專利名稱：八月紅梨果實單果重主效qtl的分子標記及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于分子遺傳育種領域，本發(fā)明涉及‘八月紅’梨果實單果重主效QTL的分子標記及其應用，可用于梨果實單果重性狀的早期分子輔助選擇，以提高育種效率。
背景技術：
梨(Pyrus L.)原產我國，是我國第三大果樹樹種。梨因其果實營養(yǎng)價值高，香甜多汁，而深受消費者喜愛。單果重不僅是影響梨果實外觀品質和商品性的重要因素，也是構成梨品種產量和經濟效益的重要因素之一，因此，梨果實單果重的大小對梨品種至關重要。 培育具有理想單果重的品種已經成為梨育種的重要目標之一。由于梨為多年生木本果樹作物，與果實品質相關的性狀大都是由多基因控制、易受環(huán)境影響的數(shù)量性狀，在分離后代表現(xiàn)為廣泛的表型變異，其基因型與表現(xiàn)型間的對應關系難以確定。而以往的傳統(tǒng)育種是基于經典數(shù)量遺傳學理論，把控制某一性狀的多個基因作為整體進行研究和選擇，在現(xiàn)有基礎上改良目標性狀難度越來較大。近年來，隨著分子標記技術的迅速發(fā)展、高密度的分子遺傳圖譜的出現(xiàn)，以及數(shù)量性狀作圖方法的不斷完善， 使得數(shù)量性狀基因座(Quantitative trait loci, QTL)定位變成了現(xiàn)實，也為提高目標數(shù)量性狀優(yōu)良基因型選擇的可能性、準確性及預見性奠定了基礎。利用分子標記定位數(shù)量性狀QTL，其實質就是分析分子標記與目標性狀QTL之間的連鎖關系，即利用已知座位的分子標記來定位未知座位的QTL，通過計算分子標記與QTL之間的交換率，來確定QTL的具體位置?；讷@得的標記基因型分離與數(shù)量性狀的量之間的關系，可直接把握數(shù)量性狀基因，并開發(fā)可應用于分子標記輔助選擇(Molecular-assisted selection,MAS)育種的技術，這已在許多重要農作物上取得了成功應用。目前有關梨數(shù)量性狀的QTL定位研究仍屬起步階段，已有的研究主要是針對一些病害或生長性狀，對重要品質性狀之一的果實單果重的QTL定位及分子標記的研究尚沒有開展。因此，開展梨果實單果重主效基因的QTL定位，篩選緊密連鎖的分子標記，建立雜交后代早期輔助選擇技術，對于提高梨果單果重改良效率，縮短育種進程，節(jié)約生產成本顯得尤為重要。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種‘八月紅’梨果實單果重主效QTL的分子標記。本發(fā)明的另一目的在于提供一種‘八月紅’梨果實單果重主效QTL的分子標記引物。本發(fā)明的另一目的在于提供一種‘八月紅’梨果實單果重主效QTL的分子標記方法。本發(fā)明的又一目的在于提供‘八月紅’梨果實單果重主效QTL的分子標記在梨分子育種中的應用。本發(fā)明定位梨果實單果重主效QTL，并提供與QTL位點緊密連鎖的分子標記，通過檢測這些分子標記可以預測梨果實單果重，為實現(xiàn)對該性狀的早期鑒定和篩選提供分子輔助選擇技術支持。本發(fā)明的目的可以通過以下技術方案實現(xiàn)一種‘八月紅’梨果實單果重主效QTL連鎖的分子標記，是通過下列步驟篩選的a)利用梨品種‘八月紅’和‘碭山酥梨’雜交獲得F1后代單株；b)用SSR、SRAP和AFLP三種分子標記方法分析兩個親本及其F1群體，統(tǒng)計分析在親本間具有多態(tài)性的位點在后代群體中的遺傳類型，獲得多態(tài)性標記位點，然后對其進行連鎖分析，構建了 ‘八月紅’梨的遺傳連鎖圖譜。對多態(tài)性標記為點進行連鎖分析時采用 Jionmap3. 0作圖軟件。c)對‘八月紅’和‘碭山酥梨’雜交后代的F1群體單株的果實單果重進行測定，利用區(qū)間作圖法(可利用MapQTL5.0作圖軟件)，將&群體每個單株的果實單果重與‘八月紅’梨遺傳連鎖圖譜中的分子標記進行連鎖和QTL分析，以LOD值彡2. 5為標準，大于2. 5 說明存在一個QTL位點，檢測到在母本‘八月紅’的第7連鎖群上檢測到單果重的QTL位點 Pfw-I，其LOD值為4. 77，是主效QTL，距離最近的一個AFLP分子標記為EACAMCAC_2000m， 大小為2000bp JgPfV-I的距離為1.019cM，該標記可以作為梨果實單果重的標記，所獲得的分子標記 EACAMCAC-2000m 的 AFLP 引物為E_ACA 5 ' -GACTGCGTACCAATTCACA-3 ‘和 M-CAC 5' -GATGAGTCCTGAGTAACAC-3‘。上述的‘八月紅’梨果實單果重主效QTL的分子標記，所述主效QTL位點PfV-I位于‘八月紅’梨第3連鎖群上，其解釋30. 9%的單果重特征。一種‘八月紅’梨果實單果重主效QTL的AFLP分子標記引物，該引物序列為 E-ACA 5' -GACTGCGTACCAATTCACA-3‘和 M_CAC:5' -GATGAGTCCTGAGTAACAC-3‘。一種‘八月紅’梨果實單果重主效QTL的分子標記方法，用梨基因組DNA，限制性內切Bl為 EcoR I 禾Π Mse I, AFLP 弓|物為 E-ACA 5' —GACTGCGTACCAATTCACA—3‘禾Π M-CAC 5 ‘ -GATGAGTCCTGAGTAACAC-3 ‘，進行PCR擴增，擴增產物在6 %變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，如果獲得一個分子標記大小為2000bp，則表明與梨果實單果重的主效QTL位點 Pfw-I相連鎖的分子標記存在，PfV-I位于‘八月紅’梨第3連鎖群上，其解釋30. 9%的單果重特征。上述的‘八月紅’梨果實單果重主效QTL的分子標記在梨分子育種中的應用。上述的‘八月紅’梨果實單果重主效QTL的分子標記在梨分子育種中的應用，用梨基因組DNA，限制性內切酶為EcoR I和Mse I，AFLP引物為E-ACA 5' -GACTGCGTACCAATTCACA-3 ’和 M-CAC :5 ‘ -GATGAGTCCTGAGTAACAC-3 ‘，進行 PCR 擴增，擴增產物在6%變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，如果獲得一個分子標記大小為 2000bp，則表明與梨果實單果重的主效QTL位點相連鎖的分子標記存在，可預測該梨品種果實具有較高的單果重。本發(fā)明的有益效果(1)本發(fā)明首次對決定‘八月紅’梨果實單果重的數(shù)量性狀位點進行了 QTL定位， 這為實現(xiàn)基于分子育種的多基因控制性狀改良奠定了重要的基礎和必要的前提。(2)本發(fā)明中確定了 ‘八月紅’果實單果重的主效QTL位點，對該數(shù)量性狀決定的貢獻率較高，位點的貢獻率為30. 9 %。因此，基于此位點篩選連鎖分子標記對目標性狀判斷的準確性大大提高。
(3)目前普遍認為可應用于分子輔助選擇的連鎖標記與目標性狀的距離需 <5cM，本發(fā)明中與主效QTL連鎖的標記距離為1.019cM，與目標位點表現(xiàn)為緊密連鎖，這對于提高分子標記輔助選擇的準確性和效率具有重要意義。因此，以上標記具有良好的應用價值，可加快對梨果實單果重性狀改良的進度


圖1為‘八月紅’單果重QTL位點Pfw-I在Β 17上的位置。BYH代表的是‘八月紅’連鎖群，BYH后的數(shù)字代表連鎖群數(shù)。連鎖群上左側的數(shù)字是標記之間的遺傳距離，單位為cM，右側則表示的是分子標記的名稱。共有3種分子標記， “E-M-”為AFLP標記，E和M分別指限制性內切酶Eco I和Mse I酶切，其后的數(shù)字是該標記多態(tài)性條帶的編號；其它為SRAP、SSR標記。連鎖群右側的實心長方形指示QTL作圖區(qū)間Pfw-I。圖2為AFLP弓丨物組合E-ACA/M-CAC對‘八月紅’和‘碭山酥梨’ F1后代PCR擴增結果在6%變性聚丙烯酰胺凝膠上的電泳檢測圖。箭頭所指的條帶即EACAMCAC-2000m。
具體實施例方式實施例1 a)利用我國的兩個梨品種‘八月紅’和‘碭山酥梨’雜交組合，獲得其97株F1群體。b)用 SSR(Simple sequence repeat)、 SRAP(Sequence related amplified polymorphism)禾口AFLP(Amplified fragment length polymorphism)三禾中分子標記方法分析兩個親本及其F1群體，統(tǒng)計分析在親本間具有多態(tài)性的位點在后代群體中的遺傳類型。 最終獲得了 23個SSRs、S基因位點、2 個SRAPs和482個AFLPs等共732個多態(tài)性標記位點，然后利用Jionmap3. 0作圖軟件對其進行連鎖分析，構建了一張共包含240個多態(tài)性標記的‘八月紅’梨的遺傳連鎖圖譜。利用SSR、SRAP、AFLP分子標記方法，對‘八月紅’和‘碭山酥梨’及后代進行分析， 并統(tǒng)計分析在親本間具有多態(tài)性的位點在后代群體中的遺傳類型。SSR標記的實驗操作程序參考^mamoto T.等(Euphytica，2002，124 :129-137)的方法；SRAP標記的實驗操作程序參考Li等(Theor Appl Genet, 2001,103 =455-461)的方法；AFLP標記分別使用Eco I和Mes I兩種內切酶，具體實驗操作程序參考Vos等(Nucleic Acids Res，1995，23 :4407-4414)的方法。所用引物由上海英駿生物技術有限公司合成。 SSR和SRAP標記用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠強堿銀染法檢測，AFLP標記用6%變性聚丙烯酰胺凝膠銀染檢測。將SSR、SRAP、AFLP電泳圖譜上清晰出現(xiàn)的多態(tài)性條帶記為“ 1 ”，無帶記為“0”，不清楚的帶或缺失記為“_”，根據(jù)已知分子量的Marker (IOObp DNA Ladder)計算各多態(tài)性條帶的分子量。將分離條帶按親本來源歸類，確定其來源及遺傳類型。利用χ 2測驗分析各標記分離是否符合3 1或1 1的孟德爾分離比例，偏分離的在標記末尾用“*”標注。c)用Joinmap3. O分析軟件構建‘八月紅’梨的分子遺傳連鎖圖譜。將第b)步驟中得到的多態(tài)性標記位點按Joinmap3. O分析軟件中適于cp群體構圖的格式導入Joinmap3. 0，排除缺失數(shù)據(jù)過多的位點和顯著偏分離的位點，以LOD = 4. 0 7. 0，重組率=0. 4，選擇Kosambi作圖函數(shù)構建遺傳連鎖圖(Van Ooi jen, 2001)。d)對該F1群體單株的果實單果重進行了測定。將單果重的表型值和‘八月紅’連鎖圖譜的相關文件導入MapQTL5. O作圖軟件，選擇區(qū)間作圖法，以LOD值> 2. 5為標準，對梨的單果重在‘八月紅’的連鎖圖譜上進行QTL分析和定位。結果表明，在‘八月紅’的第3連鎖群上檢測到單果重的QTL位點Pfw-I (圖1)， LOD值為4. 77，與最近的AFLP分子標記EACAMCAC_2000m的連鎖距離為1. 019cM，對該性狀的貢獻率為30.9%。該QTL位點為主效QTL，其最近標記的距離也遠小于可應用于分子輔助選擇的連鎖標記與目標性狀的所要求的最大距離。其中AFLP分子標記方法為，以梨DNA為模板，雙酶切體系20 μ 1 :DNA 400ng，IXNEB Buffer, BSA 0· 2 μ 1，EcoR I 3U, Mse I 3U。充分混勻后37°C酶切證，然后在65°C放置20min以使內切酶失活。將5 μ 1的下述連接液加到上步失活后的酶切產物中1 μ 1 Mse I adopter (50 μ mol · μ L-1)，1 μ 1 EcoR I adopter (5 μ mol · μ L-1)，1 μ 1 T4 Buffer (IOX),
0.9U T4 DNA ligase，ddH201. 7μ 1。充分混勻后16°C連接過夜，65°C放置IOmin終止反應。預擴增反應體系20 μ 1 1 μ 1連接產物10 X稀釋液，2 μ 1 dNTP (2. 5mmol ，
1.2 μ IMgCl2(25mmol ‘ L-1), 1 μ 1 Mse I 預擴引物(50ng · μ Γ1)，1 μ 1 EcoR I 預擴引物 (50ng
權利要求
1.一種‘八月紅’梨果實單果重主效QTL的分子標記，其特征在于是通過下列步驟篩選的(1)利用梨品種‘八月紅’和‘碭山酥梨’雜交獲得F1后代單株；(2)用SSR、SRAP和AFLP三種分子標記方法分析兩個親本及其F1群體，統(tǒng)計分析在親本間具有多態(tài)性的位點在后代群體中的遺傳類型，獲得多態(tài)性標記位點，然后對其進行連鎖分析，構建‘八月紅’梨的遺傳連鎖圖譜。(3)對‘八月紅’和‘碭山酥梨’雜交后代的F1群體單株的果實單果重進行測定，利用 MapQTL5.0作圖軟件的區(qū)間作圖法，將&群體每個單株的果實單果重與‘八月紅’梨遺傳連鎖圖譜中的分子標記進行連鎖和QTL分析，以LOD值≥2. 5為標準，大于2. 5說明存在一個QTL位點，檢測到在母本‘八月紅’的第7連鎖群上檢測到單果重的QTL位點PfV-1， 其LOD值為4. 77，是主效QTL，距離最近的一個AFLP分子標記為EACAMCAC_2000m，大小為 2000bp，距PfV-I的距離為1.019cM，該標記可以作為梨果實單果重的標記，所獲得的分子標記 EACAMCAC-2000m 的 AFLP 引物為 E-ACA 5 ' -GACTGCGTACCAATTCACA-3 ‘和 M-CAC 5 ‘ -GATGAGTCCTGAGTAACAC-3‘。
2.根據(jù)權利要求1所述的‘八月紅’梨果實單果重主效QTL的分子標記，其特征在于 所述主效QTL位點PfV-I位于‘八月紅’梨第3連鎖群上，其解釋30.9%的單果重特征。
3.一種‘八月紅’梨果實單果重主效QTL的AFLP分子標記引物，其特征在于該引物序列為 E-ACA 5' -GACTGCGTACCAATTCACA-3‘和 M-CAC 5 ‘ -GATGAGTCCTGAGTAACAC-3‘。
4.一種‘八月紅’梨果實單果重主效QTL的分子標記方法，其特征在于用梨基因組 DNA,限制性內切酶為 EcoR I 和 Mse I，AFLP 引物為 E-ACA 5' -GACTGCGTACCAATTCACA-3‘ 和M-CAC 5 ‘ -GATGAGTCCTGAGTAACAC-3 ‘，進行PCR擴增，擴增產物在6 %變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，如果獲得一個分子標記大小為2000bp，則表明與梨果實單果重的主效QTL位點PfV-I相連鎖的分子標記存在，PfV-I位于‘八月紅’梨第3連鎖群上，其解釋 30. 9%的單果重特征。
5.權利要求1或2所述的‘八月紅’梨果實單果重主效QTL的分子標記在梨分子育種中的應用。
6.根據(jù)權利要求5所述的應用，其特征在于用梨基因組DNA，限制性內切酶為 EcoR I 和 Mse I，AFLP 引 物為 E-ACA 5 ' —GACTGCGTACCAATTCACA—3 ‘和 M—CAC 5 ‘ -GATGAGTCCTGAGTAACAC-3 ‘，進行PCR擴增，擴增產物在6 %變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，如果獲得一個分子標記大小為2000bp，則表明存在與梨果實單果重的主效QTL 位點相連鎖的分子標記，可預測該梨品種果實具有較高的單果重。
全文摘要
本發(fā)明屬于遺傳育種領域，提供了‘八月紅’梨果實單果重主效QTL的分子標記及其應用。利用SRAP、SSR、AFLP構建‘八月紅’的遺傳連鎖圖譜，結合對果實單果重的表型鑒定，采用區(qū)間作圖法對此群體進行分析，在‘八月紅’的第7連鎖群上檢測到主效QTL的存在，可解釋30.9％的單果重特征。距離主效QTL位點Pfw-1距離最近的標記為EACAMCAC-2000m，其距離為1.019cM。所獲得的可滴定酸主效QTL分子標記對于加快梨品種的遺傳改良進程，提高育種選擇效率具有重要的理論和實踐指導意義。
文檔編號C12Q1/68GK102154273SQ20111003186
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月29日 優(yōu)先權日2011年1月29日
發(fā)明者吳俊 , 張瑞萍, 張紹鈴, 李秀根, 楊健 申請人:南京農業(yè)大學