專利名稱：一種基因芯片及其在水產(chǎn)病原微生物檢測中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種水產(chǎn)病原微生物檢測基因芯片，其制備方法及其在水產(chǎn)病原微生物檢測中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
改革開放以來，我國漁業(yè)取得了舉世矚目的成就，水產(chǎn)品總產(chǎn)量自1990年以來一直居世界首位，已發(fā)展成為世界漁業(yè)大國，漁業(yè)在我國國民經(jīng)濟(jì)，特別是農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展中占有越來越重要的地位。然而，生態(tài)環(huán)境的破環(huán)、生長率的下降、病害的大量爆發(fā)等已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)不容忽視、亟待解決的問題。近年來，草魚出血病、甲殼類的白斑綜合癥和桃拉綜合癥、淡水魚細(xì)菌性敗血癥以及鱉腮腺炎病等屢屢給水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來較大的損失，這種損失不僅僅體現(xiàn)在疾病的爆發(fā)對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物存活率的毀滅性打擊上，更不容忽視的是為了防治疾病，藥物特別是抗生素的不當(dāng)使用對包括水產(chǎn)養(yǎng)殖在內(nèi)的整個產(chǎn)業(yè)鏈的影響，甚至由于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)所賴于生存的水的特殊性，對生態(tài)環(huán)境乃至人的健康的影響尤為值得關(guān)注。病原微生物作為重要的致病因子，其快速準(zhǔn)確的檢測尤為關(guān)鍵。作為餐桌食品的重要組成部分，水產(chǎn)品中的金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、單增李斯特菌、沙門氏菌、志賀氏菌等食源性微生物的檢測一直都是保障餐桌安全的重要工作。隨著水產(chǎn)品流動的日趨頻繁，市場準(zhǔn)入制度的逐漸深入，人民生活水平的不斷提高，水產(chǎn)品特別是鮮活水產(chǎn)品衛(wèi)生的快速檢測已成為各方的迫切要求。傳統(tǒng)的微生物鑒定法費時費力，以PCR為代表的分子生物學(xué)及自動化控制技術(shù)的發(fā)展使得快速檢測病原微生物成為可能。目前報道較多PCR法、PCR加雜交法等方法雖然大大提高了檢測的靈敏度，簡化了檢測手續(xù)，但也存在一些不足之處。其中最局限的是上述方法在一次實驗中只能檢測一種或幾種微生物，檢測微生物的種類非常少。這對于一個水產(chǎn)品標(biāo)本中就含有數(shù)十種細(xì)菌的實際情況來說，要達(dá)到一個較理想的檢測結(jié)果還是相當(dāng)困難的。本世紀(jì)以來，基于懸浮芯片技術(shù)、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)及納米金基因芯片技術(shù)的病原體快速檢測系統(tǒng)的研究逐步展開。生物芯片是最近十年發(fā)展起來的應(yīng)用于分子生物學(xué)研究的一項新技術(shù)，它是以核酸分子雜交技術(shù)為基本原理，并結(jié)合機(jī)械制造技術(shù)、計算機(jī)技術(shù)等其他諸多高新科技，被廣泛運用于核酸序列測定、基因突變檢測、基因表達(dá)情況分析等領(lǐng)域。近年來將生物芯片運用于微生物的檢測和分類的報道也越來越多。設(shè)計合成特異性微生物探針，將其點樣于芯片上，待測微生物樣品經(jīng)DNA抽提，PCR標(biāo)記，即可與芯片進(jìn)行雜交反應(yīng)，經(jīng)掃描測讀，輸出結(jié)果，經(jīng)分析可判斷出樣品中微生物種類。相對于一般的分子生物學(xué)方法，用生物芯片檢測微生物更具有大容量、靈敏、快速、準(zhǔn)確、高效、簡便等優(yōu)點，具有廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種快速檢測水產(chǎn)病原微生物如嗜水氣單胞菌、遲緩愛德華氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、單增李斯特菌、沙門氏菌、志賀氏菌等的基因芯片，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的費時耗力的缺陷，提高檢測靈敏度和特異性，縮短檢測周期。本發(fā)明所述的基因芯片，包括固相載體和固定在固相載體上的寡聚核苷酸探針， 其中固定在固相載體上的寡聚核苷酸探針包含從以下基因序列中選取的一種或多種(1)從沙門氏菌的invA基因、志賀氏菌的ipaH基因、金黃色葡萄球菌的femA基因、單增李斯特氏菌的prfA基因，副溶血性弧菌的tlh基因，遲緩愛德華氏菌的gadB基因或嗜水氣單胞菌的16S rRNA基因、aerA基因、hlyA基因、ahpA基因中選取的DNA片段；(2)所述(1)中的DNA片段的互補(bǔ)DNA序列。上述的病原微生物寡聚核苷酸探針長度一般為20-40個核苷酸，按其設(shè)計原則為每個探針解鏈溫度相近(68°C 士3°C上下波動)，以避免發(fā)夾二聚體形成，相同序列盡量減少(避免單一堿基連續(xù)重復(fù)7次以上)。為了減少雜交時的空間位阻，合成時，在上述探針的寡核苷酸5’端補(bǔ)T使探針長度達(dá)到40bp，同時進(jìn)行氨基修飾。探針可利用生物信息學(xué)相關(guān)軟件設(shè)計完成，例如可將病原微生物靶基因序列用Clustal進(jìn)行比對，找到該基因的保守區(qū)段，將該保守區(qū)段導(dǎo)入Oligo軟件中，輸入相關(guān)參數(shù)，運行程序，從輸出結(jié)果中優(yōu)選長度在27bp 士 2bp，1值68°〇士 3 °C的探針。本發(fā)明的較佳實施例中，上述固定在固載體上的寡聚核苷酸探針具有表1中SEQ ID NO =I-SEQ ID NO :10所示的核苷酸序列的至少一種。表1針對不同水產(chǎn)病原微生物的寡聚核苷酸探針
探針編號_探針序列(5’ -3’ )
權(quán)利要求
1.一種基因芯片，包括固相載體和固定在固相載體上的寡聚核苷酸探針，其中固定在固相載體上的寡聚核苷酸探針包含從以下基因序列中選取的一種或多種(1)從沙門氏菌的irwA基因、志賀氏菌的ipaH基因、金黃色葡萄球菌的femA基因、單增李斯特氏菌的PrfA基因，副溶血性弧菌的tlh基因，遲緩愛德華氏菌的gadB基因或嗜水氣單胞菌的16S rRNA基因、aerA基因、hlyA基因、ahpA基因中選取的DNA片段；(2)所述(1)中的DNA片段的互補(bǔ)DNA序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因芯片，其特征在于所述的寡聚核苷酸探針具有20-40 個核苷酸，探針解鏈溫度為68°C 士3°C。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因芯片，其特征在于所述的寡聚核苷酸探針長度在 27bp士2bp，合成時在寡核苷酸5’端補(bǔ)T使探針長度達(dá)到40bp，同時進(jìn)行氨基修飾。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因芯片，其特征在于所述的固定在固載體上的寡聚核苷酸探針具有SEQ ID NO =I-SEQ ID NO :10所示的核苷酸序列的至少一種SeqIDNo.1 CGGGTGAGTAATGCCTGGGAAATTGSeqIDNo.2 CAATACCTATGGCCTGAGCGAGAAGSeqIDNo.3 TTTGAAGATACCGACAAGCGTAGACSeqIDNo.4 :AACATAGACCCCTCCAATAGCAACTTCSeqIDNo.5 TCCTCGCTATTATTTCCTTTCTTATCTSeqIDNo.6 :ATAACAAGCGAGATAACTTACAACAACSeqIDNo.7 :AAACTAACGGGATAAAACCAAAACAATSeqIDNo.8 TCTTTGTGAACTTTATTGGCGGTATTTSeqIDNo.9 TCACAGATATGGCATGCTTTTGAACSeqIDNo.10ιCGACGAAAGCGCCTCAGTTTAAGTA
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因芯片，其特征在于針。
6.一種檢測水產(chǎn)中病原微生物檢測的試劑盒，其特征在于包括權(quán)利要求1所述的基因芯片。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其在特在于所述試劑盒還包括檢測引物，該檢測引物具有 gadB-F/gadB-R, femA-F/femA-R, prfA-F/prfA-R, invA-F/invA-R, ipaH-F/ipaH-R， tlh-F/tlh-R, 16S-F/16S-R, aerA-F/aerA-R,hlyA-F/hlyA-R, ahpA-F/ahpA-R 引物對中的至少一種。
8.一種利用權(quán)利要求1-7任一項所述的基因芯片或試劑盒檢測水產(chǎn)中致病微生物的方法，包括如下步驟(1)、提取待檢測樣品的基因組DNA，利用PCR方法從中克隆出靶基因的cDNA序列并標(biāo)記；O)、在適于與所選基因芯片進(jìn)行雜交的條件下，加入經(jīng)標(biāo)記的待測樣品并使之反應(yīng)足夠的時間；(3)、檢測雜交反應(yīng)的結(jié)果。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于擴(kuò)增產(chǎn)物采用Cy3或Cy5進(jìn)行熒光標(biāo)記。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于進(jìn)行雜交處理后，將處理好的芯片置于掃描儀上，分別用Cy3和/或Cy5的光線進(jìn)行掃描，掃描結(jié)果用軟件進(jìn)行分析，根據(jù)基因芯片上探針顯示信號可以鑒定出相對應(yīng)的水產(chǎn)病原微生物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種水產(chǎn)病原微生物檢測基因芯片，其制備方法及其在水產(chǎn)病原微生物檢測中的應(yīng)用。將從目標(biāo)病原微生物靶基因中選出的保守序列固定在固相載體上作為寡聚核苷酸探針，在適當(dāng)?shù)碾s交條件下，加入經(jīng)標(biāo)記的待測樣品進(jìn)行反應(yīng)，根據(jù)基因芯片上探針顯示信號可以鑒定出相對應(yīng)的水產(chǎn)病原微生物。本發(fā)明提供的基因芯片能快速檢測水產(chǎn)病原微生物如嗜水氣單胞菌、遲緩愛德華氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、單增李斯特菌、沙門氏菌、志賀氏菌等，檢測靈敏度高、特異性強(qiáng)，能大幅縮短檢測周期。
文檔編號C12Q1/68GK102154473SQ20111002585
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月24日
發(fā)明者馮曉宇, 劉凱, 林啟存, 蔡麗娟, 許寶青, 郭水榮 申請人:杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院