專利名稱：一種利用藍(lán)藻將CO₂生物轉(zhuǎn)化為異丙醇的技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物新能源領(lǐng)域和環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域，涉及一種利用藍(lán)藻將(X)2生物轉(zhuǎn)化為異丙醇的技術(shù)，具體涉及可以生產(chǎn)異丙醇的重組藍(lán)藻。
背景技術(shù)：
全球面臨的能源問題、環(huán)境問題向人們提出了發(fā)展可再生清潔能源的要求，而糧食短缺要求可再生清潔能源的發(fā)展要實現(xiàn)不與人爭糧、不與作物爭地、不與人和作物爭淡水。藍(lán)藻(blue-green algae)，又稱藍(lán)細(xì)菌(cyanobacteria)，是可以進(jìn)行放氧光合作用的原核生物。藍(lán)藻廣泛分布在淡水、海水甚至是污水中，能夠利用二氧化碳和太陽能快速繁殖，是生物合成能源產(chǎn)品的理想宿主。作為原核生物，藍(lán)藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡單、遺傳背景與大腸桿菌相似，易于基因操作。近二十年來藍(lán)藻分子生物學(xué)的研究進(jìn)展為對藍(lán)藻進(jìn)行基因改造進(jìn)而合成化工產(chǎn)品奠定了基礎(chǔ)，已有在藍(lán)藻中合成乙醇的成功案例(專利US6699696)。 太陽能是地球上取之不盡的能源，而二氧化碳是導(dǎo)致地球變暖的溫室氣體，全球每年投入數(shù)以億計資金用于二氧化碳減排。因此，通過對藍(lán)藻進(jìn)行代謝途徑改造，使藍(lán)藻將太陽能和二氧化碳直接轉(zhuǎn)化為能源化工產(chǎn)品，是實現(xiàn)可再生清潔能源持續(xù)、健康發(fā)展的理想途徑之
ο異丙醇(isopropanol)是重要的化工產(chǎn)品和原料。主要用于制藥、化妝品、塑料、 香料、涂料及電子工業(yè)上用作脫水劑及清洗劑。異丙醇作為低成本溶劑或萃取劑在工業(yè)和消費產(chǎn)品中的生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用。低品質(zhì)的異丙醇還可用在汽車燃料中。在許多情況下異丙醇可代替乙醇使用。2010年我國對異丙醇的年需求總量將達(dá)到30萬噸，我國異丙醇主要用作油墨、涂料和制藥工業(yè)過程中的溶劑或萃取劑，其消費量約占異丙醇總消費量的60%。 在化學(xué)中間體領(lǐng)域，我國異丙醇主要用于生產(chǎn)異丙胺、異丙醚以及一些酯類，其消費量約占異丙醇總消費量的25%。異丙醇在其他方面的應(yīng)用主要包括電子工業(yè)清洗劑、汽車防凍液、 消毒劑、洗滌用品、日化產(chǎn)品等，其消費量約占異丙醇總消費量的15%。異丙醇是石油化工發(fā)展史上從石油原料制得的第一個化工產(chǎn)品。目前工業(yè)上用的異丙醇仍是來自石油化工產(chǎn)品。從70年代起，由于石油危機(jī)，使各種醇類發(fā)酵生產(chǎn)成為研究熱點，如生物乙醇，生物丁醇及生物異丙醇。通過三十幾年的研究，解析了上述醇類的合成途徑及相關(guān)酶，為改造微生物生產(chǎn)生物異丙醇奠定了基礎(chǔ)。近年來，美國和日本的科學(xué)家先后在大腸桿菌建立異丙醇合成途徑，并得到可以利用葡萄糖產(chǎn)異丙醇的菌株。這種方法雖然避免了加劇化石能源短缺的問題，但大腸桿菌為異養(yǎng)菌，仍需利用葡萄糖生產(chǎn)異丙醇， 沒有解決發(fā)展生物能源與糧食問題的沖突，無法實現(xiàn)可再生能源的持續(xù)發(fā)展，因此可以直接利用太陽能的光合自養(yǎng)細(xì)菌藍(lán)藻是實現(xiàn)異丙醇生物合成的理想宿主。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用藍(lán)藻將(X)2生物轉(zhuǎn)化為異丙醇的技術(shù)。
本發(fā)明提供的重組藍(lán)藻，為如下(1)至(6)中的任意一種(1)將乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的編碼基因、乙酰乙酸脫羧酶的編碼基因和醇脫氫酶的編碼基因?qū)胨{(lán)藻的基因組DNA得到的產(chǎn)異丙醇的重組藍(lán)藻I ； (2)將乙酰乙酰輔酶 A轉(zhuǎn)移酶的編碼基因和乙酰乙酸脫羧酶的編碼基因?qū)胨{(lán)藻的基因組DNA得到的產(chǎn)丙酮的重組藍(lán)藻II ； (3)將醇脫氫酶的編碼基因?qū)胨霎a(chǎn)丙酮的重組藍(lán)藻II的基因組DNA得到的產(chǎn)異丙醇的重組藍(lán)藻III ； (4)將乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶的編碼基因、乙酰乙酰輔酶A 轉(zhuǎn)移酶的編碼基因、乙酰乙酸脫羧酶的編碼基因和醇脫氫酶的編碼基因?qū)胨{(lán)藻的基因組 DNA得到的產(chǎn)異丙醇的重組藍(lán)藻IV ； (5)將乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶的編碼基因、乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的編碼基因和乙酰乙酸脫羧酶的編碼基因?qū)胨{(lán)藻的基因組DNA得到的產(chǎn)丙酮的重組藍(lán)藻V ； (6)將醇脫氫酶的編碼基因?qū)胨霎a(chǎn)丙酮的重組藍(lán)藻V的基因組DNA得到的產(chǎn)異丙醇的重組藍(lán)藻VI。所述⑴或⑵或⑷或(5)中，所述乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶可為如下(a)或(b)(a)由序列表中序列6所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列6的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶功能的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。所述(1)或⑵或(4)或(5)中，所述乙酰乙酸脫羧酶可為如下(c)或(d)(c)由序列表中序列7所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(d)將序列表中序列7的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有乙酰乙酸脫羧酶功能的由(c)衍生的蛋白質(zhì)。所述⑴或(3)或(4)或(6)中，所述醇脫氫酶可為如下(e)或(f)(e)由序列表中序列8所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(f)將序列表中序列8的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有醇脫氫酶功能的由(e)衍生的蛋白質(zhì)。所述⑷或(5)中，所述乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶可為如下(g)或(h)(g)由序列表中序列12所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(h)將序列表中序列12的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶功能的由(g)衍生的蛋白質(zhì)。所述乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的編碼基因可為如下(I)、(II)或(III)(I)序列表中序列1自5，末端第427至1746位核苷酸所示的DNA分子；(II)在嚴(yán)格條件下與⑴限定的DNA雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；(III)與(I)限定的DNA序列有90%以上同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。所述乙酰乙酸脫羧酶的編碼基因可為如下(IV)、(V)或(VI)(IV)序列表中序列1自5，末端第1747至M81位核苷酸所示的DNA分子；(V)在嚴(yán)格條件下與(IV)限定的DNA雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；(VI)與(IV)限定的DNA序列有90%以上同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。所述醇脫氫酶的編碼基因可為如下(VII)、(VIII)或(IX)(VII)序列表中序列1自5，末端第M82至3537位核苷酸所示的DNA分子；(VIII)在嚴(yán)格條件下與(VII)限定的DNA雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；(IX)與(VII)限定的DNA序列有90%以上同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。
所述乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶的編碼基因可為如下(X)、(XI)或(XII)(X)序列表中序列9自5，末端第401至1579位核苷酸所示的DNA分子；(XI)在嚴(yán)格條件下與⑴限定的DNA雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；(XII)與⑴限定的DNA序列有90%以上同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。所述產(chǎn)異丙醇的重組藍(lán)藻I是將雙鏈DNA甲通過同源重組導(dǎo)入藍(lán)藻的基因組DNA 得到的；所述雙鏈DNA甲包括所述乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的編碼基因、所述乙酰乙酸脫羧酶的編碼基因和所述醇脫氫酶的編碼基因。所述雙鏈DNA甲的兩端分別具有所述藍(lán)藻的基因組DNA的同源臂。所述雙鏈DNA甲的兩端優(yōu)選具有聚-β羥基丁酸酯合成酶的編碼基因 (slrl829)的同源臂。所述雙鏈DNA甲上還具有篩選基因。所述篩選基因優(yōu)選為氯霉素抗性基因。得到所述產(chǎn)異丙醇的重組藍(lán)藻I的過程中，所述同源重組是通過將重組質(zhì)粒甲導(dǎo)入所述藍(lán)藻實現(xiàn)的；所述重組質(zhì)粒甲上攜帶所述雙鏈DNA甲。所述重組質(zhì)粒甲為以載體 PUC-18為骨架載體，在骨架載體的多克隆位點分別插入序列表的序列2自5’末端第9至 1653位核苷酸所示DNA和序列表的序列1自5，末端第7至3537位核苷酸所示DNA得到的重組質(zhì)粒。所述重組質(zhì)粒甲優(yōu)選為以載體PUC-18為骨架載體，在骨架載體的)(ba I位點插入序列表的序列2自5’末端第9至1653位核苷酸所示DNA，在骨架載體的Bam H I位點插入序列表的序列1自5’末端第7至3537位核苷酸所示DNA，得到的重組質(zhì)粒。所述產(chǎn)丙酮的重組藍(lán)藻II是將雙鏈DNA乙通過同源重組導(dǎo)入藍(lán)藻的基因組DNA 得到的；所述雙鏈DNA乙包括所述乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的編碼基因和所述乙酰乙酸脫羧酶的編碼基因。所述雙鏈DNA乙的兩端分別具有所述藍(lán)藻的基因組DNA的同源臂。所述雙鏈DNA乙的兩端優(yōu)選具有聚-β羥基丁酸酯合成酶(slrl^9)的編碼基因的同源臂。所述雙鏈DNA乙上還具有篩選基因。所述篩選基因優(yōu)選為氯霉素抗性基因。得到所述產(chǎn)丙酮的重組藍(lán)藻II的過程中，所述同源重組是通過將重組質(zhì)粒乙導(dǎo)入所述藍(lán)藻實現(xiàn)的；所述重組質(zhì)粒乙上攜帶所述雙鏈DNA乙。所述重組質(zhì)粒乙為以載體pUC-18為骨架載體，在骨架載體的多克隆位點分別插入序列表的序列2自5’末端第9至1653位核苷酸所示DNA和序列表的序列3自5’末端第7至M81位核苷酸所示DNA得到的重組質(zhì)粒。所述重組質(zhì)粒乙優(yōu)選為以載體pUC-18為骨架載體，在骨架載體的)(ba I位點插入序列表的序列2自5’末端第9至1653位核苷酸所示DNA，在骨架載體的Bam H I位點插入序列表的序列3自5’末端第7至M81位核苷酸所示DNA，得到的重組質(zhì)粒。所述產(chǎn)異丙醇的重組藍(lán)藻III是將雙鏈DNA丙通過同源重組導(dǎo)入所述產(chǎn)丙酮的重組藍(lán)藻II的基因組DNA得到的；所述雙鏈DNA丙包括所述醇脫氫酶的編碼基因。所述雙鏈 DNA丙的兩端優(yōu)選具有谷氨酰胺酶的編碼基因(slr2079)的同源臂。所述雙鏈DNA丙的兩端分別具有所述藍(lán)藻的基因組DNA的同源臂。所述雙鏈DNA丙上還具有篩選基因。所述篩選基因優(yōu)選為卡那霉素抗性基因。得到所述產(chǎn)異丙醇的重組藍(lán)藻III的過程中，所述同源重組是通過將重組質(zhì)粒丙導(dǎo)入所述產(chǎn)丙酮的重組藍(lán)藻II實現(xiàn)的；所述重組質(zhì)粒丙上攜帶所述雙鏈DNA丙。所述重組質(zhì)粒丙為以載體pUC-18為骨架載體，在骨架載體的多克隆位點分別插入序列表的序列4自5’末端第7至1320位核苷酸所示DNA和序列表的序列5自 5’末端第7至1472位核苷酸所示DNA得到的重組質(zhì)粒。所述重組質(zhì)粒丙優(yōu)選為以載體 pUC-18為骨架載體，在骨架載體的)(ba I位點插入序列表的序列4自5’末端第7至1320 位核苷酸所示DNA，在骨架載體的Bam H I位點插入序列5自5’末端第7至1472位核苷酸，得到的重組質(zhì)粒。 所述產(chǎn)異丙醇的重組藍(lán)藻IV是將雙鏈DNA 丁通過同源重組導(dǎo)入藍(lán)藻的基因組DNA 得到的；所述雙鏈DNA 丁包括所述乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶的編碼基因、所述乙酰乙酰輔酶A 轉(zhuǎn)移酶的編碼基因、所述乙酰乙酸脫羧酶的編碼基因和所述醇脫氫酶的編碼基因。所述雙鏈DNA 丁的兩端分別具有所述藍(lán)藻的基因組DNA的同源臂。所述雙鏈DNA 丁的兩端優(yōu)選具有Genbank Accession NO. SYNPCC7002_A1630基因的同源臂。所述雙鏈DNA 丁上還具有篩選基因。所述篩選基因優(yōu)選為氯霉素抗性基因。得到所述產(chǎn)異丙醇的重組藍(lán)藻IV的過程中，所述同源重組是通過將重組質(zhì)粒丁導(dǎo)入所述藍(lán)藻實現(xiàn)的；所述重組質(zhì)粒丁上攜帶所述雙鏈DNA 丁。所述重組質(zhì)粒丁為在pMD-18T中插入序列表的序列9自5，末端第1至6141 位核苷酸所示DNA得到的重組質(zhì)粒。 所述產(chǎn)丙酮的重組藍(lán)藻V是將雙鏈DNA戊通過同源重組導(dǎo)入藍(lán)藻的基因組DNA得到的；所述雙鏈DNA戊包括所述乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶的編碼基因、所述乙酰乙酰輔酶A 轉(zhuǎn)移酶的編碼基因和所述乙酰乙酸脫羧酶的編碼基因。所述雙鏈DNA戊的兩端分別具有所述藍(lán)藻的基因組DNA的同源臂。所述雙鏈DNA戊的兩端優(yōu)選具有Genbank Accession NO. SYNPCC7002_A1630基因的同源臂。所述雙鏈DNA戊上還具有篩選基因。所述篩選基因優(yōu)選為氯霉素抗性基因。得到所述產(chǎn)丙酮的重組藍(lán)藻V的過程中，所述同源重組是通過將重組質(zhì)粒戊導(dǎo)入所述藍(lán)藻實現(xiàn)的；所述重組質(zhì)粒戊上攜帶所述雙鏈DNA戊。所述重組質(zhì)粒戊為在pMD-18T中插入序列表的序列10自5，末端第1至5085位核苷酸所示DNA得到的重組質(zhì)粒。所述產(chǎn)異丙醇的重組藍(lán)藻VI是將雙鏈DNA已通過同源重組導(dǎo)入所述產(chǎn)丙酮的重組藍(lán)藻V的基因組DNA得到的；所述雙鏈DNA已包括所述醇脫氫酶的編碼基因。所述雙鏈 DNA已的兩端分別具有所述藍(lán)藻的基因組DNA的同源臂。所述雙鏈DNA已的兩端優(yōu)選具有 GenbankAccession NO. SYNPCC7002_A0909基因的同源臂。所述雙鏈DNA已上還具有篩選基因。所述篩選基因優(yōu)選為卡那霉素抗性基因。得到所述產(chǎn)異丙醇的重組藍(lán)藻VI的過程中， 所述同源重組是通過將重組質(zhì)粒已導(dǎo)入所述產(chǎn)丙酮的重組藍(lán)藻V實現(xiàn)的；所述重組質(zhì)粒已上攜帶所述雙鏈DNA已。所述重組質(zhì)粒已為在pMD-18T中插入序列表的序列11自5，末端第1至觀99位核苷酸所示DNA得到的重組質(zhì)粒。所述藍(lán)藻具體可為淡水藍(lán)藻集胞藻6803或海水藍(lán)藻聚球藻7002。所述重組藍(lán)藻可用于生產(chǎn)異丙醇和/或丙酮。本發(fā)明提供了用藍(lán)藻生物合成異丙醇的新思路和方法。在藍(lán)藻中建立的異丙醇合成途徑如圖1所示。乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶可以是藍(lán)藻內(nèi)源酶，也可以是來源于梭菌、大腸桿菌或其它微生物的同工酶，本發(fā)明優(yōu)選來自藍(lán)藻內(nèi)源和丙酮丁酸梭菌的乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶。乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶可以是來自梭菌、大腸桿菌或其它微生物或具有催化輔酶A 轉(zhuǎn)移功能的同工酶，本發(fā)明優(yōu)選來自丙酮丁酸梭菌的乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶。乙酰乙酸脫羧酶可為來自梭菌或其它微生物的同工酶，本發(fā)明優(yōu)選來自丙酮丁酸梭菌的乙酰乙酸脫羧酶。醇脫氫酶可來自梭菌、大腸桿菌或其它微生物的同工酶，本發(fā)明優(yōu)選來自拜氏梭菌的醇脫氫酶。藍(lán)藻可以淡水藍(lán)藻或海水藍(lán)藻中任何一種藍(lán)藻或其它光合自養(yǎng)細(xì)菌，本發(fā)明中優(yōu)選淡水藍(lán)藻集胞藻6803和海水藍(lán)藻聚球藻7002。本發(fā)明的突出優(yōu)點在于利用光合自養(yǎng)微生物藍(lán)藻將地球上取之不盡的太陽能和溫室氣體二氧化碳轉(zhuǎn)化為化工產(chǎn)品異丙醇，即通過藍(lán)藻對太陽能和工業(yè)廢氣二氧化碳的利用，實現(xiàn)化工產(chǎn)品異丙醇的生產(chǎn)，避免了在能源再生過程中對糧食等有機(jī)物的使用，同時又可以利用海水和二氧化碳有利于環(huán)境。因此，利用本發(fā)明的重組藍(lán)藻來生產(chǎn)丙酮和異丙醇是實現(xiàn)可再生清潔能源持續(xù)、健康發(fā)展的理想途徑之一。


圖1在藍(lán)藻中建立合成異丙醇的代謝途徑設(shè)計圖。圖2為重組藍(lán)藻S. M3鑒定圖。圖3為HPLC檢測重組藍(lán)藻S. M3發(fā)酵液中產(chǎn)物異丙醇。圖4為重組藍(lán)藻S. M4鑒定圖。圖5為HPLC檢測重組藍(lán)藻S. M4發(fā)酵液中產(chǎn)物丙酮。圖6為重組藍(lán)藻S. M5鑒定圖。圖7為HPLC檢測重組藍(lán)藻S. M5發(fā)酵液中產(chǎn)物異丙醇。圖8為重組藍(lán)藻S. M6鑒定圖。圖9為HPLC檢測重組藍(lán)藻S. M6發(fā)酵液中產(chǎn)物異丙醇。圖10為重組藍(lán)藻S. M7鑒定圖。圖11為HPLC檢測重組藍(lán)藻S. M7發(fā)酵液中產(chǎn)物丙酮。圖12為重組藍(lán)藻S. M8鑒定圖。圖13為HPLC檢測重組藍(lán)藻S. M8發(fā)酵液中產(chǎn)物異丙醇。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。NRRL為美國農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心。ATCC為美國典型微生物菌種保藏中心。大腸桿菌(E.Coli)DH5a購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。載體pUC_18:購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。PMD-18T:購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。拜氏梭菌 (Clostridium bei jerinckii)購自 NRRL，NRRL 編號為 B593。丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)購自 ATCC，ATCC 編號為 824。淡水藍(lán)藻集胞藻6803(Synechocystis sp. PCC 680 屬于色球藻科、集胞藻屬；參考文獻(xiàn)Zhang S, Spann Kff, et al. Identification of two genes, sll0804and slrl306, as putative components of the C02-concentrating mechanism in the cyanobacterium Synechocystis sp.strain PCC 6803.J Bacteriol. 2008190 :8234-7。海水藍(lán)藻聚球藻7002(Synechococcus sp. PCC 700 屬于色球藻科、聚球藻屬； 參考文獻(xiàn)Cantrell A and Bryant DA. Molecular cloning and nucleotide sequence of the psaA and psaB genes of the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002. Plant Mol Biol. 19879 :453_468。質(zhì)粒 pRL271 :參考文獻(xiàn)Wei TF, Ramasubramanian TS, et al. Anabaena sp. strain PCC7120 ntcA Gene required for growth on nitrate and heterocystdevelopment. JBacteriol. 1994，176 :4473-4482.。藍(lán)藻表達(dá)載體pAM2770 參考文獻(xiàn):ffu X，Li Dff, et al. The Anabaena sp. strain PCC 7120asrl734 gene encodes a negative regulator of heterocyst Development. Molecul Microbiol. 2007,64 :782-794.。BG-Il培養(yǎng)基組成見表1。Trace metal mix A5組成見表2。表1BG-11培養(yǎng)基組成
權(quán)利要求
1.重組藍(lán)藻，為如下(1)至(6)中的任意一種(1)將乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的編碼基因、乙酰乙酸脫羧酶的編碼基因和醇脫氫酶的編碼基因?qū)胨{(lán)藻的基因組DNA得到的產(chǎn)異丙醇的重組藍(lán)藻I ；(2)將乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的編碼基因和乙酰乙酸脫羧酶的編碼基因?qū)胨{(lán)藻的基因組DNA得到的產(chǎn)丙酮的重組藍(lán)藻II ；(3)將醇脫氫酶的編碼基因?qū)胨霎a(chǎn)丙酮的重組藍(lán)藻II的基因組DNA得到的產(chǎn)異丙醇的重組藍(lán)藻III ；(4)將乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶的編碼基因、乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的編碼基因、乙酰乙酸脫羧酶的編碼基因和醇脫氫酶的編碼基因?qū)胨{(lán)藻的基因組DNA得到的產(chǎn)異丙醇的重組藍(lán)藻IV ；(5)將乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶的編碼基因、乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的編碼基因和乙酰乙酸脫羧酶的編碼基因?qū)胨{(lán)藻的基因組DNA得到的產(chǎn)丙酮的重組藍(lán)藻V ；(6)將醇脫氫酶的編碼基因?qū)胨霎a(chǎn)丙酮的重組藍(lán)藻V的基因組DNA得到的產(chǎn)異丙醇的重組藍(lán)藻VI。
2.如權(quán)利要求1所述的重組藍(lán)藻，其特征在于所述⑴或⑵或⑷或(5)中，所述乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶為如下(a)或(b)(a)由序列表中序列6所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列6的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和 /或添加且具有乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶功能的由(a)衍生的蛋白質(zhì)；所述⑴或⑵或⑷或(5)中，所述乙酰乙酸脫羧酶為如下(c)或⑷(c)由序列表中序列7所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(d)將序列表中序列7的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和 /或添加且具有乙酰乙酸脫羧酶功能的由(c)衍生的蛋白質(zhì)；所述⑴或⑶或⑷或(6)中，所述醇脫氫酶為如下(e)或(f)(e)由序列表中序列8所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(f)將序列表中序列8的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和 /或添加且具有醇脫氫酶功能的由(e)衍生的蛋白質(zhì)；所述⑷或(5)中，所述乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶為如下(g)或(h)(g)由序列表中序列12所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(h)將序列表中序列12的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和 /或添加且具有乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶功能的由(g)衍生的蛋白質(zhì)。
3.如權(quán)利要求2所述的重組藍(lán)藻，其特征在于所述乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的編碼基因為如下(I)、(II)或(III)(I)序列表中序列1自5，末端第427至1746位核苷酸所示的DNA分子；(II)在嚴(yán)格條件下與(I)限定的DNA雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；(III)與(I)限定的DNA序列有90%以上同源性且編碼所述蛋白的DNA分子；所述乙酰乙酸脫羧酶的編碼基因為如下(IV)、(V)或(VI)(IV)序列表中序列1自5，末端第1747至M81位核苷酸所示的DNA分子；(V)在嚴(yán)格條件下與(IV)限定的DNA雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；(VI)與(IV)限定的DNA序列有90%以上同源性且編碼所述蛋白的DNA分子； 所述醇脫氫酶的編碼基因為如下(VII)、(VIII)或(IX)(VII)序列表中序列1自5，末端第M82至3537位核苷酸所示的DNA分子；(VIII)在嚴(yán)格條件下與(VII)限定的DNA雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；(IX)與(VII)限定的DNA序列有90%以上同源性且編碼所述蛋白的DNA分子； 所述乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶的編碼基因為如下(X)、(XI)或(XII)(X)序列表中序列9自5’末端第401至1579位核苷酸所示的DNA分子；(XI)在嚴(yán)格條件下與(X)限定的DNA雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；(XII)與⑴限定的DNA序列有90%以上同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。
4.如權(quán)利要求1至3中任一所述的重組藍(lán)藻，其特征在于所述產(chǎn)異丙醇的重組藍(lán)藻I是將雙鏈DNA甲通過同源重組導(dǎo)入藍(lán)藻的基因組DNA得到的；所述雙鏈DNA甲包括所述乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的編碼基因、所述乙酰乙酸脫羧酶的編碼基因和所述醇脫氫酶的編碼基因；所述產(chǎn)丙酮的重組藍(lán)藻II是將雙鏈DNA乙通過同源重組導(dǎo)入藍(lán)藻的基因組DNA得到的；所述雙鏈DNA乙包括所述乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的編碼基因和所述乙酰乙酸脫羧酶的編碼基因；所述產(chǎn)異丙醇的重組藍(lán)藻III是將雙鏈DNA丙通過同源重組導(dǎo)入所述產(chǎn)丙酮的重組藍(lán)藻II的基因組DNA得到的；所述雙鏈DNA丙包括所述醇脫氫酶的編碼基因；所述產(chǎn)異丙醇的重組藍(lán)藻IV是將雙鏈DNA 丁通過同源重組導(dǎo)入藍(lán)藻的基因組DNA得到的；所述雙鏈DNA 丁包括所述乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶的編碼基因、所述乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的編碼基因、所述乙酰乙酸脫羧酶的編碼基因和所述醇脫氫酶的編碼基因；所述產(chǎn)丙酮的重組藍(lán)藻V是將雙鏈DNA戊通過同源重組導(dǎo)入藍(lán)藻的基因組DNA得到的；所述雙鏈DNA戊包括所述乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶的編碼基因、所述乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的編碼基因和所述乙酰乙酸脫羧酶的編碼基因；所述產(chǎn)異丙醇的重組藍(lán)藻VI是將雙鏈DNA已通過同源重組導(dǎo)入所述產(chǎn)丙酮的重組藍(lán)藻V的基因組DNA得到的；所述雙鏈DNA已包括所述醇脫氫酶的編碼基因。
5.如權(quán)利要求4所述的重組藍(lán)藻，其特征在于所述雙鏈DNA甲的兩端分別具有所述藍(lán)藻的基因組DNA的同源臂；所述雙鏈DNA乙的兩端分別具有所述藍(lán)藻的基因組DNA的同源臂；所述雙鏈DNA丙的兩端分別具有所述藍(lán)藻的基因組DNA的同源臂；所述雙鏈DNA 丁的兩端分別具有所述藍(lán)藻的基因組DNA的同源臂； 所述雙鏈DNA戊的兩端分別具有所述藍(lán)藻的基因組DNA的同源臂；所述雙鏈DNA已的兩端分別具有所述藍(lán)藻的基因組DNA的同源臂；所述雙鏈DNA甲的兩端優(yōu)選具有聚羥基丁酸酯合成酶的編碼基因的同源臂；所述雙鏈DNA乙的兩端優(yōu)選具有聚-β羥基丁酸酯合成酶的編碼基因的同源臂；所述雙鏈 DNA丙的兩端優(yōu)選具有谷氨酰胺酶的編碼基因的同源臂；所述雙鏈DNA 丁的兩端優(yōu)選具有 Genbank Accession NO. SYNPCC7002_A1630基因的同源臂；所述雙鏈DNA戊的兩端優(yōu)選具有Genbank Accession NO. SYNPCC7002_A1630基因的同源臂；所述雙鏈DNA已的兩端優(yōu)選具有 Genbank Accession NO. SYNPCC7002_A0909 基因的同源臂。
6.如權(quán)利要求4或5所述的重組藍(lán)藻，其特征在于所述雙鏈DNA甲上還具有篩選基因，所述篩選基因優(yōu)選為氯霉素抗性基因；所述雙鏈DNA乙上還具有篩選基因，所述篩選基因優(yōu)選為氯霉素抗性基因；所述雙鏈DNA丙上還具有篩選基因，所述篩選基因優(yōu)選為卡那霉素抗性基因；所述雙鏈DNA 丁上還具有篩選基因，所述篩選基因優(yōu)選為氯霉素抗性基因； 所述雙鏈DNA戊上還具有篩選基因，所述篩選基因優(yōu)選為氯霉素抗性基因；所述雙鏈DNA已上還具有篩選基因，所述篩選基因優(yōu)選為卡那霉素抗性基因。
7.如權(quán)利要求4或5或6所述的重組藍(lán)藻，其特征在于得到所述產(chǎn)異丙醇的重組藍(lán)藻I的過程中，所述同源重組是通過將重組質(zhì)粒甲導(dǎo)入所述藍(lán)藻實現(xiàn)的；所述重組質(zhì)粒甲上攜帶所述雙鏈DNA甲；得到所述產(chǎn)丙酮的重組藍(lán)藻II的過程中，所述同源重組是通過將重組質(zhì)粒乙導(dǎo)入所述藍(lán)藻實現(xiàn)的；所述重組質(zhì)粒乙上攜帶所述雙鏈DNA乙；得到所述產(chǎn)異丙醇的重組藍(lán)藻III的過程中，所述同源重組是通過將重組質(zhì)粒丙導(dǎo)入所述產(chǎn)丙酮的重組藍(lán)藻II實現(xiàn)的；所述重組質(zhì)粒丙上攜帶所述雙鏈DNA丙；得到所述產(chǎn)異丙醇的重組藍(lán)藻IV的過程中，所述同源重組是通過將重組質(zhì)粒丁導(dǎo)入所述藍(lán)藻實現(xiàn)的；所述重組質(zhì)粒丁上攜帶所述雙鏈DNA ??；得到所述產(chǎn)丙酮的重組藍(lán)藻V的過程中，所述同源重組是通過將重組質(zhì)粒戊導(dǎo)入所述藍(lán)藻實現(xiàn)的；所述重組質(zhì)粒戊上攜帶所述雙鏈DNA戊；得到所述產(chǎn)異丙醇的重組藍(lán)藻VI的過程中，所述同源重組是通過將重組質(zhì)粒已導(dǎo)入所述產(chǎn)丙酮的重組藍(lán)藻V實現(xiàn)的；所述重組質(zhì)粒已上攜帶所述雙鏈DNA已。
8.如權(quán)利要求7所述的重組藍(lán)藻，其特征在于所述重組質(zhì)粒甲為以載體pUC-18為骨架載體，在骨架載體的多克隆位點分別插入序列表的序列2自5’末端第9至1653位核苷酸所示DNA和序列表的序列1自5’末端第7 至3537位核苷酸所示DNA得到的重組質(zhì)粒；所述重組質(zhì)粒甲優(yōu)選為以載體pUC_18為骨架載體，在骨架載體的)Cba I位點插入序列表的序列2自5’末端第9至1653位核苷酸所示 DNA，在骨架載體的Bam H I位點插入序列表的序列1自5’末端第7至3537位核苷酸所示 DNA，得到的重組質(zhì)粒；所述重組質(zhì)粒乙為以載體pUC-18為骨架載體，在骨架載體的多克隆位點分別插入序列表的序列2自5’末端第9至1653位核苷酸所示DNA和序列表的序列3自5’末端第7 至對81位核苷酸所示DNA得到的重組質(zhì)粒；所述重組質(zhì)粒乙優(yōu)選為以載體pUC-18為骨架載體，在骨架載體的)Cba I位點插入序列表的序列2自5’末端第9至1653位核苷酸所示 DNA，在骨架載體的Bam H I位點插入序列表的序列3自5’末端第7至M81位核苷酸所示 DNA，得到的重組質(zhì)粒；所述重組質(zhì)粒丙為以載體pUC-18為骨架載體，在骨架載體的多克隆位點分別插入序列表的序列4自5’末端第7至1320位核苷酸所示DNA和序列表的序列5自5’末端第7 至1472位核苷酸所示DNA得到的重組質(zhì)粒；所述重組質(zhì)粒丙優(yōu)選為以載體pUC-18為骨架載體，在骨架載體的)Cba I位點插入序列表的序列4自5’末端第7至1320位核苷酸所示 DNA，在骨架載體的Bam H I位點插入序列5自5’末端第7至1472位核苷酸，得到的重組質(zhì)粒；所述重組質(zhì)粒丁為在PMD-18T中插入序列表的序列9自5，末端第1至6141位核苷酸所示DNA得到的重組質(zhì)粒；所述重組質(zhì)粒戊為在PMD-18T中插入序列表的序列10自5，末端第1至5085位核苷酸所示DNA得到的重組質(zhì)粒；所述重組質(zhì)粒已為在PMD-18T中插入序列表的序列11自5，末端第1至觀99位核苷酸所示DNA得到的重組質(zhì)粒。
9.如權(quán)利要求1至8中任一所述的重組藍(lán)藻，其特征在于所述藍(lán)藻為淡水藍(lán)藻集胞藻6803或海水藍(lán)藻聚球藻7002。
10.權(quán)利要求1至9中任一所述的重組藍(lán)藻在生產(chǎn)異丙醇和/或丙酮中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用藍(lán)藻將CO2生物轉(zhuǎn)化為異丙醇的技術(shù)。本發(fā)明提供了如下6種方法制備的重組藍(lán)藻(1)將輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因、乙酰乙酸脫羧酶基因和醇脫氫酶基因?qū)胨{(lán)藻(2)將輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因和乙酰乙酸脫羧酶基因?qū)胨{(lán)藻；(3)將醇脫氫酶的編碼基因?qū)?2)所述重組藍(lán)藻；(4)將乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶基因、乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因、乙酰乙酸脫羧酶基因和醇脫氫酶基因?qū)胨{(lán)藻；(5)將乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶基因、乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因和乙酰乙酸脫羧酶基因?qū)胨{(lán)藻；(6)將醇脫氫酶基因?qū)?5)所述產(chǎn)丙酮的重組藍(lán)藻。利用本發(fā)明重組藍(lán)藻來生產(chǎn)丙酮和異丙醇是實現(xiàn)可再生清潔能源持續(xù)、健康發(fā)展的理想途徑之一。
文檔編號C12N15/63GK102181368SQ201110038190
公開日2011年9月14日 申請日期2011年2月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月15日
發(fā)明者周杰, 張延平, 張海峰, 李寅 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所