDNA為模板PCR擴增，獲得擴增含完整β -淀粉酶基因ΒΒΑ，連入Teasy載體獲得Teasy-BBA，以Teasy-BBA質粒為模板，PCR擴增含完整β -淀粉酶基因開放閱讀框序列的目的基因OBBA或去除信號肽編碼區(qū)的β -淀粉酶基因28ΒΒΑ ； 所述PCR擴增0ΒΒΑ，所用引物為 OBBA-F 5‘ -atggctccaatccccggt-3‘， OBBA-R 5‘ -tcaatcaaacgggtttgagccatc _3‘； 所述PCR擴增^BBA，所用引物為 28BBA-F 5‘ -gtaatgctcccgttgggagttgt-3‘， 28BBA-R: 5‘ -tcaatcaaacgggtttgagccatc-3‘；(4)將目的基因OBBA和巴斯德畢赤酵母分泌表達載體分別用和進行雙酶切過夜，酶切產物純化后用T4 DNA連接酶在;T5°C反應1Γ16 h，獲得連接反應物；或將目的基因28BBA與經S/^BI酶切過夜、純化后的巴斯德畢赤酵母分泌表達載體用 T4 DNA連接酶連接，3 5°C反應14 16 h，獲得連接反應物；所述的巴斯德畢赤酵母分泌表達載體是指PPIC9K-A，及其自身分泌信號肽A被酸性磷酸脂酶信號肽B、蔗糖酶信號肽C、Killer毒素信號肽D所置換后的巴斯德畢赤酵母分泌表達載體 PPIC9K-B、pPIC9K-C、或 pPIC9K-D ；(5)將連接反應物轉化宿主菌五cWiJM109感受態(tài)細胞，涂布含50 yg/mL氨芐青霉素的LB平板，挑選陽性克隆，并進行培養(yǎng)后提取小量質粒用5^1進行酶切驗證，得到按正確方向插入目的基因的重組表達質粒；重組表達質粒包括pPIC9K-A-0BBA、pPIC9K-B-0BBA、pPIC9K-C-0BBA、pPIC9K-D-0BBA、 PPIC9K-A-28BBA、pPIC9K_B_28BBA、pPIC9K_C_28BBA、和 pPIC9K_D_28BBA ；(6)將步驟(5)所得重組表達質粒用進行酶切線性化，36 38°C反應4h，然后將酶切產物純化，以電穿孔法轉化巴斯德畢赤酵母宿主菌GS115或KM71，涂布MD培養(yǎng)基平板， 挑取單菌落，通過菌落PCR方法鑒定陽性克隆，即獲得具有目的基因的巴斯德畢赤酵母基因工程菌，通過酶活檢驗篩選得到酶活最高的轉化子，即含重組質粒PPIC9K-A-0BBA的巴斯德畢赤酵母KM71，其保藏編號為CCTCC NO =M 2011014 ；所述電穿孔法轉化，條件是電壓為1500 V，時間為5 ms，電阻為200 Ω ；MD培養(yǎng)基組分以質量濃度計為2%葡萄糖，1. 34% YNB, 2%瓊脂粉，用蒸餾水補足100% ；步驟(6 )所述PCR擴增，轉化pPIC9K- (A/B/C/D) -OBBA時所用引物為OBBA-F和0BBA-R， 轉化 pPIC9K-(A/B/C/D)-28BBA 時所用引物為 28BBA-F 和 28BBA-R。
3. 一種用權利要求1所述菌株CCTCC NO: M 2011014高效制備β-淀粉酶的方法，其特征在于采用巴斯德畢赤酵母CCTCC NO: M 2011014作為生產菌株，經高密度發(fā)酵產β-淀粉酶，所得發(fā)酵液經超濾微濾后凍干得到β-淀粉酶酶粉，步驟為(1)種子培養(yǎng)將在4°C保藏的CCTCCNO: M 2011014菌接入種子培養(yǎng)基中，在觀 301、搖床轉速為150 250 r/min的條件下培養(yǎng)M 36 h，培養(yǎng)液用做種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基；所述的種子培養(yǎng)基的組成以質量濃度計為1%酵母膏，洲蛋白胨，19Γ4%甘油，用蒸餾水補足100% ；(2)發(fā)酵培養(yǎng)按照69TlO%的體積比將步驟(1)的種子液接種到裝有10L發(fā)酵培養(yǎng)基的15 L發(fā)酵罐中，在^ 30°C、pH 5. 5 6. 0、搖床轉速為150 250 r/min的條件下培養(yǎng)，定時取樣檢測甘油濃度，當甘油濃度下降到低于0. 5%時，轉入甲醇誘導培養(yǎng)階段；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成以質量濃度計為1%酵母膏二％蛋白胨，1%甲醇，用蒸餾水補足 100% ；(3)甲醇誘導培養(yǎng)由步驟(2)獲得的發(fā)酵培養(yǎng)液，當甘油濃度下降到低于0.5%時，開始流加甲醇，流速為1 mL/min ；再通過控制溶氧來控制甲醇流加，當系統(tǒng)溶氧< 20%時，停止流加甲醇，該步驟培養(yǎng)時間為8(T100 h，獲得發(fā)酵液；(4)離心收集步驟(3)的發(fā)酵液，4°C下8000g離心10 min，收集上清液；所述發(fā)酵液酶活可達500 U/mL ；(5)微濾將步驟(4)的上清液用0.45 μ m陶瓷膜微濾機進行微濾，收集濾液；(6)超濾將步驟(5)的濾液用超濾膜過濾，獲得β-淀粉酶濃縮酶液；(7 )凍干將步驟(6 )的濃縮酶液進行冷凍干燥，獲得粉末狀β -淀粉酶制品。
全文摘要
一種β-淀粉酶的高效制備方法，屬于酶工程和生物工程技術領域。本發(fā)明將來源于紅薯的β-淀粉酶基因0BBA或去除信號肽的β-淀粉酶基因28BBA分別置于4種不同的分泌信號肽pPIC9K-A、pPIC9K-B、pPIC9K-C、或pPIC9K-D下構建8種不同的重組質粒，通過電穿孔法轉化2種本身不產β-淀粉酶的巴斯德畢赤酵母GS115或KM71，篩選獲得由KM71轉化的含pPIC9K-A-0BBA的巴斯德畢赤酵母CCTCCNOM2011014。通過對巴斯德畢赤酵母CCTCC NO:M2011014的高密度發(fā)酵，發(fā)酵液酶活可達500U/mL，通過離心、超濾微濾和凍干制備β-淀粉酶，成品蛋白濃度達到了3~6g/L，酶活力達到2000U/g。本發(fā)明能夠高效生產用于淀粉加工、制糖工業(yè)以及食品加工業(yè)的β-淀粉酶。
文檔編號C12N1/19GK102154140SQ20111002228
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月20日 優(yōu)先權日2011年1月20日
發(fā)明者王正祥 申請人:江蘇銳陽生物科技有限公司