專利名稱：一種煙葉生化添加劑及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于煙用添加劑的技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說，本發(fā)明涉及一種生化添加劑。同時，本發(fā)明還涉及所述添加劑的制備方法和在煙草工業(yè)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
煙草是一種以吸食為目的的特殊經(jīng)濟(jì)作物，其使用價值取決于它的品質(zhì)。香吃味是評價煙葉品質(zhì)的重要指標(biāo)，優(yōu)質(zhì)煙葉要求煙香氣質(zhì)純正，香氣量充足，吃味醇和，余味舒適。煙葉從種植到卷制成卷煙產(chǎn)品是一個復(fù)雜的系統(tǒng)工程，期間需要經(jīng)歷打葉復(fù)烤、煙葉醇化等一系列步驟。其中，打葉復(fù)烤是解決收獲煙葉品質(zhì)上存在缺陷的基本方法，即將煙站收購的初烤把裝煙(亦稱原煙)運到復(fù)烤車間進(jìn)行第二次烤制，將整片煙打制成一定規(guī)格的碎片煙，在打葉復(fù)烤過程中殺蟲，促進(jìn)青煙轉(zhuǎn)黃，減輕刺激和雜氣，并控制煙葉水分在11 % 13%范圍內(nèi)，防止煙葉在倉儲過程中生蟲霉變?，F(xiàn)有技術(shù)中打葉復(fù)烤后的碎片葉經(jīng)過機械打包后，需要堆放在煙葉醇化倉庫內(nèi)，在自然條件下貯存2 3年，通過自然醇化改善煙葉的抽吸品質(zhì)。這種自然醇化方法由于煙葉過于干燥，會抑制附著于煙葉表面的有益微生物的生長，所需煙葉醇化時間過長，增加了倉儲成本。雖然可以通過添加外源生物酶以縮短醇化時間，但由于外源生物酶的品種過于單一，造成香性物質(zhì)的種類減少，香氣自然感、層次感有所減弱。同時，這種添加外源生物酶自然醇化的生產(chǎn)方式，人工和酶制劑的成本較高，這些都使得現(xiàn)有生產(chǎn)方法周期過長，需要占用大量資金和庫房，生產(chǎn)成本較高。如何克服上述問題，現(xiàn)有技術(shù)中尚無理想的解決辦法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新的生化添加劑。本發(fā)明的另一目的是提供所述生化添加劑的制備方法。本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供所述生化添加劑在煙葉醇化中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案予以實現(xiàn)。*除非另有說明，本發(fā)明中所采用的百分?jǐn)?shù)均為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。A.本發(fā)明提供了一種生化添加劑，該添加劑是通過對短小芽孢桿菌{Bacillus pumilus) Van35的發(fā)酵產(chǎn)物提取。本發(fā)明從烤煙葉面上分離到一株細(xì)菌Van35，鑒定結(jié)果表明該細(xì)菌屬于短小芽孢桿菌，該菌株命名為(Bacillus卿ilus) Van35。該菌株已經(jīng)保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCG);該中心地址中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號； 保藏日期2009年11月5日；保藏號為CGMCC No. 3411。短小芽孢桿菌Van35菌株的形態(tài)學(xué)和生理生化性質(zhì)特征為菌體呈桿狀，革蘭氏陽性，芽孢橢圓形中生或端生，不膨大，芽孢比菌體小存在于菌體中。菌落呈圓形，扁平無凸起，乳白色，有光澤，邊緣不整齊。常規(guī)生理生化實驗表明ND12是好氧菌，過氧化氫酶實驗，VP實驗，產(chǎn)H2S實驗，明膠液化實驗和卵磷脂酶實驗曾陽性；水解淀粉實驗，產(chǎn)NH3實驗，甲基紅實驗，吲哚實驗，水解脂肪實驗和硝酸鹽還原實驗呈陰性。短小芽孢桿菌Van35的分子鑒定特征為利用通用引物20F (5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，)和 1500R (5，-GGTTACCTTGTTACGA CT-3，)，以短小芽孢桿菌Van35的基因組DNA作為模板擴增得到1500 bp左右的PCR產(chǎn)物，回收測序、校正之后得到的Van35菌株的部分16S rRNA基因序列1510 bp,該序列已經(jīng)遞交國際核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(GenBank)，序列索引號為(；似90547。B.本發(fā)明提供了一種煙葉生化添加劑的制備方法，該方法采用下述步驟
(1)將短小芽孢桿菌(Apumilus) Van35擴大發(fā)酵培養(yǎng)；
將50 mL液體種子培養(yǎng)基分裝于250 mL三角瓶中，接種菌株Van35，于30°C振蕩(180 r/min)培養(yǎng)24 h，得到液體種子。接種8%的液體種子于裝有MO mL液體種子培養(yǎng)基的 1000 mL三角瓶中，于30°C振蕩(180 r/min)培養(yǎng)M h，得到用于擴大培養(yǎng)的液體種子。(2)通過過濾或離心收集發(fā)酵液；
然后，無菌操作將8%的液體種子接種到裝有60 L液態(tài)產(chǎn)酶培養(yǎng)基的100 L發(fā)酵罐中， 于30°C靜態(tài)培養(yǎng)36小時放罐。離心(8000 rpm, 20 min)收集發(fā)酵液。(3)通過硫酸銨沉淀發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)，離心收集沉淀；
按照發(fā)酵液體積加入硫酸銨(56%，w/v)，攪拌2 h，再次離心(8000 rpm, 20 min)收集
沉淀
(4)透析除去硫酸銨，即得所需的生化添加劑。把沉淀溶解在600 ml的PH7. 0磷酸鹽緩沖液中，透析除去硫酸銨，得到Van35發(fā)酵提取物，該提取物即為生化添加劑Van-1。C.本發(fā)明提供了所述的生化添加劑作為煙葉醇化添加劑的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果。(1)本發(fā)明使煙葉的醇化時間較自然醇化有了大幅度的縮短，并且煙葉品質(zhì)有了明顯的提高。能有效促進(jìn)煙葉中大分子化合物含量的改變，例如，總糖和還原糖含量升高。 而總氮、煙堿、蛋白質(zhì)和纖維素的含量有所下降；同時，煙葉中的致香成分的含量提高，
(2)煙葉醇化時間的縮短有助于煙草企業(yè)節(jié)約倉儲空間和時間，提高了醇化車間的利用率，有利于煙草企業(yè)的加速發(fā)展。(3)本發(fā)明提供的生化添加劑是對傳統(tǒng)技術(shù)的重要突破，能有效改善煙葉的醇化過程，使煙葉的品質(zhì)得到了明顯提高，同時，增加了煙葉的利用率。(4)本發(fā)明工藝簡單、操作性、規(guī)范性及可控性強，原料易得，成本低，便于實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。


圖1是本發(fā)明制備菌株Van35發(fā)酵提取物的工藝流程圖。
具體實施例方式例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。實施例1
——培養(yǎng)基的制備1)斜面保藏培養(yǎng)基(克/升，g/V)胰蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl5，瓊脂15，用20% Na2CO3 調(diào)節(jié) pH 8. 5，121° C 滅菌 20 min ；
2)液體種子培養(yǎng)基(克/升，g/v)胰蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl5，用20% Na2CO3調(diào)節(jié) pH 8. 5，121°C 滅菌 20 min ；
3)液態(tài)產(chǎn)酶培養(yǎng)基(%):麩皮1.5，大豆蛋白胨1.5，干酪素1.0，CaCl20. 1%， K2HPO4 0. 1 %，KH2 PO4 0. 125%, MgSO4 · 7H20,0. 05%, FeSO4 0. 0004%, pH 8.0。121° C 滅菌20 min?！闢an35發(fā)酵提取物的制備
如圖1所示，主要包括種子培養(yǎng)、發(fā)酵、離心、硫酸銨沉淀等步驟。具體的流程如下先將50 mL液體種子培養(yǎng)基分裝于250 mL三角瓶中，接種菌株 Van35，于30°C振蕩(180 r/min)培養(yǎng)M h，得到液體種子。接種8%的液體種子于裝有 240 mL液體種子培養(yǎng)基的1000 mL三角瓶中，于30° C振蕩(180 r/min)培養(yǎng)M h，得到用于擴大培養(yǎng)的液體種子.然后，無菌操作將8%的液體種子接種到裝有60 L液態(tài)產(chǎn)酶培養(yǎng)基的100 L發(fā)酵罐中，于30°C靜態(tài)培養(yǎng)36小時放罐。離心(8000 rpm, 20 min)收集發(fā)酵液，按照發(fā)酵液體積加入硫酸銨(56%，w/v)，攪拌2 h，再次離心(8000 rpm, 20 min)收集沉淀，把沉淀溶解在600 ml的PH7. 0磷酸鹽緩沖液中，透析除去硫酸銨，得到Van35發(fā)酵提取物，該提取物即為生化添加劑Van-Ι。經(jīng)檢測生化添加劑Van-I含有多種水解酶，包括淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、蛋白酶等多種酶。實施例權(quán)利要求
1.一種煙葉生化添加劑，其特征在于該醇化添加劑是通過對短小芽孢桿菌 (Bacillus pumilus) Van35的發(fā)酵產(chǎn)物提取得到；所述的短小芽孢桿菌保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 3411。
2.—種權(quán)利要求1所述的煙葉生化添加劑的制備方法，其特征在于采用以下步驟(1)將短小芽孢桿菌(Apumilus) Van35擴大發(fā)酵培養(yǎng)；(2)通過過濾或離心收集發(fā)酵液；(3)通過硫酸銨沉淀發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)，離心收集沉淀；(4)透析除去硫酸銨，即得所需的生化添加劑。
3.權(quán)利要求1所述的生化添加劑在煙葉醇化中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種煙葉生化添加劑(Van-1)及其制備方法和應(yīng)用，屬于煙用添加劑的技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明所使用的菌株分類命名為短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)Van35；保藏編號為CGMCC No.3411。該生化添加劑Van-1處理煙葉8個月后，能有效促進(jìn)煙葉中大分子化合物含量的改變，如總糖和還原糖含量升高，總氮、煙堿、蛋白質(zhì)和纖維素的含量有所下降；同時，煙葉中的致香成分的含量提高，煙葉的品質(zhì)和自然醇化18～24個月的煙葉樣品接近。生化添加劑Van-1有助于煙葉中化學(xué)成分之間的轉(zhuǎn)化和致香成分的形成與積累，可有效地提高煙葉的醇化效果，縮短醇化時間。
文檔編號C12R1/07GK102217794SQ20111004298
公開日2011年10月19日 申請日期2011年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月23日
發(fā)明者張克勤, 朱保昆, 楊金奎, 段焰青, 王明鋒, 者為, 蔣舉興 申請人:紅云紅河煙草(集團(tuán))有限責(zé)任公司