專利名稱：一種試劑盒和檢測豬鏈球菌2型的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種試劑盒和ー種檢測豬鏈球菌2型的方法。
背景技術(shù)：
豬鏈球菌2型又稱莢膜2型豬鏈球菌(Streptococcus suis type 2, SS2),屬于革蘭氏分類法的R群，通常以引起斷奶仔豬關(guān)節(jié)炎、腦膜炎、敗血癥及支氣管炎為特征，并且能引起人畜共患病。豬鏈球菌2型通常廣泛存在于正常豬的呼吸道中，但是健康豬的扁桃體中帶菌率也可高達(dá)76%。近年來豬鏈球菌2型在我國多次爆發(fā)，不僅造成養(yǎng)殖業(yè)的巨大損失，還傳染給人，造成了巨大危害。目前，PCR法檢測豬鏈球菌2型已廣泛使用，但是，其敏感性和特異性還有待提高。例如，CN 1896279A公開了ー種PCR法檢測豬鏈球菌2型的方法，其中同時(shí)使用了 3對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，該方法只能在菌濃度為450個(gè)/ml以上時(shí)具有陽性結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服目前豬鏈球菌2型檢測中難以達(dá)到高靈敏度和高特異性的缺陷，本發(fā)明提供了一種試劑盒和ー種豬鏈球菌2型的檢測方法。根據(jù)本發(fā)明所提供的試劑盒，該試劑盒包括上游引物、下游引物和探針，所述上游引物的5’端和/或所述下游引物的5’端被生物素修飾；所述探針的5’端或3’端被地高辛修飾；所述上游引物和所述下游引物能夠通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA分子D或DNA分子D的片段得到雙鏈DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，DNA分子D的堿基序列如序列表I所示；所述探針能夠與所述雙鏈DNA擴(kuò)增產(chǎn)物中帶有生物素修飾的單鏈DNA雜交。根據(jù)本發(fā)明所提供的檢測豬鏈球菌2型的方法，該方法包括以下步驟(I)在dNTP、熱穩(wěn)定DNA聚合酶和PCR緩沖液存在下，使上游引物和下游引物與待測核酸樣本在PCR反應(yīng)條件下進(jìn)行第一接觸，得到第一接觸后的產(chǎn)物；所述上游引物和所述下游引物能夠通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA分子D或DNA分子D的片段得到擴(kuò)增產(chǎn)物， DNA分子D的堿基序列如序列表I所示；所述上游引物的5’端和/或所述下游引物的5’端被生物素修飾；(2)在封閉核酸存在下，將第一接觸后的產(chǎn)物與探針在雜交條件下進(jìn)行第二接觸， 得到第二接觸后的產(chǎn)物；所述探針能夠與所述雙鏈DNA擴(kuò)增產(chǎn)物中帶有生物素修飾的單鏈 DNA雜交；所述探針的5’端和/或3’端被地高辛修飾；(3)將第二接觸后的產(chǎn)物先后在ー抗作用條件下和ニ抗作用條件下分別與固相化的能與生物素特異結(jié)合的蛋白和標(biāo)記有辣根過氧化物酶并且能與地高辛特異結(jié)合的蛋白進(jìn)行第三接觸和第四接觸，得到第四接觸后的產(chǎn)物；(4)將第四接觸后的產(chǎn)物先后在顯色條件和終止條件下分別與顯色劑和終止劑進(jìn)行第五接觸和第六接觸，得到第六接觸后的產(chǎn)物；(5)測定第六接觸后的產(chǎn)物在490-494nm處的光密度值，并判斷該光密度值是否大于臨界值。如果光密度值大于臨界值，則認(rèn)為在該臨界值條件下，獲得待測核酸樣本的樣品中含有豬鏈球菌2型。目前，熒光定量PCR技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于豬鏈球菌2型的檢測，該方法不但繼承了常規(guī) PCR方法快速擴(kuò)增，而且使得特異性進(jìn)ー步提高，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的快速檢測。但是，熒光定量PCR方法需要使用專門的熒光定量PCR儀，而熒光定量PCR儀的購置、使用和維護(hù)成本都較高，因此限制了該方法的推廣使用。本發(fā)明提供的試劑盒和豬鏈球菌2型檢測方法，能夠在2. 5小時(shí)內(nèi)完成檢測，并且能夠在樣本中菌濃度僅為10個(gè)/ml時(shí)獲得陽性結(jié)果，具有較高靈敏性，還具有特異性高、檢測成本低廉的優(yōu)點(diǎn)。


圖I是對(duì)比例1-6的擴(kuò)增產(chǎn)物的核酸電泳圖。
具體實(shí)施例方式根據(jù)本發(fā)明所提供的試劑盒，該試劑盒包括上游引物A、下游引物B和探針C，所述上游引物A的5’端和/或所述下游引物B的5’端被生物素修飾；所述探針C的5’端和/ 或3’端被地高辛修飾；所述上游引物A和所述下游引物B能夠通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增 DNA分子D或DNA分子D的片段得到雙鏈DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，DNA分子D的堿基序列如序列表I 所示；所述探針C能夠與所述雙鏈DNA擴(kuò)增產(chǎn)物中帶有生物素修飾的單鏈DNA雜交。其中，序列表I為豬鏈球菌2型的莢膜多糖基因(capsular polysaccharide gene,cps2J)的核苷酸編碼序列，因此，DNA分子D可以cps2J基因的編碼鏈DNA分子、反義鏈DNA分子和雙鏈DNA分子中的ー種或多種。其中，所述上游引物A和所述下游引物B的序列和長度沒有特別地限制，只要是能夠通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA分子D或DNA分子D的片段得到擴(kuò)增產(chǎn)物即可，例如，可以從cps2J基因的編碼鏈DNA分子的序列中選擇17-25堿基長度的一段序列作為上游引物A的序列，同時(shí)可以從cps2J基因的編碼鏈DNA分子的序列中該上游引物A序列的下游 100-500堿基處選擇17-25堿基長度的一段序列的反向互補(bǔ)序列作為下游引物B的序列。
其中，所述序列E的序列和長度沒有特別地限制，只要是能夠使探針C與所述雙鏈 DNA擴(kuò)增產(chǎn)物中帶有生物素修飾的單鏈DNA雜交即可，例如可以從cps2J基因的編碼鏈DNA 分子的序列中選擇17-25堿基長度的一段序列作為上游引物A，同時(shí)可以從cps2J基因的編碼鏈DNA分子的序列中該上游引物A序列的下游100-500堿基處選擇17-25堿基長度的一段序列的反向互補(bǔ)序列作為下游引物B ;并且在cps2J基因的編碼鏈DNA分子的序列中上游引物A的序列和下游引物B序列的反向互補(bǔ)序列之間選擇17-25堿基長度的一段序列作為序列E的序列。需要說明的是，上游引物A的序列、下游引物B的序列和序列E的序列可以與 cps2J基因的雙鏈DNA分子中對(duì)應(yīng)的序列完全相同，也可以允許1-3個(gè)堿基的錯(cuò)配。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，其中，優(yōu)選情況下，所述上游引物A的序列為5’-CAAACGCAAGGAATTACGGTATC-3’，所述下游引物B的序列為5’ -GAGTATCTAAAGAATGCCTATTG-3’，所述探針C的序列為序列E或序列E的反向互補(bǔ)序列， 所述序列E為5’ -AAGTAGCAAGTAACCCTCCCGACA-3’，且當(dāng)探針C的序列為序列E時(shí)，上游引物A的5’端被生物素修飾；當(dāng)探針C的序列為序列E的反向互補(bǔ)序列時(shí)，下游引物B的5’ 端被生物素修飾，在該優(yōu)選情況下的試劑盒可以取得最佳的檢測效果。需要說明的是，本發(fā)明中的上游引物A、下游引物B和探針C均可通過商購定制的方式得到。根據(jù)本發(fā)明所提供的試劑盒，其中，為了方便使用者使用并保證檢測條件的一致性，優(yōu)選情況下，所述試劑盒還含有PCR反應(yīng)試劑、核酸雜交試劑和ELISA試劑中的ー種或多種；所述PCR反應(yīng)試劑選自dNTP、熱穩(wěn)定DNA聚合酶和PCR緩沖液中的ー種或多種；所述核酸雜交試劑包括封閉核酸；所述ELISA試劑選自固相化的能與生物素特異結(jié)合的蛋白、 標(biāo)記有辣根過氧化物酶并且能與地高辛特異結(jié)合的蛋白、能與辣根過氧化物酶進(jìn)行顯色反應(yīng)的試劑、能終止辣根過氧化物酶顯色反應(yīng)的試劑中的ー種或多種。根據(jù)本發(fā)明所提供的試劑盒，其中，為了方便使用者使用、保證檢測條件的一致性并降低所述試劑盒的生產(chǎn)成本，所述熱穩(wěn)定DNA聚合酶為rTaq-DNA聚合酶；所述封閉核酸為鮭魚精DNA;所述固相化的能與生物素特異結(jié)合的蛋白為固相化的鏈酶親和素；所述標(biāo)記有辣根過氧化物酶并且能與地高辛特異結(jié)合的蛋白為標(biāo)記有辣根過氧化物酶的抗地高辛的抗體；所述能與辣根過氧化物酶進(jìn)行顯色反應(yīng)的試劑為鄰苯ニ胺；所述能終止辣根過氧化物酶顯色反應(yīng)的試劑為硫酸。根據(jù)本發(fā)明所提供的檢測豬鏈球菌2型的方法，該方法以下步驟(I)在dNTP、熱穩(wěn)定DNA聚合酶和PCR緩沖液存在下，使上游引物A和下游引物B 與待測核酸樣本在PCR反應(yīng)條件下進(jìn)行第一接觸，得到第一接觸后的產(chǎn)物；所述上游引物A 和所述下游引物B能夠通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA分子D或DNA分子D的片段得到擴(kuò)增產(chǎn)物，DNA分子D的堿基序列如序列表I所示；所述上游引物A的5’端和/或所述下游引物B的5’端被生物素修飾；(2)在封閉核酸存在下，將第一接觸后的產(chǎn)物與探針C在雜交條件下進(jìn)行第二接觸，得到第二接觸后的產(chǎn)物；所述探針C能夠與所述雙鏈DNA擴(kuò)增產(chǎn)物中帶有生物素修飾的單鏈DNA雜交；所述探針C的5’端和/或3’端被地高辛修飾；(3)將第二接觸后的產(chǎn)物先后在ー抗作用條件下和ニ抗作用條件下分別與固相化的能與生物素特異結(jié)合的蛋白和標(biāo)記有辣根過氧化物酶并且能與地高辛特異結(jié)合的蛋白進(jìn)行第三接觸和第四接觸，得到第四接觸后的產(chǎn)物；(4)將第四接觸后的產(chǎn)物先后在顯色條件和終止條件下分別與顯色劑和終止劑進(jìn)行第五接觸和第六接觸，得到第六接觸后的產(chǎn)物；(5)測定第六接觸后的產(chǎn)物在490_494nm處的光密度值。在測得上述光密度值的情況下，可以判斷該光密度值是否大于臨界值。如果光密度值大于臨界值，則認(rèn)為在該臨界值條件下，獲得待測核酸樣本的樣品中含有豬鏈球菌2型。其中，所述上游引物A和所述下游引物B能夠通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA分子 D或DNA分子D的片段得到擴(kuò)增產(chǎn)物，DNA分子D的堿基序列如序列表I所示；所述探針C 能夠與所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行核酸雜交，其特征在于，其中，所述上游引物A的5’端或所述下游引物B的5’端被生物素修飾；所述探針C的5’端或3’端被地高辛修飾。其中，所述熱穩(wěn)定DNA聚合酶沒有特別的限制，只要是能用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)即可，例如可以為市售的各種Taq-DNA聚合酶。其中，所述PCR緩沖液沒有特別的限制，只要是能用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)即可，例如可以為市售的各種PCR緩沖液。其中，所述第一接觸中，dNTP、熱穩(wěn)定DNA聚合酶、PCR緩沖液、水、上游引物A、下游引物B和待測核酸樣本的用量沒有特別地限制，只要是能用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)即可，例如可以為《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(科學(xué)出版社2003年出版)中所述的比例。其中，所述PCR反應(yīng)條件沒有特別的限制，只要是能用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)即可，例如可以為《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(科學(xué)出版社2003年出版)中所述的條件；優(yōu)選情況下所述 PCR反應(yīng)條件包括94°C預(yù)變性4min，然后在94°C變性30s、56°C退火30s、72°C延伸50s的循環(huán)條件下循環(huán)25輪，然后72°C延伸lOmin。需要說明的是，本發(fā)明中，所述待測核酸樣本指從各種需要檢測的疑似含有豬鏈球菌2型的樣品中獲得的核酸樣本，所述待測核酸樣本的獲得方法沒有特別的要求，使用公知的方法即可，例如用煮沸法將屠宰后的豬的呼吸道分泌物或扁桃體組織擦拭物的培養(yǎng)物樣品制備的核酸樣本。 根據(jù)本發(fā)明所提供的檢測豬鏈球菌2型的方法，其中，序列表I為豬鏈球菌2型的莢膜多糖基因(capsular polysaccharide gene, cps2J)的核苷酸編碼序列，因此，DNA分子D可以cps2J基因的編碼鏈DNA分子、反義鏈DNA分子和雙鏈DNA分子中的ー種或多種。根據(jù)本發(fā)明所提供的檢測豬鏈球菌2型的方法，其中，所述上游引物A和所述下游引物B的序列和長度沒有特別地限制，只要是能夠通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA分子D或 DNA分子D的片段得到擴(kuò)增產(chǎn)物即可，例如，可以從cps2J基因的編碼鏈DNA分子的序列中選擇17-25堿基長度的一段序列作為上游引物A的序列，同時(shí)可以從cps2J基因的編碼鏈 DNA分子的序列中該上游引物A序列的下游100-500堿基處選擇17-25堿基長度的一段序列的反向互補(bǔ)序列作為下游引物B的序列。根據(jù)本發(fā)明所提供的檢測豬鏈球菌2型的方法，其中，所述序列E的序列和長度沒有特別地限制，只要是能夠是探針C與上述擴(kuò)增產(chǎn)物雜交即可，例如可以從cps2J基因的編碼鏈DNA分子的序列中選擇17-25堿基長度的一段序列作為上游引物A，同時(shí)可以從cps2J 基因的編碼鏈DNA分子的序列中該上游引物A序列的下游100-500堿基處選擇17-25堿基長度的一段序列的反向互補(bǔ)序列作為下游引物B ;并且在cps2J基因的編碼鏈DNA分子的序列中上游引物A的序列和下游引物B序列的反向互補(bǔ)序列之間選擇17-25堿基長度的一段序列作為序列E的序列。需要說明的是，上游引物A的序列、下游引物B的序列和序列E的序列可以與 cps2J基因中相應(yīng)片段的序列完全相同，也可以允許1-3個(gè)堿基的錯(cuò)配。根據(jù)本發(fā)明所提供的檢測豬鏈球菌2型的方法，其中，所述上游引物A的序列為5’ -CAAACGCAAGGAATTACGGTATC-3’，所述下游引物B的序列為 5’ -GAGTATCTAAAGAATGCCTATTG-3’，所述探針C的序列為序列E或序列E的反向互補(bǔ)序列， 所述序列E為5’ -AAGTAGCAAGTAACCCTCCCGACA-3’，且當(dāng)探針C的序列為序列E時(shí)，上游引物A的5’端被生物素修飾；當(dāng)探針C的序列為序列E的反向互補(bǔ)序列時(shí)，下游引物B的5’端被生物素修飾。根據(jù)本發(fā)明所提供的檢測豬鏈球菌2型的方法，其中，第二接觸中，探針C、封閉核酸和所述擴(kuò)增產(chǎn)物的用量沒有特別要求，可以為《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(科學(xué)出版社2003 年出版)中所述的用量，優(yōu)選情況下，相對(duì)于每微摩爾的探針C，封閉核酸的用量為28-36 微克，擴(kuò)增產(chǎn)物的用量為20微升，擴(kuò)增產(chǎn)物與探針C和封閉核酸混合后的物料的總體積為 55-65微升。根據(jù)本發(fā)明所提供的檢測豬鏈球菌2型的方法，其中，所述雜交條件沒有特別的要求，可以為《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(科學(xué)出版社2003年出版)中所述的條件；優(yōu)選情況下，所述雜交條件包括所述封閉核酸為鮭魚精DNA ;所述雜交條件包括將擴(kuò)增產(chǎn)物與探針 C和封閉核酸混合后的物料在93. 5-94. 5°C下維持I. 5-2. 5分鐘后在54. 5-55. 5°C下維持 0. 5-1. 5 分鐘。根據(jù)本發(fā)明所提供的檢測豬鏈球菌2型的方法，其中，優(yōu)選情況下，相對(duì)于每微升的雜交產(chǎn)物，所述固相化的能與生物素特異結(jié)合的蛋白的用量為1-2微克；所述ー抗作用條件包括作用時(shí)間為0. 5-1. 5小時(shí)，作用溫度為20-40°C。其中，固相化的能與生物素特異結(jié)合的蛋白可以為包被在微孔板中的鏈霉親和素。所述包被的方法可以為本領(lǐng)域公知的方法。根據(jù)本發(fā)明所提供的檢測豬鏈球菌2型的方法，其中，優(yōu)選情況下，相對(duì)于每微升的雜交產(chǎn)物，所述標(biāo)記有辣根過氧化物酶并且能與地高辛特異結(jié)合的蛋白的用量為3-10 納克；所述ニ抗作用條件包括作用時(shí)間為35-45分鐘，作用溫度為20-40°C。根據(jù)本發(fā)明所提供的檢測豬鏈球菌2型的方法，其中，所述顯色條件和終止條件沒有特別的要求，可以參照公知的酶聯(lián)免疫顯色和終止的條件進(jìn)行。需要說明的是，本發(fā)明中所述光密度值大于臨界值，則認(rèn)為樣本中含有豬鏈球菌2 型的判斷，可以是是在置信水平下，對(duì)已知樣本的實(shí)驗(yàn)結(jié)果按照統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)方法計(jì)算后得到的。通過本發(fā)明的方法對(duì)83例已知樣品進(jìn)行檢測，在置信度為0.01的情況下，按照T檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算得到ー個(gè)可用的臨界值為0. 198。以下通過實(shí)施例進(jìn)ー步舉例說明本發(fā)明，但本發(fā)明的范圍不限于以下實(shí)施例中。實(shí)施例I從大連寶生物公司定制購買序列為5’ -CAAACGCAAGGAATTACGGTATC-3’ (見序列表 2)且5’端被生物素修飾的上游引物Al、序列為5’ -GAGTATCTAAAGAATGCCTAITG-3’(見序列表3)的下游引物BI和序列為5’ -AAGTAGCAAGTAACCCTCCCGACA-3’(見序列表4)且3’ 端被地高辛修飾的探針Cl。稱取牛肉膏10g、胰蛋白胨20g、葡萄糖2g、碳酸氫鈉2g、氯化鈉2g、磷酸氫ニ鈉 0. 4g，溶解于IOOOml蒸餾水中，121 °C高壓滅菌15分鐘，待培養(yǎng)基冷至45-50°C時(shí)，加入多粘素E IOmg和萘啶酮酸15mg，混勻后得到THB培養(yǎng)基。將0. 5ml菌濃度為10個(gè)/ml的含有豬鏈球菌2型參考菌株(購自ATCC公司，貨號(hào)為43765)的THB培養(yǎng)基作為樣品，在沸水浴中放置5分鐘，將沸水浴后的樣品在12000g 的速度下離心2分鐘后棄去上清液得到沉淀，將得到的沉淀用150 Ul去離子水重懸浮后再在沸水浴中放置10分鐘，得到再次沸水浴后的產(chǎn)物，將再次沸水浴后的產(chǎn)物在冰上放置3 分鐘后離心(12000g，2分鐘)，吸取得到IOOiU的上清液即為待測核酸樣本。
將2 ill的上述待測核酸樣本與I. 6 ill的dNTP水溶液(dATP、dTTP、dCTP和 dGTP，總濃度lOOmM，購自大連寶生物公司，貨號(hào)為BG4001A)、0. 5iil熱穩(wěn)定DNA聚合酶 (rTaq-DNA聚合酶，濃度2. 5U/yl，購自大連寶生物公司，貨號(hào)為CK5901AA)、2 yl的PCR緩沖液(10倍濃縮液，購自大連寶生物公司，貨號(hào)A6401A)、12.4iil的無菌去離子水、0. 5 yl 的上游引物Al的水溶液(濃度IOng/ ii I)和0. 5 ii I的下游引物BI的水溶液(濃度IOng/ U I)混合后置于PCR儀上，按如下條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增94°C維持4min，然后在94°C維持30s、 56°C退火30s、72°C延伸50s的循環(huán)條件下循環(huán)25輪，然后72°C延伸IOmin ;得到擴(kuò)增產(chǎn)物 20 u I。將10 ill的上述擴(kuò)增產(chǎn)物、10 U I的探針Cl的水溶液(濃度5 u mol/yl)和10 鮭魚精DNA的水溶液(濃度3. 2mg/ml，購自大連寶生物公司)混合后加熱至94°C維持一定的變性時(shí)間(5分鐘)，然后迅速降溫至雜交溫度(56°C )維持一定的雜交時(shí)間(20分鐘)； 得到雜交產(chǎn)物30iU。將上述得到雜交產(chǎn)物全部加入包被了鏈酶親和素的微孔板的ー個(gè)孔(每孔包被量為45iig)中，室溫下放置ー抗作用時(shí)間(5分鐘)后，棄去孔中的液體，用磷酸鹽緩沖溶液(PBST 溶液，KH2PO4L 4mM, Na2HP044. 3mM, KCl 2. 7mM, NaCl 137mM,吐溫-20 濃度為 0. 05 體積％ )洗滌微孔內(nèi)壁3次(毎次用量200 yl，毎次洗滌時(shí)間3分鐘)，得到ー抗作用后的產(chǎn)物。向上述ー抗作用后的產(chǎn)物中加入50 U I辣根過氧化物酶標(biāo)記地高辛抗體的PBST 溶液(PBST的溶質(zhì)和濃度如上所述，辣根過氧化物酶標(biāo)記地高辛抗體的濃度為5ng/iil)， 室溫下放置ニ抗作用時(shí)間(40分鐘)后，棄去孔中的液體，用PBST溶液洗滌微孔內(nèi)壁3次 (毎次用量200 u 1，毎次洗滌時(shí)間3分鐘)，得到ニ抗作用后的產(chǎn)物。向上述ニ抗作用后的產(chǎn)物中加入50 ill的顯色劑(鄰苯ニ胺，購自大連寶生物公司)，室溫下放置10分鐘后，再加入50 u I終止劑(2M的硫酸水溶液)，混勻后得到顯色后的產(chǎn)物。使用酶聯(lián)免疫檢測儀測定顯色后的產(chǎn)物的在492nm處的光密度值(0D值)為 0. 269，由此判斷樣品中含有豬鏈球菌2型，與樣品為0. 5ml菌濃度為10個(gè)/ml的含有豬鏈球菌2型參考菌株的事實(shí)一致。實(shí)施例2-. 8按照實(shí)施例I相同的方法進(jìn)行檢測，不同的是按照表I用菌濃度為10個(gè)/ml的含有非豬鏈球菌2型的菌體的相應(yīng)培養(yǎng)基替代菌濃度為10個(gè)/ml的含有豬鏈球菌2型的THB
培養(yǎng)基。使用酶聯(lián)免疫檢測儀測定顯色后的產(chǎn)物的光密度值列于表I中。表I
權(quán)利要求
1.ー種試劑盒，該試劑盒包括上游引物、下游引物和探針，所述上游引物的5’端和/或所述下游引物的5’端被生物素修飾；所述探針的5’端和/或3’端被地高辛修飾；所述上游引物和所述下游引物能夠通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA分子D或DNA分子D的片段得到雙鏈DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，DNA分子D的堿基序列如序列表I所示；所述探針能夠與所述雙鏈DNA 擴(kuò)增產(chǎn)物中帶有生物素修飾的單鏈DNA雜交。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其中，所述上游引物的序列為5’-CAAACGCAAGGAATTACGGTATC-3’，所述下游引物的序列為 5’ -GAGTATCTAAAGAATGCCTATTG-3’，所述探針的序列為序列E或序列E的反向互補(bǔ)序列，所述序列 E 為 5’ -AAGTAGCAAGTAACCCTCCCGACA-3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其中，所述試劑盒還含有PCR反應(yīng)試劑、核酸雜交試劑和ELISA試劑中的ー種或多種；所述PCR反應(yīng)試劑選自dNTP、熱穩(wěn)定DNA聚合酶和PCR緩沖液中的ー種或多種；所述核酸雜交試劑包括封閉核酸；所述ELISA試劑選自固相化的能與生物素特異結(jié)合的蛋白、標(biāo)記有辣根過氧化物酶并且能與地高辛特異結(jié)合的蛋白、能與辣根過氧化物酶進(jìn)行顯色反應(yīng)的試劑、能終止辣根過氧化物酶顯色反應(yīng)的試劑中的ー種或多種。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其中，所述熱穩(wěn)定DNA聚合酶為rTaq-DNA聚合酶; 所述封閉核酸為鮭魚精DNA;所述固相化的能與生物素特異結(jié)合的蛋白為固相化的鏈酶親和素；所述標(biāo)記有辣根過氧化物酶并且能與地高辛特異結(jié)合的蛋白為標(biāo)記有辣根過氧化物酶的抗地高辛的抗體；所述能與辣根過氧化物酶進(jìn)行顯色反應(yīng)的試劑為鄰苯ニ胺；所述能終止辣根過氧化物酶顯色反應(yīng)的試劑為硫酸。
5.ー種檢測豬鏈球菌2型的方法，該方法包括以下步驟(1)在dNTP、熱穩(wěn)定DNA聚合酶和PCR緩沖液存在下，使上游引物和下游引物與待測核酸樣本在PCR反應(yīng)條件下進(jìn)行第一接觸，得到第一接觸后的產(chǎn)物；所述上游引物和所述下游引物能夠通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA分子D或DNA分子D的片段得到擴(kuò)增產(chǎn)物，DNA分子D的堿基序列如序列表I所示；所述上游引物的5’端和/或所述下游引物的5’端被生物素修飾；(2)在封閉核酸存在下，將第一接觸后的產(chǎn)物與探針在雜交條件下進(jìn)行第二接觸，得到第二接觸后的產(chǎn)物；所述探針能夠與所述雙鏈DNA擴(kuò)增產(chǎn)物中帶有生物素修飾的單鏈DNA 雜交；所述探針的5’端和/或3’端被地高辛修飾；(3)將第二接觸后的產(chǎn)物先后在ー抗作用條件下和ニ抗作用條件下分別與固相化的能與生物素特異結(jié)合的蛋白和標(biāo)記有辣根過氧化物酶并且能與地高辛特異結(jié)合的蛋白進(jìn)行第三接觸和第四接觸，得到第四接觸后的產(chǎn)物；(4)將第四接觸后的產(chǎn)物先后在顯色條件和終止條件下分別與顯色劑和終止劑進(jìn)行第五接觸和第六接觸，得到第六接觸后的產(chǎn)物；(5)測定第六接觸后的產(chǎn)物在490-494nm處的光密度值，并判斷該光密度值是否大于臨界值。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述上游引物的序列為5’ -CAAACGCAAGGAATTACGGTATC-3’， 所述下游引物的序列為 5’ -GAGTATCTAAAGAATGCCTATTG-3’，所述探針的序列為序列E或序列E的反向互補(bǔ)序列，所述序列 E 為 5’ -AAGTAGCAAGTAACCCTCCCGACA-3’。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，相對(duì)于每微摩爾的探針，封閉核酸的用量為 28-36微克，擴(kuò)增產(chǎn)物的用量為20微升，擴(kuò)增產(chǎn)物與探針和封閉核酸混合后的物料的總體積為55-65微升。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述封閉核酸為鮭魚精DNA;所述雜交條件包括將擴(kuò)增產(chǎn)物與探針和封閉核酸混合后的物料在93. 5-94. 5°C下維持I. 5-2. 5分鐘后在 54. 5-55. 5°C下維持 0. 5-1. 5 分鐘。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，相對(duì)于每微升的雜交產(chǎn)物，所述固相化的能與生物素特異結(jié)合的蛋白的用量為1-2微克；所述ー抗作用條件包括作用時(shí)間為4-6分鐘，作用溫度為20-40°C。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，相對(duì)于每微升的雜交產(chǎn)物，所述標(biāo)記有辣根過氧化物酶并且能與地高辛特異結(jié)合的蛋白的用量為3-10納克；所述ニ抗作用條件包括作用時(shí)間為35-45分鐘，作用溫度為20-40°C。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種試劑盒和一種豬鏈球菌2型的檢測方法。該試劑盒包括上游引物、下游引物和探針，所述上游引物的5’端和/或所述下游引物的5’端被生物素修飾；所述探針的5’端和/或3’端被地高辛修飾；所述上游引物和所述下游引物能夠通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA分子D或DNA分子D的片段得到雙鏈DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，DNA分子D的堿基序列如序列表1所示；所述探針能夠與所述雙鏈DNA擴(kuò)增產(chǎn)物中帶有生物素修飾的單鏈DNA雜交。本發(fā)明的試劑盒和方法具有較高靈敏性，還具有特異性性高、檢測成本低廉的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102605046SQ20111002646
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2011年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月25日
發(fā)明者方勤美, 朱繼昌, 林天龍 申請(qǐng)人:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所