專利名稱：一種慢病毒載體及其介導的分泌腦源性神經營養(yǎng)因子的骨髓間充質干細胞系的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種慢病毒載體及其介導的高效、持久分泌腦源性神經營養(yǎng)因子的骨髓間充質干細胞系的制備方法，屬于醫(yī)學生物技術領域。
背景技術：
人骨髓中包含兩種類型的干細胞，一種為造血干細胞，為各種血細胞的再生提供來源；另一種為間充質干細胞，可以為造血干細胞提供適于生長的微環(huán)境，在骨髓中具有支持造血，促進血細胞生長發(fā)育的功能。另外，間充質干細胞還可以(1)自我更新，從骨髓中剛分離出的或凍存后復蘇的間充質干細胞具有較強的增殖能力，可在短期內迅速擴增，以達到進行治療或研究的足夠數量。(2)多向分化潛能，間充質干細胞在體外不同的誘導條件下，可分化為骨細胞、軟骨細胞、和脂肪細胞等不同類型的中胚層來源的細胞；在體內生理和病理條件下，間充質干細胞還可實現跨系分化，分化為神經細胞(包括神經元和膠質細胞)和內臟具有分泌功能的腺上皮細胞。(3)免疫調制，間充質干細胞對于移植物抗宿主病、移植免疫、多種自身免疫病等超敏反應狀態(tài)，以及免疫缺陷等過低的免疫力都具有調節(jié)作用，是免疫系統的功能趨于正常。(4)如前所述，間充質干細胞在骨髓腔中可以為造血干細胞提供微環(huán)境，若異位移植到其它組織，則可分泌各種營養(yǎng)因子，并通過與局部組織細胞的接觸作用，形成有利局部細胞存活，抑制局部細胞凋亡微環(huán)境，因而具有細胞保護功能。 因為骨髓間充質干細胞具有以上特性和功能，且可來源于自體，避免潛在的免疫排斥造成的不良后果，加之對骨髓移植的基礎、臨床研究的豐富經驗，近年來自體骨髓間充質干細胞或經過ex vivo基因工程改造的骨髓間充質干細胞已經逐漸成為治療疾病的新型工具。人腦源性神經營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)不但在中樞神經系統內廣泛分布，還分布于視網膜，外周運動神經元，腎臟和前列腺組織。它在中樞神經系統發(fā)育過程中，對神經元的分化和生長發(fā)育起重要作用；在成體中，是神經元維持生存及正常生理功能所必需。更重要的是，BDNF還具有防止神經元受損傷死亡、改善神經元的病理狀態(tài)、促進受損傷神經元再生及分化等生物效應。本發(fā)明專利用慢病毒載體制備高效、持久分泌人BDNF的人骨髓間充質干細胞系， 旨在利用BDNF在病理條件下對神經的保護、營養(yǎng)作用，以及間充質干細胞的免疫調制或微環(huán)境的維持作用，此種細胞系的建成，將對各種原因造成的眼部退行性變疾病，神經系統退行性變、神經損傷以及自身免疫性神經系統疾病起到改善的效果。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種慢病毒載體及其介導的高效、持久分泌腦源性神經營養(yǎng)因子的骨髓間充質干細胞系的制備方法，使轉導后的人骨髓間充質干細胞穩(wěn)定高效表達人腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)。本發(fā)明是通過以下技術方案實現的
一種表達分泌型人腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)的慢病毒表達載體。一種慢病毒載體介導的分泌BDNF的骨髓間充質干細胞系的制備方法，包括以下步驟(1)慢病毒表達載體的構建利用PCR的方法，擴增人BDNF。人的BDNF基因結構復雜，有十幾種剪接體，但絕大多數剪接體的變異都是在非編碼的啟動子區(qū)，并不影響其所編碼的蛋白質序列。所以在設計引物時，采取在剪接體中出現頻率最多的BDNF編碼序列為模板(GenBank accession number BC029795,全名 Homo sapiens brain-derived
neurotrophic factor)。上游引物5，-GC GCTAGCCACC ACCATGACCATCCTTTTCCTTACT A-3，(SEQ IDN0. 2)，最前面的GC為保護堿基，下劃線部分為加入的酶切位點Nhel，陰影區(qū) GCCACC為Kozak序列，這個序列與酶切位點GCTAGC的最后兩個堿基共用GC，這一設計有效地利用了序列，減少了引物的冗長。再以后是BDNF的cDNA起始密碼子ATG之后的一段序列。下游引物5，-GCCTCGAGCTATCTCCCCTTTTAATG-3，(SEQ ID NO. 3)，同理，GC 為保護堿基， 下劃線部分為加入的XhoI酶切位點，CTA為終止密碼子TAG的互補序列，擴增后的人BDNF 克隆入慢病毒表達載體，并將重組慢病毒表達質粒命名為lenti-BDNF。(2)慢病毒的包裝用優(yōu)化參數的磷酸鈣轉染法包裝慢病毒，并用超速離心法濃縮病毒顆粒，測定包裝病毒的滴度；所述優(yōu)化參數的磷酸鈣轉染法是指利用磷酸鈣法轉染 293T細胞，2X轉染緩沖液的pH值7. 07-7. 13，轉染后4_7小時換液，換液后48-60小時收集細胞上清液，再用細胞上清液轉導人骨髓間充質干細胞系。(3)用包裝后的慢病毒顆粒，用逆轉染法轉導人骨髓間充質干細胞，轉導后細胞可高效分泌人BDNF，是未轉導人骨髓間充質干細胞的336倍，且隨著細胞的生長和傳代，細胞分泌BDNF的功能得以長期維持。本發(fā)明的有益效果為(1)本發(fā)明利用人BDNF本身的信號肽，并采用出現頻率最高的剪接體的序列為模板，并加入Kozak序列，將編碼人BDNF的cDNA克隆入慢病毒表達載體，后續(xù)試驗證明，這一策略完全可以實現BDNF穩(wěn)定的高效表達；(2)本發(fā)明通過優(yōu)化轉染前細胞密度，2X轉染緩沖液的pH值，轉染后換液時間，以及CaCl2濃度，摸索出高效、低成本磷酸鈣轉染并包裝病毒的方法，病毒滴度達109IU/ml以上。(3)本發(fā)明通過逆轉染的方法， 用包裝后的慢病毒顆粒，轉導人骨髓間充質干細胞，這樣可以達到快速(比正常轉染節(jié)省1 天時間)轉導。而且轉導后的人骨髓間充質干細胞可以高效(比未轉導的干細胞高出330 多倍)、持續(xù)分泌(直至轉導后72天，分泌仍未顯下降趨勢)BDNF。


圖1為人骨髓間充質干細胞在體外培養(yǎng)1.5天(A)，3天(B)，7天(C)，10天⑶ 的情況。圖2為表達分泌型人BDNF的慢病毒表達載體構建。圖2_A為人BDNF的PCR擴增產物，加上酶切位點和Kozak序列，長度為760bp (SEQ ID NO. 1)。圖2_B為PCR鑒定人 BDNF克隆入A-T載體的陽性菌株，可見篩選的菌株均為陽性。圖2-C為篩出的A-T陽性菌株NheI和XhoI雙酶切鑒定，其中小片段為切出的BDNF片段。圖2-D為純化的慢病毒載體 (大片段)和插入的BDNF片段(小片段)。圖2-E為PCR鑒定BDNF克隆入慢病毒的陽性菌株(3個陽性克隆)。
圖3為慢病毒轉導后64小時，ELISA檢測的非濃縮與濃縮慢病毒顆粒轉導的人骨髓間充質干細胞分泌BDNF的情況。圖4為轉導后25天，34天，39天，72天，western blot檢測細胞培養(yǎng)上清液中BDNF 的分泌情況。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步說明，不以任何方式限制此發(fā)明，凡依照本發(fā)明公開內容所進行的任何本領域的等同替換或顯而易見的變化或變動，均屬于本發(fā)明的保護范圍。實施例1 人骨髓間充質干細胞的培養(yǎng)一、方法1.人骨髓間充質干細胞的復蘇(此步驟目的是去除死細胞和不貼壁的細胞)(1)人骨髓間充質干細胞的完全培養(yǎng)基包括α -MEM(Invitrogen/GIBCO, USA)， 16. 5% 的胎牛血清(Atlanta Biologicals, USA)，2_4mM 的谷氨酰胺(Invitrogen/GIBCO, USA)和青/鏈霉素(終濃度為分別為100單位/ml和100 μ g/ml, Invitrogen/GIBCO)。在 37°C預熱并放入直徑為15cm的細胞培養(yǎng)皿(Corning，USA)。將人骨髓間充質干細胞從干冰中取出后37°C水浴快速解凍至95%融化時，將其迅速取出，用5ml的無菌移液器均勻、緩慢地加入加有培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)皿。(2)在37°C,5%C02細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時后，吸取上清以去除不貼壁的或死細胞，PBS漂洗2遍，以去除培養(yǎng)基中的殘留的血清。胰酶消化細胞37°C 2-7分鐘，加血清或
完全培養(yǎng)基終止反應。(3)吸取細胞到無菌50ml離心管中，室溫離心450_500g，10分鐘，重懸細胞沉淀， 計數。2.人骨髓間充質干細胞的擴增(1)將人骨髓間充質干細胞以60個細胞/cm2的密度種植與直徑為15cm的細胞培養(yǎng)板，即每板包括約IO4個細胞。根據細胞計數的結果，將細胞濃度調整為IO4細胞/ml，亦即每個培養(yǎng)平板加Iml細胞懸液。(2)在15ml細胞培養(yǎng)板內先加入37°C預熱的完全培養(yǎng)基24ml，再均勻、緩慢加入 Iml細胞懸液，并呈8字形水平移動細胞培養(yǎng)板，使細胞均勻分布。(3)每3天換新鮮培養(yǎng)基，并及時在相差顯微鏡下監(jiān)測細胞生長狀況。二、結果培養(yǎng)1. 5天后(如圖1-A)，人骨髓間充質干細胞貼壁生長，胞體較小， 成卵圓形；培養(yǎng)3天后，人骨髓間充質干細胞呈細長梭形，并伸出細長的突起，個別細胞呈扁片狀，呈與周圍細胞融合趨勢(如圖1-B)；培養(yǎng)7天后，細胞繼續(xù)長大，多數細胞呈扁片狀，但細胞尚未融合(如圖1-C)；培養(yǎng)第10天，細胞逐漸融合，呈典型的波紋狀生長(如圖 1-D)。實施例2 編碼人腦源性神經生長因子cDNA的慢病毒表達載體構建一、方法 1. PCR擴增含有酶切位點編碼人BDNF的cDNA序列 引物設計后，人BDNF的基因模板購自美國Openbiosystem公司(Catlog#MHS1010-7430336)，用高保真性 DNA 聚合酶 pfu (Stratagene，USA)，以下述方法行
PCR
組分體積(μ )
Nuclease free H2O78. 2
IOXbuffer10
dNTP(25mM each)0. 8
模板(0. 1 μ g/ μ 1)1
上游引物(10 μ Μ)4
下游引物( ο μ Μ)4
Cloned pfu (2. 5u/μ 1)2
總體積100
權利要求
1.一種表達分泌型人腦源性神經營養(yǎng)因子的慢病毒表達載體。
2.—種慢病毒載體介導的分泌BDNF的骨髓間充質干細胞系的制備方法，其特征在于， 包括以下步驟(1)慢病毒表達載體的構建利用PCR的方法，擴增人BDNF的cDNA序列，擴增后的人 BDNF克隆入慢病毒表達載體，重組慢病毒表達載體命名為Ienti-BDNF ；(2)用優(yōu)化參數的磷酸鈣轉染法包裝慢病毒，并用超速離心法濃縮病毒顆粒，測定包裝病毒的滴度；(3)用包裝后的慢病毒顆粒，用逆轉染法轉導人骨髓間充質干細胞。
3.根據權利要求2所述慢病毒載體介導的分泌腦源性神經營養(yǎng)因子的骨髓間充質干細胞系的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)用優(yōu)化參數的磷酸鈣轉染法包裝慢病毒是指利用磷酸鈣法轉染293T細胞，2X轉染緩沖液的pH值7. 07-7. 13，轉染后4_7小時換液， 換液后48-60小時收集細胞上清液，再用細胞上清液轉導人骨髓間充質干細胞系。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種慢病毒載體及其介導的分泌腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)的骨髓間充質干細胞系的制備方法，包括以下步驟(1)慢病毒表達載體的構建利用PCR的方法，擴增人BDNF的cDNA序列，擴增后的人BDNF克隆入慢病毒表達載體，重組慢病毒表達載體命名為lenti-BDNF；(2)用優(yōu)化參數的磷酸鈣轉染法包裝慢病毒，并用超速離心法濃縮病毒顆粒，測定包裝病毒的滴度；(3)用包裝后的慢病毒顆粒，用逆轉染法轉導人骨髓間充質干細胞。本發(fā)明通過優(yōu)化轉染前細胞密度，2X轉染緩沖液的pH值，轉染后換液時間，以及CaCl2濃度，摸索出高效、低成本磷酸鈣轉染并包裝病毒的方法。轉導后的人骨髓間充質干細胞可以高效、持續(xù)分泌BDNF。
文檔編號C12R1/91GK102174578SQ20111002653
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月25日 優(yōu)先權日2011年1月25日
發(fā)明者孫國玲, 張琰, 李筱榮, 王飛 申請人:天津醫(yī)科大學眼科中心