專利名稱：糧食及其加工副產(chǎn)物中脂肪酶活力的快速測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及糧食精深加工領(lǐng)域，特指一種稻米、小麥、大豆及其加工副產(chǎn)物中脂肪酶活力的快速檢測方法，可廣泛應(yīng)用于糧食加工企業(yè)、倉儲企業(yè)及糧油檢測機(jī)構(gòu)的品質(zhì)檢驗(yàn)與控制。
背景技術(shù)：
稻谷、小麥?zhǔn)侨祟愔饕澄镔Y源，在加工過程中會產(chǎn)生大量的副產(chǎn)品一一胚芽、麩皮、糠等，這些副產(chǎn)物含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)也富含脂肪酶、脂肪氧化酶等，在酶的催化作用下這些副產(chǎn)物很容易水解酸敗，因而目前主要作為飼料出售，附加值較低。為了充分利用糧食資源，需要對糧食及其加工副產(chǎn)物的品質(zhì)進(jìn)行酶的鈍化處理， 其中脂肪酶活力的準(zhǔn)確測定是制定穩(wěn)定化處理工藝的基礎(chǔ)。谷物脂肪酶的活力測定一般分為三個步驟首先是從谷物中提取脂肪酶；然后往酶提取液中加入底物并均質(zhì)化，培育游離脂肪酸；最后對生成的游離脂肪酸進(jìn)行檢測，求出酶活力。即先進(jìn)行脂肪酶的提取與純化，再將酶與底物的混合培育脂肪酸，最后進(jìn)行脂肪酸的測定。人們已經(jīng)開發(fā)了一系列谷物游離脂肪酸的測定方法，如滴定法、比色法和色譜法等，其中最為常用的是滴定法和比色法。比色法測定快速、靈敏度高且儀器價(jià)格便宜，受到人們青睞，尤其是銅皂比色法常用于測定樣品中游離脂肪酸含量。迄今，該方法已歷經(jīng)了數(shù)次創(chuàng)新，Baker利用5%醋酸銅試劑與谷物中脂肪酸反應(yīng)生成銅皂，通過吸光值求得谷物中游離脂肪酸含量；Dimcombe使用 Cu(NO3) ·3Η20和三乙醇胺為銅試劑和顯色試劑；Lowry等使用乙酸銅一吡啶作為銅試劑，省去了顯色試劑；Kwon等人用異辛烷取代苯提取游離脂肪酸，改進(jìn)后的方法省去了溶劑蒸發(fā)步驟，簡化了測定過程。綜上，銅皂比色法用于糧食游離脂肪酸的測定已發(fā)展得較為成熟，但該法用于谷物脂肪酶活力的測定尚有兩大限制因素。首先是谷物脂肪酶的提取與純化過程繁瑣；其次脂肪酶水溶液與水不溶性底物難以混合均勻。脂肪酶只能在油水接觸面上起作用，水不溶性底物(如橄欖油)與酶液在混合反應(yīng)時(shí)，由于均質(zhì)條件的差異，其形成的乳化液往往不穩(wěn)定，且乳液顆粒大小也不均衡，造成測定結(jié)果重現(xiàn)性差。2003年，Goffman等人先用磷酸鹽緩沖溶液浸提米糠脂肪酶，然后將粗酶液加入橄欖油乳化液中培養(yǎng)18h，再用銅皂比色法測定脂肪酶活力。該法雖省去了脂肪酶的純化步驟，但其培養(yǎng)時(shí)間過長，不能適應(yīng)脂肪酶活力快速測定的要求。2003年，F(xiàn). EI Amrani等發(fā)明了一種低水分體系下測定脂肪酶活度的方法，具體步驟如下圖。該法將待測樣品粉碎后，再與橄欖油混合，培養(yǎng)一段時(shí)間，然后采用滴定法測定游歷脂肪酸含量。該法雖不用提取脂肪酶，但存在兩個缺點(diǎn)培養(yǎng)時(shí)間72h，太費(fèi)時(shí)，如此長時(shí)間的主要目的是為了產(chǎn)生足夠數(shù)量的游離脂肪酸，這是因?yàn)殡娢坏味y定游離脂肪酸的靈敏度低(相對于銅皂比色法)；其二需要用到恒PH自動電位滴定儀(目前國內(nèi)還沒有廠家生產(chǎn)該類儀器，需進(jìn)口)。糧食中游離脂肪酸是有機(jī)弱酸的混合物，其滴定終點(diǎn)突變不明顯，同時(shí)在糧食游離脂肪酸提取過程中，部分色素進(jìn)入提取液，進(jìn)一步增加了終點(diǎn)判斷的難度，使得個體間終點(diǎn)判斷差異增大。該法通過精密電位滴定儀準(zhǔn)確判定終點(diǎn)或色譜法，但儀器都比較昂貴。2006年，Devin等人發(fā)明了一種低水分體系下測定小麥和麩皮中脂肪酶活度的方法。該法無需提取及純化脂肪酶，直接往脫脂小麥麩皮中加入水和底物，經(jīng)過一段時(shí)間培養(yǎng)之后，通過銅皂比色法測定游離脂肪酸含量來計(jì)算脂肪酶活力。Devin的方法僅探討了水和橄欖油添加量對小麥脂肪酶活力的影響，但未說明以下問題其一，Devin在測定麥麩脂肪酶活力時(shí)，其原始水分為15%，在此基礎(chǔ)上實(shí)驗(yàn)得出優(yōu)化的加水量，而原始含水量不同的谷物，該研究獲得的絕對加水量便失去了參考價(jià)值；其二，樣品、水和橄欖油三者混合程度對測定結(jié)果的重現(xiàn)性的影響極大，因?yàn)榧尤氲酱郎y樣品中的水和橄欖油量相對很少，若采用常規(guī)方法難以充分混勻，這樣會導(dǎo)致檢測結(jié)果重現(xiàn)性差。而如何將樣品、水和橄欖油有效混勻，研究人員沒有明確指出。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有方法在測定谷物脂肪酶活力時(shí)，脂肪酶的提取與純化過程繁瑣，測定體系內(nèi)各組分混合不勻?qū)е陆Y(jié)果重現(xiàn)性差，無法適應(yīng)不同原始含水量的樣品，耗時(shí)長等缺陷，本發(fā)明立足于水分活度這個對酶活力起重要作用的影響因子，提供一種在低水分體系下快速測定谷物脂肪酶活力的方法，可推廣到糧食加工企業(yè)與儲藏企業(yè)，用于糧食加工及其副產(chǎn)物品質(zhì)的實(shí)時(shí)評估。本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是
首先將糧食及其加工副產(chǎn)物等待測樣品用有機(jī)溶劑進(jìn)行部分脫脂，并根據(jù)其原始水分含量大小加入適量蒸餾水(或30°c以下低溫烘干)，調(diào)節(jié)至一定水分活度，然后往其中加入適量橄欖油，并混合均勻，培養(yǎng)一段時(shí)間后，最后由銅皂比色法測定其增加的游離脂肪酸量，換算得到糧食及其加工副產(chǎn)物中脂肪酶的活力。本發(fā)明的方法具體按照下述步驟進(jìn)行
(1)待測糧食及其加工副產(chǎn)物樣品經(jīng)粉碎后，過30目篩，取篩下物，加入5 10倍體積的有機(jī)溶劑置于氣浴搖床中，以100 250rpm振蕩脫脂20 120min ；
(2)傾斜倒出脫脂的溶酶后，將樣品置于烘箱中，20 60°C熱風(fēng)烘干0.5 池去除殘余溶酶，取出放入干燥器中；
(3)稱取步驟2干燥后的樣品適量，分別置于兩試管中，一只空白Ai,另一只為Af，往每只試管中分別加入0 2. 5倍質(zhì)量的蒸餾水(或30°C以下低溫烘干0. 5 他)，調(diào)節(jié)其水分活度為0. 6 0. 9，優(yōu)選0. 7 0. 8 ；再加入0. 2 2. 5倍質(zhì)量的橄欖油，將三者充分?jǐn)嚢杈鶆颍?br> (4)取步驟3空白管Ai中的試樣，立即加入廣10倍體積的有機(jī)溶劑，渦旋振蕩30秒， 然后5000rpm離心3min，上清液倒入圓底燒瓶中，反復(fù)提取2 3次；
(5)取步驟3樣品管Af中的試樣，25 75°C下，優(yōu)選30 55°C，培養(yǎng)1 他，優(yōu)選2 4h后，取出，加入1 10倍體積的有機(jī)溶劑，振蕩30秒，然后5000rpm轉(zhuǎn)速下離心3min，上清液倒入圓底燒瓶中，反復(fù)提取2 3次；
(6)將步驟4、5得到的提取液在40°C以下減壓蒸發(fā)，除去有機(jī)溶劑。剩余固形物溶于0. 5 3倍樣品質(zhì)量的異辛烷后，加入1 2倍異辛烷體積的5%醋酸銅溶液(用吡啶調(diào)節(jié)其至pH5. 5 6. 5)，振蕩lmin，4000rpm離心2 lOmin，獲得有機(jī)相與水相；
(7)經(jīng)過步驟(6)獲得的有機(jī)相，在715nm下測其吸光度值，試樣吸光值與油酸異辛烷標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光值做比較；
(8)將步驟(7)中得到的吸光度值，代入下式計(jì)算脂肪酶活力
權(quán)利要求
1.糧食及其加工副產(chǎn)物中脂肪酶活力的快速測定方法，其特征在于按照下述步驟進(jìn)行(1)待測糧食及其加工副產(chǎn)物樣品經(jīng)粉碎后，過30目篩，取篩下物，加入5 10倍體積的有機(jī)溶劑置于氣浴搖床中，以100 250rpm振蕩脫脂20 120min ；(2)傾斜倒出脫脂的溶酶后，將樣品置于烘箱中，20 60°C熱風(fēng)烘干0.5 池去除殘余溶酶，取出放入干燥器中；(3)稱取步驟(2)干燥后的樣品適量，分別置于兩試管中，一只空白Ai,另一只為Af，往每只試管中分別加入0 2. 5倍質(zhì)量的蒸餾水或30°C以下低溫烘干0. 5 他，調(diào)節(jié)其水分活度為0. 6 0. 9 ；再加入0. 2 2. 5倍質(zhì)量的橄欖油，將三者充分?jǐn)嚢杈鶆颍?4)取步驟(3)空白管Ai中的試樣，立即加入廣10倍體積的有機(jī)溶劑，渦旋振蕩30秒， 然后5000rpm離心3min，上清液倒入圓底燒瓶中，反復(fù)提取2 3次；(5)取步驟(3)樣品管Af中的試樣，25 75°C下，培養(yǎng)1 他后，取出，加入1 10 倍體積的有機(jī)溶劑，振蕩30秒，然后5000rpm轉(zhuǎn)速下離心3min，上清液倒入圓底燒瓶中，反復(fù)提取2 3次；(6)將步驟(4)、(5)得到的提取液在40°C以下減壓蒸發(fā)，除去有機(jī)溶劑；剩余固形物溶于0. 5 3倍樣品質(zhì)量的異辛烷后，加入1 2倍異辛烷體積的5%醋酸銅溶液振蕩lmin， 4000rpm離心flOmin，獲得有機(jī)相與水相，其中所述的5%醋酸銅溶液使用前用吡啶調(diào)節(jié)其至 ρΗ5· 5 6. 5 ；(7)經(jīng)過步驟(6)獲得的有機(jī)相，在715nm下測其吸光度值，試樣吸光值與油酸異辛烷標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光值做比較；(8)將步驟(7)中得到的吸光度值，代入下式計(jì)算脂肪酶活力LA= 1000---&tis其中LA =脂肪酶活動度(U/g); 1000為從mol/L到μ mol/mL的轉(zhuǎn)換系數(shù)； 4為用于重溶油脂的異辛烷的體積(mL)； ν為加入橄欖油的體積(mL)； Af為在715nm下經(jīng)過培養(yǎng)的樣品的吸光度； Ai為在715 nm下空白樣品的吸光度； ε為油酸在715 nm下的摩爾吸光系數(shù)(M 1^cm O ； t為培養(yǎng)時(shí)間(h)； 1為路徑長度(cm); s為樣品干重(g)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的糧食及其加工副產(chǎn)物中脂肪酶活力的快速測定方法，其特征在于其中上述測定過程中所用的橄欖油需要進(jìn)行預(yù)先純化，按照下述步驟進(jìn)行往橄欖油中邊攪拌邊加入約10 30% (W/V)的氧化鋁，Ih內(nèi)每隔10 15分鐘攪拌混合物一次； 靜置，待氧化鋁沉淀后，過濾獲得純化的橄欖油；取一定量純化橄欖油，加入1 3倍橄欖油體積的乙醚和1 3倍橄欖油體積的95%乙醇，以酚酞為指示劑，用0. 05N的NaOH滴定，如果堿的用量超過橄欖油體積的1/10，重復(fù)純化橄欖油一次。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的糧食及其加工副產(chǎn)物中脂肪酶活力的快速測定方法，其特征在于其中所述步驟(3)中調(diào)節(jié)其水分活度為0. 7 0. 8 ；其中所述步驟(5)中樣品管Af中的試樣，30 55°C，培養(yǎng)2 4h后，取出，加入1 10倍體積的有機(jī)溶劑，振蕩30秒，然后5000rpm轉(zhuǎn)速下離心3min，上清液倒入圓底燒瓶中，反復(fù)提取2 3次；根據(jù)權(quán)利要求1所述的糧食及其加工副產(chǎn)物中脂肪酶活力的快速測定方法，其特征在于其中所述的有機(jī)溶劑是指正己烷、乙醚或乙酸乙酯。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的糧食及其加工副產(chǎn)物中脂肪酶活力的快速測定方法，其特征在于其中所述的檢測對象、橄欖油和蒸餾水三者混合方法是采用白式研磨儀或電動勻漿機(jī)混合儀器進(jìn)行混和。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的糧食及其加工副產(chǎn)物中脂肪酶活力的快速測定方法，其特征在于其中所述的糧食及其加工副產(chǎn)物為小麥、稻谷、玉米、大豆、小麥胚芽、麩皮、米糠、糙米、玉米胚芽或大豆胚芽。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種稻米、小麥及其加工副產(chǎn)物中脂肪酶活力的快速檢測方法，涉及糧食精深加工領(lǐng)域。首先將米糠等待測樣品進(jìn)行部分脫脂，并根據(jù)其原始水分含量大小加入適量蒸餾水、調(diào)節(jié)至一定水分活度，然后往其中加入適量橄欖油，培養(yǎng)一段時(shí)間，最后由銅皂比色法測定其增加的游離脂肪酸量，換算得到米糠脂肪酶活力。該方法省去了脂肪酶的提取及純化步驟，操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，可廣泛應(yīng)用于糧食加工企業(yè)、倉儲企業(yè)及糧油檢測機(jī)構(gòu)的糧油品質(zhì)檢驗(yàn)與控制。
文檔編號C12Q1/44GK102175633SQ20111004391
公開日2011年9月7日 申請日期2011年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月24日
發(fā)明者任曉鋒, 徐斌, 李波, 苗文娟, 董英 申請人:江蘇大學(xué)