專利名稱：南瓜耐旱基因CmNAGS及其抗除草劑植物表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及南瓜耐旱基因CmNAGS及其抗除草劑植物表達(dá)載體。
背景技術(shù)：
隨著全球水資源危機(jī)及環(huán)境的惡化，農(nóng)作物經(jīng)常遭受到干旱脅迫的危害。目前， 全球約有43%的耕地處于干旱、半干旱地區(qū)，由此造成的減產(chǎn)超過所有自然災(zāi)害的總和。 我國約有48%的土地處于干旱、半干旱地帶，其中沒有灌溉條件的旱地約占總耕地面積的 51.9%。干旱是限制我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要因素之一。植物遭受干旱脅迫后，脫水萎蔫，引起一系列生理生化代謝紊亂，如果持續(xù)過久，導(dǎo)致植物死亡。轉(zhuǎn)基因技術(shù)是解決干旱危害的有效途徑之一，克隆耐旱相關(guān)基因并轉(zhuǎn)化作物，使其在作物中過量表達(dá)，將會大幅提高作物的耐旱能力。N-乙酰谷氨酸合成酶(N-acetylglutamate synthase, NAGS)是生物體內(nèi)L-精氨酸生物合成途徑的關(guān)鍵酶，催化該途徑的第一步反應(yīng)，其主要功能是將谷氨酸乙?；癁?N-乙酉先谷氨酸(參考文獻(xiàn)Slocum R D. Genes, enzymes and regulation of a rginine biosynthesis in plants. PlantPhysiology and Biochemistry· 2005，43 :729-745)。精氨酸是植物中一種重要的氮素儲藏氨基酸，也是多胺合成的前體，多胺可緩解干旱條件下葉綠素?fù)p失(參考文獻(xiàn)Capell TiEscobar CiLiu H. Overexpression of the oat a rginine decarboxylase cDNA in transgenic rice affects normaldevelopment patterns in vitro and result in putrescine accumulation in transgenic plants. Theoretical md Applied Genetics. 1998,97 :246-2 )，該途徑的中間產(chǎn)物瓜氨酸在干旱條件下是一種新型高效的羥自由基清除劑，在抗旱性良好的野生西瓜中含量較高(參考文獻(xiàn):Akashi K，Miyake C，Yokota A. Citrulline, a novel compatible solute in d rought-tolerant wild watermeIonleaves, is an efficient hyd roxyl radical scavenger. Federation of European Biochemical SocietiesLetters. 2001，508 :438-442)，另一個中間產(chǎn)物鳥氨酸參與脯氨酸的生物合成(參考文獻(xiàn)Delauney A JiVerma D P S. Proline biosynthesis and osmoregulation in plants. Plant Journal. 1993,4(2) :215-223)。Kalamaki 等首次從番茄中分離出S/NAGS1基因，將該基因連接到CaMV35S啟動子后轉(zhuǎn)化擬南芥，干旱脅迫下，轉(zhuǎn)基因擬南芥中鳥氨酸、瓜氨酸含量明顯提高，萎蔫時間遲于對照組，復(fù)水后可恢復(fù)健康生長狀態(tài)，表現(xiàn)出較好的耐旱性，而對照組植株死亡(參考文獻(xiàn)Kalamaki M S， Alexandrou D， Lazari D， Merkouropoulos G， Fotopoulos V， Pateraki I， Aggelis A，Carrillo-Lo ‘ pez A，Rubio-Cabetas M D，Kanellis A K. Over-expression of a tomatoN-acetyl-L-glutamate synthase gene (S/NAGS1)in Arabidopsis thaliana results in high ornithinelevels and increased tolerance in salt and d rought stresses. Journal of Experimental Botany· 2009，8 :1_13)。bar 基因編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(phosphinithricin acetlyltransferase，PAT)，對抗草丁膦有很高的專一性。將除草劑抗性基因?qū)胱魑铮阌锌赡塬@得抗除草劑的作物品種。目前，對除草劑草丁膦的抗性bar基因已經(jīng)導(dǎo)入水稻(參考文獻(xiàn)Toki S， Takamatsu S,Nojiri C,Ooba S,AnzaiH,lwata M,Christensen A H,Quail P H,Uchimiya H.Expression of a maize ubiquitin genepromoter-bar chimeric gene in transgenic rice plants. Plant Physiology. 1992，100 :1503-1507)、玉米(參考文獻(xiàn)Palmer K Ε, Thomson J A, Rybicki E P.Generation of maize cell lines containingautonomosly replicating maize streak virus-based gene vectors. Archives of Virology. 1999, 144 :1345-1360)、番茄(參考文獻(xiàn)Knapp S, Larondelle Y，Ros β berg Μ, Fu rtek D, Theres K. Transgenictomato lines containing Ds elements at defined genomic positions as tools for ta rgeted transposontagging. Molecular and General Genetics. 1994,243 :666-673)等作物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為提高農(nóng)作物耐旱性提供一個新的南瓜耐旱基因CmNAGS。本發(fā)明的另一目的是提供該耐旱基因CmNAGS抗除草劑植物表達(dá)載體及其構(gòu)建方法。所構(gòu)建的植物表達(dá)載體可直接用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的作物遺傳轉(zhuǎn)化，創(chuàng)制耐旱和抗除草劑新種質(zhì)，可用于農(nóng)作物品種改良。本發(fā)明的技術(shù)問題可通過如下技術(shù)方案解決南瓜耐旱基因CmNAGS(N-乙酰谷氨酸合成酶基因CmNAGS)，該基因的序列為SEQ ID NO. 1。南瓜耐旱基因CmNAGS抗除草劑植物表達(dá)載體，由本發(fā)明所述的南瓜耐旱基因 CmNAGS與植物表達(dá)載體構(gòu)成。其中，所述的植物表達(dá)載體通過分別用EcoR I/Hind III雙酶切植物表達(dá)載體 PCAMBIA3301和全序列合成的T800 DNA片段，回收lU89bp的pCAMBIA3301大片段和849bp 的T800 DNA小片段，連接所述兩個片段得到的中間載體pCAMBIA3301-T800。所述的南瓜耐旱基因CmNAGS抗除草劑植物表達(dá)載體構(gòu)建方法如下1)南瓜耐旱基因CmNAGS的克隆以提取的南瓜幼嫩葉片為材料，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA ；以所述的反轉(zhuǎn)錄的 cDNA為模板，設(shè)計上游引物YWNMBs2 :SEQ ID NO. 5，下游引物YWNM&i2 :SEQ ID NO. 6，用高保真酶PCR擴(kuò)增上游和下游分別引入Mc I和)(ba I酶切位點的CmNAGS基因，產(chǎn)物連接到 PMD19-T克隆載體，轉(zhuǎn)化DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行序列測定，得到序列為SEQ ID N0. 7所示的上下游分別引入Me I和Xba I酶切位點的CmNAGS基因；2)中間載體 pCAMBIAMOl-TOOO 的改造全序列合成含有CaMV35S啟動子、多克隆位點、Nos終止子的T800片段SEQ ID N0. 2，其中，啟動子的上游和終止子的下游分別引入了 EcoR I和Hind III酶切位點；EcoR I和HindIII雙酶切pCAMBIA3301 (含bar基因)和所述的T800片段，回收lU89bp的 PCAMBIA3301大片段(含bar基因)和849bp的T800DNA小片段，連接所述兩個片段得到中間載體pCAMBIA3301-T800 (含bar基因)，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切驗證；
3)植物表達(dá)載體 pCAMBIA3301-T800-CmNAGS 的構(gòu)建分別用Me I和Xba I雙酶切步驟1)得到的插入CmNAGS基因的pMD19_T和 PCAMBIA3301-T800 質(zhì)粒，回收 CmNAGS 基因片段(1854bp)和質(zhì)粒 pCAMBIA3301_T800 大片段 (12138bp)，連接所述兩片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切驗證， 得到所述的南瓜耐旱基因CmNAGS抗除草劑植物表達(dá)載體pCAM BIA3301-T800_CmNAGS。有益效果1.本發(fā)明提供的南瓜耐旱基因CmNAGS是一個新的耐旱基因，該基因轉(zhuǎn)化作物，可提高農(nóng)作物的耐旱性。2.本發(fā)明將南瓜N-乙酰谷氨酸合成酶基因CmNAGS克隆至含有抗除草劑基因 (bar基因)的中間載體pCAMBIA3301-T800中，CmNAGS基因在CaMV35S啟動子的啟動下超量表達(dá)，大量合成參與精氨酸生物合成途徑第一步反應(yīng)的N-乙酰谷氨酸合成酶，使植物體內(nèi)精氨酸及中間產(chǎn)物鳥氨酸和瓜氨酸含量提高，提高植物耐旱性。同時，bar基因編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(phosphinithricin acetlyltransferase, PAT)，可使轉(zhuǎn)基因作物對抗以膦絲菌素(Phosphinothricin，PPT)為有效成分的Basta、Liberty等除草劑。3.本發(fā)明構(gòu)建的南瓜耐旱基因CmNAGS抗除草劑植物表達(dá)載體為首次報道，可使轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物具有抗除草劑和提高耐旱性雙重特性，可直接用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)農(nóng)作物遺傳轉(zhuǎn)化，創(chuàng)制耐旱和抗除草劑新種質(zhì)，對于優(yōu)良作物新品種的培育及在生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用，具有重要意義。


圖ICmNAGS瓊脂糖凝膠電泳分析；1:DNA Marker(2Kb/lKb/0. 75Kb/0. 5Kb/0. 25Kb/0. 1Kb)；2 : CmNAGS。圖2中間載體pCAM BIA3301-T800質(zhì)粒雙酶切瓊脂糖凝膠電泳分析；1:DNA Marker(2Kb/lKb/0. 75Kb/0. 5Kb/0. 25Kb/0. 1Kb)；2 :pCAM BIA3301_T800/EcoR I/Hind III ；3 :pCAM BIA3301-T800。圖3植物表達(dá)載體pCAM BIA3301-T800-CmNAGS質(zhì)粒雙酶切瓊脂糖凝膠電泳分析；1:DNA Marker(2Kb/lKb/0. 75Kb/0. 5Kb/0. 25Kb/0. 1Kb)；2,3 :pCAMBIA3301-T800-CmNAGS/Sac I/Xba I。圖 4 植物表達(dá)載體 pCAM BIA3301-T800-CmNAGS 圖譜。
具體實施例方式實施例1. CmNAGS的克隆選用耐旱性良好的雜種南瓜(Cucurbita maximaX C. moschata) ‘帝王新土佐，(為日本砧木品種，購自日本Tokita種苗株式會社)作為材料，幼苗期片真葉)干旱脅迫處理，取幼嫩葉片，參照TaKaRa公司總RNA提取試劑盒說明書方法，提取葉片總RNA，按照東洋紡(上海)生物技術(shù)有限公司cDNA合成試劑盒ReverTra Ace-a- 說明取2 μ g總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用RNase消化cDNA產(chǎn)物，參照番茄耐旱基因CmNAGS序列信息(NCBI登錄號FJ543466)，經(jīng)01igo6. 0軟件分析設(shè)計引物擴(kuò)增CmNAGS ；上游引物YWNs:SEQ ID NO. 3，下游引物YWNa SEQ ID NO. 4，以提取的葉片cDNA 為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)50μ L反應(yīng)體系10XPCR Buffer 5. 0 μ L，YWNs、YWNa引物各 1· 0 μ L(20 μ mol · L-1)，dNTP mix 4. 0 μ L(2. 5mmol · L-1)，Taq DNA Polymerase 0. 2 μ L, cDNA 模板 1 μ L，ddH20 37. 8 μ L ；反應(yīng)程序95°C 預(yù)變性 4min，然后 94°C 解鏈 30sec,54. 6 °C 退火30seC，72°C延伸2min，反應(yīng)30個循環(huán)，72°C延伸IOmin ；PCR產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒 (AXYGEN)回收純化后瓊脂糖凝膠電泳分析(圖譜見圖1)，用T4DNA連接酶(TaKaRa)連接到 PMD19-T載體(TaKaRa)，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞(南京天為生物技術(shù)有限公司)，進(jìn)行序列測定，序列為SEQ ID NO. 1。實施例2.植物雙價表達(dá)載體pCAMBIA3301-T800-CmNAGS的構(gòu)建1)中間載體 pCAMBIAMOl-TOOO 的改造全序列合成含有CaMV35S啟動子、多克隆位點、Nos終止子的T800片段(見SEQ ID N0. 2)，在兩端分別引入EcoR I和Hind III酶切位點(北京鼎國昌盛生物科技有限公司)； 取質(zhì)粒載體pCAMBIA3301 (澳大利亞國際農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)應(yīng)用中心)和T800片段各15μ L， 分別用 EcoRI (Promega)和 Hind 111 (Promega)雙酶切，50 μ L 酶切體系10 X Buffer E 5 μ L,BSA 0. 5yL，質(zhì)粒 pCAMBIA3301 或 Τ800 15 μ L,EcoR I 1· 25 μ L，Hind III 1. 25 μ L, ddH20 27 μ L ；37°C酶切反應(yīng)3h，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，用凝膠回收試劑盒 (AXYGEN)回收質(zhì)粒 pCAMBIA3301 大片段(11289bp)和 T800 小片段(849bp)，按照 1 4 的比例用 T4DNA 酶(TaKafci)連接，連接反應(yīng)體系 Q5yL):10XT4 ligase Buffer 2. 5 μ L, PCAMBIA3301 大片段 2μ L，T800 小片段 8 μ L，T4DNA 連接酶 1 μ L，ddH20 11. 5μ L ；16°C 過夜反應(yīng)，取10 μ L連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，涂板37°C過夜培養(yǎng)；挑取單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切驗證(圖譜見圖2、；pCAM BIA3301-T800中間載體改造完成；2.)植物表達(dá)載體 PCAMBIA33Ol-T8OO-CmNAGS 的構(gòu)建①以南瓜葉片cDNA作為模板，用高保真酶(I^rimeSTAR HS DNA Polymerase, TaKaRa)進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，50 μ L 反應(yīng)體系10 X PCR Buffer 5. O μ L, YWNMBs2 (SEQ ID NO. 5), YWNMSa2 (SEQ ID NO. 6)弓 | 物各 1. O μ L (20 μ mol · L-1)，dNTP mix4. O μ L (2. 5mmol · L-1)， PrimeSTAR HS DNAPolymerase 0. 4μ L, cDNA 模板 1 μ L, ddH20 37. 6 μ L ；反應(yīng)程序95°C 預(yù)變性^iin,然后98°C解鏈lOsec，54. 6°C退火15sec，68°C延伸2min，反應(yīng)30個循環(huán)，72°C 延伸lOmin。PCR產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒(AXYGEN)回收，連接到pMD19_T克隆載體，轉(zhuǎn)化 DH5a感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行序列測定，序列為SEQ ID N0. 7 ；②取改造好的質(zhì)粒載體pCAMBIA3301-T800 15 μ L和第①步所得到的插入CmNAGS 基因的 PMD19-T 用 Sac I (Promega)和 Xba I (Promega)雙酶切，雙酶切體系(50 μ L) IOXBuffer E 5 μ L, BSA 0. 5 μ L，質(zhì)粒 pCAMBIA3301_T800 或插入 CmNAGS 基因的 pMD19_T 載體 15 μ L，Sac I 1. 25 μ L，Xba I 1. 25 μ L, ddH20 28. 25 μ L ;37°C反應(yīng) 3h ；雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，用凝膠回收試劑盒(AXYGEN)回收質(zhì)粒pCAMBIA3301-T800大片段 (12138bp)和 CmNAGS 小片段(1854bp)；③回收的質(zhì)粒pCAMBIA3301-T800 大片段(12138bp)和 CmNAGS 小片段(1854bp)， 按照1 4的比例，用T4DNA連接酶(TaKaRa)連接，連接反應(yīng)體系(25 μ L) :10 X T4 ligase Buffer 2. 5 μ L，pCAMBIA3301-T800 大片段 2 μ L, CmNAGS 小片段 8 μ L, T4DNA 連接酶 1 μ L,ddH20 11.5111^;161過夜連接反應(yīng)，取1(^1^連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化0!15(1感受態(tài)細(xì)胞。37°C過夜培養(yǎng)，挑取單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切驗證(圖譜見圖幻。植物表達(dá)載體 pCAMBIA3301-T800-CmNAGS(圖譜見圖4)的構(gòu)建成功。 綜上所述，本發(fā)明構(gòu)建了含有耐旱基因和抗除草劑基因的植物表達(dá)載體 pCAMBIA3301-T800-CmNAGS，其中CmNAGS首次報道。所構(gòu)建的載體可導(dǎo)入大豆及其他作物中，提高作物的耐旱性。
權(quán)利要求
1.南瓜耐旱基因CmNAGS，其特征在于該基因的序列為SEQID NO. 1。
2.南瓜耐旱基因CmNAGS抗除草劑植物表達(dá)載體，其特征在于由權(quán)利要求1所述的南瓜耐旱基因CmNAGS與植物表達(dá)載體構(gòu)成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的南瓜耐旱基因CmNAGS抗除草劑植物表達(dá)載體，其特征在于所述的南瓜耐旱基因CmNAGS抗除草劑植物表達(dá)載體是將南瓜耐旱基因CmNAGS經(jīng)Mc I和 Xba I雙酶切后插入到中間載體pCAMBIA3301-T800的Sac I和Xba I位點得到。
4.權(quán)利要求3所述的南瓜耐旱基因CmNAGS抗除草劑植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟1)南瓜耐旱基因CmNAGS的克隆以提取的南瓜幼嫩葉片為材料，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA ；以所述的反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，設(shè)計上游引物YWNMBs2 :SEQ ID NO. 5，下游引物YWNM&i2 :SEQ ID NO. 6，用高保真酶 PCR擴(kuò)增得到上、下游分別引入Me I和)(ba I酶切位點的CmNAGS基因，所述的PCR產(chǎn)物 CmNAGS基因連接到pMD19-T克隆載體，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行序列測定；2)中間載體pCAMBIA3301-T800的改造全序列合成含有CaMV35S啟動子、多克隆位點、Nos終止子的T800片段SEQ ID NO. 2， 其中，CaMV35S啟動子的上游和Nos終止子的下游分別引入了 EcoR I和Hind III酶切位點； EcoR I 和 Hind III 雙酶切 pCAMBIA3301 和所述的 T800 片段，回收 lU89bp 的 pCAMBIA3301 大片段和849bp的T800DNA小片段，連接所述兩個片段得到中間載體pCAMBIA3301-T800，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切驗證；3)植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-T800-CmNAGS的構(gòu)建分別用Mc I和Xba I雙酶切步驟1)得到的插入CmNAGS基因的pMD19_T 和pCAMBIA3301-T800質(zhì)粒，回收1854bp的CmNAGS基因片段和12138bp的質(zhì)粒 PCAMBIA3301-T800大片段，連接所述兩片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切驗證，得到所述的南瓜耐旱基因CmNAGS抗除草劑植物表達(dá)載體 pCAMBIA3301-T800-CmNAGS。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，公開了南瓜耐旱基因CmNAGS及其抗除草劑植物表達(dá)載體。本發(fā)明所提供的南瓜耐旱基因CmNAGS序列為SEQ ID NO.1。其抗除草劑植物表達(dá)載體由所述的南瓜耐旱基因CmNAGS插入到中間載體pCAMBIA3301-T800的Sac I和Xba I位點得到。本發(fā)明含CmNAGS基因的植物表達(dá)載體可用于農(nóng)作物遺傳轉(zhuǎn)化，CmNAGS基因在CaMV35S啟動子的啟動下超量表達(dá)，合成催化精氨酸生物合成途徑第一步反應(yīng)的N-乙酰谷氨酸合成酶，可使植物體內(nèi)精氨酸、鳥氨酸、瓜氨酸含量提高，增強植物耐旱性。同時，bar基因編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶，可使轉(zhuǎn)基因作物對抗以膦絲菌素為有效成分的Basta、Liberty等除草劑。
文檔編號C12N15/82GK102154331SQ201110025649
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月24日
發(fā)明者張功臣, 朱月林, 楊立飛, 蓋鈞鎰, 閆聞 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)