專利名稱：體外誘導乙型肝炎病毒特異性細胞毒性t淋巴細胞的方法
技術領域：
本發(fā)明屬生物技術的細胞生物學和免疫學等領域，涉及以HBV細胞毒性T淋巴細胞(Cytotoxic T Lymphocyte, CTL)表位肽包被人工抗原提呈細胞(artificial antigen-presentingcells，aAPC)在體外誘導HBV特異性CTL，用于殺傷表達HBV抗原的細胞。
背景技術：
慢性乙型肝炎病毒感染的治療仍然是醫(yī)學界面臨的重大難題，目前抗HBV治療的藥物還不能徹底清除病毒，如何有效清除HBV依然是乙型肝炎治療研究的熱點。(I)HBV特異性細胞毒T淋巴細胞(Cytotoxic T Lymphocytes,CTLs)是機體清除 HBV的重要因素。研究多克隆、多特異性、強應答的特異性CTL的制備方法，對慢性乙型肝炎的治療具有重要意義。已有研究表明，HBV特異性CTL是機體清除HBV的重要因素急性乙型肝炎患者清除HBV主要由⑶8+CTL介導，CTL可通過致肝細胞溶解和/或非溶解兩條途徑清除肝細胞內的HBV(尤其是HBV cccDNA)，發(fā)揮抗病毒效應。急性乙型肝炎患者體內的CTL常為多克隆、多特異性、強應答及高IFN-Y分泌的。相反慢性乙型肝炎患者的HBV持續(xù)感染與宿主T細胞免疫應答不足相關。研究發(fā)現，慢性乙型肝炎患者體內抗原提呈細胞(Antigen Presenting Cells, APC)的抗原提呈功能缺陷，不能把病毒抗原的信息傳遞給機體的免疫系統(tǒng)，因此慢性乙型肝炎患者體內的特異性CTL常表現為寡特異性、弱應答。由此可見，過繼輸入足夠量的多克隆、多特異性、強應答的特異性CTL來清除病毒，可與目前抗病毒治療相互補充，解決不能徹底清除肝細胞內病毒的問題。(2) aAPC是用人工的方法模擬APC)的功能——T淋巴細胞活化信號，可在體外活化特異性T淋巴細胞。目前常用的方法是在磁珠表面交聯抗CD^單克隆抗體(mAb)和MHC I-Ig 抗原肽復合物，該磁珠可以誘導活化抗原肽特異性的CTL。由于aAPC具有較高的可操控性，可人為控制MHC抗原肽復合物，從而實現對CD8+T淋巴細胞活化的調控，并有活化條件較均一，質量易控制，T細胞活化增殖周期短等優(yōu)點。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種體外誘導HBV特異性細胞毒性T淋巴細胞的方法，采用該方法可以用于擴增抗HBV的T淋巴細胞。為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種體外誘導乙型肝炎病毒特異性細胞毒性 T淋巴細胞的方法，其特征是包括以下步驟1)、制備可負載任意多肽的人工抗原提呈細胞aAPC 采用MHC I-Ig和抗OT^mAb包被磁珠用直接包被法將MHC I-Ig和抗CD28 mAb 包被在磁珠上，構建成可負載任意多肽的人工抗原提呈細胞aAPC ；2)、表位肽負載aAPC
MHC I-Ig和抗⑶觀mAb包被的aAPC經PBS洗滌，以PBS將表位肽分別配制成濃度為20 40 μ g/ml多肽溶液，再將洗滌后的aAPC以4 8X 108/ml濃度重懸到所述多肽溶液中，得負載抗原肽的aAPC ；負載的表位肽的序列為以下任意一個 FLPSDFFPSV ；②ILCWGgLMTL;③QLLWFHISCL;④TLATWYGVNL;⑤YLVSFGVWIR;⑥SWLSLLVPFV;⑦FLLSLGIHLN;⑧FLLTRILTIP ；(9) ILSTLPETTV ；⑩NLEDPASRDL ；3)、負載抗原肽的aAPC體外誘導HBV抗原特異性CTL 分離HLA_A*0201正常人外周血PBMC細胞，以MACS技術分選獲得⑶8+T細胞；將 ⑶8+T細胞與負載抗原肽的aAPC在培養(yǎng)基中37°C，5% C02培養(yǎng)刺激3 4周，所述培養(yǎng)基 % OpTmizer T-Cell Expansion SFM serum free, 2% heated inactivated humanserum, 100-200IU IL-2 ；再以磁鐵吸附分離抗原特異性CTL ；對所獲得的抗原特異性CTL采用Tetramer染色法測定其數量熒光素標記的鏈親和素與4個生物素標記的MHC-肽復合物結合形成四聚體 (Tetramer)，得MHC-肽四聚體；MHC-肽四聚體與抗原特異性CTL上的TCR結合后，通過流式細胞儀進行檢測。采用本發(fā)明的方法可以用于擴增抗HBV的T淋巴細胞。
具體實施例方式1)制備可負載任意多肽的人工抗原提呈細胞aAPC 采用MHC I-Ig和抗CD^mAb包被磁珠用直接包被法將MHC I-Ig和抗⑶觀mAb 包被在磁珠(Dynabeads M-450，購自invitrogen)上，構建成可負載任意多肽的人工抗原提呈細胞aAPC ；具體方法滅菌的0. IM硼酸鹽緩沖液洗滌磁珠兩次，使磁珠與1 1混合的 HLA-A2-Ig和anti-CD28 mAb9. 3 (抗⑶沘的單克隆抗體，購買)在旋轉器上4°C孵育Mh。 用洗磁珠緩沖液洗滌兩次，再在含有洗磁珠緩沖液中孵育Mh，然后其去洗液，加入新鮮的緩沖液。制備的aAPC最后每個磁珠含有0. 9\105分子的!11^42-化和1. 9 X IO5 anti-OT^ mAb 9. 3分子。制備好的磁珠4°C可保存3個月。包被后的磁珠即為aAPC。2)、表位肽負載aAPC MHC I-Ig和抗⑶觀mAb包被的aAPC經PBS洗滌，以PBS將表位肽分別配制成濃度為20 40 μ g/ml多肽溶液，再將洗滌后的aAPC以4 8X 108/ml濃度重懸到所述多肽溶液中，得負載抗原肽的aAPC ；
負載的表位肽的序列可選用以下任意一條①FLPSDEFPSV，即PheLeu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val (SEQ ID NO :1)；②ILCWGgLMTL ；③QLLWFfll SCL ；④TLATWYGVNL ；⑤YLVSFGVWIR ；⑥SWLSLLVPFV ；⑦FLLSLGIHLN ；⑧FLLTRILTIP;⑨ILSTL￡ETTV ；⑩NLEDPASRDL。在本實施例中選用的是第①條。3)、負載抗原肽的aAPC體外誘導HBV抗原特異性CTL 分離HLA_A*0201正常人外周血PBMC細胞，以MACS技術分選獲得⑶8+T細胞(德國milteny公司產品“CD8+T Cell Isolation Kit”，按試劑盒說明書操作)；將 ⑶8+T細胞與負載抗原肽的aAPC在培養(yǎng)基中37°C，5% C02培養(yǎng)刺激3 4周，所述培養(yǎng)基為 0pTmizer T-Cell Expansion SFM serum free (Gibco),2 % heated inactivated humanserum(Gibco)，100-200IU IL-2 ；再以磁鐵(DynaMag-2，Dynabeads)吸附分離抗原特異性CTL(按使用說明書操作)。對所獲得的抗原特異性CTL采用Tetramer染色法測定其數量熒光素標記的鏈親和素(購買)與4個生物素標記的MHC-肽復合物(委托商業(yè)公司合成)結合形成四聚體(Tetramer)，得MHC-肽四聚體；MHC-肽四聚體與抗原特異性 CTL上的TCR結合后，通過流式細胞儀進行檢測?？乖禺愋訡TL比例在10%以上，較對照組提高30%以上。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發(fā)明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發(fā)明的保護范圍。
權利要求
1.體外誘導乙型肝炎病毒特異性細胞毒性T淋巴細胞的方法，其特征是包括以下步驟1)、制備可負載任意多肽的人工抗原提呈細胞aAPC采用MHC I-Ig和抗CD^mAb包被磁珠用直接包被法將MHC I-Ig和抗CD^mAb包被在磁珠上，構建成可負載任意多肽的人工抗原提呈細胞aAPC ；2)、表位肽負載aAPCMHC I-Ig和抗CD^mAb包被的aAPC經PBS洗滌，以PBS將表位肽分別配制成濃度為 20 40 μ g/ml多肽溶液，再將洗滌后的aAPC以4 8X 108/ml濃度重懸到所述多肽溶液中，得負載抗原肽的aAPC;負載的表位肽的序列為以下任意一個 ① FLPSDFFPSV ； (2) ILCffGELMTL ； ③ QLLffFHISCL ； @ TLATWYGVNL ； YLVSFGVWIR ； SWLSLLVPFV ；⑦FLLSLGIHLN ；⑧FLLTRILTIP ； @ ILSTL￡ETTV ； ⑩ NLEDPASRDL ；3)、負載抗原肽的aAPC體外誘導HBV抗原特異性CTL分離HLA-A*0201正常人外周血PBMC細胞，以MACS技術分選獲得⑶8+T細胞；將⑶8+T 細胞與負載抗原肽的aAPC在培養(yǎng)基中37°C，5% C02培養(yǎng)刺激3 4周，所述培養(yǎng)基為 OpTmiζer T-Cell Expansion SFM serum free, 2% heated inactivated humanserum, 100-200IU IL-2 ；再以磁鐵吸附分離抗原特異性CTL ；對所獲得的抗原特異性CTL采用Tetramer染色法測定其數量 熒光素標記的鏈親和素與4個生物素標記的MHC-肽復合物結合形成四聚體 (Tetramer)，得MHC-肽四聚體；MHC-肽四聚體與抗原特異性CTL上的TCR結合后，通過流式細胞儀進行檢測。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種體外誘導乙型肝炎病毒特異性細胞毒性T淋巴細胞的方法，包括以下步驟1)制備可負載任意多肽的人工抗原提呈細胞aAPC；2)表位肽負載aAPC；3)負載抗原肽的aAPC體外誘導HBV抗原特異性CTL；對所獲得的抗原特異性CTL采用Tetramer染色法測定其數量熒光素標記的鏈親和素與4個生物素標記的MHC-肽復合物結合形成四聚體(Tetramer)，得MHC-肽四聚體；MHC-肽四聚體與抗原特異性CTL上的TCR結合后，通過流式細胞儀進行檢測。采用該方法可以用于擴增抗HBV的T淋巴細胞。
文檔編號C12N5/0783GK102168066SQ20111003332
公開日2011年8月31日 申請日期2011年1月31日 優(yōu)先權日2011年1月31日
發(fā)明者朱海紅 申請人:浙江大學