專(zhuān)利名稱(chēng)：一種乙肝病毒核心抗原的核酸適配體序列及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬分子免疫領(lǐng)域，涉及ー種こ肝病毒核心抗原的核酸適配體的序列及其用途。
背景技術(shù)：
こ型肝炎(こ肝)是嚴(yán)重危害我國(guó)人民健康的主要傳染病，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)こ型肝炎病毒(こ肝病毒，HBV)攜帯者達(dá)I. 3億，肝病患者高達(dá)3000萬(wàn)，毎年因各類(lèi)肝病死亡人數(shù)達(dá)30萬(wàn)。肝病已經(jīng)成為當(dāng)今威脅中國(guó)人ロ健康的主要疾病之一，數(shù)量巨大的慢性肝病患者的存在，以及每年新發(fā)現(xiàn)肝炎病例的出現(xiàn)，對(duì)社會(huì)醫(yī)療資源造成極大的消耗。研究顯示，こ肝病毒是こ型肝炎的主要致病原，病原明確。目前こ肝的治療效果并不是很理想，臨床實(shí)踐顯示こ肝病毒已對(duì)大部分治療藥物產(chǎn)生了耐藥性，因此，亟待開(kāi)發(fā)新的 對(duì)抗こ肝病毒的治療手段?，F(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)了こ肝病毒的DNA序列，其主要含有四個(gè)編碼區(qū)，分別為S、P、C、X開(kāi)放讀框；其中，C開(kāi)放讀框編碼核心抗原(HBcAg)，該核心抗原是診斷こ肝病毒感染的重要標(biāo)志之一。有研究指出，對(duì)こ肝病毒自身生活周期密切相關(guān)的蛋白或酶進(jìn)行干預(yù)是殺滅和抑制病毒的有效策略之一，也是未來(lái)診斷和治療こ肝的理想方向。目前，已知核酸適配體(aptamer)是經(jīng)體外篩選技術(shù)篩選出的能特異結(jié)合金屬離子、多肽、蛋白質(zhì)乃至整個(gè)細(xì)胞的寡聚核苷酸(DNA或RNA)片段，其特異性如同抗體一祥，對(duì)可結(jié)合的配體有嚴(yán)格的識(shí)別能力和高度的親和力。核酸適配體的體外篩選技術(shù)被稱(chēng)為指數(shù)富集的配體糸統(tǒng)進(jìn)化(Systematic evolution of ligand by exponential enrichment,SELEX)技術(shù)，SELEX技術(shù)模擬自然進(jìn)化過(guò)程，對(duì)隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)施加選擇壓力(結(jié)合靶目標(biāo))，淘選與靶目標(biāo)高度特異結(jié)合片段(如圖I所示);相比抗體等多肽類(lèi)的適配體(peptideaptamer),核酸適配體的優(yōu)勢(shì)相當(dāng)明顯,例如制備簡(jiǎn)單快捷、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、至今未見(jiàn)報(bào)道存在免疫原性或毒性、靶分子范圍廣、親和力高、特異性強(qiáng)、易于進(jìn)行改造修飾等。核酸適配體的諸多優(yōu)勢(shì)令其在基礎(chǔ)研究、臨床檢測(cè)、新藥開(kāi)發(fā)等方面有著廣泛的用途。在臨床檢測(cè)方面，目前能用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)幾乎都可以用核酸適配體
替代，如Archemix公司開(kāi)發(fā)的一種適配體分子傳感器-RiboReporter 即可以將檢測(cè)到
的蛋白信號(hào)直接轉(zhuǎn)化成光信號(hào)記錄并分析，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)生物混合液(如血清、細(xì)胞提取物)中的大分子蛋白的直接快速檢測(cè)。在新藥開(kāi)發(fā)方面，最典型的例子便是第一個(gè)通過(guò)美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市的核酸適配體藥物Macugen。它是抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)的核酸適配體，被用于治療濕性老年性黃斑變性(wet AMD)。另ー個(gè)核酸適配體藥物的例子是由Aptamera公司研制的AGRO100。臨床前試驗(yàn)表明，AGR0100對(duì)多種癌細(xì)胞均有抑制作用。目前國(guó)內(nèi)外大部分從事核酸適配體研究的科學(xué)家和生物技術(shù)公司主要針對(duì)心血管疾病，而較少關(guān)注中國(guó)人的常見(jiàn)疾病，如肝炎、肝癌、胃癌等，因此本發(fā)明擬考慮核酸適配體如何應(yīng)用于上述嚴(yán)重威脅我國(guó)人民健康的重大疾病。就こ肝病毒來(lái)說(shuō)，已有研究報(bào)道了針對(duì)こ肝病毒核心抗原的肽適配體，但迄今尚無(wú)針對(duì)こ肝病毒的核酸適配體的報(bào)道或公開(kāi)。因此，開(kāi)發(fā)針對(duì)こ肝病毒的核酸適配體，將為こ肝病毒的診斷和抗こ肝病毒治療提供有力支持，具有重要的臨床價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種こ肝病毒核心抗原的核酸適配體序列，具體涉及ー種HBV核心抗原的核酸適配體中具有特異結(jié)合HBV核心抗原的特征序列。本發(fā)明中，所述的HBV核心抗原的核酸適配體(序列I)中含有特異結(jié)合HBV核心抗原的特征序列，所述的特征序列為CATTT。 本發(fā)明中，所述的こ肝病毒核心抗原選自こ肝病毒株A、B、C、D、E、F、G、F、G或H
基因型。本發(fā)明的進(jìn)ー步目的是提供所述核酸適配體序列的用途，根據(jù)對(duì)該序列分析，設(shè)計(jì)抗HBV感染的藥物并進(jìn)ー步制備抗HBV感染的藥物或制品。本發(fā)明采用基因重組質(zhì)粒表達(dá)核心抗原，并篩選與其特異結(jié)合的核酸適配體，制得具有特異結(jié)合HBV核心抗原的特征序列CATTT (本發(fā)明中命名為華山適配體I號(hào)，簡(jiǎn)稱(chēng)HSSTOl)。通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
采用已知的分子克隆技術(shù)，以含有雙拷貝HBV基因組序列的重組質(zhì)粒pBS_HBV3.6II(序列2)為基礎(chǔ)，根據(jù)HBc基因序列設(shè)計(jì)引物
HBc_L :5’ -GCCCATATGGACATTGACCCGTA-3’ ；
HBc_R:5’ -GCCCTCGAGTCAAACAACAGTAGTTT-3’ ；
通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增出HBc基因，用限制性?xún)?nèi)切酶NdeI和NotI酶切，同時(shí)用相同的限制性?xún)?nèi)切酶切pET28a質(zhì)粒(購(gòu)自北京畢特博生物公司)，然后用T4連接酶連接入pET28a的Ndel/Notl酶切位點(diǎn)中，制得含HBc基因的重組質(zhì)粒pET28a_HBc (質(zhì)粒結(jié)構(gòu)如圖2所示)；
將含有pET28a-HBc的大腸桿菌BL21 (DE3)(購(gòu)自上海杰慶生物公司)單菌落接種到含卡納抗生素的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過(guò)夜，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至200mL新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后離心收集菌體；
用 5mL 裂解液(50mM Tris-HCl(pH8. 5 9. 0)，2mM EDTA, IOOmM NaCl, O. 5% TritonX-100, lmg/ml溶菌酶)重懸細(xì)菌，冰浴中IOOw超聲破碎；取Iml上清與500ulNi_NTAAgarose珠子混合,用2ml PBS+Mg( ImM MgC12)洗兩遍,再用2ml PBS+Mg重懸，吸出蛋白-珠子混合物，加Roche cOmplete Mini EDTA-free蛋白保護(hù)劑保存。隨后利用核酸適配體的體外篩選技術(shù)即SELEX技木，以HBc蛋白-珠子混合物為正篩靶標(biāo)，以含pET28a空白質(zhì)粒的大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物-珠子混合物為反篩靶標(biāo)，從體外合成的隨機(jī)寡聚 DNA 文庫(kù)(5’ -acgctcggatgccactacagNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNctcatggacgtgctggtgac-3’ )中篩選出與HBc特異結(jié)合的核酸適配體；將篩選出的序列用引物 Aptamer_L (5’ -FAM-acgctcggatgccactacag-3’)和 Aptamer_R (5’ -biotin-gtcaccagcacgtccatgag-3’ )進(jìn)行擴(kuò)增并進(jìn)行TA克隆入pMD19_T載體(購(gòu)自上海博光生物公司)，轉(zhuǎn)化DH5a細(xì)菌(購(gòu)自北京天根生物公司)；挑去白色菌落以引物RV-M(5，-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’)和 M13 (-47) (5，-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’)進(jìn)行PCR確定陽(yáng)性克隆后，抽提質(zhì)粒并用M13 (-47) (5’ -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’ )為測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，采用測(cè)序儀測(cè)序。本發(fā)明中，所述的核酸適配體序列選自天然存在或人工合成的序列，或任何其他來(lái)源的同樣的序列；
所述的核酸適配體序列含有與所述特征序列的核苷酸的全部相同的序列，即所有核酸適配體均含有所述的特征序列。本發(fā)明所述的特征序列是核酸適配體與HBc特異性結(jié)合的基礎(chǔ)，可用于藥物設(shè)計(jì)、制備藥物或其他制品，所述的含有該特征序列的核酸適配體可作為抗HBV的探針或靶點(diǎn)，用于設(shè)計(jì)、制備抗こ肝病毒的藥物或制劑。


圖I是核酸適配體的體外篩選技術(shù)即SELEX技術(shù)的一般流程圖。圖2是pET28a_HBc質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例l:HBc基因克隆
用已知的分子克隆技術(shù)，以含有雙拷貝HBV基因組序列的重組質(zhì)粒pBS_HBV3. 611為基礎(chǔ)，根據(jù)HBc基因序列設(shè)計(jì)引物
HBc_L :5’ -GCCCATATGGACATTGACCCGTA-3’
HBc_R :5’ -GCCCTCGAGTCAAACAACAGTAGTTT-3’
配置 PCR 體系(總體積 50ul) H20 38ul, 10XPCR 緩沖液 5ul，25mM MgCl2 3ul,dNTP (IOmM) lul，引物混合物 I. 5ul(H20 IOOuM HBc_L IOOuM HBc_R = 4 :0. 5 :0. 5)，DNA模板lul, PrimeStar酶O. 5ul。按如下條件,在PCR儀上擴(kuò)增94°C加熱預(yù)變
性2min后，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸20s，30個(gè)循環(huán)，72°C延伸8min，4°C保溫<lh。反應(yīng)結(jié)束后，取5ul產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中100V恒壓電泳，鑒定擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符的DNA片段后，用Axygen的PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化。用限制性?xún)?nèi)切酶NdeI和NotI雙酶切，同時(shí)用相同的限制性?xún)?nèi)切酶切pET28a質(zhì)粒，在I %的瓊脂糖凝膠中100V恒壓電泳后用Axygen膠回收試劑盒回收酶切片段，在T4連接酶作用下連接上述兩段片段，獲得含HBc基因的重組質(zhì)粒pET28a-HBc。將pET28a_HBc和pET28a空白質(zhì)粒分別用天根的高效轉(zhuǎn)化試劑盒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)細(xì)胞中。
實(shí)施例2 =HBc表達(dá)與純化
將含有重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-HBc的大腸桿菌單菌落接種到5mL含Kan抗生素的LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。按I :100體積比將過(guò)夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至200mL新鮮培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2 4h，待0D_值達(dá)O. 6時(shí)，加入IPTG(終濃度為O. ImM)，30°C誘導(dǎo)培養(yǎng)8h。4000rpm離心30min收集菌體。用 5mL 裂解液(50mM Tris-HCl (ρΗ8· 5 9. O)，2mM EDTA, IOOmM NaCl, O. 5%Triton X-100, lmg/ml溶菌酶)重懸細(xì)菌，分裝在3個(gè)2ml的管中，-80度30min。冰浴中IOOw超聲破碎(2s 5s，60 80次)。取Iml上清與500ul Ni-NTA Agarose珠子混勻，加入純化柱，用2ml PBS+Mg (ImM MgCl2)洗兩遍后，用2ml PBS+Mg重懸吸出蛋白珠子混合物。每管加7XRoche cOmplete Mini EDTA-free蛋白保護(hù)劑,4度保存作為正篩革巴標(biāo)。同樣將含pET28a空白質(zhì)粒的大腸桿菌進(jìn)行相同操作得到反篩靶標(biāo)。
實(shí)施例3 :核酸適配體篩選(一輪)
首輪寡聚 DNA 文庫(kù)序列5’ -ac gc t c ggat gc cac tacagNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNctcatggacgtgctggtgac-3’ ；
富集所用引物
Aptamer_L: 5’ -FAM-acgctcggatgccactacag-3J ；
Aptamer_R: 5，-biotm-gtcaccagcacgtccatgag-J ；
將寡聚DNA文庫(kù)測(cè)定OD26tl后，離心干燥。用300ul PBS+Mg溶解文庫(kù),取200pmol (第一輪2. 5nmol),95°C 8min,迅速置冰上,稍后快速離心。反篩將200pmol的文庫(kù)吸入相當(dāng)于40pmol正篩靶標(biāo)的反篩靶標(biāo)中，用PBS+Mg補(bǔ)足到800ul。37°C搖床振蕩30min。吸入Milipore超濾管快速離心(〈lOOOrpm),取濾出液。正篩取40pmol正篩靶標(biāo)，800rpm離心，吸掉上清，然后用Iml PBS+Mg洗兩次。將濾出液加入40pmol正篩祀標(biāo)中，37°C搖床振蕩30min。吸入Milipore超濾管快速離心(〈lOOOrpm)，棄濾出液。用PBS+Mg超濾洗滌三遍。隨后用600uL PBS+Mg將正篩靶標(biāo)從膜上吸到另一管中，加60uL胰酶，37°C IOmin0加水補(bǔ)足到ImL, 95°C lOmin，迅速置冰上。待變冷后，5000rpm離心5min。上清轉(zhuǎn)移到一干凈的EP管中。富集配置PCR 體系(總體積 IOOOul) =H2O 740ul, 10XPCR 緩沖液 IOOul, dNTP80ul，引物混合物 25ul (H2O IOOuM Aptamer_L IOOuM Aptamer_R = 4 :0. 5 :0. 5)，DNA 模板(正篩上清50ul，Taq HS酶5ul。按如下條件，在PCR儀上擴(kuò)增94°C加熱預(yù)變性2min后，94°C變性30s，58°C退火20s，72°C延伸 20s, 20 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 4min，4°C保溫 <lh。純化純化柱用MilliQ水洗一遍，PBS洗兩遍,加入150ul GE的StreptavidinSepharose后PBS洗兩遍,加入PCR產(chǎn)物,搖床振蕩20min,放出液體,PBS洗兩遍后,加0. 5mLNaOH靜置2-3min后放出液體，放出液上脫鹽柱，待液體從脫鹽柱幾乎流盡時(shí)加ImL MilliQ水洗脫，同時(shí)開(kāi)始接洗脫液lmL，該洗脫液即為富集了的寡聚DNA文庫(kù)，可進(jìn)行下ー輪篩選。
實(shí)施例4 :核酸適配體TA克隆
在微量離心管中配制下列溶液，全量為5ul :pMD19-T Vector lul，適配體PCR產(chǎn)物lul，dH20 3ul。加入 5ul 的 Solution I。16°C反應(yīng) 30 分鐘。全量(IOul)加入至 IOOulDH5a感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30分鐘。42°C加熱45秒鐘后，再在冰中放置I分鐘。加入890ul LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)60分鐘。在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成單菌落。
實(shí)施例5 :核酸適配體克隆的菌落PCR與測(cè)序PMD19-T菌落PCR和測(cè)序引物
RV-M: 5，-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3，
Ml3(-47) : 5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’
用滅菌牙簽挑取白色單克隆菌落加入到4ml LB (Amp 50ng/L)液體培養(yǎng)基內(nèi)，180rpm，37°C搖菌過(guò)夜(<16h)，取Iul菌液作PCR模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以水作為陰性對(duì)照。
配置 PCR 體系菌液 Iul，引物 RV-M(IOuM) O. 5ul，引物 M13 (-47) O. 5ul,2XTaq Mix7. 5ul，水5. 5ul (總體系15ul)。按如下條件，在PCR儀上擴(kuò)增95°C預(yù)變性5min ;94°C變 性30s，55°C退火30s，72°C延伸45s，共33個(gè)循環(huán)；72°C總延伸lOmin。反應(yīng)結(jié)束后取3_6ul菌液PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，140V電泳20min。若出現(xiàn)明亮的目的大小條帶而陰性對(duì)照沒(méi)有條帶，說(shuō)明該菌液為陽(yáng)性克隆。隨后行質(zhì)粒提取取4ml過(guò)夜培養(yǎng)的新鮮菌液，收集菌體，按照Omega的質(zhì)粒提取試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行質(zhì)粒提取。最后加水溶解。采用Nanodrop對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行濃度和純度測(cè)定。測(cè)序反應(yīng)BDTv3. I O. 5ul，質(zhì)粒 lOOng，引物 M13 (-47) O. 5ul，加水至 5ul。96°C加熱預(yù)變性Imin后，96°C變性10s，50°C退火10s，60°C延伸4min，33個(gè)循環(huán)，4°C保溫。反應(yīng)結(jié)束后將5ul測(cè)序產(chǎn)物+1.25ul EDTA (125mM,pH 8. O)+15ul無(wú)水こ醇封好，震蕩4次，室溫放置15min,立即3860rpm,室溫(25°C )離心40min后立即倒扣在紙巾上，離心到900rpm,立刻停。加60ul 70%こ醇，(不需震蕩)封好。隨后室溫下3860rpm，離心15min。立即倒扣在紙巾上，離心到900rpm，立刻停。避光室溫干燥15min，加IOul Hi_Di，封好蓋。95°C變性4min,立刻冰上靜置4min，短暫離心，上3730x1測(cè)序儀。測(cè)序結(jié)果顯示，6個(gè)克隆中都存在同一段序列CATTT。結(jié)果證實(shí)，本發(fā)明獲得了具有特異結(jié)合HBV核心抗原的特征序列，該段特征序列為CATTT。
權(quán)利要求
1.一種こ肝病毒核心抗原的核酸適配體序列，其特征在于，具有序列I的結(jié)構(gòu)，其含有特異結(jié)合HBV核心抗原的特征序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的こ肝病毒核心抗原的核酸適配體序列，其特征在于，所述的特征序列為CATTT。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的こ肝病毒核心抗原的核酸適配體序列，其特征在于，所述的序列選自天然存在或人工合成的序列，或任何其他來(lái)源的同樣的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的こ肝病毒核心抗原的核酸適配體序列，其特征在于，所述核酸適配體的序列含有與所述的特征序列的核苷酸的全部相同的序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的こ肝病毒核心抗原的核酸適配體序列，其特征在于，所述的こ肝病毒核心抗原選自こ肝病毒株A、B、C、D、E、F、G、F、G或H基因型。
6.權(quán)利要求I的こ肝病毒核心抗原的核酸適配體序列中的特征序列在設(shè)計(jì)藥物中的用途。
7.權(quán)利要求I的こ肝病毒核心抗原的核酸適配體序列中的特征序列在制備藥物或其他制品中的用途。
8.按權(quán)利要求6或7所述的用途，其特征在于，所述的藥物為抗こ肝病毒的藥物或制齊U。
9.權(quán)利要求I的こ肝病毒核心抗原的核酸適配體序列在制備檢測(cè)HBV的探針或靶點(diǎn)中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬分子免疫領(lǐng)域，涉及一種乙肝病毒核心抗原的核酸適配體序列及用途。本發(fā)明采用基因重組質(zhì)粒表達(dá)核心抗原，并篩選與其特異結(jié)合的核酸適配體，制得具有特異結(jié)合HBV核心抗原的特征序列CATTT。本發(fā)明所述的特征序列是核酸適配體與HBc特異性結(jié)合的基礎(chǔ)，可用于藥物設(shè)計(jì)、制備藥物或其他制品，所述的含有該特征序列的核酸適配體可作為抗HBV的探針或靶點(diǎn)，用于設(shè)計(jì)、制備抗乙肝病毒的藥物或制劑。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102649961SQ201110044709
公開(kāi)日2012年8月29日 申請(qǐng)日期2011年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月24日
發(fā)明者劉杰, 張作偉, 張駿 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院