專利名稱：豬脂肪組織特異性嵌合啟動子的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于動物基因工程技術領域。具體涉及一個豬脂肪組織特異啟動子的構建，功能驗證及應用，并通過組建嵌合啟動子的方法提高其轉錄活性，構建成兩個嵌合啟動子，但同時又不破壞它的脂肪組織特異性。
背景技術：
啟動子(promoter)是基因的一個組成部分，在遺傳學中是指一段能使基因進行轉錄的脫氧核糖核酸(deoxyribonuclein acid, DNA)序列。啟動子能夠被核糖核酸 (ribonuclein acid,RNA)聚合酶,轉錄調節(jié)因子等識別并與之結合形成轉錄起始復合物區(qū)域，從而起始基因轉錄。啟動子通常位于基因上游，它控制基因轉錄的起始位點和表達的程度，是RNA聚合酶進行精確有效轉錄所必需的[1]。與RNA聚合酶親和力高的啟動子，其起始頻率和效率均高，也稱為強啟動子。一個典型的啟動子包括CAAT-box和TATA-box，它們分別依賴于DNA的RNA聚合酶的識別和結合位點，一般位于轉錄起始位點上游幾十個堿基處。 在核心啟動子上游通常會有一些特殊的DNA序列，即順式作用元件(ciselement)，轉錄因子與之結合從而激活或抑制基因的轉錄[1]。一旦RNA聚合酶定位并結合在啟動子上即可啟動基因轉錄，因此啟動子是基因表達調控的重要元件，它與RNA聚合酶及其他蛋白輔助因子等反式作用因子的相互作用是啟動子調控基因轉錄的實質。對于外源基因能否在哺乳動物細胞中高水平表達，啟動子則是一個非常關鍵的因素。在轉基因動物研究中如何選配設計啟動子是決定外源基因在受體細胞中能否正確表達的關鍵環(huán)節(jié)，一般對非特異性表達基因而言，只能用組成型或廣譜型與之重組，而對特異性表達基因而言，所選用的啟動子必須具有嚴格的時空作用特異性，如組織細胞特異性啟動子、生長發(fā)育時期特異性啟動子和誘導特異性啟動子等。有時為了增強基因的特異性表達， 還必須設計出單一型增強子或復合型增強子與之匹配。有許多報道表明，采用增加啟動子數(shù)目能提高外源基因的表達效率。章倩倩等[2]學者將骨骼肌中特異高效表達的啟動子序列和巨細胞病毒(CMV)啟動子組合在一起大大地提高外源基因在肌肉組織的表達效率。同時增強子作為遠端調控區(qū)也可增強啟動子的轉錄活性，其中最先被研究描述的是SV40。動物和人類病毒基因轉錄調控機制與高等真核細胞的基因轉錄調控機制類同，研究病毒的啟動子為了解真核生物基因組調控提供了模型，應用病毒的啟動子等基因轉錄調節(jié)原理構建各類基因工程載體，能夠有效提高目的基因的轉錄以及表達效率。人的CMV早期基因增強子與其它病毒增強子如皰疹病毒，勞氏肉瘤病毒和肝炎B 病毒相比是活性最高的一個增強子[3]。在許多研究試驗中通常將CMV增強子與啟動子組合從而達到增強基因的轉錄活性^4’5’6’7’8’9’1'最新研究報道[11]從豬BAC庫中分離得到 adiponectin基因5’側翼區(qū)序列，經(jīng)過5’ -RACE確定3個轉錄起始位點。在該試驗中通過構建一系列缺失片段，發(fā)現(xiàn)啟動子區(qū)-1671-+263是豬adiponectin基因轉錄活性的有效區(qū)，其中-1671—1455是促使adiponectin基因高表達所必需的。熒光素酶報告載體和EMSA 分析在-1150—1130區(qū)存在一個重要的順式作用元件cAMP-responsive element (CRE)，與cAMP-responsive element binding protein (CREB)結合，結果表明 CREB是豬adiponectin 基因轉錄活性的重要調控因子。但該片斷是否可作為脂肪組織特異的高效表達啟動子并不是很清楚。在轉基因動物的制備過程中，需要能在特異組織中高效表達的啟動子，而可用的啟動子又很少。因此本研究在于選取豬的豬adiponectin基因的-1671-+263區(qū)域，將其與 CMV增強子和SV40增強子分別嵌合，從而改造成適合轉基因生產(chǎn)所需要的啟動子。為后續(xù)的轉基因動物對脂肪組織特異啟動子的需求提供素材。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于確定豬脂肪組織特異性調控元件adi-ρ 并驗證其活性，之后通過組建嵌合啟動子的方法，最終構建保留其組織特異，且能具有高效轉錄活性的嵌合啟動子。在本發(fā)明中，申請人擴增了豬adiponectin基因第一外顯子之前啟動子區(qū)域中含有 CRE結合位點的640bp片段，將其命名為adi-ρ ，構建pGL3-Basic雙熒光素酶報告載體， 與pRL-TK質粒瞬時共轉染分化7天后小鼠前體脂肪細胞3T3-L1和小鼠骨骼肌細胞C2C12， 驗證其活性。之后擴增了 pCMV IE啟動子片段(其序列見序列表SEQ ID NO :2，片段長度為548bp)和SV40增強子片段(其序列見序列表SEQ ID NO :3，片段長度為237bp)，分別與adi-pro調控元件進行組合,構建pGL3-CMV_adi-pro啟動子(見序列表SEQ ID NO -A, 長度為1188bp)和pGL3-SVenh-adi-pro (見序列表SEQ ID NO :5，長度為877bp)嵌合啟動子，將這兩個啟動子片斷分別與pRL-ΤΚ質粒瞬時共轉染未分化以及分化7天的3T3-L1和 C2C12，最終得到兩個活性較高的脂肪組織特異性嵌合啟動子(其序列如SEQ ID NO :4和5 所示)。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的由圖I的技術流程，首先利用PCR方法擴增出adi-pro片段(電泳結果如附圖2 所示)，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示，序列長度為640bp，測序后利用美國國家生物技術信息中心NCBI (http://blast, ncbi. nlm. nih. Rov/Blast. crD進行序列比對,確定所擴增的序列是正確的。接下來，擴增帶有Kpn I與Mlu I酶切位點的adi-pro片段,并將這條序列克隆到PMD-18T載體上(圖22)。隨后用限制性內(nèi)切酶Kpn I與Mlu I雙酶切 pMD-18T-adi-pro載體(雙酶切電泳圖如圖3所示)與pGL3_Basic載體(圖23所示)。將從pMD-18T-adi-pro載體中酶切出的adi-pro片段與pGL3_Basic載體進行連接反應。將構建好的雙熒光素酶報告載體命名為pGL3-adi-pix)，用限制性內(nèi)切酶Kpn I與Mlu I雙酶切該載體電泳檢測adi-pro片段是否成功構建于該載體(雙酶切電泳結果如圖4所示)。 之后將pGL3-adi-pro與pRL_TK(圖26所示)瞬時共轉染分化7天的小鼠前體脂肪細胞和小鼠骨骼肌成肌細胞(圖5所示)，通過酶標儀測定熒光值，用熒光比值確定adi-pro調控元件是否在成熟的脂肪細胞中表現(xiàn)出的活性要高于在肌細胞中表現(xiàn)出的活性。同時將已構建好的pGL3-adi-pix)雙熒光素酶報告載體與pRL-ΤΚ瞬時共轉染未分化與分化7天的小鼠前體脂肪細胞，觀測adi-pro調控元件活性的變化情況。試驗結果表明,adi-pro調控元件在成熟的脂肪細胞中表現(xiàn)出的活性要高于在肌細胞中表現(xiàn)出的活性(圖6所示)；同時 adi-pro調控元件在未分化的脂肪細胞中活性較低，而在成熟的脂肪細胞中則表現(xiàn)出較高的活性(圖7所示)。第二步，以真核表達載體pIRES2-EGFP (圖25所示)為模板擴增帶有Kpn I與MluI酶切位點的PCMVIE啟動子片段(電泳結果如圖9所示)，將該片段命名為CMV，序列長度為548bp。將這條序列克隆到pMD-18T載體，隨后用限制性內(nèi)切酶Kpn I與Mlu I雙酶切 PMD-18T-CMV與pGL3-Basic載體(電泳結果如圖11所示)，將從pMD_18T_CMV載體中切出的CMV片段與線性pGL3-Basic載體進行連接反應。將構建好的雙熒光素酶報告載體命名為PGL3-CMV。用限制性內(nèi)切酶Kpn I與Mlu I雙酶切該載體電泳檢測CMV片段是否成功構建于該載體(電泳結果如圖12所示)；同時擴增帶有Mlu I與Xho I酶切位點的adi-pro 片段(電泳結果如圖10所示)，與含有pCMV IE啟動子的雙熒光素酶報告載體進行連接反應。將構建好的雙熒光素酶報告載體命名為pGL3-CMV-adi-pro。用限制性內(nèi)切酶Mlu I與 Xho I雙酶切該載體電泳檢測adi-pro片段是否成功構建于該載體(電泳結果如圖13所示)，說明成功組建嵌合啟動子CMV-adi-pro,其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:4所示。第三步，以真核表達載體pGL3_Enhancer (圖24所示)為模板擴增帶有Kpn I與 Mlu I酶切位點的SV40增強子片段(電泳結果如圖14所示)，將該片段命名為SVenh，片段長度為237bp。將這條序列克隆到pMD-18T載體，之后用限制性內(nèi)切酶Kpn I與Mlu I雙酶切 pMD-18T-SVenh載體(電泳結果如圖15所示)與雙熒光素酶報告載體pGL3-CMV_adi-pro， 將從pMD-18T-SVenh載體中切出的SVenh片段代替pGL3-CMV-adi-pro雙熒光素酶報告載體中的CMV片段，將構建好的雙熒光素酶報告載體命名為pGL3-SVenh-adi-pix)，限制性內(nèi)切酶Kpn I與Mlu I雙酶切該載體電泳檢測SVenh片段是否成功構建于該載體(雙酶切電泳結果如圖16所示)，說明成功組建嵌合啟動子SVenh-adi-pro,其核苷酸序列如序列表 SEQID N0:3所示。最后用限制性內(nèi)切酶Kpn I與Mlu I雙酶切pMD-18T_adi-pro載體與 pGL3-Enhancer真核表達載體,將切出的adi-pro片段與pGL3_Enhancer載體進行連接反應。將構建好的雙熒光素酶報告載體命名為pGL3-Enhancer-adi-pr0，限制性內(nèi)切酶Kpn I 與Mlu I雙酶切該載體電泳檢測adi-pro片段是否成功構建于該載體(電泳結果如圖8所示)O第四步，將pGL3-CMV-adi-pro載體報告系統(tǒng)以及pGL3_adi-pro載體報告系統(tǒng), 以pGL3-Basic作為陰性對照，與pRL-ΤΚ質粒瞬時共轉染分化7天的小鼠前體脂肪細胞與分化7天的小鼠骨骼肌成肌細胞。轉染實驗結束后收集細胞，用酶標儀測定熒光值，觀察 CMV-adi-pro是否表現(xiàn)出高活性，并且在成熟的脂肪細胞中表現(xiàn)的活性要高于在肌細胞中表現(xiàn)出的活性。之后將pGL3-CMV-adi-pro嵌合啟動子載體報告系統(tǒng)同樣以pGL3-Basic作為陰性對照，與pRL-ΤΚ質粒瞬時共轉染未分化以及分化7天的小鼠前體脂肪細胞，測得熒光比值，觀測CMV-adi-pro嵌合啟動子活性的變化情況。試驗結果CMV-adi-pro嵌合啟動子的活性要高于非嵌合啟動子adi-pro的活性，在成熟的脂肪細胞中表現(xiàn)的活性要高于在肌細胞中表現(xiàn)出的活性(圖17所示)；并且CMV-adi-pro在未分化的脂肪細胞中活性很低而在成熟的脂肪細胞中則活性較高(圖18所示)。結果表明嵌合啟動子CMV-adi-pro不僅使單一調控元件adi-pro的活性增強同時還保留了 adi-pro調控元件的組織細胞特異性。第五步，將pGL3-SVenh-adi-pro嵌合啟動子載體報告系統(tǒng)以及 pGL3-Enhancer-adi-pro載體報告系統(tǒng)，以pGL3_Enhancer作為陰性對照，與pRL-TK質粒瞬時共轉染分化7天的小鼠前體脂肪細胞與分化7天的小鼠骨骼肌成肌細胞，通過熒光比值觀測嵌合啟動子SVenh-adi-pix)所表現(xiàn)出的活性是否要高于非嵌合啟動子，并且 SVenh-adi-pro嵌合啟動子在成熟的脂肪細胞中表現(xiàn)出的活性是否也高于在肌細胞中表現(xiàn)出的活性。接下來將pGL3-SVenh-adi-pro載體報告系統(tǒng)同樣以pGL3_Enhancer作為陰性對照，與PRL-TK質粒瞬時共轉染未分化以及分化7天的小鼠前體脂肪細胞，測得熒光比值， 觀測SVenh-adi-pro嵌合啟動子活性的變化情況。試驗結果SVenh_adi-pro嵌合啟動子的活性要高于非嵌合啟動子的活性，在成熟的脂肪細胞中表現(xiàn)的活性要高于在肌細胞中表現(xiàn)出的活性(圖19所示)；SVenh-adi-pro嵌合啟動子在未分化的脂肪細胞中表現(xiàn)的活性較低，而在成熟的脂肪細胞中則表現(xiàn)出較高活性(圖20所示)。同樣可得出SVenh-adi-pix) 嵌合啟動子不僅使單一調控元件adi-pro的活性增強同時還保留了 adi-pix)調控元件的組織細胞特異性。第六步，將載體報告系統(tǒng)pGL3-CMV_adi-pro 和 pGL3-SVenh_adi-pro,與 pRL-TK 質粒瞬時共轉染分化7天的小鼠前體脂肪細胞，通過測得的熒光比值，比較兩個不同嵌合啟動子的活性。試驗結果在成熟的脂肪細胞中，CMV-adi-pro嵌合啟動子的活性遠遠高于 SVenh-adi-pro嵌合啟動子的活性(圖21所示)。本發(fā)明的優(yōu)點在于(I)本發(fā)明詳盡的驗證了 adi-pix)調控元件的活性，通過嵌合的方法構建了含有 pCMV IE啟動子和SV40增強子的不同嵌合啟動子，使adi-ρ 調控元件的活性大大提高。(2)本發(fā)明獲得了在成熟脂肪細胞活性較高且具有組織細胞特異的兩個嵌合啟動子，為基因工程和分子育種提供了新的特異表達的啟動子資源。更詳細的技術方案參見《具體實施方式
》的內(nèi)容。


序列表SEQ ID NO: I是本發(fā)明中選取豬adiponectin基因第一外顯子之前啟動子區(qū)中含有CRE結合位點的adi-pro核苷酸序列，其長度為640bp。序列表SEQ ID NO 2是本發(fā)明中擴增的pCMVIE啟動子片段，其長度為548bp。序列表SEQ ID NO 3是本發(fā)明中擴增的SV40增強子片段，其長度為237bp。序列表SEQ ID NO 4是本發(fā)明的嵌合啟動子CMV-adi-pix)的核苷酸序列，其長度為 1188bp。序列表SEQ ID NO 5是本發(fā)明的嵌合啟動子SVenh-adi-pro的核苷酸序列，其長度為877bp。圖I :是本發(fā)明的技術路線圖。圖2 :是本發(fā)明中利用Adi-F、Adi-R引物對所擴增的選取豬adiponectin基因第一外顯子之前啟動子區(qū)含有CRE結合位點的adi-pro序列電泳檢測圖。圖中泳道M =DNA 分子標準(DL20001adder)。圖3 :是本發(fā)明中利用Adi-FUAdi-Rl引物擴增出的adi-pro基因片段，將該片段連入到PMD-18T載體，之后用限制性內(nèi)切酶Kpn I和MluI雙酶切pMD_18T載體的電泳檢測圖。圖中泳道M =DNA分子標準(DL20001adder)。圖4 :是本發(fā)明中帶有Kpn I和Mlu I酶切位點的adi-pro基因片段與用限制性內(nèi)切酶Kpn I和Mlu I雙酶切pGL3-Basic進行連接反應構建出pGL3_adi-pro載體報告系統(tǒng)后，進行Kpn I和Mlu I雙酶切鑒定的電泳檢測圖。圖中泳道M:DNA分子標準 (DLlOOOOladder)。
圖5 :是本發(fā)明中分別培養(yǎng)的未分化的小鼠前體脂肪細胞、未分化的小鼠骨骼肌成肌細胞、分化7天的小鼠前體脂肪細胞以及分化7天的小鼠骨骼肌成肌細胞在倒置顯微鏡下拍攝的細胞圖片。圖中細胞放大倍數(shù)為10X20。圖6 :是本發(fā)明中adi-pro調控元件在不同細胞中的活性比較分析，即在分化7天的小鼠前體脂肪細胞和分化7天的小鼠骨骼肌成肌細胞。圖中pGL3-BasiC為陰性對照， 熒光比值結果均值用Excel電子表格的STDEV函數(shù)計算標準偏差。圖7 :是本發(fā)明中adi-pro調控元件在同一種細胞不同時期中的活性分析，即在未分化與分化7天的小鼠前體脂肪細胞。圖中熒光比值結果均值用Excel電子表格的STDEV 函數(shù)計算標準偏差。圖8 :是本發(fā)明中帶有Kpn I和Mlu I酶切位點的adi-pro基因片段與用限制性內(nèi)切酶Kpn I和Mlu I雙酶切pGL3_Enhancer進行連接反應構建出pGL3-Enhancer-adi-pro 載體報告系統(tǒng)后的電泳檢測圖。圖中泳道M =DNA分子標準(DL20001adder)。圖9 是本發(fā)明中利用CMV-F、CMV-R弓丨物擴增出的pCMVIE啟動子序列電泳檢測圖。圖中泳道M =DNA分子標準(DL20001adder)。圖10 :是本發(fā)明中利用Adi-F2、Adi-R2引物擴增出的adi-pro序列電泳檢測圖。 圖中泳道M DNA分子標準(DL20001adder)。圖11 :是本發(fā)明中限制性內(nèi)切酶Kpn I和Mlu I雙酶切pGL3_Basic與連入帶有 Kpn I和Mlu I酶切位點pCMV IE啟動子的pMD_18T載體的電泳檢測圖。圖中泳道M:DNA 分子標準(DLlOOOOladder)，泳道I和2 :限制性內(nèi)切酶Kpn I和Mlu I雙酶切pGL3_Basic 載體；泳道3和4 :限制性內(nèi)切酶Kpn I和Mlu I雙酶切的pMD_18T_CMV載體。圖12 :是本發(fā)明中帶有Kpn I和Mlu I酶切位點的CMV片段與用限制性內(nèi)切酶Kpn I和Mlu I雙酶切pGL3-Basic進行連接反應構建出pGL3-CMV_adi-pro載體報告系統(tǒng)后，進行Kpn I和Mlu I雙酶切鑒定的電泳檢測圖。圖中泳道M:DNA分子標準(DL20001adder)。圖13 :是本發(fā)明中帶有Mlu I和Xho I酶切位點的adi-pro片段與用限制性內(nèi)切酶Mlu I和Xho I雙酶切pGL3-Basic進行連接反應構建出雙熒光素酶載體報告系統(tǒng)后，進行Mlu I和Xho I雙酶切鑒定的電泳檢測圖。圖中泳道M:DNA分子標準(DL20001adder)。圖14 :是本發(fā)明中利用SVenh-F、SVenh-R引物擴增出的SV40增強子序列電泳檢測圖。圖中泳道M =DNA分子標準(DL20001adder)。圖15 :是本發(fā)明中利用SVenh-F、SVenh-R引物擴增出的SVenh片段，將該片段連入到pMD-18T載體，之后用限制性內(nèi)切酶Kpn I和Mlu I雙酶切pMD-18T_SVenh載體的電泳檢測圖。圖中泳道M =DNA分子標準(DL20001adder)。圖16 :是本發(fā)明中帶有Kpn I和Mlu I酶切位點的SVenh片段與用限制性內(nèi)切酶 Kpn I和Mlu I雙酶切pGL3-CMV_adi-pro進行連接反應構建出pGL3-SVenh_adi-pro載體報告系統(tǒng)后，進行Kpn I和Mlu I雙酶切鑒定的電泳檢測圖。圖中泳道M =DNA分子標準 (DL20001adder)。圖17 :是本發(fā)明中CMV-adi-pro嵌合啟動子在不同細胞中的活性比較分析，即在分化7天的小鼠前體脂肪細胞和分化7天的小鼠骨骼肌成肌細胞，同時與非嵌合的adi-pro 調控元件進行活性比較。圖中pGL3-BasiC為陰性對照，熒光比值結果均值用Excel電子表格的STDEV函數(shù)計算標準偏差。
圖18 :是本發(fā)明中CMV-adi-pro嵌合啟動子在同一種細胞不同時期的活性分析, 即在未分化和分化7天的小鼠前體脂肪細胞。圖中pGL3-BasiC為陰性對照，熒光比值結果均值用Excel電子表格的STDEV函數(shù)計算標準偏差。圖19 :是本發(fā)明中SVenh-adi-pro嵌合啟動子在不同細胞中的活性比較分析， 即在分化7天的小鼠前體脂肪細胞和分化7天的小鼠骨骼肌成肌細胞，同時與非嵌合的 adi-pro調控元件進行活性比較。圖中pGL3_Enhancer為陰性對照,突光比值結果均值用 Excel電子表格的STDEV函數(shù)計算標準偏差。圖20 :是本發(fā)明中SVenh-adi-pro嵌合啟動子在同一種細胞不同時期的活性分析，即在未分化和分化7天的小鼠前體脂肪細胞。圖中pGL3-Enhancer為陰性對照，熒光比值結果均值用Excel電子表格的STDEV函數(shù)計算標準偏差。圖21 :是本發(fā)明中嵌合啟動子CMV-adi-pro與嵌合啟動子SVenh-adi-pro在分化7天的小鼠前體脂肪細胞中的活性分析。圖中熒光比值結果均值用Excel電子表格的 STDEV函數(shù)計算標準偏差。圖22 :是本發(fā)明中用于克隆的T載體結構示意圖。圖23 :是本發(fā)明中用于分析豬adi-pro調控元件與嵌合啟動子CMV-adi-pro、 SVenh-adi-pro活性的pGL3_Basic雙突光素酶報告載體結構示意圖。圖24 :是本發(fā)明中用于擴增SVenh序列以及分析嵌合啟動子SVenh-adi-pro活性的pGL3-Enhancer雙突光素酶報告載體結構示意圖。圖25 :是本發(fā)明中用于擴增CMV啟動子序列的pIRES2_EGFP真核表達載體結構示意圖。圖26 :是本發(fā)明中用于分析豬adi-pro調控元件與嵌合啟動子CMV-adi-pro、 SVenh-adi-pro活性所用的pRL_TK內(nèi)參載體結構示意圖。圖27 :是本發(fā)明中用于計算熒光比值標準偏差所用的STDEV函數(shù)推導公式圖。圖28 :是本發(fā)明獲得的第一個啟動子的原序列，長度為1188bp。圖29 :是本發(fā)明獲得的第二個啟動子的原序列，長度為877bp。
具體實施例方式實施例I :豬脂肪組織特異表達基因adiponectin第一外顯子前啟動子區(qū)含有CRE 結合位點序列adi-pro的獲取。I.主要試劑苯酚(國藥集團化學試劑有限公司)、氯仿(國藥集團化學試劑有限公司)、異戊醇(國藥集團化學試劑有限公司)、質粒提取試劑盒(購自OMEGA公司)、pMD-18T載體 (寶生物工程大連有限公司)、LA Taq聚合酶(寶生物工程大連有限公司)、dNTP (購自 Fermentas 公司)、DL_2000Marker (購自 Fermentas 公司)、UNIQ-10 柱式 DNA 膠回收試劑盒(購自北京百泰克生物技術有限公司)2.主要溶液的配制(I)血液樣品采集相關溶液的配制IM Tris. cl儲備液稱取121. 4g Tris堿溶于800mL雙蒸水中，加濃鹽酸調至pH =8. O,定容至lOOOmL。高壓滅菌,室溫保存。
O. 5MEDTA (pH = 8. O):稱取 186. lgNa2EDTA · 2H20 溶于 800mL 雙蒸水中，加入 NaOH(約20g)調至pH = 8. O,定容至lOOOmL。高壓滅菌,室溫保存。(2)基因組DNA提取相關溶液的配制蛋白酶K :200mg蛋白酶K溶于IOmL雙蒸水中，以2mL分裝，_20°C冷凍保存。飽和平衡酚溶液市售酚經(jīng)180°C重蒸餾，冷至室溫后加入8-羥基喹啉至終濃度 O. 1%,加入等體積的O. 5mol/L Tris · Cl (pH8. O)，充分搖動混勻。靜置分層移去上層緩沖液，加入等體積的O. lmol/L Tris ·Η(1(ρΗ8.0)，搖動20min，再吸去上層水相，重復直至酚相pH值達7. 9以上，置于棕色瓶中，室溫保存。氯仿/異戊醇(體積比24 I):量取480mL 氯仿，加入20mL異戊醇，混勻。10 X SET 緩沖液15m mol/L Tris*Cl(pH8. 0), 15m mol/L EDTA，5mmol/L 氯化鈉。10% SDS :稱取50gSDS加熱溶于400mL雙蒸水中，定容至500mL。高壓滅菌，室溫保存。TE 緩沖液100mmol/L Tris · Cl (pH = 8. 0), lmmol/L EDTA (pH = 8· 0)。 (3) 瓊脂糖凝膠電泳及檢測相關溶液的配制50XTAE儲備液稱取242gTris堿溶于750mL雙蒸水中，加入57. ImLHAC, IOOmL 0. 5M EDTA (pH = 8. 0)，加水定容至 IOOOmL05XTBE儲備液稱取54gTris堿和27. 5g硼酸溶于750mL雙蒸水中，加入20mL 0. 5M EDTA (pH = 8. 0)，加水定容至 IOOOmL06X上樣緩沖液0· 25%溴酚蘭。0. 25%二甲苯青，15% Ficoll聚蔗糖。溴化乙錠(EB，10mg/mL) :IOOmL雙蒸水中加入0. lgEB，攪拌使完全溶解，轉入棕色試劑瓶，錫紙包裹。(4)相關溶液的配制LB液體培養(yǎng)基取細菌培養(yǎng)用胰蛋白胨10g，細菌培養(yǎng)用酵母提取物5g，NaCl 5g 溶于950mL雙蒸水中，搖動容器直至溶質完全溶解，用5mol/L NaOH(約0. 2mL)調節(jié)pH值至7. 0，加水定容至IOOOmL,高壓滅菌，室溫保存。LB固體培養(yǎng)基按上述方法配制液體培養(yǎng)基，每IOOmL加入I. 5g瓊脂粉，在121°C 高壓蒸汽下滅菌30min，在無菌狀態(tài)下鋪平板，冷卻后封口備用。0. lmol/L CaCl2溶液取I. Ig無水CaCl2溶于90mL雙蒸水中，加入雙蒸水定容至 IOOmL,在121°C高壓蒸汽下滅菌30min,于室溫下保存。3.組織樣品收集“大白豬”(為外國豬血緣)與“梅山豬”(為中國豬血緣)的血樣，利用常規(guī)的酚/氯仿抽提法提取豬基因組DNA，詳細步驟如下4.豬基因組DNA的提取(I)每頭豬前腔靜脈采血20mL左右，加入一預裝有ImL抗凝劑(0. 5mol/LEDTA)的 50mL離心管中。(2)用高速冷凍離心機3000rpm, 4°C離心IOmin,棄上層血清。(3)加I. 5倍體積的雙蒸水，輕搖lOmin，破碎紅細胞。(4) 5000rpm, 4°C離心IOmin,棄去上層紅細胞衆(zhòng)。(5)加入20mL 0. 9% NACl溶液洗滌，5000rpm，4°C離心lOmin，棄去上清，獲得白細
胞沉淀。
(6)加入I X SET緩沖液懸浮白細胞，加入蛋白酶K (10mg/L)至濃度ΙΟΟμ g/mL，再加入10% SDS至終濃度O. 5%，55°C消化過夜。(7)加入等體積的飽和酚，蓋緊管蓋，輕輕上下顛倒混勻約20min，5000rpm，4°C離心 IOmin0(8)用剪掉尖嘴的大口徑吸頭吸取上清液，移入新的50mL離心管，棄去下層苯酚。(9)重復上述步驟7、8兩次。(10)加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇(體積比25 24 I)混合液，輕輕倒轉離心管，混勻15min, IOOOrpm, 4°C離心15min,再按照步驟8收集上清。(11)加入等體積的氯仿/異戊醇(體積比24 I)，同上再抽提一次。(12)加入2. 5倍體積預冷的無水乙醇，輕輕搖動離心管，即有DNA呈絮狀析出。(13)用巴斯德吸管吸出絮狀的DNA于一新干凈的I. 5mL的離心管中，用70%乙醇洗漆一次，3000rpm離心5min,棄去上層乙醇。(14)將離心管于真空干燥泵中37°C抽真空干燥DNA，加入300 μ L TE溶解DNA，于 4°C保存。5.豬基因組DNA的濃度鑒定和質量檢測利用Pharmacia公司的DNA/RNA濃度測定儀測定DNA濃度，根據(jù)濃度的大小以及稀釋倍數(shù)，換算成待測DNA濃度，并把管中的DNA作相應的稀釋，以50ng/ μ L分裝，_20°C保存。根據(jù)記錄的A260/A280比值，估測DNA質量，一般A260/A280在I. 6-1. 8之間，蛋白質含量為零時可以滿足本試驗的要求。6. adi-pro 片段的擴增利用 NCBI 網(wǎng)站(http://www. ncbi. nlm. nih. Rov/nuccore/F.T461661. I)獲取至丨J豬 adiponectin基因第一外顯子前啟動子的序列信息，GenBank登錄號FJ461661. I。選取其中含有CRE結合位點的啟動子序列，命名為adi-pix)。以大白豬和梅山豬的基因組DNA為模板，利用表I中引物Adi-F和Adi-R進行PCR擴增。PCR反應總體系為25μ L :0. 5μ L dNTP, O. 5μ L特異引物，O. 25 μ L LA Taq 酶，2.5yL Buffer，300_500ng 基因組 DNA 模板，加去離子水至25 μ L0PCR 反應條件94°C 4min ；94°C 45s, 59. 5°C退火 40s, 72°C 45s 共計 35 個循環(huán)；最后 72°C延伸 IOmin0PCR產(chǎn)物的回收與純化PCR產(chǎn)物經(jīng)I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，在紫外燈下從瓊脂糖凝膠上將含有目的片段的凝膠切下，放入I. 5mL Ependorff管中，然后用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司)純化PCR產(chǎn)物。連接反應將純化的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，連接反應總體積是10 μ 1，其中包括I. 5 μ 12 X ligationbuffer,0. 3 μ I載體，5 μ I純化PCR產(chǎn)物，4°C過夜連接。轉化無菌狀態(tài)下取50 100 μ I感受態(tài)細胞于I. 5ml Ependorff管中，將 5 10 μ I的連接產(chǎn)物加入輕輕混勻，在冰上放置30min后42°C熱激90s，其間不要搖動 Ependorff管，取出后迅速冰浴2 3min，加入400 μ I無抗生素的LB培養(yǎng)液，37°C，220rpm/ min溫浴復蘇45-60min。然后6000rpm/min離心6min,去除適量的上清,將剩余的菌體與培養(yǎng)基輕輕混勻，含100μ g/mL氨芐青霉素(Amp)的平板上，涂勻，37°C正置培養(yǎng)Ih后倒置培養(yǎng)，14-16小時后觀察有無菌落長出。
陽性克隆子的鑒定及測序從平板上挑取單克隆接入I. 5mL含500 μ L氨芐青霉素 (Amp)濃度為100 μ g/mL的LB培養(yǎng)液中，并于37°C搖床220rpm/min培養(yǎng)約4_6h左右。以菌液為模板，選用特異性引物Adi-F與Adi-R(表I所示)進行PCR擴增。電泳檢測，挑取陽性克隆子的菌液送去測序，序列測定由北京奧科生物技術有限責任公司完成。測序結果顯示為正確的adi-pro片段序列(見SEQ ID NO 1所示，序列長度為640bp)。實施例2 :調控元件adi-pro轉染載體的構建I.主要試劑DLIOOOOMarker，T4DNA連接酶購自寶生物工程大連有限公司；限制性內(nèi)切酶 KpnI, Mlu I購自NEB公司；質粒小量快速提取試劑盒購自原平皓生物公司；Endo-free Plasmid Mini KitII質粒小提試劑盒購自OMEGA公司；pGL3_Basic真核表達載體購自 Promega 公司2.雙熒光素酶報告載體pGL3-Basic雙酶切用Kpn I、Mlu I 雙酶切 pGL3_Basic 載體，雙酶切體系 20 μ I :2 μ I Buffer 2， O. 5μ I Kpn 1,0. 5μ I Mlu I，I μ lpGL3_Basic 載體，O. 2 μ I BSA，補滅菌超純水至 20 μ I。 酶切4-6h。酶切產(chǎn)物用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒(購自北京百泰克生物技術有限公司)回收純化。3.含adi-ρ 片段的TA克隆載體雙酶切利用表I中引物Adi-Fl與Adi-Rl擴增出帶有Kpn I和Mlu I酶切位點的adi-pro 片段，與PMD-18T載體連接。用Kpn I、Mlu I雙酶切pMD-18T_adi-pro載體，雙酶切體系 20 μ I 2 μ I Buffer 2,0. 5μ I KpnI, 0. 5 μ IMlu Ι，6 μ I 含有目的片段的 TA 克隆載體， 0. 2μ I BSA，補滅菌超純水至20 μ I。酶切4-6h。酶切產(chǎn)物用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒(購自北京百泰克生物技術有限公司)回收純化。3.重組載體的構建將雙酶切回收后的adi-ρ 片段連入雙酶切后的pGL3-Basic載體上，所構建的載體分別命名為 pGL3-adi-pro。連接體系 10μ 1:1 μ I 10 X Buffer, 0. 5 μ I 5U/μ I Τ4 ligase, 2 μ I雙酶切的pGL3_Basic載體,6 μ I adi-pro片段,補滅菌超純水至10 μ I。16°C 過夜連接。然后連接產(chǎn)物轉化入大腸桿菌DH5a。利用PCR來檢測陽性克隆，陽性克隆送北京奧科生物技術有限責任公司進行測序。序列經(jīng)測序確認正確后，對陽性克隆進行擴大培養(yǎng)，并抽提質粒。質粒提取用OMEGA公司的質粒提取試劑盒提取，質粒純度與濃度純度利用 NanoDrop2000 Spectrophotometer (美國 NanoDrop 公司)檢測，所測的樣品的 0D260/280 值在I. 8-2. O才可用于后續(xù)的實驗。另外，所提取的質粒再次進行雙酶切鑒定，雙酶切鑒定結果如圖4所示。雙酶切鑒定結果顯示所構建的重組載體正確。實施例3 adi-pro調控元件的活性分析I.主要試劑胎牛血清(FBS，購自美國GIBCO公司)；馬血清(HBS，購自美國GIBCO公司)；DMEM 高糖培養(yǎng)基(購自美國GIBCO公司);脂質體Lipofectamine2000 (購自invitrogen公司)； Dual-Luciferase Reporter AssaySystem(購自 Promega 公司)2.主要耗材細胞培養(yǎng)24孔板(美國Corning公司)、細胞培養(yǎng)瓶、一次性塑料移液管、0. 22 μ m孔徑的一次性濾器、一次性針頭注射器、封口膜(Parafilm公司)、橡膠手套，酶標板(美國Corning公司)3.主要試劑的配制(I) I XPBS 配制稱取 NaCl 8g，KCl O. 2g，Na2HPO4 · 12H20 I. 54g, KH2PO4 0. 19g 溶解于IOOOmL蒸懼水中，調節(jié)pH至7. O,高壓滅菌。(2)油紅O染液稱取O. 5g油紅0(購自Amersco公司)加入IOOmL異丙醇靜置 8-lOmin后濾紙過濾，按照油紅O染液與去離子水3 2的比例稀釋油紅O染液，濾紙過濾 2次,室溫放置IOmin,置于棕色瓶4°C避光保存。(3)細胞凍存液的配制無菌容器中加入4mL滅菌胎牛血清，14mL過濾后的無血清培養(yǎng)基，2mLDMS0 (購自Sigma公司)，混勻避光，分裝于I. 5mL離心管，_20°C保存。(4)0. 25%胰酶溶液的配制:調至pH至8.0，過濾除菌，分裝200yL于1.5mL離心管中，-20°C保存。(5) 10%胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)基的配制50mL規(guī)格注射器吸取DMEM高糖培養(yǎng)基，每IOOmLDMEM高糖培養(yǎng)基中加入IOmL胎牛血清，O. 22 μ M過濾器進行過濾除菌，封口
4°C保存。(6) 2%馬血清高糖DMEM培養(yǎng)基的配制50mL規(guī)格注射器吸取DMEM高糖培養(yǎng)基， 每IOOmL DMEM高糖培養(yǎng)基中加入2mL馬血清，O. 22 μ M過濾器進行過濾除菌，封口 4°C保存。(7)胰島素(Insulin)儲存液的配制稱取25mg胰島素(購自Sigma公司)，加入 12. 5mL的稀鹽酸(PH2-3)，配制終濃度為I μ g/mL的胰島素儲存液。(8)IBMX(1-甲基-3-異丁醇黃嘌呤)儲存液的配制稱取IOOmg IBMX(購自Sigma 公司)，加入900 μ LDMSO,配制終濃度為O. 5mol/L的IBMX儲存液。(9)地塞米松(Dexamethasone)儲存液的配制稱取25mg地塞米松(購自Sigma 公司)，加入6. 37mL無水乙醇，配制終濃度為I μ mol/L的地塞米松儲存液。4.細胞培養(yǎng)當小鼠前體脂肪細胞3T3-L1與小鼠骨骼肌成肌細胞C2C12的細胞匯合度達到 70%-80%時即可對細胞進行傳代培養(yǎng)。首先吸取細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)舊的培養(yǎng)基，用IXPBS沖洗2-3遍，加入O. 25%的胰蛋白酶(Trypsin，購自美國GIBCO公司)200-300 μ L，使胰蛋白酶與貼壁細胞充分接觸，置于37°C培養(yǎng)箱消化大約30s，棄去胰蛋白酶，加入新的胎牛血清高糖培養(yǎng)基，用吸管充分吹打混勻，使之成為單細胞懸液，之后接種到細胞培養(yǎng)瓶中，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。24h后可以更換培養(yǎng)液吸棄未貼壁的細胞。之后培養(yǎng)可每1-2 天換液一次(未分化細胞見附圖5未分化的小鼠前體脂肪細胞和未分化的小鼠骨骼肌成肌細胞)。5.細胞的誘導分化培養(yǎng)(1)3T3_L1細胞的誘導分化培養(yǎng)將接種于24孔板生長24h匯合度達到70% _80%的細胞從細胞培養(yǎng)箱中取出，在倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)以及生長狀況。每個孔板細胞數(shù)達8X 104-1 X 105。將胎牛血清高糖培養(yǎng)基吸出，之后將誘導培養(yǎng)基按照每孔600 μ L加入。其中誘導培養(yǎng)基為^lmL 胎牛血清高糖培養(yǎng)基中加入O. 5 μ L胰島素，I μ L ΙΒΜΧ, I μ L地塞米松稀。在分化培養(yǎng)基中誘導分化2天后細胞體積開始變大變圓，局部出現(xiàn)小突起，此時將細胞培養(yǎng)基換為胎牛血清高糖培養(yǎng)基，繼續(xù)在5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。在小鼠前體脂肪細胞3T3-L1誘導分化7天后，進行轉染試驗。期間大約每1-2天進行一次換液。(2)油紅O染色首先吸棄原有培養(yǎng)液，用PBS緩沖液(商購)洗滌2-3次，加入10%中性甲醛固定 IOmin0之后加入油紅O染液進行染色,染色IOmin后吸棄去染色液,置于顯微鏡下進行觀察，及時拍照，如果染色時間過長，脂滴會自發(fā)破裂(染色后脂滴見附圖5分化7天的小鼠前體脂肪細胞)。(3)C2C12細胞的誘導分化培養(yǎng)將接種于24孔板生長24h匯合度達到70% _80%的細胞從細胞培養(yǎng)箱中取出，置于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)以及生長情況。每個孔板細胞數(shù)達8X 104-1 X 105。吸棄舊的2%馬血清高糖培養(yǎng)基，換成新鮮的2%馬血清高糖培養(yǎng)基，置于5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。在小鼠骨骼肌成肌細胞誘導分化6-7天后，進行轉染試驗。期間大約每1-2天進行一次換液。5.瞬時轉染試驗選用Lipofectamine 2000進行瞬時轉染試驗。其中選用pRL_TK質粒(普洛麥格 (北京)生物技術有限公司，即美國Promega公司)作為參照，與pGL3_adi-pro質粒共轉染。(I)轉染試驗開始前2h，用10%胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)基(配制方法50mL規(guī)格注射器吸取DMEM高糖培養(yǎng)基，每IOOmLDMEM高糖培養(yǎng)基中加入IOmL胎牛血清，O. 22 μ M過濾器進行過濾除菌，封口 4°C保存)進行培養(yǎng)。(2)24孔板每孔按照Iyg質粒轉染量進行轉染。首先將每個待轉染的質粒用 50 μ L的0ΡΤΙ-ΜΕΜΙ低血清培養(yǎng)基來稀釋，在室溫下靜置5min。(3)對于要轉染的每孔細胞，用50 μ L的0ΡΤΙ-ΜΕΜΙ低血清培養(yǎng)基(購自 invitrogen 公司)稀釋 Lipofectamine 2000，待轉染質粒與脂質體 Lipofectamine 2000 按照I : 3 (質量與體積比)來添加,在室溫下靜置5min,待Lipofectamine 2000稀釋完成后，20min之內(nèi)必須和質粒稀釋液進行混合。在混合20min期間，吸棄細胞培養(yǎng)板中原有的培養(yǎng)基，用0ΡΤΙ-ΜΕΜΙ低血清培養(yǎng)基清洗每個孔板，以稀釋殘留原有培養(yǎng)基，防止影響轉染效率。(4) pRL-TK 質粒與 pGL3_adi-pro 質粒共轉染。pRL-TK 質粒與 pGL3_adi-pro 質粒按照I : 20的比例進行共轉染試驗。(5)將 pRL-TK 質粒和 pGL3_adi-pro 與 Lipofectamine 2000 混合物加入到 24 孔板中，并輕輕前后晃動培養(yǎng)板使其混勻。(6)將24孔板置于CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)6h后更換新的培養(yǎng)基，以保證轉染后細胞的活性。6.熒光素酶活性測定選用Promega 公司的 Dual-Luciferase Reporter Assay System 雙突光素酶報告系統(tǒng)進行試驗。(I)在轉染后48h之內(nèi)(24_36h之間)對細胞進行裂解。裂解細胞前，吸棄原培養(yǎng)液，用PBS清洗2-3次，吸取100 μ L的細胞裂解液加入到每個細胞孔中，其中細胞裂解液按照Passive Lysis Buffer :滅菌去離子水為I : 4的比例進行配制。裂解液加完之后,將細胞孔板前后左右晃動20min或進行吹打,使細胞充分裂解。裂解完成后，細胞裂解液可置于-20°C進行保存或可直接進行雙熒光素酶活性的測定。(2)將 10mT,的 Luciferase Assay Buffer II 加入到 Luciferase Assay Substrate中，充分混勻。此混合液為BufferI。(3)將 200 μ L 的 Stop&Glo Substrate 50X 加入到 10mT,的 Stop&Glo Buffer 中， 充分混勻。此混合液為BufferII。(4)用多功能酶標儀進行測定。在黑色酶標板中每孔加入10 μ L細胞裂解液，置于多功能酶標儀中。測定過程分兩步，首先加入50 μ L Buffer I，待此步驟運行結束之后再加 Λ 50 μ L Buffer II。注意整個測定過程應避光操作。實施例4 :組建嵌合啟動子CMV-adi-pro與SVenh-adi-proI.主要試劑同實施例2所用試劑；限制性內(nèi)切酶Xho 1(購自NEB公司)； PIRES2-EGFP真核表達載體；pGL3-EnhanCer真核表達載體(購自北京普洛麥格(北京)生物技術有限公司，即美國Promega公司)。2.組建嵌合啟動子CMV-adi-pro :擴增CMV片段以pIRES2-EGFP(購自北京普洛麥格(北京)生物技術有限公司，即美國Promega公司)真核表達載體作為模板，利用表I中引物CMV-F與CMV-R擴增 548bp(見序列表SEQ ID NO 2)的pCMV IE啟動子片段，將該片段命名為CMV。PCR反應總體系為 25μ L :0. 5μ L dNTP，0. 5μ L 特異引物，O. 25μ L LA Taq 酶，2.5yL Buffer,, IuL pIRES2-EGFP (質粒稀釋100倍)，加去離子水至25yL。PCR反應條件94°C 4min ; 94°C 45s, 65. 1°C退火45s，7°C 45s共計35個循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物回收純化，與PMD-18T載體連接，轉化，挑取陽性克隆進行測序。pGL3-Basic真核表達載體與pMD_18T_CMV載體的雙酶切反應(I)Kpn I 與 Mlu I 雙酶切 pMD_18T_CMV 載體8 μ L pMD_18T_CMV 載體，2 μ L buffer 4,0. 7μ L Kpn I 限制性內(nèi)切酶，0. 6 μ L Mlu I 限制性內(nèi)切酶，0. 2 μ L BSA,8. 5μ L 去離子水。(2) Kpn I 與Mlu I 雙酶切 pGL3_Basic 真核表達載體1 μ L pGL3_Basic 載體,2 μ L buffer 4,0. 7μ L Kpn I 限制性內(nèi)切酶，O. 6 μ L Mlu I 限制性內(nèi)切酶，O. 2 μ L BSA, 15. 5μ L
去離子水。放置37 °C恒溫培養(yǎng)箱進行酶切反應4_6h。連接反應目的片段回收之后進行連接反應，連接反應體系總體積為10 μ L，其中 6μ L CMV，2y LpGL3-Basic 載體，I μ L Τ4 buffer,0. 5μ L Τ4 連接酶，O. 5 μ L 去離子水。 16 °C過夜連接。連接產(chǎn)物轉化,挑取陽性克隆,提取質粒(Endo-free Plasmid Mini KitII質粒小提試劑盒購自OMEGA公司)。擴增帶有Mlu I和Xho I酶切位點的adi-pro片段利用表I中引物Adi_F2與 Adi-R2擴增片段。pGL3-CMV載體與pMD-18T_adi-pro載體的雙酶切反應(I)Xho I 與 Mlu I 雙酶切 pMD-18T-adi-pro 載體8 μ L pMD-18T-adi-pro 載體， 2μ L buffer 3,0. 5μ L Xho I 限制性內(nèi)切酶，O. 5 μ L Mlu I 限制性內(nèi)切酶，O. 2 μ L BSA, 8. 8μ L去離子水。
(2) Xho I 與 Mlu I 雙酶切 pGL3_CMV 載體:I μ L pGL3_CMV 載體，2 μ L buffer 3，
O.5μ L Xho I限制性內(nèi)切酶，O. 5μ L Mlu I限制性內(nèi)切酶，O. 2 μ L BSA，15. 8 μ L去離子水。放置37 °C恒溫培養(yǎng)箱進行酶切反應4_6h。目的片段回收，連接，轉化，挑取陽性克隆，提取質粒pGL3-CMV-adi-pix)。提取質粒之后限制性內(nèi)切酶雙酶切質粒檢測如圖12和圖13所示，酶切出CMV片段與adi-pix)片段。3.組建嵌合啟動子 SVenh-adi-pro :擴增SVenh片段以pGL3_Enhancer真核表達載體為模板，利用表I中引物 SVenh-F與SVenh-R擴增237bp (見序列表SE ID NO 3)的SV40增強子片段，該基因片段命名為SVenh。PCR反應總體系為25 μ L :2 μ L dNTP，I μ L特異引物，O. 25 μ L LA Taq酶，
2.5 μ L Buffer,，O. 2 μ L pGL3_Enhancer，加去離子水至 25 μ L。PCR 反應條件94°C 4min ； 94°C 45s，67°C退火35s，72°C 30s共計35個循環(huán)；最后72°C延伸lOmin?；厥諗U增得到的 SVenh片段，4°C過夜與pMD_18T載體進行連接反應。轉化，挑取陽性克隆，測序正確后提取質粒。pGL3-SVenh-adi-pro載體的構建同樣用Kpn I與Mlu I這兩種限制性內(nèi)切酶進行雙酶切反應。將pGL3-CMV-adi-pro載體中的CMV基因序列切掉，取而代之的是從 pMD-18T-SVenh載體切下的SVenh片段。16°C過夜連接之后，進行轉化，挑取陽性克隆等試驗，測序正確后用Endo-free Plasmid Mini KitII質粒小提試劑盒提取質粒。表I本發(fā)明所設計的擴增序列的弓I物序列信息
權利要求
1.一個豬脂肪組織特異性嵌合啟動子，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:4所示。
2.一個豬脂肪組織特異性嵌合啟動子，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:5所示。
3.權利要求I或2所述的啟動子在調控基因在豬脂肪組織表達中的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于動物基因工程技術領域，具體涉及兩個豬脂肪組織特異性嵌合啟動子的克隆、功能驗證及應用。本發(fā)明驗證了adi-pro調控元件的活性，通過嵌合的方法構建了含有pCMVIE啟動子和SV40增強子的不同嵌合啟動子，使adi-pro調控元件的活性大大提高，為基因工程和分子育種提供了新的特異表達的啟動子資源。所述的啟動子的核苷酸序列分別如序列表SEQ ID NO4和SEQ ID NO5所述。
文檔編號C12N15/113GK102604947SQ20111002869
公開日2012年7月25日 申請日期2011年1月24日 優(yōu)先權日2011年1月24日
發(fā)明者李芳 , 蔣思文 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學