專(zhuān)利名稱(chēng)：甘蔗dⅲ家族蔗糖磷酸合成酶基因及其植物表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物體內(nèi)控制蔗糖合成的關(guān)鍵酶基因及其編碼蛋白的序列，以及植物表達(dá)載體，屬植物基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
蔗糖磷酸合成酶(以下簡(jiǎn)稱(chēng)SPS)是高等植物體內(nèi)控制蔗糖合成的關(guān)鍵酶，植物體內(nèi)蔗糖的積累與SPS活性正相關(guān)，此外，SPS還參與植物的生長(zhǎng)和產(chǎn)量形成，并在植物抗逆性，如抗寒、抗旱和耐鹽過(guò)程中起重要作用。轉(zhuǎn)SPS基因的研究在20世紀(jì)90年代初首先在番茄上進(jìn)行，將玉米SPS基因?qū)敕阎校D(zhuǎn)基因番茄葉片中SPS活性增加了 6倍，葉片中淀粉含量減少而蔗糖含量增加。之后，在多種植物上進(jìn)行了轉(zhuǎn)SPS基因的研究。將玉米的SPS基因轉(zhuǎn)入水稻中，轉(zhuǎn)基因水稻的 SPS活性是未轉(zhuǎn)基因水稻的3倍，使轉(zhuǎn)基因水稻的株高明顯比未轉(zhuǎn)基因的高。轉(zhuǎn)擬南芥SPS 基因的煙草莖內(nèi)蔗糖含量增加，且由于節(jié)間增長(zhǎng)和莖徑增粗，轉(zhuǎn)基因煙草的莖重明顯增加。 轉(zhuǎn)玉米SPS基因的馬鈴薯葉片中的SPS活性是對(duì)照植株的四倍，轉(zhuǎn)基因植株地上部分和地下部分的干重也分別增加15%和20%，表明葉片中蔗糖的合成有助于促進(jìn)植株的生長(zhǎng)。導(dǎo)入玉米SPS基因的番茄植株葉片的SPS活性顯著提高，葉片分配向蔗糖的碳同化物提高了 50%，轉(zhuǎn)基因植株比對(duì)照的果實(shí)個(gè)數(shù)增加1.5倍，果實(shí)成熟提前，總干重提高32%。轉(zhuǎn)玉米 SPS基因的煙草葉片中的SPS超量表達(dá)，使蔗糖合成和碳吸收能力提高，有助于整個(gè)植株的生長(zhǎng)和發(fā)育，提高開(kāi)花數(shù)目，故轉(zhuǎn)基因煙草提前開(kāi)花，并且開(kāi)花數(shù)目比野生型的煙草多。轉(zhuǎn)擬南芥A家族SPS基因(AtSPSA)的楊樹(shù)的木質(zhì)部纖維長(zhǎng)度增加，葉片和莖組織細(xì)胞內(nèi)蔗糖含量增加，春季葉片衰老減緩而萌芽提前。表明SPS基因參與調(diào)控白楊的發(fā)育過(guò)程。此外， 轉(zhuǎn)SPS基因還能提高棉花品質(zhì)。以上轉(zhuǎn)基因研究表明，將SPS基因?qū)胱魑矬w內(nèi)，是提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)、增強(qiáng)作物抗逆性的有效途徑。甘蔗是高光合效率C4作物，它的蔗糖含量是所有植物中是最高的，表明其控制蔗糖合成的關(guān)鍵酶-SPS的作用效率也是非常高效的。用甘蔗SPS基因改良其它作物品種或通過(guò)改變甘蔗SPS表達(dá)調(diào)控途徑進(jìn)一步提高甘蔗蔗糖含量和產(chǎn)量具有重要意義。Langenkamper等對(duì)高等植物基因組和已知的SPS基因的全長(zhǎng)序列和其保守序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析后把SPS基因分為A、B、C三個(gè)家族。但是，Castleden等之后還對(duì)小麥等單子葉植物的SPS基因進(jìn)行研究后認(rèn)為，雙子葉植物中的SPS基因至少有A、B、C三個(gè)家族，而禾本科的單子葉植物中的SPS基因則可分為五個(gè)家族，分別為A、B、C、DIII和DIV。 且不同植物中SPS基因的數(shù)量不同，柑橘基因組中有三個(gè)SPS基因，分別屬于A、B、C三個(gè)家族；擬南芥基因組中有四個(gè)SPS基因，其中兩個(gè)屬于A家族，另外兩個(gè)分別屬于B、C家族。 水稻基因組中有五個(gè)SPS基因，分別屬于五個(gè)家族。而玉米基因組中至少有七個(gè)SPS基因， 其中A、C、DIII家族各有一個(gè)，而B(niǎo)、DIV家族各有兩個(gè)。甘蔗屬于禾本科的單子葉植物，所以甘蔗基因組中至少有5個(gè)分別屬于5個(gè)不同家族的SPS基因。但是，目前甘蔗中只克隆了一個(gè)SPS基因的完整CDNA序列，且沒(méi)有進(jìn)一步研究并申請(qǐng)專(zhuān)利的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是研究一個(gè)新的甘蔗DIII家族蔗糖磷酸合成酶基因及其植物表達(dá)載體，使其得到開(kāi)發(fā)應(yīng)用。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是在對(duì)所有全長(zhǎng)序列的植物SPS基因進(jìn)行進(jìn)化分析的基礎(chǔ)上，比對(duì)植物DIII家族SPS基因的CDNA序列，并設(shè)計(jì)擴(kuò)增SoSPSDIII基因核心片段的引物；提取甘蔗幼嫩葉片總RNA，并經(jīng)反轉(zhuǎn)錄，用常規(guī)PCR法擴(kuò)增SoSPSDIII基因核心片段；再通過(guò)RACE (Rapid Amplification ofcDNA ends, cDNA末端快速擴(kuò)增)技術(shù)克隆到甘蔗蔗糖磷酸合成酶基因 (SofSPSDIII)的全長(zhǎng)cDNA序列，總長(zhǎng)3252bp ；經(jīng)VectorNTI軟件分析，該序列的ORF(Open Reading Frame，開(kāi)放閱讀框)為^92bp，編碼964個(gè)氨基酸；起始密碼子(ATG)位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)后60bp處，終止密碼子(TAA)后還有一段301bp的非編碼序列，并帶有真核生物典型的PolyA尾巴。以下是本發(fā)明所獲得的甘蔗SofSPSDIII基因的全長(zhǎng)cDNA序列tcaactctcccattccgtcccccgatctcgccggattctcctcctcgccggcggcggcg ^^ gcggg caacgacaactggatcaacagctacctcgacgccatcctagacgccggaaaggccgccatcggcggcgaccggccct ccctcctcctccgcgagcgcggccatttctcccccgcgcgctacttcgtcgaggaggtcatcaccggctacgacgag accgacctctacaagacatggctacgcgcgaacgccatgcggagcccgcaggagaggaacacgcggctcgagaacat 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tggttttgaggttatacttgcaaggaagctccgagcaagagttaaacgtggtgctaattgttatggtcgttttatgc ctcgtatggttataattcctcctggagttgaatttggtcacattattcacgattttgatatggacggtgaagaagag aatccatccccggcatctgaggatccacctatttggtctcagataatgcgcttctttacaaatcctaggaagcctat gattctagctgttgctcgcccttatcctgagaagaatattactacgcttgtaaaagcatttggtgaatgtcggccac taagggagcttgcaaaccttacattgataatgggtaaccgtgaagctatatctaagatgcacaatatgagtgctgct gtcttgacatcagtgcttacattgattgatgaatatgacttgtatggtcaagtggcataccccaagcatcataagca ctcggaagttcctgacatttatcgtttagctgcaagaacaaagggggcttttgtaaatgtagcttacttcgaacaat ttggagttactctgatagaggctgctatgaatggtttgcctataattgcgacaaaaaatggagcccctgttgaaattaatcaggtcctgaacaatggtctccttgttgatccgcacgatcagaatgccattgcggatgcactatataaacttct ttctgacaaacaactttggtcaaggtgcagagagaatggactgacaaatattcaccaattctcgtggcccgaacatt gcaagaattacctgtcaaggatattaactcttggcccaaggtctcctgctattggtaacagagaggagcggagtaat acacctatttcaggaaggagg caaatcattgttatttctgtagactctgttaacaaggaagatctagtcaggataa tcagaaatgctattgaggtcatacatacacaaaacatgtcgggttcaactggttttgtgctgtcaacttcgctgact atatcagagatacattcactgctactatctggtggcatgcttcccactgattttgatgctttcatctgcaatagtgg gagtaacatttactatccttcatattctggtgaaacgccaaacaactccaagattacatttgcattagatcaaaatc accagtcacatatcgagtatcgttggggaggagaaggactaaggaaatatcttgtgaagtgggccacttcagtggta gaaagaaagggaagaacagagaggcaaattatttttgaagatccagaacactcttcagcctattgtcttgcatttag agtggttaatcccaatcatcttcctcctttaaaggagttgaggaagttgatgagaatccaatctctccgttgcaatg cattgtataaccacagcgctaccagattatctgtagtccctatccatgcatcaagatctcaggctctaaggtacttg tgtatacgttgggggatagaggtgccaaatgttgcagtcctcgtgggtgaaagtggcgattcagattacgaggaact gctggggggtctccataggaccgttatcctgaagggcgagttcaacacccccgcaaacaggatccacacggtgagga gataccccttacaggatgtcgtcccacttgacagctcaaacatcaccggtgtcgaaggctacaccacggatgacttg aagtcggccctgcagcagatgggtatactcacacaa ^aaj taacacctccggagcttctgtttccacacccaagcca acgggaaaacgaaaggaaaggagacgaaccaagtgcaactgtttccatgctcgatggaaatgccgattttgctcgta ggctgtagaggttgtgtatgtgtgtgcgtgcgtgcggtggtggcctattcttgagctgtgaataactgccctccttt gtttgtaatgccccaaaaattttgaagtgagtaccctacaaccaaacaggaaacaggttcacatattgataatggaa aaRacRaatRcaaRaaaRRaaaacaaaaaa以下是本發(fā)明所獲得的甘蔗SofSPSDIII基因所編碼蛋白的氨基酸序列MAGNDNWINSYLDAILDAGKAAIG⑶RPSLLLRERGHFSPARYFVEEVITGYDETDLYKTWLRANAMRS PQERNTRLE匪TWRIWNLARKKKEFEKEEACRLSKRQPETEKTRADATADMSEDLFEGEKGEDA⑶PSVAYGDSTTG SSPKTSSIDKLYIVLISLHGLVRGENMELGRDSDTGGQVKYVVELAKALSSSPGVYRVDLLTRQILAPNFDRSYGEP AELLVSTSGKNSKQEKGENSGAYIIRIPFGPKDKYLAKEHLWPFIQEFVDGALSHIVRMSKAIGEETGRGHPVWPSV IHGHYASAGIAAALLSGALNLPMAFTGHFLGKDKLEGLLKQGRQTREQI匪TYKIMCRIEAEELSLDASEIVIASTR QEIEEQWNLYDGFEVILARKLRARVKRGANCYGRFMPRMVIIPPGVEFGHIIHDFDMDGEEENPSPASEDPPIWSQI MRFFTNPRKPMILAVARPYPEKNITTLVKAFGECRPLRELANLTLIMGNREAISKMHNMSAAVLTSVLTLIDEYDLY GQVAYPKHHKHSEVPDIYRLAARTKGAFVNVAYFEQFGVTLIEAAMNGLPIIATKNGAPVEINQVLNNGLLVDPHDQ NAIADALYKLLSDKQLWSRCRENGLTNIHQFSWPEHCKNYLSRILTLGPRSPAIGNREERSNTPISGRRQIIVISVD SVNKEDLVRIIRNAIEVIHTQ匪SGSTGFVLSTSLTISEIHSLLLSGGMLPTDFDAFICNSGSNIYYPSYSGETPNN SKITFALDQNHQSHIEYRWGGEGLRKYLVKWATSVVERKGRTERQIIFEDPEHSSAYCLAFRVVNPNHLPPLKELRK LMRIQSLRCNALYNHSATRLSWPIHASRSQALRYLCIRWGIEVPNVAVLVGES⑶SDYEELLGGLHRTVILKGEFN TPANRIHTVRRYPLQDVVPLDSSNITGVEGYTTDDLKSALQQMGILTQ擴(kuò)增SofSPSDIII基 因ORF，連接到植物表達(dá)載體pBI121上的組成型啟動(dòng)子 CaMV35S后面，構(gòu)成一個(gè)新的植物表達(dá)載體，命名為pBI-SofSPSDIII。本發(fā)明的載體在轉(zhuǎn)基因提高作物的蔗糖含量、產(chǎn)量或增強(qiáng)抗逆性方面具有很好的應(yīng)用前景。


圖1是本發(fā)明SofSPSDIII植物表達(dá)載體構(gòu)建過(guò)程。擴(kuò)增SofSPSDIII基因0RF，酶切后與相同酶切的pBI121連接， 轉(zhuǎn)化大腸桿菌 Jml09,經(jīng)PCR驗(yàn)證和酶切驗(yàn)證獲得陽(yáng)性克隆。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的具體實(shí)施方式
如下1.植物 SPS 基因進(jìn)化分析用 “sucrose phosphate synthase” 搜索 NCBI 網(wǎng)站 (http //www. ncbi. nlm. nih. gov)非冗余氨基酸數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得所有植物SPS序列。對(duì)所獲得的所有序列進(jìn)行分析，除去重復(fù)的序列。共得到植物SPS序列77條，其中全長(zhǎng)序列43條。 用ClustalX對(duì)所有全長(zhǎng)SPS的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，并將比對(duì)結(jié)果保存為PHYLIP格式； 然后用PHYLIP軟件包的kqboot，Protdist, Neighbor和Consense程序進(jìn)行進(jìn)化分析，將植物所有全長(zhǎng)SPS基因分為相應(yīng)的家族。2.設(shè)計(jì)擴(kuò)增SoSPSDIII基因核心片段的引物比對(duì)植物DIII家族SPS基因的cDNA 序列，在保守區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)用于擴(kuò)增SofSPSDIII部分片段的引物SofSPSDIII-F(5，-atggcgg gcaacgacaa-3')禾口 SofSPSDIII—R(5，-gaagcgcattatctgagacc-3‘)。3.甘蔗總RNA的提取(1)取50 IOOmg甘蔗相應(yīng)組織(如幼嫩葉鞘、葉片等)在液氮中研磨成粉末，加入ImlTrizol提取液，吹吸混勻；(2)將溶液快速轉(zhuǎn)移至1. 5ml的離心管中，室溫下放置5min，以完全溶解核蛋白體；(3) 4"C，12，OOOg,離心 15min ；(4)吸取上清液于另一個(gè)1. 5ml離心管中，以0. 2ml氯仿Iml Trizol提取液的比例加入0. 2ml新鮮的氯仿，充分振蕩混勻15sec，室溫放置2 ^iin后出現(xiàn)分層；(5) 40C，12，000g/min,離心 15min ；(6)吸取上清液于另一個(gè)1. 5ml離心管中，加入等體積預(yù)冷的異丙醇，室溫放置 IOmin 沉淀 RNA ；(7) 40C，12，000g/min,離心 IOmin ；(8)丟棄上清液，留沉淀，用0.5-lml 75 %的乙醇漂洗沉淀2遍(每次4 °C， 12，OOOg，離心 5min)。(9)將沉淀晾干后溶于適量的DEPC處理水，于_70°C保存(或_20°C短期貯存?zhèn)溆?；(10)取1 μ 1 RNA樣品用1 %瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，另取1 μ 1 RNA樣品測(cè)濃度。
4. RT-PCR (反轉(zhuǎn)錄 PCR)RT-PCR RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas) i式齊[J 盒操作手冊(cè)進(jìn)行。(1)準(zhǔn)備一個(gè)0. 2ml的離心管，加入以下成分甘蔗總RNA :0. 1_5μ g ；oligo (dT) 18 引物(0. 5 μ g/μ 1) :1μ 1 ；加入DEPC處理的水到總體積12 μ 1 ；
短暫離心混勻。(2) 70°C溫育5min后置于冰上，短暫離心。(3)將離心管置于冰上，加入以下成分5Xreaction buffer :4μ 1 ；RiboLock Ribonuclease Inhibitor (20u/μ 1) 1μ 1 ；10mM dNTP mix :2μ 1 ；短暫離心混勻。(4)371溫育5111土11。(5)加入 1 μ 1 RevertAid M-MuLV 反轉(zhuǎn)錄酶(200u/ μ 1)；使終體積達(dá)到 20 μ L·(6)421溫育60111土11。(7)70°C溫育IOmin終止反應(yīng)，將離心管置于冰上。5. SoSPSDIII基因核心片段克隆以2μ 1 RT-PCR產(chǎn)物為模板，用SofSPSDIII-F和 SofSPSDIII-R引物進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后克隆到T載體并測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度1371bp。6. SoSPSDIII基因全長(zhǎng)cDNA克隆根據(jù)上一步測(cè)序獲得的核心區(qū)序列，設(shè)計(jì)了 5，-RACE和3，-RACE的基因特異引物，DIII5，-GSPl (5，_cgttcgcgcgtagccatgtcttgt_3，)DII15， _GSP2(5， _ccggtgatgacctcctcgacgaagt_3，)DIII3' -GSPl (5' -gcaaggaagctccgagcaagagtt-3‘)DIII3，_GSP2(5，_tcctcctggagttgaatttggtcaca_3，)。提取甘蔗幼嫩葉總RNA，按 SMART RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)試劑盒操作手冊(cè)進(jìn)行5’-RACE和3’-RACE。產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后克隆到T載體并測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，5，-RACE產(chǎn)物長(zhǎng)度21 lbp，3，-RACE產(chǎn)物長(zhǎng)度1937bp。7.甘蔗SoSPSDIII基因全長(zhǎng)序列分析將所獲得的三個(gè)序列進(jìn)行拼接，獲得了 SofSPSDIII基因全長(zhǎng)cDNA序列，總長(zhǎng)3252bp。經(jīng)VectorNTI軟件分析，該序列的ORF為 2892bp，編碼964個(gè)氨基酸。起始密碼子(ATG)位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)后60bp處，終止密碼子 (TAA)后還有一段301bp的非編碼序列，并帶有真核生物典型的polyA尾巴。8.甘蔗SofSPSDIII基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)SofSPSDIII全長(zhǎng)cDNA序列，設(shè)計(jì)一對(duì)用于擴(kuò)增SofSPSDIII基因ORF的引物，DIII-ORF-F(CccTCTAGAatRRcRRRcaacRacaa)和 DIII-QRF-R(RRRCCCGGGttattRtRtRaR tatacccatctgc)，并分別在5，端加上XbaI和XmaI酶切位點(diǎn)。用RT-PCR產(chǎn)物為模板，用 DIII-ORF-F和DIII-ORF-R為弓|物進(jìn)行常規(guī)PCR。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，用XbaI和XmaI 進(jìn)行雙酶切，同時(shí)用XbaI和XmaI 對(duì)植物表達(dá)載體pBI121進(jìn)行雙酶切。酶切產(chǎn)物用PCR純化試劑盒純化后進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，在含Km的培養(yǎng)基上篩選。在 PBI121質(zhì)粒的插入位點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)各設(shè)計(jì)一條引物，pBI121-conF(cagtggtcccaaagatggaccc cca)和pBI121-conR(tccagactgaatgcccacaggccgt)，以少量菌體為模板，用該對(duì)引物行常規(guī)PCR驗(yàn)證。挑選3個(gè)能擴(kuò)增出預(yù)期產(chǎn)物的陽(yáng)性克隆菌株提質(zhì)粒酶切驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的質(zhì)粒送上海鼎安公司測(cè)序進(jìn)一步確認(rèn)，并命名為PBl-SofSPSDIII。甘蔗DIII家族蔗糖磷酸合成酶基因(SofSPSDIII)序列表，見(jiàn)后頁(yè)。
權(quán)利要求
1.甘蔗DIII家族蔗糖磷酸合成酶基因SofSPSDIII，其特征在于它具有序列表中 SEQIDN0. 1的DNA序列，且它的編碼區(qū)從第60位核苷酸到四51位核苷酸；SofSPSDIII編碼的蛋白，是具有序列表中SEQID NO. 2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQID NO. 2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQID NO. 2的氨基酸殘基序列相同活性的衍生蛋白質(zhì)； 本發(fā)明所獲得的甘蔗SofSPSDIII基因的全長(zhǎng)cDNA序列tcaactctcccattccgtcccccgatctcgccggattctcctcctcgccggcggcggcg|at^ gcgggcaacga caactggatcaacagctacctcgacgccatcctagacgccggaaaggccgccatcggcggcgaccggccctccctcc tcctccgcgagcgcggccatttctcccccgcgcgctacttcgtcgaggaggtcatcaccggctacgacgagaccgac ctctacaagacatggctacgcgcgaacgccatgcggagcccgcaggagaggaacacgcggctcgagaacatgacgtg gaggatctggaaccttgcaaggaagaagaaggagttcgagaaagaagaagcttgtcgtttgtcaaaacgccagccag aaactgagaaaacacgagctgatgctactgcagatatgtctgaagatctctttgaaggtgaaaagggagaagatgct ggtgatccatctgttgcatatggggacagcaccacagggagctcacctaagacaagttcaattgacaagctatacat agtattgatcagtttacatggtctggtccgtggtgagaatatggagcttggccgagattcagatacgggtggccagg tcaaatatgtggttgaacttgctaaagcactaagttcatctcctggagtttaccgggttgatctgctaacaagacaa atattagcaccaaattttgatcgtagttatggtgaacctgcagaattattggtttcaacaagtggtaaaaattctaa acaagaaaaaggagaaaatagtggcgcatatataattcggataccatttggtccaaaagataagtatctagctaaag aacatctatggcctttcattcaagaatttgttgatggtgcactcagccatattgtgaggatgtcaaaagccataggt gaagaaactggccgcgggcatccagtatggccttctgtgattcatgggcattatgccagtgcaggaattgctgctgc tttactttctggagcacttaaccttcctatggcattcacaggacattttcttgggaaagataaattggaagggcttc tcaaacaagggagacaaactagggaacagataaatatgacatacaaaataatgtgccgaattgaggcagaggagcta tctcttgacgcatctgagattgtcattgcaagcactaggcaagaaatagaagagcagtggaacttgtatgatggttt tgaggttatacttgcaaggaagctccgagcaagagttaaacgtggtgctaattgttatggtcgttttatgcctcgta tggttataattcctcctggagttgaatttggtcacattattcacgattttgatatggacggtgaagaagagaatcca tccccggcatctgaggatccacctatttggtctcagataatgcgcttctttacaaatcctaggaagcctatgattct agetgttgetcgcccttatcctgagaagaatattactacgcttgtaaaagcatttggtgaatgtcggccactaaggg agcttgcaaaccttacattgataatgggtaaccgtgaagctatatctaagatgcacaatatgagtgctgctgtcttg acatcagtgcttacattgattgatgaatatgacttgtatggtcaagtggcataccccaagcatcataagcactcgga agttcctgacatttatcgtttagctgcaagaacaaagggggcttttgtaaatgtagcttacttcgaacaatttggag ttactctgatagaggctgctatgaatggtttgcctataattgcgacaaaaaatggagcccctgttgaaattaatcag gtcctgaacaatggtctccttgttgatccgcacgatcagaatgccattgcggatgcactatataaacttctttctga caaacaactttggtcaaggtgcagagagaatggactgacaaatattcaccaattctcgtggcccgaacattgcaaga attacctgtcaaggatattaactcttggcccaaggtctcctgctattggtaacagagaggagcggagtaatacacct atttcaggaaggaggcaaatcattgttatttctgtagactctgttaacaaggaagatctagtcaggataatcagaaa tgctattgaggtcatacatacacaaaacatgtcgggttcaactggttttgtgctgtcaacttcgctgactatatcag agatacattcactgctactatctggtggcatgcttcccactgattttgatgctttcatctgcaatagtgggagtaac atttactatccttcatattctggtgaaacgccaaacaactccaagattacatttgcattagatcaaaatcaccagtc acatatcgagtatcgttggggaggagaaggactaaggaaatatcttgtgaagtgggccacttcagtggtagaaagaa agggaagaacagagaggcaaattatttttgaagatccagaacactcttcagcctattgtcttgcatttagagtggttaatcccaatcatcttcctcctttaaaggagttgaggaagttgatgagaatccaatctctccgttgcaatgcattgta taaccacagcgctaccagattatctgtagtccctatccatgcatcaagatctcaggctctaaggtacttgtgtatac gttgggggatagaggtgccaaatgttgcagtcctcgtgggtgaaagtggcgattcagattacgaggaactgctgggg ggtctccataggaccgttatcctgaagggcgagttcaacacccccgcaaacaggatccacacggtgaggagataccc cttacaggatgtcgtcccacttgacagctcaaacatcaccggtgtcgaaggctacaccacggatgacttgaagtegg ccctgcagcagatgggtatactcacacaa[taa|taacacct ccggagc ttctgttt ccacacccaagccaacgggaaaa cgaaaggaaaggagacgaaccaagtgcaactgtttccatgctcgatggaaatgccgattttgctcgtaggctgtaga ggttgtgtatgtgtgtgcgtgcgtgcggtggtggcctattcttgagctgtgaataactgccctcctttgtttgtaat gccccaaaaattttgaagtgagtaccctacaaccaaacaggaaacaggttcacatattgataatggaaaagacgaat gcaagaaaggaaaacaaaaaa本發(fā)明所獲得的甘蔗SofSPSDIII基因所編碼蛋白的氨基酸序列 MAGNDNWINSYLDAILDAGKAAIG⑶RPSLLLRERGHFSPARYFVEEVITGYDETDLITWLRANAMRSPQE RNTRLE匪TWRIWNLARKKKEFEKEEACRI^KRQPETEKTRADATADMSEDLFEGEKGEDA⑶PSVAYGDSTTGSSP KTSSIDKLYIVLISLHGLVRGENMELGRDSDTGGQVKYVVELAKALSSSPGVYRVDLLTRQILAPNFDRSYGEPAEL LVSTSGKNSKQEKGENSGAYIIRIPFGPKDKYLAKEHLWPFIQEFVDGALSHIVRMSKAIGEETGRGHPVWPSVIHG HYASAGIAAALLSGALNLPMAFTGHFLGKDKLEGLLKQGRQTREQI匪TYKIMCRIEAEELSLDASEIVIASTRQEI EEQWNLYDGFEVILARKLRARVKRGANCYGRFMPRMVIIPPGVEFGHIIHDFDMDGEEENPSPASEDPPIWSQIMRF FTNPRKPMILAVARPYPEKNITTLVKAFGECRPLRELANLTLIMGNREAISKMHNMSAAVLTSVLTLIDEYDLYGQV AYPKHHKHSEVPDIYRLAARTKGAFVNVAYFEQFGVTLIEAAMNGLPIIATKNGAPVEINQVLNNGLLVDPHDQNAI ADALYKLLSDKQLWSRCRENGLTNIHQFSWPEHCKNYLSRILTLGPRSPAIGNREERSNTPISGRRQIIVISVDSVN KEDLVRIIRNAIEVIHTQ匪SGSTGFVLSTSLTISEIHSLLLSGGMLPTDFDAFICNSGSNIYYPSYSGETPNNSKI TFALDQNHQSHIEYRWGGEGLRKYLVKWATSVVERKGRTERQIIFEDPEHSSAYCLAFRVVNPNHLPPLKELRKLMR IQSLRCNALYNHSATRLSWPIHASRSQALRYLCIRWGIEVPNVAVLVGES⑶SDYEELLGGLHRTVILKGEFNTPA NRIHTVRRYPLQDVVPLDSSNITGVEGYTTDDLKSALQQMGILTQ
2.甘蔗Dili家族蔗糖磷酸合成酶基因植物表達(dá)載體，其特征在于載體中的啟動(dòng)子為 CaMV35S，載體中的基因?yàn)镾ofSPSDIII，即含有序列表中SEQID NO. 1的第60位核苷酸到第 2954位核苷酸片段，構(gòu)成一個(gè)新的植物表達(dá)載體，命名為pBI-SofSPSDIII。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種甘蔗DⅢ家族蔗糖磷酸合成酶基因及其植物表達(dá)載體。該基因SofSPSDⅢ是下列序列之一1.序列表中的1的DNA序列；2.編碼序列表中2的蛋白質(zhì)序列。該基因編碼的蛋白，是具有序列表中2的氨基酸殘基序列，或者是將2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與2相同活性的衍生蛋白質(zhì)。本發(fā)明的植物表達(dá)載體含有來(lái)自序列表中1的第60位核苷酸到第2954位核苷酸片段，插入到載體pBI121的組成型啟動(dòng)子CaMV35S后面，構(gòu)成一個(gè)新植物表達(dá)載體，命名為pBI-SofSPSDⅢ。本發(fā)明的載體在轉(zhuǎn)基因提高作物的蔗糖含量、產(chǎn)量或增強(qiáng)抗逆性方面具有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/52GK102154333SQ20111003247
公開(kāi)日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月30日
發(fā)明者劉麗敏, 劉助生, 唐紅琴, 廖青, 方鋒學(xué), 李雙喜, 李楊瑞, 游建華, 莫磊興, 黃東亮, 黎濤 申請(qǐng)人:廣西壯族自治區(qū)甘蔗研究所