專利名稱：一種植物耐逆相關(guān)蛋白及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物耐逆相關(guān)蛋白及其編碼基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
干旱和鹽脅迫是影響植物生長最嚴重的逆境脅迫因子，是我國農(nóng)作物產(chǎn)量和播種面積的首要限制因素。脯氨酸是植物在逆境脅迫下積累的滲透脅迫物質(zhì)，起到調(diào)節(jié)細胞滲透壓、保護蛋白質(zhì)分子、作為活性氧的清除劑等作用，以維持植物的正常生長。植物積累脯氨酸能力的高低，決定了植物抗逆性的強弱。在植物體內(nèi)，脯氨酸的合成通過鳥氨酸/精氨酸和谷氨酸兩個途徑，在逆境脅迫下，谷氨酸途徑是合成脯氨酸的主要途徑。Δ L吡咯琳-5-羧酸合成酶(P5CQ是谷氨酸途徑中的限速酶，它是一個雙功能酶，具有谷氨酸激酶和谷氨酶-Y -半醛脫氨酶活性，催化脯氨酸合成的前2步反應(yīng)，同時它又可以被產(chǎn)物脯氨酸反饋抑制。羊草又名堿草，是歐亞大陸草原區(qū)東部草甸草原重要建群種之一。羊草是一種高產(chǎn)、適口性好的牧草，耐鹽堿，但不耐澇或嚴重干旱，培育高抗逆性羊草，無疑會帶來巨大的經(jīng)濟效益和生態(tài)效益。植物的抗旱、耐鹽堿性狀是多基因控制的數(shù)量性狀，給通過雜交育種提高作物的抗逆性帶來很大困難，因此可通過基因工程來改良作物的抗逆性。通過轉(zhuǎn)基因增加植物P5CS基因的表達量，從而提高植物積累脯氨酸的能力，是培育抗旱、耐鹽堿植物的一條有效途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種植物耐逆(抗旱、耐鹽)相關(guān)蛋白Δ L吡咯琳-5-羧酸合成酶及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供的植物耐逆相關(guān)蛋白(LcP5CSl)，是一種Δ L吡咯琳-5-羧酸合成酶， 來源于羊草(Leymus chinensis (Trin. ) Tzvel.)，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且參與脯氨酸合成的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。序列表中序列1由730個氨基酸殘基組成，自氨基末端第21位-第295位氨基酸殘基為AAK_super family的保守結(jié)構(gòu)域，自氨基末端310位-710位為ALDH-SF super family的保守結(jié)構(gòu)域，自氨基末端第22位-第730位氨基酸殘基為P5CS Multi-domain序列。為了便于LcP5CSl的純化，可在由序列1的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)的氨基端或羧基端連接上如表1所示的標簽。表1標簽的序列標簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個)RRRRRPoly-His2-10(通常為6個)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tag II8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述(b)中的LcP5CSl可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述(b)中的LcP5CSl的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5' 端和/或3'端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。編碼上植物耐逆相關(guān)蛋白的基因(LcP5CSl)也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述基因可為如下1)或2)或3)或4)的DNA分子1)序列表中序列2自5'末端第3-2195位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中的序列2所示的DNA分子；3)在嚴格條件下可與1)或2、限定的基因雜交且編碼所述蛋白的基因；4)與1)或2)限定的基因具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的基因。序列表中的序列2由2197個堿基組成，其開放閱讀框架(ORF)為自5'末端第 3-2195位核苷酸。上述嚴格條件可為在0. IXSSPE(或0. 1XSSC)，0. 1% SDS的溶液中，在65°C條件下雜交并洗膜。含有以上任一所述基因的重組載體也屬于本發(fā)明的保護范圍，如重組表達載體?？捎矛F(xiàn)有的植物表達載體構(gòu)建含有所述基因的重組表達載體。所述植物表達載體包括雙元農(nóng)桿菌載體(如pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、 PCAMBIA3301、pCAMBIA1301_UbiN、pCAMBIA1300等)和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；?如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用所述基因構(gòu)建重組植物表達載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子、組成型啟動子或誘導(dǎo)型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S啟動子、玉米的泛素啟動子⑴biquitin)、脅迫誘導(dǎo)型啟動子Rd29A等，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、 螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素標記物、卡那霉素標記物等)或是抗化學(xué)試劑標記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。含有以上任一所述基因(LcP5CSl)的表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系及重組菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。擴增上述基因的全長或任一片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。所述蛋白、所述基因、所述重組表達載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌中的任意一種均可應(yīng)用于培育耐逆植物。本發(fā)明的另一個目的是提供一種培育抗鹽、耐旱轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明所提供的培育抗鹽、耐旱轉(zhuǎn)基因植物的方法，可將編碼上述Δ1-吡咯琳-5-羧酸合成酶的基因(LcP5CSl)導(dǎo)入目的植物(如植物細胞或組織)中，得到耐逆性高于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達的載體，將編碼所述蛋白的基因?qū)胫参锛毎?，可獲得抗鹽、耐旱性增強的轉(zhuǎn)基因細胞系及轉(zhuǎn)基因植株。攜帶有所述基因的表達載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物，如煙草、苜宿、擬南芥、水稻、小麥、 玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草等。本發(fā)明提供的蛋白及其編碼基因，是植物在逆境脅迫下合成脯氨酸的限速酶。將本發(fā)明的基因?qū)胫参?，提高植物的脯氨酸的積累量從而提高植物的抗逆性，特別是干旱和高鹽脅迫可強烈誘導(dǎo)該基因的表達，通過轉(zhuǎn)基因手段提高作物△ L吡咯琳-5-羧酸合成酶表達量，可提高作物和草類的抗逆性，有助于提高作物產(chǎn)量、擴大播種面積和實現(xiàn)草原生態(tài)系統(tǒng)的健康持續(xù)發(fā)展。本發(fā)明提供的蛋白及其編碼基因?qū)τ谂嘤鼓嫘蕴岣叩难虿菁捌渌参镄缕贩N具有重要實用價值。本發(fā)明有助于了解植物在滲透脅迫下積累脯氨酸的作用機理，為揭示脯氨酸積累機制對植物維持正常生長發(fā)育和抗逆性的調(diào)節(jié)功能、為提高作物產(chǎn)量與改良品質(zhì)的基因工程研究提供遺傳學(xué)依據(jù)。


圖1為羊草幼苗總RNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果；圖2為PCR擴增LcP5CSl全長cDNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果；圖3為LcP5CSl的系統(tǒng)進化樹；圖4為LcP5CSl基因在鹽脅迫處理條件下的響應(yīng)模式(半定量RT-PCR)；圖5為LcP5CSl基因在干旱處理條件下的響應(yīng)模式(半定量RT-PCR)；圖6為羊草在鹽脅迫下脯氨酸的積累量；圖7為羊草在干旱脅迫下的脯氨酸的積累量；圖8為重組載體pSm301_LcP5CSl的PCR鑒定；
圖9為重組載體PSm301-LcP5CSl的雙酶切鑒定；圖10為轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后農(nóng)桿菌陽性轉(zhuǎn)化子PCR鑒定結(jié)果；圖11為轉(zhuǎn)基因擬南芥PCR鑒定結(jié)果；圖12為高鹽Q50mM NaCl)處理3天后轉(zhuǎn)化LcP5CSl的擬南芥和野生型擬南芥的
表型；
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。羊草(吉生一號)2005年9月購自吉林省吉生羊草良種站實施例1、羊草植物耐逆相關(guān)蛋白(Δ L吡咯琳-5-羧酸合成酶)及其編碼基因的獲得一、羊草植物耐逆相關(guān)基因LcP5CSl的克隆1、植物材料處理及總RNA的提取以250mM NaCl處理12h羊草(吉生一號)幼苗，具體方法為將正常生長8周的羊草(吉生一號)幼苗進行鹽脅迫處理。用250mM NaCl水溶液浸根，室溫培養(yǎng)，取處理12h羊草(吉生一號)幼苗為材料， 提取總RNA，進行1. 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1所示。所提取的RNA有兩條明顯的電泳條帶，從上到下依次為^S RNA和18S RNA，表明獲得了純度較高、較完整的總RNA。2、植物耐逆相關(guān)基因的克隆根據(jù)本實驗室高通量測序結(jié)果，結(jié)合已公開的植物Δ L吡咯琳-5-羧酸合成酶的氨基酸殘基序列尋找保守區(qū)域，根據(jù)保守區(qū)域序列設(shè)計引物，具體的引物序列如下Sl 5' -GAATGGGCAGGGGTGGCAT-3‘；S2 5' -CCTCATTGCAAAGGAAGATCC-3‘。以步驟1提取羊草幼苗的總RNA為模板，用Primekript 1st Strand cDNASynthesized Kit試劑盒(Takara公司)并參照試劑盒說明書，反轉(zhuǎn)合成第一鏈 cDNAo 反應(yīng)體系及反應(yīng)條件如下:01igo-dT(10pmol/y 1)1.0 μ 1、dNTP Mixture (IOmmo 1/ leach) L 0μ 1、Total RNA ( ^ 1 μ g) L 0μ 1、RNase-free water7. 0 μ 1,65 °C 5min ；然后力口 5 X Buffer 4·0μ1、RNase Inhibitor (40U/μ 1) 0· 5 μ 1、PrimeScript RTase (200U/ μ 1)0. 5μ 1，42°C 45min,70°C 15min，將合成的第一鏈 cDNA 貯存于 _20°C備用。以獲得的第一鏈cDNA為模板，用Sl和S2組成的引物對進行PCR擴增；PCR反應(yīng)體系為:cDNA 模板、Sl 與 S2 各 1 μ l(10umol/l)，IOXBuffer 2. 5 μ l，dNTP Mixture (IOmmo 1/ leach) 2 μ 1，Taq 酶 0. 25 μ 1，ddH20 12. 25 μ 1 ；反應(yīng)條件為先 94 °C 預(yù)變性 5min ；然后 940C 30s, 550C 30s, 72°C 2min 30s，共；35 個循環(huán)；最后 72°C延伸 lOmin。反應(yīng)結(jié)束后，對PCR擴增產(chǎn)物進行1. 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖2所示。 圖2中，泳道M為DL2000P1US DNA分子量標準(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，泳道1 為PCR擴增產(chǎn)物。結(jié)果表明，經(jīng)PCR擴增獲得了長度約為2200bp的目的片段。回收并純化 PCR產(chǎn)物，將其連接到PMD-18T載體(Takara公司)上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，篩選陽性克隆進行菌液PCR鑒定，提取陽性克隆的質(zhì)粒進行測序，對測序結(jié)果進行BLAST分析。測序結(jié)果如序列2所示，經(jīng)分析表明，該片段長2197bp，編碼序列表的序列1所示的蛋白質(zhì)。將序列1所示的蛋白質(zhì)命名為LcP5CSl (由730個氨基酸殘基組成)，將LcP5CSl 的編碼基因命名為LcP5CSl，其全長cDNA如序列表的序列2所示。實施例2、LcP5CSl和LcP5CSl的生物信息學(xué)分析一、LcP5CSl基因的序列分析及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)功能預(yù)測利用DNAMAN和OMIGA軟件對LcP5CSl的全長cDNA序列進行生物信息學(xué)分析，該序列全長2197bp，自5'端第3位-第2195位為0RF。推測其分子量為78. 887kDa，等電點pi 值 6. 69。用在線 BlAST 工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析 LcP5CSl 的結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明，該蛋白屬于P5CS Multi-domain，表明該蛋白是P5CS家族中的一員。二、LcP5CSl與其它P5CS類蛋白序列的同源性及系統(tǒng)進化樹分析利用在線Blast工具對LcP5CSl與植物中其它已克隆的P5CS氨基酸序列 (GeneBank 登陸號為TaP5CS 分另Ij 為 AAX!35536，SbP5CSlACU65226, SbP5CS2ACU65227, 0sP5CSl BAA19916, ZmP5CS ABI21839, AtP5CSlNP181510, AtP5CS2NP191120， BnP5CSAAAK01360, BnP5CSB AAKO1361, TomPROl AAB67877, TomPR02 Q96480, EcGPK YP539318進行同源性分析比對，見圖3。結(jié)果如圖3，表明LcP5CSl與單子葉植物高粱SbP5CSl的同源性分別為87%;而與其它單子葉P5CS雙子葉的P5CS同源性較低。進化樹分析表明，P5CS類蛋白在進化過程中出現(xiàn)了較大的差異，單子葉的P5CS聚為一類，雙子葉植物中除番茄的TomPROl與原核生物大腸桿菌的EcGPK同源性較近外，其它的雙子葉P5CS也聚為一類。實施例3、LcP5CSl在干旱和鹽脅迫條件下的表達模式分析將正常生長8周的羊草(吉生一號)幼苗進行不同處理。第一組(鹽脅迫處理)用250mM NaCl水溶液浸根，室溫培養(yǎng)；分別取處理0，l，2，4，8，12，24，48h的處理材料葉片，迅速保存于液氮中。第二組(干旱脅迫處理)停止供水，室溫培養(yǎng)；分別取斷水處理0，1，2，3，4，5，6d的羊草幼苗葉片，迅速凍于液氮中。提取上述兩組處理過的羊草幼苗的總RNA，進行RT-PCR。LcP5CSl 引物1 :5' -GTCGGCACCGCTATTGTC-3‘；2:5' -GCCAAACTGTCGTTATCCC-3 ‘；內(nèi)參 Actin 引物1 :5' -TGGACTCTGGTGATGGTGTGAG-3‘；2:5' -GTGCTAAGGGAGGCAAGGATG-3‘。內(nèi)參反應(yīng)條件-MV 5min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s, 26 個循環(huán)。LcP5CSl 反應(yīng)條件94°C 5min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 40s, 30 個循環(huán)。結(jié)果見圖4、圖5。結(jié)果表明，LcP5CSl轉(zhuǎn)錄水平明顯受干旱和鹽脅迫誘導(dǎo)，在誘導(dǎo)條件下，LcP5CSl基因的相對表達量迅速增加。實施例4、LcP5CSl的功能驗證(測定其產(chǎn)物脯氨酸的含量)干旱、鹽脅迫下脯氨酸含量測定，以確定在干旱和鹽脅迫下LcP5CSl表達量的增高和脯氨酸含量的關(guān)系，從而驗證脯氨酸的含量是否與LcP5CSl的表達量相關(guān)。干旱、鹽脅迫的具體方法同實施例3。1.脯氨酸提取取0.05-0. 5g脅迫處理后不同時間點羊草葉片，用3%磺基水楊酸溶液研磨提取，磺基水楊酸的最終體積為5ml。勻漿液轉(zhuǎn)入玻璃離心管中，在沸水浴中提取 IOmin0冷卻后，以3000r/min離心lOmin，取上清液待測。2.含量測定1)標準曲線制作在l-10ug/ml脯氨酸濃度范圍呢制作標準曲線.取標準溶液各anl，加入aiil 3%磺基水楊酸，2ml冰乙酸和細1 2. 5%茚三酮溶液，置沸水浴中顯色 60min.冷卻后，加入細1甲苯萃取紅色物質(zhì).靜置后，取甲苯相測定520nm波長處的吸收值，依據(jù)脯氨酸量和相應(yīng)吸收值繪制標準曲線。2)樣品測定取2ml上清液，加入2ml水，再加入冰乙酸等顯色試劑，同標準曲線程序進行顯色，萃取和比色。結(jié)果如圖6、7表明，在脅迫處理后，植物體內(nèi)脯氨酸含量升高，并且脯氨酸含量的增高在P5CS表達量增高之后，證明提高LcP5CSl表達量可增加植物體內(nèi)脯氨酸含量，說明 LcP5CSl是逆境脅迫下脯氨酸合成的關(guān)鍵酶。實施例5、LcP5CSl轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得將上述實施例1擴增得到的LcP5CSl基因以含有KpnI和BamHI的引物L(fēng)cP5CSSN 1301-s (5，-CGGGATCCATGGGCAGGGGTGGCAT-3 ’)和 LcP5CSSNl30 l_r (5 ’ -GGGGTACCTCATTGCAAA GGAAGATCCT-3，)擴增后克隆入載體PMD18-T (TaKaRa公司)，PCR擴增條件為94°C預(yù)變性 5min ；然后 94°C 30s，58°C 30s，72°C 2min 30s，共；35 個循環(huán)；最后 72°C延伸 lOmin。鑒定后陽性菌液提質(zhì)粒，用KpnI和BamHI雙酶切，插入到經(jīng)同樣酶切的植物表達載體pSm301 (購自CAMBIA公司)的KpnI和BamHI酶切位點間，將得到的重組載體命名為pSm301_LcP5CSl。 用引物 LcP5CSSm301-s 和 LcP5CSSN1301_r 對pSm301_LcP5CSl 進行 PCR鑒定，反應(yīng)條件同上，結(jié)果如圖8所示，泳道M為為DL2000P1US DNA分子量標準(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，泳道1、3、4、5、7、8、9、10為鑒定正確的重組質(zhì)粒。用恥111和BamHI對pSN1301_LcP5CSl 進行雙酶切鑒定，結(jié)果如圖9所示，其中，泳道M為DL2000Plus DNA分子量標準(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，經(jīng)酶切獲得一條2000bp左右的條帶，證明目的片段已正確連接入植物表達載體中。重組載體pSm301_LcP5CSl導(dǎo)入到農(nóng)桿菌EHA105株系(購自美國Clontech公司， 商品目錄號K1612-1)中，PCR篩選陽性重組子，引物與反應(yīng)條件同上，結(jié)果如圖10所示，圖 10中，泳道M為DL2000P1US DNA分子量標準(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，泳道1、2、 3、5為陽性重組子PCR結(jié)果。擬南芥種子(Columbia生態(tài)型，來源于法國農(nóng)科院凡耳賽研究中心世界擬南芥種子庫)用75%乙醇消毒aiiin，〗1^ NaClO滅菌15min后，播種于MS培養(yǎng)基，光照培養(yǎng)3天后，將小苗移至營養(yǎng)土 蛭石=1 1的土壤中，待大部分植株都抽苔之后，在花序基部剪掉整個主苔，去其頂端優(yōu)勢，約1周后在腋芽部位長出4-6個新生側(cè)苔， 待側(cè)苔花序形成花蕾并部分開花或形成1-2個角果時，便可用于轉(zhuǎn)化。IOmL管添加YEB液體培養(yǎng)基2mL，并添加篩選抗生素利福平和卡那霉素各50mg/L。挑取農(nóng)桿菌單菌落接種于管中，28°C 200rpm搖菌。當(dāng)天晚間轉(zhuǎn)接于含同樣濃度抗生素的YEB液體培養(yǎng)基50ml的三角瓶中，28°C搖菌過夜。第二天轉(zhuǎn)入250ml含有抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中搖菌至OD 600 在1. 2左右，轉(zhuǎn)入離心管中，室溫5000rmp離心5min。棄上清，將沉淀轉(zhuǎn)入含3 %的蔗糖和0. 1% Selwert (Sigma公司)的蒸餾水中，使其0D600在0. 8左右。將野生型植株花序浸泡于轉(zhuǎn)化菌液中20秒，保鮮膜包裹，避光保存過夜后揭膜，正常養(yǎng)護。得到種子后滅菌，播種于含有20mg/L的潮霉素的MS篩選培養(yǎng)基上，篩選陽性轉(zhuǎn)基因苗，將這些苗移至土壤中，生長10天后對轉(zhuǎn)基因植株進行PCR檢測，反應(yīng)條件與引物同上，結(jié)果如圖11所示，泳道M為 DL2000Plus DNA分子量標準(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，泳道2、5、6、7、8、9、10、12 為獲得的8個陽性轉(zhuǎn)基因植物株系PCR鑒定結(jié)果。獲得的陽性轉(zhuǎn)基因植物自交得到T2代種子。實施例6、LcP5CS轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗逆性實驗將野生型擬南芥種子(對照(Columbia生態(tài)型，來源于法國農(nóng)科院凡耳賽研究中心世界擬南芥種子庫))和實施例5獲得的LcP5CSl轉(zhuǎn)基因擬南芥T2代種子分別播種于MS 培養(yǎng)基中，三天后將小苗移至土中，在溫室培養(yǎng)一周后進行鹽脅迫處理Q50mM NaCl)，三天后觀察表型。結(jié)果轉(zhuǎn)基因擬南芥經(jīng)鹽處理三天后沒有死亡，結(jié)果如圖12左圖；而野生型已經(jīng)完全萎蔫死亡，結(jié)果如圖12右圖。上述實驗結(jié)果表明本發(fā)明的LcP5CSl可以增強植物的抗逆能力，從而可以作為植物基因工程的候選基因加以應(yīng)用，用來改良植物的抗逆性狀。
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有與1)所述蛋白相同功能的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下1)或2)或3)或4)的 DNA分子1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼ΔL吡咯琳-5-羧酸合成酶的DNA 分子；3)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼ΔL吡咯琳-5-羧酸合成酶的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組表達載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌。
5.擴增權(quán)利要求2或3所述基因的全長或其任意片段的引物對。
6.權(quán)利要求1所述蛋白、權(quán)利要求2或3所述基因、權(quán)利要求4所述重組表達載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌中的任意一種在培育耐逆植物中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述耐逆為耐旱和/或耐鹽。
8.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將權(quán)利要求2或3所述基因?qū)肽康闹参镏?，得到耐逆性高于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物；所述目的植物為擬南芥、煙草、百脈根、水稻、小麥、 玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草、苜宿、大豆、棉花或羊草。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述耐逆性為耐旱性和/或耐鹽性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種植物Δ1-吡咯琳-5-羧酸合成酶及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且參與脯氨酸合成的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供的蛋白及其編碼基因，可以調(diào)控植物脯氨酸的合成，受鹽和干旱脅迫誘導(dǎo)，參與羊草對鹽和干旱脅迫的響應(yīng)。將本發(fā)明的基因?qū)胫参铮梢蕴岣咧参锏目鼓嫘?。本發(fā)明提供的蛋白及其編碼基因?qū)τ谂嘤鼓嫘蕴岣叩难虿菁捌渌参镄缕贩N具有重要實用價值。
文檔編號C12N15/11GK102373187SQ20111002555
公開日2012年3月14日 申請日期2011年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月11日
發(fā)明者劉公社, 李曉峰, 蘇蔓, 陳雙燕, 齊冬梅 申請人:中國科學(xué)院植物研究所