專利名稱：一種蟬擬青霉菌株的鑒定方法
技術(shù)領域：
本專利涉及分子生物學技術(shù)領域，具體涉及保藏號為CGMCC No. 3453的蟬擬青霉菌株的鑒定方法。
背景技術(shù)：
蟬花，別名蟲花，是某些蟬若蟲受蟬擬青霉菌寄生后的產(chǎn)物，是ー種菌蟲復合體。此菌于1838年由Miquel定名為蝶棒束孢霉Isaria cicadae。此后出現(xiàn)多種同物異名。如蝶卓 Cordyceps cicadae,基生_束抱 Isaria basiIi,羊克糴球殼抱 Sphaeria sinclairii, 叢生蟲殼菌Torrubia caespitosa,辛克萊蟲草Cordyceps sinclairii,哈里棒束抱Isariahariottii,小蝶鸞Cordyceps sobolifera,辛克萊棒束抱 Isaria sinclairii,蒙克蘇棒束抱 Isaria mokanshawii 和多枝棒束抱 Isaria arbuscula 等等。蝶擬青霉的有性階段被認為是大蝶草Cordyceps cicadae,在自然界廣為分布的是蟬擬青霉，大蟬草稀少。常采到的是蟬擬青霉及其寄主山蟬若蟲寄生后的復合體。根據(jù)歷史產(chǎn)區(qū)浙江的1467份樣品的調(diào)查，藥材蟬花主要是蟬擬青霉寄生后的蟲菌復合體。蟬擬青霉屬半知菌類真菌，其孢梗束自蟲體頭部長出，單生或叢聚成束，淺黃色，長I. 5 8. O厘米，前端膨大，呈紡錘形或呈雞冠花狀。本發(fā)明所涉及的蝶擬青霉菌株[Paecilomyces cicadae (Miq. ) Samson]已于2009年11月18日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)注冊保藏，保藏號為 CGMCC No. 3453。該蝶擬青霉菌株[Paecilomyces cicadae (Miq. ) Samson]采用如下方法進行分離從云南三江源頭采集純凈無污染野生蟬花標本，在浄化工作臺上用火焰滅菌過的移植鑷從樣本上取少量分生孢子于加入孟加拉紅的PSA平板上置22°C -25°C下培養(yǎng)120h后再挑取單菌落接入斜面培養(yǎng)基，在22°C _25°C下培養(yǎng)并經(jīng)反復純化即可得本發(fā)明所述的蟲單擬青霉菌株[Paecilomyces cicadae (Miq. ) Samson]。蝶擬青霉菌株P(guān)aecilomyces cicadae (Miq. ) Samson CGMCC No. 3453 屬于半知菌亞門Deuteromycotina,絲抱綱Hyphomycetes,束梗抱目Stilbellales,束梗抱科Stilbellaceae,擬青霉屬Paecilomyces。其主要形態(tài)特征為在PDA培養(yǎng)基上25°C培養(yǎng)10天，菌落圓形，平展，初絮狀，后粉狀，白色至淺黃色，背面淺黃色，直徑5 6厘米。菌絲無色，分枝，具隔膜，寬I. 2 2.5 μ m。分生孢子梗多分枝，寬3. O 5. 5 μ m，由每輪2 5個產(chǎn)孢細胞組成輪狀分枝。產(chǎn)孢細胞瓶形，基部球狀膨大，向上變細窄，4. 5 6. 5 X 2. 5 3. 5 μ m。分生孢子圓柱形，單細胞，無色，平滑，鏈生，直或彎曲，6. 5 8. 8( 11. O) X2. 5 3. 5 μ m。蝶擬青霉菌株P(guān)aecilomyces cicadae (Miq. ) Samson CGMCC No. 3453 經(jīng)試驗證實其培養(yǎng)物具有易于培養(yǎng)、產(chǎn)量高的特點，其培養(yǎng)產(chǎn)物具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、降血糖、降血月旨、降血壓、明目、抗輻射、解熱鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜催眠、滋補強壯、改善腎功能等功能，因此具有廣泛的エ業(yè)化應用價值。由于地理來源不同、寄主不同的蟬擬青霉菌株，其次生代謝產(chǎn)物方面具有較大的變異性。但是現(xiàn)有的蟬擬青霉鑒定方法是通過菌體形態(tài)，生長特性及生理反應的特征進行鑒定的，這些形態(tài)學鑒定的方法受環(huán)境因素影響，難以對形態(tài)差異較小的種間和種內(nèi)菌株加以鑒別。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用RAPD (random amplified polymorphic DNA隨機擴增多態(tài)性DNA標記)技術(shù)鑒定蝶擬青霉菌株P(guān)aecilomyces cicadae (Miq. ) Samson CGMCCNo. 3453的方法，以及特定引物和反應條件下蟬擬青霉菌株CGMCC No. 3453的RAPD條帶圖
-i'Tfe レ曰。本發(fā)明公開了一種鑒定 !單擬青霉菌株P(guān)aecilomyces cicadae (Miq. ) SamsonCGMCCNo. 3453的方法，包括下列步驟I)提取待檢菌株的DNA ；2)對步驟I)獲得的待檢菌株DNA分別采用下列引物進行PCR擴增S6 TGCTCTGCCC ；SlO CTGCTGGGAC ；S31 CAATCGCCTG ；OPV-14 AGATCCCGCC ；0PW-06 AGGCCCGATG ；3)將步驟2)獲得的擴增產(chǎn)物分別經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后獲得待檢菌株的RAH)條帶圖譜；4)將步驟3)獲得的待檢菌株的RAPD條帶圖譜與標準樣本的RAPD條帶圖譜比較
判定獲得鑒定結(jié)果。進ー步的，步驟2)的引物還包括以下引物中的ー種或多種S7 GGTGACGCAG ；S33 CAGCACCCAC ；S69 CTCACCGTCC ；0PC-10 TGTCTGGGTG ；0PF-06 GGGAATTCGG ；0PG-03 GAGCCCTCCA ；OPH-18 GAATCGGCCA ；0PH-20 :GGGAGACATC。進ー步的，所述步驟2)所采用的PCR擴增反應體系如下總體積25ul，DNA樣本20-50ng,Mg2+ 50n mol,dNTP 5n mol，引物IOp mol，Taq 酶1. 5U (如 TAKARA Ex Taq)，酶反應緩沖液2. 5ul (如TAKARA Ex Taq Buffer)，加雙蒸水至25ul。進ー步的，所述步驟2)所采用的PCR擴增反應條件如下先95°C 3分鐘；而后依次95°C 40秒，560C I分鐘，72°C 2分鐘，共循環(huán)40次；然后72°C延伸5分鐘，最后降溫至4で。
進ー步的，所述步驟4)中，將步驟3)獲得的待檢菌株RAH)條帶圖譜與標準樣本的RAPD條帶圖譜比較，如兩者相似度為95%以上，則鑒定待檢菌株為蟬擬青霉菌株P(guān)aecilomyces cicadae(Miq. ) Samson CGMCC No. 3453。所述相似度的計算方法為F = 2NXY/(Νχ+Νγ)*100% (其中F為相似度，Nxy為待檢菌株RAPD條帶圖譜與標準樣本的RAPD條帶圖譜比較后二者相同的條帶數(shù)，Nx為待檢菌株RAPD條帶圖譜擁有的條帶數(shù)，Ny為標準樣本的RAPD條帶圖譜擁有的條帶數(shù))。采用本發(fā)明的鑒定方法，可快速、準確地鑒定蟬擬青霉菌株CGMCC No. 3453，并且不受環(huán)境影響。


圖I :各引物對應的標準樣本的RAPD條帶圖譜I :S6為引物RAPD條帶圖譜，泳道I為BA001的PCR結(jié)果，泳道M為Maker，條帶按照分子量大小順序依次是:23130bp，9416bp，6557bp，2322bp，2027bp，IOOObp,900bp,800bp,700bp，600bp，500bp，400bp。BAOOl 的 RAPD 條帶大小估算為 6500 6000bp 之間，5500 4700bp 之間，2600 2300bp 之間，2000 1800bp 之間，1700 1600bp 之間，1450 1350bp之間，1300 1200bp之間。2 :S7為引物RAPD條帶圖譜，泳道I為BA001的PCR結(jié)果，泳道M為Maker，條帶按照分子量大小順序依次是23130bp,9416bp,6557bp, 2322bp, 2027bp, 1000bp, 900bp, 800bp,700bp，600bp，500bp，400bp。BAOOl 的 RAPD 條帶大小估算為 4700 3700bp 之間，2000 1800bp 之間，1550 1400bp 之間，1350 1200bp 之間，790 720bp 之間。3 :S10為引物RAPD條帶圖譜，泳道I為BA001的PCR結(jié)果，泳道M為Maker，條帶按照分子量大小順序依次是23130bp，9416bp，6557bp，2322bp，2027bp，1000bp，900bp，800bp，700bp，600bp，500bp，400bp。BAOOl 的 RAPD 條帶大小估算為 5700 5200bp 之間，4800 4300bp 之間，2300 2050bp之間，2000 1900bp之間，1850 1700bp 之間，1350 1200bp 之間，920 880bp 之間，830 790bp 之間，740 700bp 之間，450 410bp 之間。4 S31為引物RAPD條帶圖譜，泳道I為BA001的PCR結(jié)果，泳道M為Maker，條帶按照分子量大小順序依次是23130bp，9416bp，6557bp，2322bp，2027bp，1000bp，900bp，800bp，700bp，600bp，500bp，400bp。BAOOl 的 RAPD 條帶大小估算為 8100 6900bp 之間，4700 3300bp 之間，2200 1800bp 之間，1650 1300bp 之間，1200 IIOObp 之間，870 830bp之間，690 650bp之間。5 :S33為引物RAPD條帶圖譜，泳道I為BA001的PCR結(jié)果，泳道M為Maker，條帶按照分子量大小順序依次是23130bp，9416bp，6557bp，2322bp，2027bp，1000bp，900bp，800bp，700bp，600bp，500bp，400bp。BAOOl 的 RAPD 條帶大小估算為 5000 4000bp 之間，2800 2300bp 之間，2150 200bp 之間，1750 1550bp 之間，1500 1380bp 之間，1200 1050bp 之間，900 850bp 之間。6 S69為引物RAPD條帶圖譜，泳道I為BA001的PCR結(jié)果，泳道M為Maker，條帶按照分子量大小順序依次是23130bp，9416bp，6557bp，2322bp，2027bp，1000bp，900bp，800bp, 700bp,600bp, 500bp，400bp。BAOOl 的 RAPD 條帶大小估算為 45000 35000bp 之間， 6000 4300bp 之間，2900 2300bp 之間，2130 1900bp 之間，1500 1270bp 之間，400 380bp之間。7 0PC-10為引物RAPD條帶圖譜，泳道I為BA001的PCR結(jié)果，泳道M為Maker，條帶按照分子量大小順序依次是23130bp，9416bp，6557bp，2322bp, 2027bp, IOOObp, 900bp,800bp，700bp，600bp，500bp，400bp。BAOOl 的 RAPD 條帶大小估算為 5000 4300bp 之間，3800 3300bp 之間，2000 1750bp 之間，900 850bp 之間，750 800bp 之間。8 0PF-06為引物RAPD條帶圖譜，泳道I為BA001的PCR結(jié)果，泳道M為Maker，條帶按照分子量大小順序依次是23130bp，9416bp，6557bp，2322bp, 2027bp, IOOObp, 900bp,800bp，700bp，600bp，500bp，400bp。BAOOl 的 RAPD 條帶大小估算為 65000 50000bp 之間，6500 4800bp 之間，4300 3800bp 之間，2500 2300bp 之間，1850 1600bp 之間， 1250 1050bp 之間。9 0PG-03為引物RAPD條帶圖譜，泳道I為BA001的PCR結(jié)果，泳道M為Maker，條帶按照分子量大小順序依次是23130bp，9416bp，6557bp，2322bp, 2027bp, IOOObp, 900bp,800bp，700bp，600bp，500bp，400bp。BAOOl 的 RAPD 條帶大小估算為 4700 4300bp 之間，4000 2800bp 之間，2400 2050bp 之間，1900 1700bp 之間，1080 IOOObp 之間。10 :0PH-18為引物RAPD條帶圖譜，泳道I為BA001的PCR結(jié)果，泳道M為Maker，條帶按照分子量大小順序依次是23130bp，9416bp，6557bp，2322bp, 2027bp, IOOObp, 900bp,800bp，700bp，600bp，500bp，400bp。BAOOl 的 RAPD 條帶大小估算為 4300 3600bp 之間，2600 2300bp 之間，1950 1750bp 之間，1650 1350bp 之間，1020 970bp 之間，750 720bp之間，560 540bp之間。11 :0PH-20為引物RAPD條帶圖譜，泳道I為BA001的PCR結(jié)果，泳道M為Maker，條帶按照分子量大小順序依次是23130bp，9416bp，6557bp，2322bp, 2027bp, IOOObp, 900bp,800bp，700bp，600bp，500bp，400bp。BAOOl 的 RAPD 條帶大小估算為 5500 4300bp 之間，3500 3100bp 之間，2700 2400bp 之間，2350 2280bp之間，1830 1600bp 之間，1050 980bp之間，650 620bp之間，440 420bp之間。12 :0PV-14為引物RAPD條帶圖譜，泳道I為BA001的PCR結(jié)果，泳道M為Maker，條帶按照分子量大小順序依次是23130bp，9416bp，6557bp，2322bp, 2027bp, IOOObp, 900bp,800bp，700bp，600bp，500bp，400bp。BAOOl 的 RAPD 條帶大小估算為 6400 4700bp 之間，4300 3700bp 之間，2100 2000bp 之間，1950 1800bp 之間，1620 1500bp之間，1350 1250bp 之間，1220 1180bp 之間，830 860bp 之間。13 :0PW_06為引物RAPD條帶圖譜，泳道I為BA001的PCR結(jié)果，泳道M為Maker，條帶按照分子量大小順序依次是23130bp，9416bp，6557bp，2322bp, 2027bp, IOOObp, 900bp,800bp，700bp，600bp，500bp，400bp。BAOOl 的 RAPD 條帶大小估算為 6000 5200bp 之間，4700 4100bp 之間，3700 3000bp 之間，2200 2070bp 之間,1700 — 1550bp 之間,1500 —1300bp 之間，1050 IOOObp 之間。圖2 =RAPD指紋圖譜的穩(wěn)定性試驗獲得的電泳圖譜I S6為引物的RAPD條帶圖譜2 S10為引物的RAPD條帶圖譜3 S31為引物的RAPD條帶圖譜4:0PV-14為引物的RAPD條帶圖譜
5 0PW-06為引物的RAPD條帶圖譜6 =OPC-IO為引物的RAPD條帶圖譜圖3 :內(nèi)不同批次抽提的蟬擬青霉菌株CGMCC No. 3453的DNA的RAPD多態(tài)性相似度試驗獲得的電泳圖譜I :S6為引物的RAPD條帶圖譜2 S10為引物的RAPD條帶圖譜 3 S31為引物的RAPD條帶圖譜4 :S33為引物的RAPD條帶圖譜5 =OPV-14為引物的RAPD條帶圖譜6 0PW-06為引物的RAPD條帶圖譜7 =OPC-IO為引物的RAPD條帶圖譜圖4 :同一菌株不同傳代數(shù)的樣本DNA的RAPD相似度試驗獲得的電泳圖譜I :S6為引物的RAPD條帶圖譜2 :S10為引物的RAPD條帶圖譜3 S31為引物的RAPD條帶圖譜4 :S33為引物的RAPD條帶圖譜5 =OPV-14為引物的RAPD條帶圖譜6 0Pff-06為引物的RAPD條帶圖譜條帶A :第11代的蟬擬青霉菌株CGMCC No. 3453對應的RAPD條帶圖譜條帶B :第10代的蟬擬青霉菌株CGMCC No. 3453對應的RAPD條帶圖譜條帶C :第5代的蟬擬青霉菌株CGMCC No. 3453對應的RAPD條帶圖譜條帶D :第I代的蟬擬青霉菌株CGMCC No. 3453對應的RAPD條帶圖譜圖5 (包括圖5-1和圖5-2):不同菌株RAPD多態(tài)性指紋圖譜檢測試驗獲得的電泳圖譜I :S6為引物的RAPD條帶圖譜2 :S7為引物的RAPD條帶圖譜3 :S10為引物的RAPD條帶圖譜4 S31為引物的RAPD條帶圖譜5 :S33為引物的RAPD條帶圖譜6 :S69為引物的RAPD條帶圖譜7 =OPC-IO為引物的RAPD條帶圖譜8 0PF-06為引物的RAPD條帶圖譜9 0PG-03為引物的RAPD條帶圖譜10 =OPH-18為引物的RAPD條帶圖譜11 0PH-20為引物的RAPD條帶圖譜12 =OPV-14為引物的RAPD條帶圖譜13 0PW-06為引物的RAPD條帶圖譜條帶E :蛹蟲草菌株對應的RAPD條帶圖譜條帶F :細腳擬青霉菌株對應的RAPD條帶圖譜
條帶G :蟬擬青霉菌株B-5對應的RAPD條帶圖譜條帶H :蟬擬青霉菌株Π2對應的RAPD條帶圖譜條帶I :蟬擬青霉菌株CGMCC No. 3453對應的RAPD條帶圖譜
具體實施例方式下面結(jié)合實施例進ー步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中菌種培養(yǎng)及DNA的提取均采用常規(guī)方法進行。本發(fā)明基于RAPD技術(shù)，先人工合成多個隨機多態(tài)核苷酸序列作為引物，從中篩選出重復性好，擴增條帶種間及種內(nèi)差異明顯的隨機多態(tài)核苷酸序列S6，S7，S10, S31，S33，S69, OPV-14, 0PW-06、0PC-10, 0PF-06、0PG-03、OPH-18 和 0PH-20，并進ー步優(yōu)化反應條件，從而獲得建立了對蟬擬青霉菌株CGMCC No. 3453的鑒定方法。 實施例IRAPD指紋圖譜的穩(wěn)定性試驗試驗操作I.常規(guī)方法提取蟬擬青霉菌株CGMCC No. 3453的DNA，采用引物S6，S10，S31，S80，OPV-14, 0PW-06, 0PC-10進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增，然后進行瓊脂糖電泳，檢測RAPD條帶圖譜。2. PCR反應條件如下反應體系體積25ul, DNA :20_50ng, Mg2+ :50n mol, dNTP :5n mol,引物IOp mol,Taq酶1. 5U(TAKARA Ex Taq)，酶反應緩沖液2. 5ul (TAKARA Ex Taq Buffer)，加雙蒸水至25ul，用移液器吹打均勻。PCR反應條件95 °C 3分鐘，接下來是95 °C 40秒，56 °C I分鐘，72 °C 2分鐘，循環(huán)40次，然后72°C延伸5分鐘，最后降溫至4°C。I.瓊脂糖凝膠電泳，膠1.5%的瓊脂糖膠；緩沖液IX TBE緩沖液(90m MTris-H3BO3, 2m M EDTA)，電壓160v,時間:45 分鐘。2.圖像拍攝，拍攝儀器Tanon 2500。實驗結(jié)果分別以S6，S10，S31，S80，0PV-14，0PW-06和0PC-10為引物，以同一次提取的蟬擬青霉菌株CGMCC No. 3453的DNA為模板的PCR獲得電泳圖譜(如圖2所示)從電泳圖譜上看，以同一次抽提的DNA作為模板的PCR反應，得到的主要的隨機擴增片段是一致的，按照公式F = 2NXY/(NX+NY)*100% (其中F為相似度，Nxy為二者相同的條帶數(shù)，Nx為X擁有的條帶數(shù)，Ny為Y擁有的條代數(shù))，計算二者的相似度為100%。從以上試驗結(jié)果可以得出，RAPD檢測DNA的多態(tài)性是一種穩(wěn)定的方法。實施例2，內(nèi)不同批次抽提的蟬擬青霉菌株CGMCC No. 3453的DNA的RAPD多態(tài)性相似度試驗操作I.取不同批次提取的蟬擬青霉菌株CGMCC No. 3453的DNA，分別以引物S6，S10,S31，S33，OPV-14, 0PW-06, 0PC-10進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增，然后進行瓊脂糖電泳，檢測RAPD條帶圖譜。2. PCR反應條件如下
反應體系體積25ul，DNA :20_50ng，Mg2+ :50n mol, dNTP :5n mol，引物10p mol,Taq 酶IU (TAKARA Ex Taq)，酶反應緩沖液2. 5ul (TAKARA Ex Taq Buffer)，加雙蒸水至25ul，用移液器吹打均勻。PCR反應條件95 °C 3分鐘，接下來是95 °C 40秒，56 °C I分鐘，72 °C 2分鐘，循環(huán)40次，然后72°C延伸5分鐘，最后降溫至4°C。3.瓊脂糖凝膠電泳，膠1.2%的瓊脂糖膠；緩沖液IX TBE緩沖液(90m MTris-H3BO3, 2m M EDTA)，電壓160v,時間:45 分鐘。4.圖像拍攝,拍攝儀器Tanon 25 00。實驗結(jié)果電泳圖譜(如圖3所示)是36，510，531，(^-14，0 胃-06和0卩(-10為引物，以兩次提取的BA001的DNA為模板的PCR反應結(jié)果。從電泳圖譜上看，以兩次不同抽提的DNA作為模板的PCR反應，得到的主要的隨機擴增片段是一致的，并且次要擴增片段也存在很高的相似性，按照公式F = 2NXY/Νχ+Νγ*100% (其中F為相似度，Nxy為二者相同的條帶數(shù)，Nx為X擁有的條帶數(shù)，Ny為Y擁有的條代數(shù))，計算二者的相似度為98.8%。從以上結(jié)果可以得出，本發(fā)明的RAPD檢測不同樣本的DNA多態(tài)性是一種穩(wěn)定的，可操作的方法。實施例3，同一菌株不同傳代數(shù)的樣本DNA的RAPD相似度試驗試驗操作I.提取同一蟬擬青霉菌株CGMCC No. 3453的四個不同傳代數(shù)的樣本的DNA，做RAPD引物S6，S10, S31，OPV-14, 0PW-06進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增，然后進行瓊脂糖電泳，檢測RAPD條帶圖譜。2. PCR反應條件如下反應體系體積25ul, DNA :20_50ng, Mg2+ :50n mol, dNTP :5n mol,引物IOp mol,Taq酶1. 5U(TAKARA Ex Taq)，酶反應緩沖液:2. 5ul (TAKARA Ex Taq Buffer)，加雙蒸水至25ul，用移液器吹打均勻。PCR反應條件95 °C 3分鐘，接下來是95 °C 40秒，56 °C I分鐘，72 °C 2分鐘，循環(huán)40次，然后72°C延伸5分鐘，最后降溫至4°C。5.瓊脂糖凝膠電泳，膠I. 5 %的瓊脂糖膠；緩沖液IX TBE緩沖液(90m MTris-H3BO3, 2m M EDTA)，電壓160v,時間:45 分鐘。6.圖像拍攝，拍攝儀器Tanon 2500。實驗結(jié)果電泳圖譜(如圖4所示)分別是S6，S10, S31，OPV-14和0PW-06為引物，以ー個菌株的四個不同傳代數(shù)的樣本的DNA為模板的PCR反應結(jié)果。從電泳圖譜上看，以兩次不同抽提的DNA作為模板的PCR反應，得到的主要的隨機擴增片段是一致的，并且次要擴增片段也存在很高的相似性，按照公式F = 2NXY/Νχ+Νγ*100% (其中F為相似度，Nxy為二者相同的條帶數(shù)，Nx為X擁有的條帶數(shù)，Ny為Y擁有的條代數(shù))，計算第I代樣本與第5代樣本的相似度為98. 2 %，計算第I帶樣本與第10代樣本的相似度為98. 2%，計算第I帶樣本與第11代樣本的相似度為96. 3 %，計算第5代樣本與第10代樣本的相似度為100%，計算第5代樣本與第11代樣本的相似度為98. 2%，計算第10代樣本與第11代樣本的相似度為98. 2%。由以上實驗結(jié)果可以得出，RAPD鑒定菌株是ー種穩(wěn)定的、可操作的方法。實施例4蟬擬青霉菌株CGMCC No. 3453及其它兩種蟬擬青霉菌株、細腳擬青霉菌株和蛹蟲草菌株RAPD多態(tài)性指紋圖譜檢測實驗操作I.取蟬擬青霉菌株CGMCC No. 3453，蟬擬青霉菌株Π2 (分離自安徽繁昌采集的竹蟬蛹)，蟬擬青霉菌株B-5 (分離自上海采集的鱗翅目蛹體)，細腳擬青霉菌株(分離自上海采集的鱗翅目蛹體)，及蛹蟲草菌株(分離自黑龍江黑河采集的蚱蟬蛹體)分別培養(yǎng)后提取 DNA，分別采用引物 S6、S7、S10、S31、S33、S69、0PC-10、0PF-06、0PG-03、0PH-18、0PH-20、OPV-14、0PW-06進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增，然后進行瓊脂糖電泳，檢測RAPD條帶圖
-i'Tfeレ曰。引物編號序列對照表
權(quán)利要求
1.一種鑒定蟬擬青霉菌株CGMCC No. 3453的方法，包括下列步驟 1)提取待檢菌株的DNA； 2)對步驟I)獲得的待檢菌株DNA分別采用下列引物進行PCR擴增56TGCTCTGCCC ；SlO CTGCTGGGAC ；S31 CAATCGCCTG ；OPV-14 AGATCCCGCC ；0PW-06 AGGCCCGATG ； 3)將步驟2)獲得的擴增產(chǎn)物分別經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后獲得待檢菌株的RAH)條帶圖譜； 4)將步驟3)獲得的待檢菌株的RAH)條帶圖譜與標準樣本的RAH)條帶圖譜比較判定獲得鑒定結(jié)果。
2.如權(quán)利要求I所述鑒定蟬擬青霉菌株CGMCCNo. 3453的方法，其特征在于，步驟2)的引物還包括下列引物中的ー種或多種57GGTGACGCAG ；S33 CAGCACCCAC ；S69 CTCACCGTCC ；0PC-10 TGTCTGGGTG ；0PF-06 GGGAATTCGG ；0PG-03 GAGCCCTCCA ；OPH-18 GAATCGGCCA ；0PH-20 :GGGAGACATC。
3.如權(quán)利要求I所述鑒定蟬擬青霉菌株CGMCCNo. 3453的方法，其特征在于，所述步驟2)所采用的PCR擴增反應體系如下總體積25ul，DNA樣本20_50ng，Mg2+ :50n mol,dNTP 5n mol，引物IOp mol, Taq酶1. 5U,酶反應緩沖液2. 5ul,加雙蒸水至25ul。
4.如權(quán)利要求I所述鑒定蟬擬青霉菌株CGMCCNo. 3453的方法，其特征在于，所述步驟2)所采用的PCR擴增反應條件如下先95°C 3分鐘；而后依次95°C 40秒，56°C I分鐘，720C 2分鐘，共循環(huán)40次；然后72°C延伸5分鐘，最后降溫至4で。
5.如權(quán)利要求I所述鑒定蟬擬青霉菌株CGMCCNo. 3453的方法，其特征在于，所述步驟4)中，將步驟3)獲得的待檢菌株RAH)條帶圖譜與標準樣本的RAH)條帶圖譜比較，如兩者相似度為95%以上，則鑒定待檢菌株為蟬擬青霉菌株CGMCC No. 3453。
6.如權(quán)利要求5所述鑒定蟬擬青霉菌株CGMCCNo. 3453的方法，其特征在于，所述相似度的計算方法為F = 2Nノ(Νχ+Νγ)*100% (其中F為相似度，Nxy為待檢菌株RAH)條帶圖譜與標準樣本的RAPD條帶圖譜比較后二者相同的條帶數(shù)，Nx為待檢菌株RAPD條帶圖譜擁有的條帶數(shù)，Ny為標準樣本的RAPD條帶圖譜擁有的條帶數(shù))。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學技術(shù)領域，公開了一種鑒定蟬擬青霉菌株CGMCCNo.3453的方法，包括下列步驟提取待檢菌株的DNA；對待檢菌株DNA分別采用引物S6、S10、S31、OPV-14和OPW-06進行PCR擴增獲得的擴增產(chǎn)物分別經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后獲得待檢菌株的RAPD條帶圖譜；將獲得的待檢菌株的RAPD條帶圖譜與標準樣本的RAPD條帶圖譜比較判定獲得鑒定結(jié)果。采用本發(fā)明的鑒定方法，可快速、準確地鑒定蟬擬青霉菌株CGMCCNo.3453，并且不受環(huán)境影響。
文檔編號C12Q1/04GK102643895SQ201110042699
公開日2012年8月22日 申請日期2011年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月22日
發(fā)明者孫長勝, 張健, 江三多, 陳超, 魏寧, 鮑曉妮 申請人:上海泛亞生命科技有限公司