專利名稱：玉米脫水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白ZmDBP2及其編碼基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物中一種與脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因，特別涉及一種脫水 應(yīng)答元件結(jié)合蛋白及其編碼基因。
背景技術(shù)：
干旱、高鹽及高溫等逆境脅迫是影響玉米生長、發(fā)育的障礙因子。因此，了解玉米 對逆境條件的應(yīng)答與信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，提高玉米品種的抗逆性，成為玉米遺傳研究及玉米品 種改良的重要任務(wù)之一。在逆境脅迫下植物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生一系列應(yīng)答反應(yīng)，伴隨著許多生理生化及發(fā)育上的 變化。明確植物對逆境的反應(yīng)機(jī)制，將為抗逆基因工程研究和應(yīng)用提供科學(xué)論據(jù)。目前，植 物抗逆性研究已逐漸深入到細(xì)胞、分子水平，并與遺傳學(xué)和遺傳工程研究相結(jié)合，探索用生 物技術(shù)來改進(jìn)植物生長特性，其目的是提高植物對逆境的適應(yīng)能力。在干旱、高鹽和高溫等環(huán)境脅迫的逆境條件下，植物能夠在分子、細(xì)胞和整體水平 上做出相應(yīng)的調(diào)整，以最大程度上減少環(huán)境所造成的傷害并得以生存。許多基因受脅迫誘 導(dǎo)表達(dá)，這些基因的產(chǎn)物不僅能夠直接參與植物的脅迫應(yīng)答，而且能夠調(diào)節(jié)其它相關(guān)基因 的表達(dá)或參與信號(hào)傳導(dǎo)途徑，從而使植物避免或減少傷害，增強(qiáng)對脅迫環(huán)境的抗性。與脅迫 相關(guān)的基因產(chǎn)物可以分為兩大類第一類基因編碼的產(chǎn)物包括離子通道蛋白、水通道蛋白、 滲透調(diào)節(jié)因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜堿等)合成酶等直接參與植物脅迫應(yīng)答的基因產(chǎn)物；第 二類基因編碼的產(chǎn)物包括參與脅迫相關(guān)的信號(hào)傳遞和基因表達(dá)調(diào)節(jié)的蛋白因子，如蛋白激 酶、轉(zhuǎn)錄因子等。其中，轉(zhuǎn)錄因子在植物脅迫應(yīng)答的基因表達(dá)調(diào)控中起著重要作用。轉(zhuǎn)錄因子也稱為反式作用因子，是能夠與真核基因啟動(dòng)子區(qū)域中順式作用元件發(fā) 生特異性作用的DNA結(jié)合蛋白，通過它們之間以及與其它相關(guān)蛋白之間的相互作用，激活 或抑制轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合區(qū)決定了它與順式作用元件結(jié)合的特異性，而轉(zhuǎn)錄調(diào)控 區(qū)決定了它對基因表達(dá)起激活或是抑制作用。此外，其自身活性還受到核定位及寡聚化等 作用的影響。目前已知在植物中與脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子主要有具有AP2結(jié)構(gòu)域的 AP2 (APETALA2) /EREBP (θ, ethylene responsive element binding protein)轉(zhuǎn)錄因子家族、含有堿性區(qū)域和亮氨酸拉鏈的bZIP (basic region/leucine zipper motif transcription factors)類轉(zhuǎn)錄因子、含有保守的WRKY氨基酸序列的WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族、含有堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)和亮氨酸拉鏈的MYC家族和具有色氨酸簇 (Trp cluster)的MYB家族。這五個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族，除WRKY家族不參與植物的水脅迫反應(yīng) 外，其它四個(gè)家族均參與調(diào)節(jié)植物對干旱、高鹽等的逆境脅迫反應(yīng)。其中，AP2/EREBP類轉(zhuǎn) 錄因子在高等植物中廣泛存在，它是植物所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，近年來，在擬南芥、煙草、 玉米、水稻、大豆和油菜中均有報(bào)道，這表明AP2/EREBP類轉(zhuǎn)錄因子在高等植物中普遍存在 并具有重要作用。DREB (脫水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白，DRE-binding protein)類轉(zhuǎn)錄因子是AP2家族中EREBP-Iike亞家族中的一個(gè)成員。DREB和EREBP類轉(zhuǎn)錄因子它們在氨基酸序列上沒有顯 著的相同性，但都含有一段非常保守的由58個(gè)左右氨基酸組成的DNA結(jié)合區(qū)域(EREBP/AP2 結(jié)構(gòu)域)。蛋白質(zhì)三維分析表明，該區(qū)域含有3個(gè)折疊，對識(shí)別各類順式作用元件起關(guān) 鍵作用。其中位于第二個(gè)β -折疊中的第14、19位的兩個(gè)氨基酸殘基的差異，決定這類轉(zhuǎn)錄 因子與不同順式作用元件的特異結(jié)合。DREB類轉(zhuǎn)錄因子第14位氨基酸是纈氨酸(V14)，第 19位氨基酸是谷氨酸(Ε19)，其中第19位的氨基酸并不保守，例如水稻的OsDREBI轉(zhuǎn)錄因 子的第 19 位氨基酸就是纈氨酸(Dubouzet TG, Sakuma Y, Ito Y, Kasuga M, Dubouzet EG, Miura S, SekiM, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K, 2003)。在 DREB 相關(guān)蛋白中決定 DNA結(jié)合的特異性方面，V14的作用明顯要比E19重要(Sakuma Y,Liu Q,Dubouzet JG,Abe H, Shinozaki K and Yamaguchi-ShinozakiK, 2002)；而 ERF 類轉(zhuǎn)錄因子第 14 位氨基酸是甘 氨酸，第19位是天冬氨酸，因而DREB特異結(jié)合DRE/CRT順式元件，ERF特異結(jié)合GCC-盒。 AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域的C-端區(qū)還包含1個(gè)由18個(gè)氨基酸殘基組成的核心序列，該序列形成雙 親性的α-螺旋，該α-螺旋可能參與同其它轉(zhuǎn)錄因子及DNA間的相互作用。目前，在許多植物中都發(fā)現(xiàn)這種含有EREBP/AP2結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，并分別與抗 病、抗逆等信號(hào)傳遞有關(guān)(劉強(qiáng)，趙南明，Yamaguchi-Shinozaki K5Shinozaki K, 2000) 劉 強(qiáng)等認(rèn)為，一個(gè)DREB基因可以調(diào)控多個(gè)與植物干旱、高鹽及低溫耐性有關(guān)的功能基因的表 達(dá)(劉強(qiáng)，趙南明，Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K, 2000) Kasuga 等的研究證實(shí)， 導(dǎo)入到擬南芥的DREBlA基因可以同時(shí)促進(jìn)與逆境脅迫耐性有關(guān)的基因rd29、rdl7、kinl、 cor6. 6,corl5a以及erdlO的表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植株的抗逆性大大增強(qiáng)(KasugaM，Liu Q, Miura S, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K.，1999)。同樣，低溫耐性轉(zhuǎn)錄因子 CBFl 的轉(zhuǎn)基因 植株的耐低溫能力有顯著提高(Jaglo-Ottosen KR,Gilmour SJ,Zarka DG, Schabenberger O, Thomashow MF.，1998)。由于植物的逆境耐性是由多基因調(diào)控的復(fù)雜性狀，依靠導(dǎo)入單個(gè) 功能性蛋白基因很難實(shí)現(xiàn)植物抗逆性的綜合提高。因此，利用一個(gè)關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)多 個(gè)功能基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)植物的抗逆性，已經(jīng)成為植物抗逆基因工程的研究熱點(diǎn)。根據(jù)含DNA結(jié)合區(qū)的數(shù)目，AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子分為AP2 (APETALA2)和乙烯應(yīng)答 元件結(jié)合蛋白 EREBP (ethylene-responsive element binding protein)以及 RAV 三個(gè)大 類型。AP2型轉(zhuǎn)錄因子包括擬南芥的AP2、ANT，玉米的Glossy、idsl等。這種類型的轉(zhuǎn)錄 因子含有兩個(gè)AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長發(fā)育，在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)14個(gè)AP2型轉(zhuǎn) 錄因子基因；EREBP型轉(zhuǎn)錄因子僅含1個(gè)AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域，調(diào)節(jié)植物對激素(乙烯)、病 原、低溫、干旱及高鹽等地分子應(yīng)答反應(yīng)。EREBP型轉(zhuǎn)錄因子中，已發(fā)現(xiàn)有煙草EREBP1-4、 番茄 Pti4-6、擬南芥 RAV1-2、AtEBP, AtERF 1-5, DREB1A-C(CBF1-3)和 DREB2A-B 等許多成 員，分別與細(xì)胞發(fā)育、激素、抗病、低溫及干旱、高鹽等信號(hào)傳遞有關(guān)。這些EREBP型轉(zhuǎn)錄 因子又可以再分為EREBP (ethylene-responsive element binding protein,艮口 ERF)亞 組，包括煙草EREBP1-4、番茄Pti4-6、擬南芥AtEBP、AtERFl_5、這類轉(zhuǎn)錄因子與含核心序 列AGCCGCC的GCC-盒特異結(jié)合，因此，它的DNA結(jié)合區(qū)又稱為GCC-盒結(jié)合域(GCC_box binding domain，GBD)，其中第2個(gè)G、第5個(gè)G、第7個(gè)C對ERF蛋白的識(shí)別有重要作用(Hao D，Ohme-Takagi M，Sarai A，1998)。用核磁共振對其三維空間結(jié)構(gòu)的研究表明，AtERFl的 GBD通過形成3個(gè)反向的β -片層與其靶序列GCC-盒的大溝相結(jié)合；DREBP亞組，包括擬 南芥DREBlA-C (CBFlD和DREB2A-B，這類轉(zhuǎn)錄因子在干旱、高鹽、低溫下特異結(jié)合干旱應(yīng)答元件DRE/CRT，在擬南芥基因組中發(fā)現(xiàn)IM個(gè)DREBP型轉(zhuǎn)錄因子基因；RAV型轉(zhuǎn)錄因子包 括擬南芥RAVI、RAV2、含有兩個(gè)不同的DNA結(jié)合區(qū)-ERF/AP2和B3，在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)6個(gè) RAV型轉(zhuǎn)錄因子基因。還有一類特殊的轉(zhuǎn)錄因子AL079349，它與以上的轉(zhuǎn)錄因子都不同，自
成一類。最近發(fā)現(xiàn)EREBl5s蛋白參與了干旱、高鹽和低溫脅迫的信號(hào)傳導(dǎo)和基因表達(dá)調(diào)控。 Mine等人從低溫儲(chǔ)藏的土豆塊莖中分離到了 EREBP轉(zhuǎn)錄因子CIP353，受低溫脅迫誘導(dǎo)強(qiáng)烈 表達(dá)(Mine Τ, Hiyoshi Τ, KasaokaK, Ohyama A，2003)，說明可能有 EREBP 蛋白參與 了受低 溫脅迫的基因表達(dá)調(diào)控。Park等利用西紅柿為材料，得到了受高鹽、乙烯或茉莉酸誘導(dǎo)表達(dá) 的 EREBP 轉(zhuǎn)錄因子 Tsi 基因，EMSA(Electrophoretic mobility shift assays)試驗(yàn)分析 發(fā)現(xiàn)，Tsi蛋白與GCC-box和DRE/CRT順式元件都能結(jié)合(Park JM, Park CJ, Lee SB, Ham BK, Shin R，Paek KH，2001)，盡管前者結(jié)合能力大于后者，但說明，某些EREBP蛋白能激活 受滲透脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的基因。在正常生長條件下，Tsi基因的超量表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因植株 (35S: :Tsil)的耐鹽性、增強(qiáng)了抗病性(Park JM,Park CJ,Lee SB,Ham BK,Shin R，Paek KH, 2001)，以上說明了 Tsi基因可能參與了生物脅迫和非生物脅迫兩條信號(hào)傳導(dǎo)途徑。由高鹽 脅迫激活的一條類MAPK信號(hào)傳遞模式(包括SIMKK和SIMK)，將脅迫信號(hào)傳遞給EIN2 (在 乙烯信號(hào)傳遞途徑的CTRl下游)(Guo HW and Ecker J，2004)，最后激活某些EREBI3s轉(zhuǎn)錄因 子，調(diào)控滲透脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，提高植物的耐鹽性。對于是否存在含GCC-box元件，且 表達(dá)產(chǎn)物直接參與非生物脅迫響應(yīng)的基因，還有待作進(jìn)一步的證實(shí)。綜合目前的研究結(jié)果，植物在逆境脅迫條件下的信號(hào)傳遞途徑至少有以下六條途 徑(1)依賴于ABA的信號(hào)傳遞途徑有三條受干旱、高鹽誘導(dǎo)，激活MYB、MYC類轉(zhuǎn)錄因子基 因，調(diào)控具有MYBR或MYCR順式作用元件的靶基因；受干旱、高鹽、高溫誘導(dǎo)，激活A(yù)BF/AREB 類轉(zhuǎn)錄因子基因，調(diào)控具有ABRE順式作用元件的靶基因；受干旱、高鹽誘導(dǎo)，激活CBF4， DREBl類轉(zhuǎn)錄因子基因，調(diào)控具有DRE/CRT順式作用元件的靶基因。⑵不依賴于ABA的信 號(hào)傳遞途徑有三條受干旱、高鹽誘導(dǎo)，激活DREB2類轉(zhuǎn)錄因子基因，調(diào)控具有DRE/CRT順 式作用元件的靶基因；受低溫誘導(dǎo)，激活CBF1-3/DREB1A-C類轉(zhuǎn)錄因子基因，調(diào)控具有DRE/ CRT順式作用元件的靶基因；受干旱、高鹽或乙烯誘導(dǎo)，激活ERF類轉(zhuǎn)錄因子基因，調(diào)控具有 DRE/CRT或GCC順式作用元件的靶基因。用酵母單雜交系統(tǒng)證明轉(zhuǎn)錄因子的激活特性的主要原理如圖3所示，將DRE順式 作用元件和突變體DRE順式作用元件分別構(gòu)建到pHISi-Ι載體和pLacZi載體的基本啟動(dòng) 子Pmin (minimal promoter)上游，Pmin啟動(dòng)子下游連接報(bào)道基因(His3、LacZ和URA3)。 當(dāng)連接有編碼轉(zhuǎn)錄因子的目的基因的表達(dá)載體YEP-GAP (不含激活功能)分別轉(zhuǎn)化到連有 DRE順式作用元件和突變體DRE順式作用元件的酵母細(xì)胞后，如果連有突變體DRE順式作 用元件的酵母細(xì)胞中的報(bào)道基因不能表達(dá)，而連有特定的DRE順式作用元件的酵母細(xì)胞中 的報(bào)道基因能夠表達(dá)，說明該轉(zhuǎn)錄因子能與DRE順式作用元件結(jié)合，且具有激活功能，激活 了 Riiin啟動(dòng)子，促使報(bào)道基因表達(dá)。從而證明了目的轉(zhuǎn)錄因子的體內(nèi)結(jié)合特異性和激活功 能。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種脫水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的脫水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白，名稱為ZmDBP2，來源于玉米屬玉米(Zea mays L.)，是具有序列表中SEQ ID N2 :2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID No 2 的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID No 2 的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID N2 :2衍生的蛋白質(zhì)。序列表中序列2的氨基酸殘基序列是由343個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，自氨基 端第166位-223位氨基酸殘基序列為保守的AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域。脫水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白編碼基因，名稱為ZmDBP2，來源于玉米屬玉米(Zea mays L.)，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID Na 1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID Na 2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID Na 1限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼相同功 能蛋白質(zhì)的DNA序列。序列1中的cDNA序列由1501個(gè)堿基組成，該基因的開放閱讀框架為自5'端第 155位-1186位堿基，共編碼343個(gè)氨基酸(序列表中的序列2)。含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體及細(xì)胞系均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。擴(kuò)增ZmDBP2中任一片段的引物對也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明的ZmDBP2在干旱、高鹽、低溫、ABA的誘導(dǎo)下表達(dá)，并且可以特異 的調(diào)控含有DRE/CRT順式元件(核心序列CCGAC)的基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。本發(fā)明的ZmDBP2為 人為控制抗逆和耐逆相關(guān)基因的表達(dá)提供了基礎(chǔ)，將在培育抗逆性和耐逆性增強(qiáng)的植物育 種中發(fā)揮重要的作用。


圖1為ZmDBP2與玉米ZmDREB氨基酸序列的同源性比對結(jié)果圖2為ZmDBP2受脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR圖譜圖3為用酵母單雜交系統(tǒng)證明轉(zhuǎn)錄因子的體內(nèi)結(jié)合特異性和激活特性的原理示 意圖
圖4為實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件圖
圖5為獲得ZmDBP2基因編碼氨基酸部分的全序列的PCR擴(kuò)增條件圖
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、ZmDBP2的克隆一、mRNA 的分離將沙土中生長20天左右的玉米兩葉期幼苗進(jìn)行干旱處理5小時(shí)(處理方法將幼 苗小心的取出，注意不要傷根，用干凈的吸水紙將葉片及根部的水分吸干，再將幼苗放在干 凈的吸水紙上，置于陰涼處5小時(shí))，用液氮速凍，_80°C保存?zhèn)溆?。采用Trizol法(TianGen)提取小麥葉片總RNA，第一鏈cDNA合成用反轉(zhuǎn)錄酶 XL (AMV) (TaKaRa)。采用 SMART 法(BD)進(jìn)行合成 ds cDNA 取 2 μ 1 cDNA 進(jìn)行 100 μ 1 體系 的LD-PCR擴(kuò)增ds cDNA，循環(huán)數(shù)為M，延伸時(shí)間為6min。擴(kuò)增結(jié)束后取5 μ IPCR產(chǎn)物進(jìn)行 瓊脂糖凝膠(1.0%)電泳檢測。二、ZmDBP2基因全長序列的獲得
通過5’ RACE和3’ RACE的方法從玉米中獲得一個(gè)新的脫水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白基 因核苷酸序列及對應(yīng)的氨基酸序列，結(jié)果得到具有序列表中序列1所示的核苷酸序列的 ZmDBP2，其開放閱讀框架為自5'端第155位-1186位堿基，共編碼343個(gè)氨基酸(序列表 中的序列幻，自氨基端第166位-223位氨基酸殘基序列為保守的AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域。同源 序列比對結(jié)果表明，ZmDBP2與已報(bào)道的玉米ZmDBFl (AAM80486)同源性最高，只有34. 47% 的同源性(如圖1所示)，說明ZmDBP2是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的玉米基因。圖1中，黑框表示一致的 氨基酸部分。實(shí)施例2、實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析ZmDBP2的表達(dá)特性一、苗齡為20天的玉米幼苗，進(jìn)行以下處理(1)干旱處理將水培的玉米幼苗取出吸干根上的水分，置于干燥的濾紙上，干旱 培養(yǎng)1小時(shí)、2小時(shí)、5小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)后取出材料，用液氮速凍，_80°C保存(2)鹽漬處理將玉米幼苗置于2%的由NaCl和Na2SO4組成的鈉鹽溶液中(NaCl 與Na2SO4的質(zhì)量百分比為3 2)中，光照培養(yǎng)1小時(shí)、2小時(shí)、5小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48 小時(shí)后分別取出材料，用液氮速凍，-80°C保存?zhèn)溆谩?3)冷害處理將玉米幼苗置于4°C培養(yǎng)箱，光照培養(yǎng)1小時(shí)、2小時(shí)、5小時(shí)、12小 時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)后取出并用液氮速凍，-80°C保存?zhèn)溆谩?4) ABA處理將玉米幼苗置于200 μ M的ABA溶液中，光照培養(yǎng)1小時(shí)、2小時(shí)、5小 時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)后分別取出并用液氮速凍，-80°C保存?zhèn)溆谩?5)對照的處理直接取未經(jīng)任何處理的玉米幼苗_80°C凍存作為對照。二、mRNA 的分離將生長20天的幼苗處理后，，用液氮速凍，_80°C保存?zhèn)溆?。采用Quikpr印Micro mRNA PurificationKit (Pharmacia)進(jìn)行 mRNA 的分離。三.反轉(zhuǎn)錄為cDNA采用R103_Quant_Reverse_Transcriptase (TIANGEN)將純化的 mRNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA.反應(yīng)體系10XRT buffer2μ 1dNTP mix(2. 5mM each)4μ 1oligo-dT 引物(10)2μ 1RNase inhibitor(10U/)1 μ 1Quant reverse transcriptase 1 μ 1RNase free H205 μ 1模板 RNA5μ 1總體系為2037°C 孵育 60min。四、實(shí)時(shí)熒光定量PCR根據(jù)已知的ZmDBP2序列，在其可變區(qū)設(shè)計(jì)特異引物。ZmDBP2RTF 5’ -GCCCGATGGCATTTTAGACG-3’ ；ZmDBP2RTR :5’ -AACCAGGAGATTAGCACGCA-3’
以actin為內(nèi)參基因。反應(yīng)體系cDNA1 μ 12. 5XRealMasterMIX8μ 120 X SYBR1 μ 1ddH2010 μ 1反應(yīng)條件圖4ZmDBP2對各個(gè)脅迫及激素表現(xiàn)出響應(yīng)。圖2實(shí)施例3、ZmDBP2的激活特性一、將ZmDBP2基因構(gòu)建到表達(dá)載體YEP-GAP上1、獲得ZmDBP2基因編碼氨基酸部分的全序列根據(jù)已克隆的ZmDBP2基因的序列設(shè)計(jì)引物，引物末端分別加EcoRI和BioI酶切 位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增獲得編碼氨基酸部分的全序列，程序及體系如下引物序列ZmDBP2-EI :5，-GGGGAATTCGCTCCATCCAAGCTGTAGTCCT-3，ZmDBP2-XI :5’ -GGGCTCGAGGCTCATGACAGGATGGAATCC-3，反應(yīng)體系(50μ 1)模板(60ng/ul)0. 5 μ 1dNTP (IOmM)1 μ 1引物 05 μ Μ)1 μ 1IOXbuffer5μ 1ddh2042. 1 μ 1Taq (5U/μ 1)0. 4 μ 1擴(kuò)增條件(PTC-200)圖5取擴(kuò)增產(chǎn)物2ul在1. 2%瓊脂糖凝膠中電泳檢測，溴化乙啶染色，紫外凝膠成像儀 掃描，觀察在1.1Kb左右的位置處是否有一條亮帶。采用 Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2· 0 (TaKaRa 公司，Code No. DV807A)回收純化PCR產(chǎn)物(同三、cDNA文庫的篩選的探針的回收)。2、將ZmDBP2基因構(gòu)建到表達(dá)載體YEP-GAP上將步驟1中純化的PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體YEP-GAP (Liu Q, Kasuga M, Sakuma Y, Abe H, Miura S, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K. ,1998),用 EcoRI(Takara)禾口 XhoI (Takara)分別酶切4_Mir，反應(yīng)體系如下IOX 緩沖液 H5μ 1EcoR I(12U/y 1)2μ 1XhoI (12U/μ 1)2μ 1PCR 產(chǎn)物 /YEP-GAP20 μ 1ddH2021 μ 1
采用 Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2· 0 (TaKaRa 公司，Code No. DV807A)回收純化酶切產(chǎn)物(同三、cDNA文庫的篩選的探針的回收)。將純化的酶切PCR產(chǎn)物和酶切載體YEP-GAP連接4^hr，反應(yīng)體系如下
10 X Ligase buffer1 μ 1
酶切PCR產(chǎn)物4μ 1
酶切載體YEP-GAP4μ 1
T4DNA Ligase1 μ 1
取0. 5μ 1連接產(chǎn)物，電擊轉(zhuǎn)化JM109菌株，37°C過夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆，測序分
析序列是否正確，得到含有ZmDBP2基因的重組表達(dá)載體YEP-GAP-ZmDBP2。二、ZmDBP2的體內(nèi)結(jié)合特異性和激活特性的驗(yàn)證1、酵母報(bào)道子的構(gòu)建將含有4 個(gè) DRE 元件的片段 5，-GAATTC-DRE-DRE-DRE-DRE-GTCGAC-3，(DRE 的核心 序列TACCGACAT)分別構(gòu)建到 pHis-1 載體(MATCHMAKER One-Hybrid System，Clontech 公 司)的 Pminms3 啟動(dòng)子和 pLacZi 載體(MATCHMAKER One-Hybrid System, Clontech 公司) Pcyci啟動(dòng)子上游，分別得到重組載體pHis-l-DRE和pLacZi_DRE，用Xho I和Nco I內(nèi)切酶 分別將pHis-1-DRE和pLacZi-DRE載體切成線狀。先將線狀pHis-1-DRE載體轉(zhuǎn)化到酵母 細(xì)胞(YM4271 株系，MATCHMAKER One-Hybrid System，Clontech 公司)內(nèi)，獲得能在 SD/His 培養(yǎng)基上正常生長的酵母轉(zhuǎn)化子(Yeast transformant)。接著以這種酵母轉(zhuǎn)化子為寄主細(xì) 胞，繼續(xù)轉(zhuǎn)化含有4個(gè)重復(fù)DRE元件的pLacZi-DRE載體。這樣在同時(shí)缺乏組氨酸和尿嘧啶 的SD/His7toa-培養(yǎng)基上，選擇獲得含有pHis-1-DRE和pLacZi-DRE的正常雙重酵母報(bào)道 子；將 4 個(gè) DRE 元件的核心序列 CCGAC 突變成 TTTTT (MDRE)，即 5，-GAATTC-MDRE-MDRE-MDR E-MDRE-GTCGAC-3，，按正常的雙重酵母報(bào)道子構(gòu)建方法，再構(gòu)建一個(gè)含4個(gè)MDRE盒的突變 體雙重酵母報(bào)道子。2、PEG/LiAc法轉(zhuǎn)化酵母及結(jié)果分析(1)接種酵母菌株(YM4271 株系，MATCHMAKER One-Hybrid System, Clontech 公 司)到Iml YPD液體培養(yǎng)基中，劇烈震蕩2分鐘，分散團(tuán)塊后將懸浮液轉(zhuǎn)至含有50ml YPD液 體培養(yǎng)基的三角瓶中，30°C /250rpm搖過夜，測0D600 = 1. 7-1. 8 (計(jì)數(shù)約4X IO7個(gè)/mL)；(2)取30ml步驟(1)過夜培養(yǎng)物接到300ml新鮮的YPD培養(yǎng)基中，30°C /250rpm 培養(yǎng)，約3小時(shí)至0D600 = 0. 5士0. 1，室溫IOOOg離心5min，收集菌體，棄上清，用1/2體積 IXTE 懸浮，1000g/5min 離心；(3)吸棄上清，用1. 5ml新鮮配制的ΙΧΤΕ/LiAc溶液懸浮，振蕩混勻備用；(4)取出0. Iml酵母感受態(tài)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，依次加下列溶液0. Iyg表達(dá)載體 YEP-GAP-ZmDBP2、0. Img ssDNA(鮭魚精 DNA, Sigma)、0· 6mlPEG/LiAc 高速振蕩 1 分鐘， 30 0C /200rpm振蕩培養(yǎng)30分鐘；(5)加入70ul DMS0(sigma#D8779)，輕輕倒置混勻，42°C熱激30分鐘，其間輕輕振 蕩，冰浴2分鐘，室溫IOOOg離心5min ；(6)吸棄上清，加入0.5ml 1 X TE buffer懸浮細(xì)胞；(7)用接種環(huán)蘸取懸浮液，分別在含有0，15mmol/L 3-AT的SD/His/^ra-/!1!^選 擇性培養(yǎng)基上畫線培養(yǎng)。
(8)平板的一半培養(yǎng)步驟1構(gòu)建的正常雙重酵母報(bào)道子，另一半培養(yǎng)步驟1構(gòu)建的 突變體雙重酵母報(bào)道子，以便做對照分析。(9)顛倒放置于培養(yǎng)箱中，30°C培養(yǎng)3-4天。(10)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在0mmol/L3-AT的SD/HiS_/^ra_/trp_的培養(yǎng)基平板上正常的酵母 報(bào)道子和突變的酵母報(bào)道子都有生長，但突變的酵母報(bào)道子的直徑明顯小；而在15mmol/L 3-AT的SD/His/toa/Trp的培養(yǎng)基平板上正常的酵母報(bào)道子能正常生長，但突變的酵母報(bào) 道子被抑止沒有生長。3、半乳糖苷酶活性檢測(1)從Ommol/L 3-AT的SD/HiS_/^ra_/trp_的培養(yǎng)基平板上分別挑取正常的酵母 報(bào)道子和突變的酵母報(bào)道子菌落。轉(zhuǎn)至YPD液體培養(yǎng)基中，于30°C振蕩培養(yǎng)，待長至對數(shù)生 長后期，取1. 5ml菌液，3000rpm離心30s ；(2)棄上清，控干管中液體，將離心管置于液氮中速凍lOmin，取出使其自然融解， 加50ul Z/X-gal溶液，30°C溫育，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常的酵母報(bào)道子在6- 內(nèi)變藍(lán)，而突變的酵 母報(bào)道子在1 內(nèi)沒有變化，仍為白色。說明轉(zhuǎn)錄因子ZmDBP2能與DRE順式作用元件結(jié)合， 且具有激活功能，激活了 Riiin啟動(dòng)子(還是Rninms3啟動(dòng)子或PCTa啟動(dòng)子？)，促使報(bào)道基 因表達(dá)。從而證明了 ZmDBP2的體內(nèi)結(jié)合特異性和激活功能。三、藥劑配制
(I)YPD液體培養(yǎng)基
細(xì)菌培養(yǎng)用酵母抽提物(Bacto-Yeast Extract)10g/L
細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨(Bacto-Ρ印tone)20g/L
調(diào)節(jié)pH至5. 8，121°C /15min滅菌，降至60°C以后加入40%的Glucose，使其終濃度為20g/L。
(2) SD/His/Ura/Trp選擇性培養(yǎng)基
不含氨基酸的酵母氮源(Yeast nitrogen base)6. 7g/L
營養(yǎng)缺陷型混合物(drop-out media without His/Ura/Trp) 100ml
瓊月旨粉(Bacteriological agar)20g/L
調(diào)節(jié)pH至5. 8，121 °C /15min滅菌，降至60°C后加入40% Glucose,使其終濃度為20g/L。
(3)營養(yǎng)缺陷型混合物(Drop-out mix) (10X)
L-Isoleucine (異亮氨酸)300mg/L
L-Valine (纈氨酸)1500mg/L
L-Adenine (腺嘌呤)200mg/L
L-Arginine (精氨酸)200mg/L
L-Histidine Hcl monohydrate (組氨酸)200mg/L
L-Leucine (亮氨酸)lOOOmg/L
L-Lysine Hcl (賴氨酸)300mg/L
L-Methionine (甲硫氨酸)200mg/L
L-Phenylalanine ( ^MMSI)500mg/L
L-Threonine (蘇氨酸)2000mg/L
L-Tyrosine (酪氨酸) 300mg/L(4)lXPEG/LiAc 50% (w/v) PEG33508ml10XTE buffer1ml1OXLiAc1ml(5)10XTE Buffer 1OOmM Tris-Hcl1OmM EDTA,pH = 7. 5121°C高壓滅菌，室溫保存。(6)ΙΧΤΕ/LiAc 10XTE buffer1ml1OXLiAcIml(MH2O8ml(7)ZBuffer Na2HPO4 · 7H20 16.lg/LNaH2PO4 · H2O 5. 5g/L KCl0. 75g/LMgSO4 · 7H20 0. 246g/L調(diào)節(jié) pH 至 7. 0，121°C /15min 滅菌，4°C保存。(8)X_gal儲(chǔ)存液(X-gal Stock Solution)用 N，N-dimethyl-formamide (DMF)溶解 X_gal，使其終濃度為 20mg/ml，_20°C貯存。(9)含有X-gal 的 Z buffer 緩沖液 100ml (Ζ buffer with X_gal),注意現(xiàn)用現(xiàn)
配Z buffer98mlβ - 巰基乙酉享(β -mercaptoethanol)0. 27mlX-gal 儲(chǔ)存液(X-gal stock solution)1. 67ml
權(quán)利要求
1.一種脫水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白，是具有序列表中SEQ IDN2 :2氨基酸殘基序列的蛋白 質(zhì)，或者是將SEQ ID N2 :2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或 添加且具有與SEQ ID No 2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID No 2衍生的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其特征在于所述蛋白質(zhì)具有序列表中SEQID No 2的氨基酸殘基序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的蛋白質(zhì)，其特征在于所述SEQID N2 :2的自氨基端第 166位-2235位氨基酸殘基序列為保守的AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域。
4.一種脫水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQID Na 1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQID No 2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQID N2 :1限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋 白質(zhì)的DNA序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于所述基因具有序列表中序列1的DNA序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因，其特征在于所述基因的開放閱讀框架為自5'端第 115位-1186位堿基。
7.含有權(quán)利要求4、5或6所述基因的表達(dá)載體。
8.含有權(quán)利要求4、5或6所述基因的細(xì)胞系。
9.擴(kuò)增權(quán)利要求4、5或6所述基因中的任一片段的引物對。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種脫水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白及其編碼基因。本發(fā)明的脫水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明的ZmDBP2在干旱、高鹽、低溫和ABA的誘導(dǎo)下表達(dá)，并且可以特異的調(diào)控含有DRE/CRT順式元件(核心序列CCGAC)的基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。本發(fā)明的ZmDBP2為人為控制抗逆和耐逆相關(guān)基因的表達(dá)提供了基礎(chǔ)，將在培育抗逆性和耐逆性增強(qiáng)的植物育種中發(fā)揮重要的作用。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102140134SQ20111002536
公開日2011年8月3日 申請日期2011年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月24日
發(fā)明者孫嘯濤, 李小鵬, 李秀婷, 王成濤, 王昌濤, 王靜 申請人:北京工商大學(xué)