專利名稱：：生物指示物的制作方法生物指示物本申請(qǐng)為分案申請(qǐng)，原申請(qǐng)的申請(qǐng)日為2005年3月22日，申請(qǐng)?zhí)枮?00580009130.0(PCT/GB2005/001056)，發(fā)明名稱為“生物指示物”。本發(fā)明涉及生物指示物，一般而言，其適于驗(yàn)證一種過程，包括基于熱的失活過程和失活步驟，更具體地，其適于驗(yàn)證失活傳染性海綿狀腦病(transmissiblespongiformencephalopathy)(TSE)因子的步驟?？?雅綜合征(Creutzfeldt-JakobDisease)(CJD)是一種相對(duì)罕見的人類神經(jīng)變性疾病形式，以家族性、散發(fā)性或醫(yī)源性疾病存在，發(fā)病率是每百萬人群中大約1例。該疾病的一個(gè)新的變種形式(vCJD)的出現(xiàn)-其主要發(fā)生在年輕人群中并且可能是由于消費(fèi)了受牛海綿狀腦病(BSE)感染的肉類產(chǎn)品，增加了病例數(shù)大量增加的概率。這些因素具有重要的公共健康意義。在二十世紀(jì)八十年代晚期，高比例的英國人群曾經(jīng)通過食物潛在地暴露于該疾病。盡管迄今為止的病例數(shù)相對(duì)低(至2004年2月是149例)，仍然存在著對(duì)來自通過其它傳播途徑，包括手術(shù)、移植、輸血或污染的醫(yī)療用品的所有形式CJD的顯著風(fēng)險(xiǎn)。這些途徑中的許多涉及該疾病在臨床情況中的醫(yī)源性傳播，其它途徑在動(dòng)物模型中得到確定。在人類中引起所有形式CJD的因子對(duì)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)方法的失活是高度抵抗的。迫切需要對(duì)外科器械除污染的有效方法。已經(jīng)對(duì)多種處理，包括化學(xué)處理和利用濕熱或干熱的高溫及高壓的應(yīng)用進(jìn)行了測試，但是沒有一種方法是滿足要求的[Taylor，D.Μ.(1999)于Principlesandpracticeofdisinfection,preservationandsterilisation中.(Russell,A.D.，Hugo,W.B.andAyliffe,G.A.J.，Eds):pp222-236Blackwel1ScientificPublications,Oxford；Taylor,D.M..(2001)ContribMicrobiol.7,58-67；Taylor,D.Μ.,Fernie,K,Steele,PJ.,McConnel1,I.andSomerville,R.A.(2002)JGenVirol.83,3199-3294]焚燒是有效的，但是阻礙了對(duì)原材料和或器械的任何恢復(fù)或再利用。已經(jīng)顯示，高濃度氫氧化鈉(高達(dá)2M)或高水平次氯酸鈉(高達(dá)20000ppm)的應(yīng)用明顯降低TSE因子的水平，但是其對(duì)外科器械具有損害效應(yīng)，并且對(duì)操作者有害。已經(jīng)提議了多種其它方法作為失活外科器械上的TSE因子的方法，這些方法目前還在開發(fā)中。這些包括多種氣態(tài)殺菌劑，包括蒸氣態(tài)過氧化氫、臭氧和環(huán)氧乙烷。已經(jīng)提議了其它方法作為常規(guī)滅菌之前特定的抗TSE預(yù)處理，這些方法包括在限定的pH條件和溫度條件下，用熱穩(wěn)定蛋白酶處理外科器械。嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)芽孢的失活是常規(guī)用于驗(yàn)證高壓滅菌之正確實(shí)施的方法。這種指示物可以給出細(xì)菌或病毒被該過程失活的相對(duì)指示，以該過程通常由于降低了感染因子水平IO6個(gè)數(shù)量級(jí)而得到驗(yàn)證。然而，TSE因子獨(dú)特的穩(wěn)定性質(zhì)意味著需要強(qiáng)得多的指示物來提供對(duì)失活這種因子的過程的性能的相對(duì)指示?；跓岱€(wěn)定芽孢或酶制備物的其它生物指示物是熟悉本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。這些指示物都有缺點(diǎn)它們不能驗(yàn)證感染因子活性降低超過IO6的失活。TSE因子的失活也是處理受牛海綿狀腦病(BSE)感染物質(zhì)和制備動(dòng)物來源的原材料中的重要問題?，F(xiàn)在存在可靠的科學(xué)根據(jù)，認(rèn)為BSE的發(fā)生和傳播是通過煉油操作中的轉(zhuǎn)變形成的，高度感染的神經(jīng)組織被通過肉骨粉添加劑(meat-and-bone-mealsupplements)反過來喂給牲畜。也有可靠證據(jù)表明，BSE是vCJD的病因，幾乎確定地是食用污染的牛肉產(chǎn)品的結(jié)果。由于這個(gè)原因，死于BSE的任何牲畜，以及所有牲畜的脊髓和腦組織，通常從食物鏈中被去除，并且經(jīng)可選的途徑被處理。其結(jié)果是，大量的動(dòng)物廢物目前被積累或經(jīng)焚燒處理。用熱穩(wěn)定蛋白酶對(duì)這些物質(zhì)進(jìn)行處理是一個(gè)可能的解決方法。此外，存在著對(duì)確保任何感染物在適當(dāng)?shù)倪^程中被摧毀的驗(yàn)證方法的需求。本發(fā)明的一個(gè)目的是，提供可選的和/或改進(jìn)的生物指示物以及它的應(yīng)用。因此，在本發(fā)明的第一方面，提供了生物過程指示物(biologicalprocessindicator)，用于驗(yàn)證旨在降低樣品中生物因子的含量或活性的處理過程，其包括激酶。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，指示物還包括固體支持物，其中的激酶被固定化在所述固體支持物中或被固定化在所述固體支持物上。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，激酶是熱穩(wěn)定激酶。在本發(fā)明的應(yīng)用中，生物指示物被包含在待接受處理的樣品中，所述處理意圖在于降低樣品中的潛在污染物，特別是傳染因子的含量。從以前的試驗(yàn)已知，處理所致指示物激酶活性的降低與污染物的量或活性的降低相關(guān)。為了確定污染物的量/活性是否被降低至可接受水平以下，在處理之前和之后，或在處理過程中測定指示物激酶的活性。當(dāng)達(dá)到已知與污染物中的可接受降低相關(guān)的活性水平時(shí)，則認(rèn)為該處理是有效的。如果污染物是感染因子，則認(rèn)為樣品是無菌的。在本發(fā)明的一個(gè)特殊應(yīng)用中，熱穩(wěn)定激酶是指示一種因子(例如，感染因子)在清潔步驟或失活步驟之后可能存在的方法中的報(bào)告物。首先，含有熱穩(wěn)定的腺苷酸激酶、乙酸激酶或丙酮酸激酶的樣品被暴露于清潔/失活程序(例如，選擇的溫度、PH值或蛋白酶濃度中的一種或多種)。隨后的步驟是通過熱處理去除任何污染的酶活性，例如，在60至80°C，至少10分鐘(S卩，在不明顯影響熱穩(wěn)定激酶的條件下)。隨后使熱穩(wěn)定激酶在30°C至70°C與底物(例如ADP)反應(yīng)，使得ATP產(chǎn)生。ATP的形成可以通過生物發(fā)光檢測而測定，其中應(yīng)用螢光素/螢光素酶和合適的發(fā)光計(jì)，在20-30°C測定10分鐘至1小時(shí)。發(fā)光計(jì)的讀數(shù)給出了殘余激酶活性，即，暴露于清潔/失活處理后的激酶活性的讀數(shù)。根據(jù)以前的單獨(dú)試驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)，該方法通過將殘余激酶活性與被處理樣品中的傳染因子的可能性存在相關(guān)聯(lián)而完成。在一種實(shí)施方案中，在指示物加入之前，樣品中的污染性酶活性或ATP可以通過起始處理步驟(例如，選擇的溫度、PH值或蛋白酶濃度)被去除。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)激酶能夠產(chǎn)生可以在極寬范圍內(nèi)檢測的信號(hào)。一般而言，激酶是應(yīng)用含有ADP的底物被檢測的，ADP轉(zhuǎn)變?yōu)锳TP，ATP本身被用于產(chǎn)生光，例如，應(yīng)用螢光素/螢光素酶，用發(fā)光計(jì)檢測。寬范圍使得指示物特別適于驗(yàn)證，原因是激酶甚至在量/活性降低許多個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)時(shí)保持可檢測。對(duì)于滅菌，大多數(shù)國家機(jī)構(gòu)(nationalinstitutes)認(rèn)為生物因子的量或活性降低6個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)是驗(yàn)證滅菌狀態(tài)所需的。本發(fā)明的激酶提供了驗(yàn)證因子的量或活性的降低程度充分超過6個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)、至8個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)和更多的潛能，因而增加了目前提供的監(jiān)測范圍。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，激酶是熱穩(wěn)定的，因此適于在驗(yàn)證高溫下進(jìn)行的過程中應(yīng)用。也發(fā)現(xiàn)熱穩(wěn)定激酶對(duì)其它極端環(huán)境具有抗性，并且例如，通常發(fā)現(xiàn)其對(duì)極端PH值具有抗性和對(duì)暴露于蛋白水解酶具有抗性。因此本發(fā)明的激酶可以被用來監(jiān)測生物因子的處理，所述處理應(yīng)用高PH值、高溫和蛋白酶中的一種、其組合或全部。熱穩(wěn)定意味著，暴露于70°C30分鐘后，保留至少95%的激酶活性。本發(fā)明的優(yōu)選酶非常熱穩(wěn)定，并且在加熱至80°C10分鐘后將保留至少95%的活性。來自嗜溫生物、甚至是多種嗜熱生物如嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)的激酶(廣泛用作生物指示物)不滿足這些標(biāo)準(zhǔn)，但是適于用作在較低溫度下進(jìn)行處理的指示物。在本發(fā)明特定實(shí)施方案中應(yīng)用的激酶是腺苷酸激酶、乙酸激酶和丙酮酸激酶，或它們的組合。進(jìn)一步地，腺苷酸激酶、乙酸激酶或丙酮酸激酶可以從激烈熱球菌(Pyrococcusfuriousus)、P.abyssi、P.horikoshii、沃氏熱球菌(P.woesii)、硫石黃礦硫化葉菌(Sulfolobussolfataricus)、嗜酸熱硫化葉菌(S.acidocaldarius)、芝田硫化葉菌(S.shibatae)>Rhodothermusmarinus>Thermococcuslitoralis>Thermatogamaritima>Thermatoganeapolitana和甲烷球菌各種(Methanococcusspp.)得到。腺苷酸激酶是特別優(yōu)選的，用在下面詳述的本發(fā)明實(shí)施例中。激酶催化ATP從含ADP的底物中形成，隨后容易地用已知方法和試劑檢測ATP。適用于本發(fā)明的具體激酶在SEQIDNO.s1_30中列出。ATP生物發(fā)光檢測是測定激酶活性的優(yōu)選方法。標(biāo)準(zhǔn)的螢光素_螢光素酶分析方法可以檢測少至10_15摩爾的ATP。通過偶聯(lián)酶擴(kuò)增與生物發(fā)光檢測方法，能夠檢測少至10_2°摩爾的激酶。這種類型的形式從而提供了檢測分子的顯著靈敏性，其中應(yīng)用與腺苷酸激酶(AK)連接的結(jié)合物質(zhì)種類(bindingspecies)，如WO02/053723中所述。偶聯(lián)于生物發(fā)光檢測的激酶、例如AK的應(yīng)用，具有許多其它的明顯優(yōu)勢。本分析在比其它類似分析形式相比大得多的范圍內(nèi)，給出了酶活性和光產(chǎn)物之間的直接關(guān)聯(lián)。因此，雖然應(yīng)用傳統(tǒng)報(bào)告酶如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶的分析將在5-6個(gè)對(duì)數(shù)的稀釋范圍內(nèi)得到成比例的反應(yīng)，但AK-螢光素酶分析可以提供至少8個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)的動(dòng)態(tài)范圍。作為直接指示物，這使得它們對(duì)于需要失活水平高于標(biāo)準(zhǔn)的6個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)范圍的過程特別有用，因?yàn)槠淇梢允剐盘?hào)在整個(gè)分析范圍內(nèi)有意義，這在應(yīng)用其它分析形式時(shí)有些不可能。這與在更壞的情況下，多如8個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)的傳染性存在于外科器械表面時(shí)的TSE失活特別相關(guān)，假定存在每mg高達(dá)IO8傳染單位水平的Img腦組織。在這些情況下，提供8個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)的信號(hào)范圍的本發(fā)明指示物是特別有價(jià)值的。假定過程類型需要TSE指示物，則優(yōu)選高水平的熱穩(wěn)定性和物理穩(wěn)定性。在下面的實(shí)施例中，比較了來自嗜熱生物體的一系列AK酶的性質(zhì)。甚至來自嗜熱生物體如指示菌株嗜熱脂肪芽孢桿菌的AKs在相對(duì)低的溫度下喪失其大部分活性。對(duì)于欲包含在例如高壓滅菌循環(huán)中的基于激酶的指示物，應(yīng)用顯著增強(qiáng)的熱穩(wěn)定性程度，如被來自硫化葉菌屬(Sulfolobus)的種或激烈熱球菌的酶所證明。對(duì)于增加酶、例如激酶對(duì)熱失活的穩(wěn)定性的許多添加劑和對(duì)制劑的改變，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。鑒于本發(fā)明實(shí)施方案中應(yīng)用的熱穩(wěn)定激酶已經(jīng)比這種過程類型中應(yīng)用的其它酶明顯更加穩(wěn)定，它們將需要明顯少的穩(wěn)定作用。本文描述的AK酶，特別是來自嗜酸熱硫化葉菌、硫磺礦硫化葉菌、芝田硫化葉菌、激烈熱球菌、Rhodothermusmarinus和Thermococcus1itoralis的AK酶，在80°C和90V時(shí)明顯更加穩(wěn)定，這是與甚至來自通常用作滅菌過程指示物的生物體如嗜熱脂肪芽孢桿菌的酶相比而言的。在許多情況下，被固定在固體支持物上的這些AK酶不需要進(jìn)一步穩(wěn)定以提供欲在例如高壓滅菌、巴氏滅菌或等價(jià)方法之后測定的所需活性范圍。穩(wěn)定劑，如高達(dá)4M濃度的山梨醇，或高達(dá)2M濃度的其它多元醇如乙二醇、甘油，或甘露醇的添加可以改進(jìn)酶的熱穩(wěn)定性。其它添加劑如木聚糖、海藻糖、明膠也可以單獨(dú)或聯(lián)合提供附加的穩(wěn)定效應(yīng)。一定范圍的二價(jià)金屬離子，最主要是Ca2+、Mg2+或Mn2+的添加也可以改進(jìn)酶穩(wěn)定性。也可以用對(duì)酶的化學(xué)修飾改進(jìn)它們的熱穩(wěn)定性。用乙醛酸對(duì)表面暴露的氨基進(jìn)行還原性烷基化(例如，Melik-Nubarov(1987)BiotechIetts9:725_730)、向蛋白質(zhì)表面加入碳水化合物(例如，Klibanov(1979)Anal.Biochem.931-25)和酰胺化(例如，Klibanov(1983)Adv.Appl.Microbiol.29:1_28)，均可以增加酶的穩(wěn)定性。用于酶固定的其它方法_包括應(yīng)用化學(xué)交聯(lián)劑和應(yīng)用多種聚合物支持物_也是增加酶的熱穩(wěn)定性的相關(guān)方法(在Gupta(1991)Biotech.Appl.Biochem.14:1_11中綜述)。相似的修飾也與指示物對(duì)其它滅菌過程如過氧化氫或臭氧的穩(wěn)定相關(guān)。特別地，氣態(tài)殺菌劑向酶接近受到限制的過程，將在需要時(shí)提供增加酶穩(wěn)定性的有用方法，所述限制是例如，受到包封在合適聚合物中或與降低氣體滲透的添加劑配制的限制。有效增強(qiáng)酶的熱穩(wěn)定性的許多處理也與對(duì)蛋白酶處理的穩(wěn)定性相關(guān)，例如，用于開發(fā)通過蛋白酶處理有效失活TSE因子的指示物。一般而言，表現(xiàn)出高水平熱穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)對(duì)降解過程如變性或蛋白酶處理也可能表現(xiàn)出高度的穩(wěn)定性(參見，例如，DanielRM,CowanDA,MorganHW,CurranMP,"Acorrelationbetweenproteinthermostabilityandresistancetoproteolysis",BiochemJ.1982207641~4；ReesDC,RobertsonAD,"Somethermodynamicimplicationsforthethermostabilityofproteins"，ProteinSci.2001101187-94；BurdetteDS,TchernajenckoW,ZeikusJG.'EffectofthermalandchemicaldenaturantsonThermoanaerobacterethanolicussecondary-alcoholdehydrogenasestabilityandactivity“，EnzymeMicrobTechnol.20002711-18；ScandurraR,ConsalviV,ChiaraluceR,PolitiL,EngelPC,"Proteinthermostabilityinextremophiles",Biochimie.1998Nov；80(11)933-41；禾口LiaoHH.，"ThermostablemutantsofkanamycinnucleotidyltransferasearealsomorestabletoproteinaseK,urea,detergents,andwater—miscibleorganicsolvents",EnzymeMicrobTechnol.1993Apr；15(4):286_92)。/人胃，與介的嗜溫性激酶相比，熱穩(wěn)定激酶通常表現(xiàn)出對(duì)設(shè)計(jì)用來失活TSE因子的蛋白酶處理行為的更高的穩(wěn)定性。根據(jù)應(yīng)用的過程的類型，也可以選擇激酶，以便滿足過程的其它特性。因此，對(duì)于堿性PH下的蛋白酶處理，方案趨向于應(yīng)用來自中度嗜堿生物如激烈熱球菌的熱穩(wěn)定激酶，而在酸性PH下的蛋白酶處理可能應(yīng)用來自嗜酸性生物如嗜酸熱硫化葉菌或硫磺礦硫化葉菌的激酶。如果需要改進(jìn)激酶指示物對(duì)蛋白酶處理的穩(wěn)定性，存在許多其它選擇。這些選擇中的許多與上述針對(duì)熱處理穩(wěn)定酶的方法相同。例如，含有山梨醇、甘露醇或其它復(fù)合聚合物的制劑降低指示物表面的酶的失活水平。此外，特異性降低蛋白酶底物降解速率的處理與此用途特別相關(guān)。例如，在含有充當(dāng)可選的蛋白酶底物的、最高達(dá)約10mg/ml(超過優(yōu)選的指示物濃度10倍)的合適的載體蛋白如酪蛋白或清蛋白的溶液中的激酶制劑，將特異地降低激酶指示物的消化速率。類似地，向制劑中加入游離氨基酸如甘氨酸、酪氨酸、色氨酸或二肽將提供在底物水平對(duì)酶抑制的方法并降低激酶指示物的局部失活。本發(fā)明還提供了通過在細(xì)菌中重組表達(dá)產(chǎn)生多種熱穩(wěn)定激酶的方法，所述激酶用作生物指示物。已經(jīng)顯示，酶的遺傳修飾使熱穩(wěn)定性顯著增加，通過類比，這樣的突變也可能顯著增強(qiáng)指示物酶在其它過程，如蛋白酶處理或氣態(tài)“滅菌”中的穩(wěn)定性。在圖1中顯示的、采用三聚體(古細(xì)菌)AKs的已經(jīng)確定的3-D結(jié)構(gòu)(Vonrheinetal(1998)J.MoI.Biol.282167-179andCriswelletal(2003)J.MoI.Biol.330:1087_1099)，對(duì)激酶熱穩(wěn)定性進(jìn)行比較，鑒定出影響酶穩(wěn)定性的氨基酸。表現(xiàn)出改進(jìn)熱穩(wěn)定性的激酶的遺傳工程變體也在本發(fā)明中被提供和應(yīng)用，并且可以通過許多方法產(chǎn)生。這些主要涉及認(rèn)為形成三聚體分子的中央核心堆積區(qū)(centralcorepackingregion)的氨基酸的特定的位點(diǎn)定向誘變和隨機(jī)“定向進(jìn)化”方法，其中整個(gè)分子經(jīng)歷隨后的誘變和對(duì)具有改進(jìn)性質(zhì)的分子進(jìn)行選擇/篩選的循環(huán)。本文中描述的修飾，例如，在實(shí)施例8-10中描述的修飾，是基于雜交方法，其中根據(jù)觀察到的結(jié)構(gòu)相關(guān)分子之間的差異，應(yīng)用基于共有序列的方法，確定出可能影響酶的熱穩(wěn)定性的區(qū)域。隨后通過將確定變化引入與最佳熱穩(wěn)定性相關(guān)的氨基酸，或者在確定為熱穩(wěn)定性所必須的位置處引入每一可能的氨基酸的隨機(jī)替換。本發(fā)明的特定修飾酶是實(shí)施例8-10中列出的多種變體，將它們共同稱作SEQIDNOs17-19(盡管幾種變體被每一參考符號(hào)所包含)。生物指示物可以適當(dāng)?shù)赜迷谔幚順悠返娜萜髦?。例如，指示物包括為基質(zhì)的固體支持物，激酶分散在所述基質(zhì)中?；|(zhì)應(yīng)當(dāng)耐受處理?xiàng)l件，并且有助于為來自處理的激酶提供保護(hù)_因而對(duì)指示物提供一些穩(wěn)定作用。激酶可以位于聚合物基質(zhì)中。支持物可以被設(shè)計(jì)為，射入或加入到處理容器中，其可以是指示條(indicatorstrip)、蘸棒(dipstick)或珠子。本發(fā)明中包含多種支持物，其帶有或不帶有化學(xué)修飾并帶有多種制劑中的一種或多種激酶指示物，這取決于，例如，待驗(yàn)證過程的需要。在一種形式中，支持物是作為固定裝置的塑料、陶瓷、鋼或其它金屬或聚合物表面，激酶在其上被干燥。支持物可以是聚碳酸酯、聚苯乙烯或聚丙烯條或蘸棒，其可能具有平坦表面，激酶被施加在該表面上。帶有用于連接激酶的多孔表面的其它類型的支持物作為氣態(tài)過程的指示物也特別有用。包被了激酶的塑料、金屬或陶瓷珠子也可以為指示物提供有價(jià)值的形式，這也具有監(jiān)測氣態(tài)過程的特定相關(guān)性。對(duì)于一些用途，這些支持物比固體支持物有優(yōu)勢，因?yàn)樗鼈優(yōu)檫B接指示物提供了明顯增加的表面積。對(duì)于制備用于驗(yàn)證TSE失活過程的設(shè)備的特定實(shí)例，鋼表面如棒(rod)、盤(disk)或切片(coupon)是外科器械除污染的有效指示物。例如，熱穩(wěn)定腺苷酸激酶的結(jié)合是疾病相關(guān)朊病毒異構(gòu)體的聚集形式(PrPse)的非常好的模式，如此提供了顯著好的PrPse與手術(shù)鋼表面相互作用的指示物。激酶在指示物的支持物上結(jié)合或向指示物的支持物的結(jié)合可以通過用于將蛋白質(zhì)連接到表面上的常規(guī)方法獲得，例如，將蛋白質(zhì)在0.IM碳酸氫鈉緩沖液中，在約pH9.6，在室溫下溫育約1小時(shí)?？蛇x地，用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的寬范圍的偶聯(lián)化學(xué)中的任意方法，將蛋白質(zhì)與表面共價(jià)偶聯(lián)。例如，與SPDP(Piercechemicals；采用制造商的指導(dǎo)說明)衍生化、用DTT還原，以提供游離巰基用于交聯(lián)的腺苷酸激酶，被共價(jià)連接到帶有馬來酰亞胺表面的聚苯乙烯支持物。帶有這樣的巰基結(jié)合表面的塑料表面在文獻(xiàn)中充分描述。這種偶聯(lián)方法的另外的益處是，如果需要，可以將酶從支持物切割出來，例如，通過用DTT或MESNA還原，以使得單獨(dú)對(duì)任何指示物支持物進(jìn)行分析。本發(fā)明描述的腺苷酸激酶和其它指示物激酶具有如下性質(zhì)它們?cè)谘苌⑴c這些支持物交聯(lián)后保持活性?？蛇x地，應(yīng)用聚苯乙烯或聚碳酸酯支持物上的胺活性表面，其中應(yīng)用雙功能交聯(lián)劑如單體戊二醛，以通過蛋白質(zhì)上的游離胺基為激酶提供直接的不可切割交聯(lián)。也可以應(yīng)用紫外線(UV)處理直接將指示物連接到合適的支持物。可以用與塑料表面相似的方法處理鋼表面，用以介導(dǎo)指示物激酶的共價(jià)連接。寬范圍的蛋白交聯(lián)劑可以從各個(gè)公司得到，如Piercechemicalcompany(Perbio)。對(duì)巰基、氨基、羥基和羧基有活性的試劑被設(shè)計(jì)成偶聯(lián)蛋白質(zhì)，但是它們可以被相等地用于將蛋白質(zhì)交聯(lián)到天然有活性的或包被的固體支持物如塑料、其它聚合物、玻璃和金屬。也可以利用將酶交聯(lián)到糖的活性化學(xué)物。例如，可以用試劑BMPH((N-[β-馬來酰亞胺基丙酸]酰胼*TFA),KMUH((N-[k_馬來酰亞胺基i^一酸]酰胼)和MPB!K4-(4-N-馬來酰亞胺基苯基)丁酸鹽酸酰胼)(4-N-Maleimidophenyl)butyricacidhydrazidehydrochloride)將含有游離巰基的激酶與糖交聯(lián)，其中巰基的形式或是半胱氨酸殘基或是還原產(chǎn)生巰基活性基團(tuán)的化學(xué)衍生蛋白質(zhì)。這對(duì)于固體支持物可能特別重要，所述支持物是復(fù)合糖(例如紙、基于纖維素的膜、凝膠或樹脂)或者可以用糖溶液包被或處理，產(chǎn)生適當(dāng)?shù)幕钚员砻?。?duì)于每種類型的支持物，激酶優(yōu)選地在增強(qiáng)結(jié)合和/或穩(wěn)定結(jié)合的蛋白質(zhì)的溶液中配制。這樣的制劑包括含有多達(dá)10%(w/v)蔗糖、山梨醇、甘露糖、纖維素或聚乙二醇(PEG)的溶液。此外，激酶可以被配制為施加在合適支持物的表面或腔內(nèi)的凝膠的一部分。實(shí)例包括藻酸鹽、瓊脂或聚丙烯酰胺基質(zhì)。指示物也可以包括穩(wěn)定激酶的制劑，合適的穩(wěn)定劑選自金屬離子、糖、糖醇和凝膠形成劑。為了協(xié)助指示物的應(yīng)用，還可以包括將指示物連接到表面的裝置，如突出部分、凹入部分或孔，用于通過工具如螺釘、螺帽和螺栓或夾具將支持物連接到表面。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，將純化的激酶如腺苷酸激酶(AK)，配制成高達(dá)Img/ml的濃度，并包被在固體支持物上。優(yōu)選地，將Ι-aiig或0.5-lmg或0.1-0.5mg或0.Img的激酶包被在固體支持物上。對(duì)于蛋白酶處理，可以使激酶干燥在類似于微量滴定板的聚丙烯、聚碳酸酯或聚苯乙烯表面上。對(duì)于121°C15-20分鐘的標(biāo)準(zhǔn)高壓滅菌或134°C18分鐘的“朊病毒循環(huán)”高壓滅菌，可以應(yīng)用熱穩(wěn)定性支持物如不銹鋼。對(duì)于氣態(tài)失活步驟如過氧化氫或臭氧，可以應(yīng)用聚碳酸酯固體支持物，其也可以被配制為多孔基質(zhì)，以便在需要時(shí)，對(duì)失活劑提供更高程度的抗性。方便的固體支持物采用蘸棒形式，其從失活步驟直接被轉(zhuǎn)移到含有全部所需分析成分的管中。這可以是與食品和制藥工業(yè)市場上已有的眾多“快速讀出(rapidread-out)“衛(wèi)生監(jiān)測器中的其中一種監(jiān)測器相連的管式發(fā)光計(jì)(tubeluminometer)0可選地，它可以采用為研究中的指示物設(shè)計(jì)的專用設(shè)備形式，特別著重于保持熱穩(wěn)定酶所需的最佳溫度(參見實(shí)施例24)。本發(fā)明也提供了生物指示物，包括在生物因子經(jīng)歷不同水平失活作用后可以檢測的多種酶。一種實(shí)施方案的生物指示物包括支持物、位于第一位置的第一酶和位于第二位置的第二酶，第二位置與第一位置分開。第一酶和第二酶都具有將產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)榈孜锏幕钚裕⑶以谏镏甘疚锉┞队谑Щ钸^程起始時(shí)間段之后，兩種酶的活性均可以被檢測。在生物指示物暴露于失活過程隨后一段時(shí)間后，第一酶的活性不能被檢測到，但是第二酶的活性可以被檢測。在生物指示物暴露于失活過程又一隨后時(shí)間段后，第二酶的活性不能被檢測到。本實(shí)施方案的優(yōu)勢是，可以用指示物表示由過程得到的生物因子的大致失活水平，而無需采取精確的測定。因此，例如，當(dāng)可以測定兩種酶時(shí)，這可以表明，失活沒有達(dá)到一定的閾值。當(dāng)僅可以測定第二酶時(shí)，這表明，失活的第一閾值已經(jīng)達(dá)到，但還沒有達(dá)到第二閾值。最后，當(dāng)兩種酶均不再測得時(shí)，這表明，失活已經(jīng)經(jīng)過了第二閾值。如果第一酶在活性降低程度達(dá)到6個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)時(shí)可以檢測，第二酶在活性降低程度達(dá)到8個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)時(shí)可以檢測，則能夠檢測兩種酶表明，失活沒有達(dá)到6個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)，僅能夠檢測第二酶表明，活性的降低程度已達(dá)到6個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)和8個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)之間，兩種酶均檢測不到表明，活性降低程度達(dá)到了至少8個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)。第一酶適于在活性降低多達(dá)5和8個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)之間時(shí)可檢測，第二酶適于在活性降低6個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)或更多時(shí)可檢測。第一酶優(yōu)選地在活性降低6和7個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)之間時(shí)可檢測，第二酶優(yōu)選地在活性降低7和8個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)之間時(shí)可檢測。生物指示物還可以包括位于第三位置(與第一位置和第二位置分開)的第三酶，其中在生物指示物暴露于失活過程又一隨后時(shí)間段之后，第三酶可以被檢測，并且在生物指示物暴露于失活過程第三個(gè)隨后時(shí)間段之后，第三酶不能被檢測。第三酶適于在活性降低8個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)或更多時(shí)可檢測。應(yīng)用具有在不同水平處理中(例如，不同的暴露時(shí)間)可檢測的多種酶的這種類型的指示物，可以監(jiān)測失活過程的進(jìn)展，并且可以容易地預(yù)測失活的終點(diǎn)。多酶指示物的優(yōu)選酶是激酶，更優(yōu)選地是熱穩(wěn)定的酶，更優(yōu)選地是如本文中公開和描述的與本發(fā)明其它實(shí)施方案相關(guān)的酶。在本發(fā)明的第二方面，提供了試劑盒(任選地是便攜式試劑盒)，用于驗(yàn)證降低樣品中生物因子的量或活性的處理過程，包括(i)根據(jù)本發(fā)明第一方面的生物過程指示物，和(ii)激酶的底物。為了對(duì)激酶量/活性進(jìn)行測定，試劑盒可以包括檢測ATP的工具，例如螢光素/螢光素酶和任選的發(fā)光計(jì)。底物優(yōu)選地是ADP。從前面的對(duì)已知生物因子的試驗(yàn)中，可以得出將生物因子的量或活性的降低程度與激酶活性相關(guān)聯(lián)的數(shù)據(jù)，試劑盒從而也可以包括將激酶活性與指定的一系列生物因子的量或活性的降低程度相關(guān)聯(lián)的一個(gè)或多個(gè)查詢表(look-uptables)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，試劑盒用于監(jiān)測TSE失活。在本發(fā)明的第三方面，提供了驗(yàn)證處理過程的方法，包括(i)獲得樣品，所述樣品含有生物因子，或者懷疑其含有生物因子；(ii)在確定量的激酶存在的情況下，使樣品接受處理，其中所述處理降低生物因子的量或活性；(iii)測定殘余的激酶活性，可選地，計(jì)算激酶活性的降低程度；和(iv)將所述殘余活性與預(yù)先確定的激酶活性相比較，或者將激酶活性的所述降低程度與預(yù)先確定的激酶活性降低程度相比，其中所述預(yù)先確定的激酶活性或預(yù)先確定的激酶活性降低程度相當(dāng)于在相同處理?xiàng)l件下，該生物因子量或活性的確認(rèn)的降低程度。在本文中，激酶可以是本說明書中描述的任一激酶，和/或具有本說明書描述激酶的任意性質(zhì)。優(yōu)選地，激酶被配制為根據(jù)本發(fā)明第一方面的指示物。樣品通常在不存在任何激酶的情況下提供，因此方法可以包括，獲得認(rèn)為含有生物因子的樣品和加入確定量的激酶。因子可以根本不存在(雖然優(yōu)選地，已知樣品含有生物因子)。驗(yàn)證的要點(diǎn)在于，在進(jìn)行處理之后，確認(rèn)曾經(jīng)可能存在的任何因子已被去除/失活至可接受的程度。典型地，操作者在處理樣品之前和處理樣品之后測定激酶活性。也可能有污染的激酶，通常是嗜溫性激酶，可以在激酶活性分析之前進(jìn)入樣品。因此，優(yōu)選的是，加入到樣品的激酶是熱穩(wěn)定的并且分析步驟包括使嗜溫性激酶失活，如在測定殘余激酶活性之前，在70°C處理樣品至少30分鐘，優(yōu)選地在80°C處理樣品至少10分鐘。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)在螢光素/螢光素酶存在的情況下用發(fā)光計(jì)檢測時(shí)，激酶在處理之前的活性是每千克激酶至少10，000，000相對(duì)光單位(RelativeLightUnit)(RLU)，或者每千克激酶至少8，000,000相對(duì)光單位，或者每千克激酶至少5，000,000相對(duì)光單位，或者每千克激酶至少3，000,000相對(duì)光單位，或者每千克激酶至少1，000,000相對(duì)光單位，或者每千克激酶至少500，000相對(duì)光單位。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，預(yù)先確定的激酶活性是小于每千克激酶10，000相對(duì)光單位，或者小于每千克激酶1000相對(duì)光單位，或者小于每千克激酶500相對(duì)光單位，或者小于每千克激酶250相對(duì)光單位，或者小于每千克激酶100相對(duì)光單位，或者小于每千克激酶10相對(duì)光單位，或者小于每千克激酶1相對(duì)光單位，或者是每千克激酶0相對(duì)光單位。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，預(yù)先確定的激酶活性降低程度等于或大于激酶活性1個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)的降低(logreduction)，或者2個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)的降低，或者3個(gè)對(duì)數(shù)的級(jí)降低，或者4個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)的降低，或者5個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)的降低，或者6個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)的降低，或者7個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)的降低，或者8個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)的降低，或者9個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)的降低。在其它實(shí)施方案中，預(yù)先確定的激酶活性降低程度相當(dāng)于激酶的量或濃度至少6個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)的降低，或者7個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)的降低，或者8個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)的降低，或者9個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)的降低。在又一實(shí)施方案中，預(yù)先確定的激酶活性降低程度相當(dāng)于RLU降低至少800，000，或至少900，000，或至少950，000，或至少990，000，或至少999，000，或至少999，900，或至少999，990，或至少999，999RLU。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，樣品中生物因子量或活性的確認(rèn)降低程度是至少6個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)，優(yōu)選地至少7個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)，更優(yōu)選地至少8個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)，最優(yōu)選地至少9個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，持續(xù)處理直至殘余的激酶活性或激酶活性降低程度相當(dāng)于至少6個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)、或至少7個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)、或至少8個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)、或至少9個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)的生物因子量或活性的確認(rèn)降低程度。在本發(fā)明的第四方面，提供了將樣品中生物因子量或活性的降低程度與根據(jù)本發(fā)明第一方面的指示物的激酶活性相關(guān)聯(lián)的方法，包括(i)制備含有確定量的生物因子的樣品和含有限定量激酶的樣品；(ii)使樣品接受處理；(iii)測定殘余的激酶活性，可選地計(jì)算激酶活性的降低程度；(iv)測定生物因子的殘余量或殘余活性，可選地計(jì)算生物因子的量或活性的降低程度；(ν)重復(fù)步驟(i)至(ν)，其中至少一個(gè)處理參數(shù)被變化。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物因子和激酶可以在相同的樣品中存在。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，處理參數(shù)包括時(shí)間、溫度、PH值、壓力、蛋白酶濃度、和殺菌劑或去污劑濃度中的一種或多種。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，處理包括在50-140°C，優(yōu)選地在80-100°C，更優(yōu)選在134-138°C加熱樣品；處理參數(shù)是時(shí)間；通過使樣品接受所述處理1、5、10、20、40和60分鐘時(shí)間，重復(fù)步驟⑴至(iv)。在又一實(shí)施方案中，處理包括將樣品暴露于pH值9-14、優(yōu)選地pH值12或更高、更優(yōu)選地約PH12；處理參數(shù)是時(shí)間；通過使樣品接受所述處理1、5、10、20、40和60分鐘時(shí)間，重復(fù)步驟(i)至(iv)。在另一實(shí)施方案中，處理包括將樣品暴露于濃度是0.5-aiig/ml、優(yōu)選地是約lmg/ml、更優(yōu)選地是約2mg/ml的蛋白酶；處理參數(shù)是時(shí)間；通過使樣品接受所述處理1、5、10、20、40和60分鐘時(shí)間，重復(fù)步驟⑴至(iv)。上述方法使得能夠制備校準(zhǔn)數(shù)據(jù)，用于進(jìn)一步用指示物驗(yàn)證對(duì)含有或懷疑含有生物因子的樣品的處理。許多處理過程的校準(zhǔn)描述于實(shí)施例21-23中。在本發(fā)明的第五方面，提供了激酶作為指示物的應(yīng)用，用于驗(yàn)證降低樣品中生物因子的量或活性的處理過程。在該上下文中，激酶可以是本說明書中描述的激酶中的任一，和/或具有本說明書中描述的激酶的任意性質(zhì)。優(yōu)選地，激酶被配制為根據(jù)本發(fā)明第一方面的指示物?，F(xiàn)在描述應(yīng)用本發(fā)明指示物監(jiān)測/驗(yàn)證多種過程。在一個(gè)實(shí)施方案中，應(yīng)用指示物驗(yàn)證生物洗滌制備物在洗滌循環(huán)中的性能(參見實(shí)施例14)。雖然洗滌循環(huán)的驗(yàn)證將潛在地在家庭環(huán)境中應(yīng)用，其最有優(yōu)勢的用途將是在衛(wèi)生保健、藥學(xué)或食品制備環(huán)境中，例如，用于驗(yàn)證與遭受或暴露于感染因子(例如，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)或諾沃克病毒/諾沃克類病毒發(fā)作)的患者相關(guān)的床上用品、外衣或其它物品的除污染情況。在本文中，本發(fā)明的指示物的優(yōu)勢是，它與生物材料如血液或其它體液有關(guān)。為了驗(yàn)證洗滌循環(huán)，通過將合適的激酶交聯(lián)在柔性棒(flexiblewand)、布條(stripofcloth)或適于包含在循環(huán)中的其它材料上，制備指示物。將指示物和其它加載物放入洗滌器。優(yōu)選地，可以將指示物固定在洗滌器內(nèi)部上合適的固定器中，以便協(xié)助其回收。隨后進(jìn)行洗滌循環(huán)，在對(duì)加載物進(jìn)行任意的進(jìn)一步操作或處理之前，去除指示物并評(píng)價(jià)指示物，其中應(yīng)用“讀數(shù)器(reader)”，讀數(shù)器已被校準(zhǔn)，以便提示指示物中殘余激酶活性的可接受水平-可接受水平來自對(duì)過程中的合適洗滌性能的在前校準(zhǔn)和評(píng)定。這種評(píng)定可能包括污染(soiling)的總水平和微生物的可存活數(shù)，如應(yīng)用技術(shù)人員已知的合適的模式微生物所評(píng)定。根據(jù)校準(zhǔn)的讀數(shù)，加載物被批準(zhǔn)進(jìn)行進(jìn)一步處理，或重復(fù)洗滌循環(huán)。在第二種實(shí)施方案中，應(yīng)用指示物驗(yàn)證病毒失活過程(參見實(shí)施例1。對(duì)環(huán)境中活病毒分離物的檢測是困難的，特別是在與對(duì)速度和精確性要求嚴(yán)格的緊急情況相關(guān)時(shí)。本發(fā)明提供了開發(fā)出使能夠基本上實(shí)時(shí)監(jiān)測除污染步驟的指示系統(tǒng)的可能性。這對(duì)于在病毒因子爆發(fā)(例如，諾沃克類病毒)或蓄意釋放(如天花)后衛(wèi)生保健和相關(guān)設(shè)施的表面除污染是特別有價(jià)值的。驗(yàn)證病毒失活過程的指示物可以采取多種不同形式，例如，用于監(jiān)測噴灑或浸入殺病毒劑的區(qū)域的棒或蘸棒，或者用于監(jiān)測氣態(tài)除污染過程的懸浮指示物?？蛇x地，指示物激酶可以在除污染之前被噴灑在表面上，隨后通過擦拭該表面評(píng)定殘余激酶活性水平。在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，應(yīng)用指示物驗(yàn)證細(xì)菌蛋白毒素，植物毒素如蓖麻毒蛋白和其它毒性蛋白質(zhì)、肽或肽類似物的蛋白酶降解情況(參見實(shí)施例16)。蛋白酶表現(xiàn)出降解寬范圍蛋白毒素的巨大潛能，所述蛋白毒素是潛在的生物戰(zhàn)/生物恐怖襲擊制劑，包括肉毒桿菌毒素、炭疽毒素和蓖麻毒蛋白。它們也具有失活寬范圍的其它潛在具有毒性的或有害蛋白或肽制劑，從而使得能夠?qū)Ρ砻?設(shè)備除污染或?qū)ξ镔|(zhì)進(jìn)行安全處理的潛能。在該上下文中，本發(fā)明的指示物與待除污染的表面/物質(zhì)共同接受蛋白酶除污染步驟。在步驟的末期，移去指示物并根據(jù)本發(fā)明方法評(píng)定殘余激酶活性水平。隨后將殘余激酶活性水平與特定蛋白毒素或毒素群的失活指數(shù)相關(guān)聯(lián)。假定活性水平等于或低于限定的指數(shù)值，則物質(zhì)可以被安全地處理或者表面/設(shè)備被重新使用。優(yōu)選地，將合適的安全極限設(shè)置在失活指數(shù)的校準(zhǔn)中，使得允許過程性能的任何變化。本發(fā)明的中應(yīng)用的酶的附加穩(wěn)定性使其比寬范圍的其它酶指示物更確定地和更動(dòng)態(tài)范圍地進(jìn)行，所述其它酶指示物包括那些來自“熱穩(wěn)定”生物如嗜熱脂肪芽孢桿菌的指示物，如顯示AKs形式嗜熱生物的相對(duì)熱穩(wěn)定性的數(shù)據(jù)所示(圖1，實(shí)施例2)。也可以用指示物驗(yàn)證洗凈藥物生產(chǎn)設(shè)備中的蛋白酶除污染步驟。寬范圍的藥物產(chǎn)品應(yīng)用來自人或動(dòng)物的材料，所述材料可能受到寬范圍因子的污染，包括朊病毒(TSE)因子和病毒(例如，西尼羅病毒、肝炎病毒、HIV)。當(dāng)材料來源是動(dòng)物來源(例如胎牛血清、馬免疫球蛋白)和中間處理期帶有增加特定樣品中未鑒定病原體濃度的風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，風(fēng)險(xiǎn)可能被加重。在制造批次之間應(yīng)用蛋白酶洗凈制造設(shè)備和裝置(例如，層析柱、容器、管)的可能性，具有降低或消除這種風(fēng)險(xiǎn)的潛能，甚至在污染物沒有被正式鑒定時(shí)。這對(duì)朊病毒因子是特別可靠的，例如，具有將感染因子積累和攜帶進(jìn)最終產(chǎn)物的顯著風(fēng)險(xiǎn)的血液分離設(shè)備中的朊病毒因子。為了驗(yàn)證這種類型的步驟，本發(fā)明的指示物理想地被設(shè)計(jì)為欲浸入蛋白酶處理液的蘸棒，或者與待清潔設(shè)備排列連接的筒狀物(cartridge)。通過在處理后評(píng)定指示部件中殘余激酶的活性水平，并將其與可接受的清潔水平相關(guān)聯(lián)，可以開發(fā)快速和性能可靠的監(jiān)測器。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，應(yīng)用指示物驗(yàn)證生物因子如TSE的氣態(tài)失活(參見實(shí)施例17)。許多出版物和文章提出了臭氧或其它氣態(tài)殺菌劑使這種因子失活的潛能，但是，至今為止，沒有方法明確表現(xiàn)出是有效的。為了支持此氣態(tài)技術(shù)的開發(fā)和引入到衛(wèi)生保健中，將需要驗(yàn)證該技術(shù)的性能的方法。由于因子如TSE已經(jīng)表現(xiàn)出比傳統(tǒng)的病毒或細(xì)菌因子對(duì)這種形式的失活作用更具抗性，目前可利用的驗(yàn)證氣態(tài)失活的方法未必合適。本發(fā)明著眼于此問題。對(duì)于這種類型的失活，通過任何適當(dāng)方法將指示物激酶連接在固體支持物上，例如，普通吸附和通過酰胺、肽、羰基或半胱氨酸鍵的化學(xué)交聯(lián)。例如，對(duì)于臭氧滅菌，可以應(yīng)用剛性的聚氯乙烯(PVC)、玻璃、鋼、聚酰胺或聚丙烯支持物，激酶通過以前描述的任一化學(xué)方法偶聯(lián)于支持物。隨后將指示物包含在待滅菌的一批材料/器械中，暴露于臭氧，并針對(duì)設(shè)計(jì)用來評(píng)價(jià)待測因子相應(yīng)失活的適當(dāng)校準(zhǔn)的失活指數(shù)進(jìn)行評(píng)定。成功的失活使得能夠繼續(xù)加工或應(yīng)用材料/器械。指示物可以可選地被連接于管或等價(jià)的內(nèi)部空間的內(nèi)表面，以至于氣體滲透受到限制。這提供了適于評(píng)定氣體滲透入帶有腔的器械的等價(jià)空間、或滲透通過填塞的加載物質(zhì)的監(jiān)測器?？蛇x地，可以將激酶連接于多孔材料如聚苯乙烯珠子，或者可以將其固定在凝膠或樹脂中。在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，應(yīng)用指示物驗(yàn)證液體化學(xué)滅菌系統(tǒng)(例如，Endoclens)，如用于內(nèi)窺鏡和相關(guān)器械的處理(參見實(shí)施例18)。寬范圍的內(nèi)窺鏡常規(guī)用于醫(yī)療中，是醫(yī)學(xué)診斷和治療的重要部分。這些器械極度敏感并且為常規(guī)清潔和消毒提出了非常顯著的問題。傳統(tǒng)地，和在目前的實(shí)踐中仍然存在的，在用低溫方法除污染之前手工清潔內(nèi)窺鏡。已經(jīng)開發(fā)出一些化學(xué)消毒劑和自動(dòng)再處理裝置著眼于對(duì)器械如內(nèi)窺鏡的敏感部件除污染的特殊問題，傳統(tǒng)的高壓滅菌對(duì)于所述敏感部件是不可能的。這些方法有助于降低難于清潔器械上的污染水平，該污染水平與寬范圍的病毒和細(xì)菌病原體的醫(yī)源性傳播相關(guān)。目前驗(yàn)證這種過程的方法是，監(jiān)測洗滌溶液的流速和溫度。本發(fā)明的指示物提供了驗(yàn)證的進(jìn)一步方法，所述方法提供了內(nèi)窺鏡腔內(nèi)的實(shí)際清潔效率的讀數(shù)。對(duì)于這種類型的驗(yàn)證，指示物被連接于設(shè)計(jì)為具有和內(nèi)窺鏡管相似的總內(nèi)徑的管的內(nèi)表面。此指示裝置被串聯(lián)連接于自動(dòng)再處理裝置上的內(nèi)窺鏡。隨后用通常的方式處理內(nèi)窺鏡。在處理末期，優(yōu)選地在將內(nèi)窺鏡從裝置中移去之前，分離指示物并評(píng)定殘余的激酶活性水平。可以將活性水平與從前限定的該過程的可接受性能的閾值相關(guān)，根據(jù)該評(píng)定結(jié)果，可以將內(nèi)窺鏡轉(zhuǎn)移用于另外的清潔或除污染或準(zhǔn)備應(yīng)用。如果性能水平不足，則可以用如前述連接的新的指示物再處理器械(用相同和更嚴(yán)格的條件)。指示裝置也適于驗(yàn)證內(nèi)窺鏡和/或任何其它帶有內(nèi)腔的器械的手工清潔。在制備用于上述驗(yàn)證的指示物時(shí)，優(yōu)選的是，根據(jù)酶的疏水性，使激酶通過非特異性蛋白吸附方法與其支持物粘合。圖5說明了不同的重組激酶以此方式與聚苯乙烯粘合的能力。圖5也說明了，一些激酶對(duì)于這種類型的用途具有更令人滿意的性質(zhì)，例如，與來自T.maritima和A.fulgidus的激酶相比，嗜酸熱硫化葉菌激酶對(duì)這種類型的表面明顯更加粘附。這對(duì)于其它類型的表面可以是不同的，特別是對(duì)表面的粘附可以通過帶電氨基酸殘基進(jìn)行的表面。在此類指示物中，激酶從表面的直接去除是評(píng)價(jià)清潔性能的決定性特征，而不是對(duì)激酶的任何變化或修飾。如此，這類“吸附的”指示物在評(píng)定洗滌性能中有非常寬范圍的應(yīng)用。這對(duì)于驗(yàn)證從設(shè)備如內(nèi)窺鏡的內(nèi)腔有效去除生物膜的過程的能力是特別重要的，因?yàn)檎J(rèn)為它是影響性能的關(guān)鍵因素之一。如此，可以用合適的非感染生物膜作為激酶的基質(zhì)，優(yōu)選地應(yīng)用血清、蔗糖溶液、含水凝膠或刺激生物膜的其它工具，以便確保該過程有效針對(duì)對(duì)此污染形式。適于驗(yàn)證這種過程的其它類型的指示物與以前描述的那些指示物相似，其中激酶被共價(jià)連接于支持物表面，產(chǎn)生化學(xué)連接如二硫鍵、酰胺鍵或羰基鍵。在這些情況下，洗滌和/或滅菌的效果通過修飾激酶被施加，以至于激酶不再有活性。這將與通過斷裂肽鍵、交聯(lián)蛋白質(zhì)或破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的其它方法起作用的化學(xué)殺菌劑特別相關(guān)。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，應(yīng)用指示物監(jiān)測洗滌器-消毒器中的常規(guī)的清潔性能，如在醫(yī)院中應(yīng)用的那些洗滌器-消毒器(參見實(shí)施例19)。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，應(yīng)用指示物監(jiān)測戊二醛或鄰苯二醛(ortho-phthaldehyde)(ΟΡΑ)處理。多年來，戊二醛和甲醛已經(jīng)被廣泛用作殺菌劑。化學(xué)消毒劑通過以非特異方式多重交聯(lián)蛋白質(zhì)，以破壞其功能而起作用。近來，出現(xiàn)鄰苯二醛(OPA)作為此家族的新的消毒劑，由于它避免了與戊二醛有關(guān)的一些毒性問題而被廣泛應(yīng)用。本發(fā)明的指示物適于監(jiān)測所有這種類型的化學(xué)消毒劑，原因是激酶對(duì)這種類型的非特異性交聯(lián)敏感。在這種類型的指示物中，激酶被共價(jià)連接于合適的表面并與待滅菌的其它物品共同暴露于化學(xué)殺菌劑。過程的效率通過移去指示物并測定殘余激酶活性來評(píng)定。將此活性與表明該過程正確性能的限定閾值相比較。不同類型激酶的應(yīng)用可以為過程提供附加的敏感性或靈敏度，如不同用途中可能所需的。本申請(qǐng)中描述的熱穩(wěn)定腺苷酸激酶可以根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)被廣義地歸為兩類。因此，來自硫化葉菌各種的酶是具有含中央疏水核心的三聚結(jié)構(gòu)的酶的例子，所述中央疏水核心是在高溫下維持其活性的主要決定因素。第二類酶是單體酶，由來自Thermotoga各種的腺苷酸激酶示例，但是具有略微更長的多肽鏈，所述多肽鏈帶有影響活性部位的附加的“蓋(Iid)”結(jié)構(gòu)域。這些不同類型的熱穩(wěn)定酶將對(duì)這類化學(xué)殺菌劑表現(xiàn)出不同的敏感性，這是由于在酶作用期間它們的肽鏈的可變的柔性。對(duì)于任何特定的殺菌劑和/或濃度，經(jīng)驗(yàn)篩選將鑒定出具有適當(dāng)靈敏度的酶，用于監(jiān)測和驗(yàn)證這些類型的化學(xué)品。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，應(yīng)用指示物作為環(huán)氧乙烷、過氧化氫或其它氣態(tài)過程的超速讀出監(jiān)測器。目前，寬范圍的氣態(tài)殺菌劑被許多制造商用于細(xì)菌和病毒因子的常規(guī)消毒。本發(fā)明方法利用氣體的氧化性質(zhì)來破壞肽鍵。如此，本發(fā)明的激酶，以它們的堅(jiān)韌的理化性質(zhì)，對(duì)提供非?？焖俚氖Щ钭x出是理想的。該實(shí)施例中的指示物與之前描述的那些指示物相似，例如，與因子如TSE的臭氧失活相關(guān)的指示物。殺菌和除污染過程中的特別有挑戰(zhàn)性的問題是驗(yàn)證大量液體的殺菌情況的能力，這可能在制造許多藥品或其它藥物制品中是必需的。雖然目前的方法監(jiān)測特定過程的溫度、時(shí)間、和/或壓力參數(shù)(根據(jù)其精確性質(zhì))，但驗(yàn)證大量液體中的實(shí)際殺菌情況的可利用方法極少，如果存在這種方法的話。這在甚至約1升體積內(nèi)是困難的，而在更大體積下幾乎是不可能的。本發(fā)明提供了許多解決此問題的可能方案(參見實(shí)施例20)。在最簡單的形式中，可以將激酶加入待滅菌的液體中，激酶的濃度適于測定過程末期激酶失活的限定水平和使該水平等同于滅菌狀態(tài)。雖然這在一些類型的過程中可能不是所希望的，激酶的惰性性質(zhì)和等同酶活性在所有生物體中的普遍存在，使其可以接受?？山邮苄钥梢酝ㄟ^下列事實(shí)得到改進(jìn)許多熱穩(wěn)定酶是被高度濃縮，因此在接種到動(dòng)物中之后具有非常低的免疫源性。當(dāng)這種直接添加不可接受時(shí)，可以將激酶這樣加入大量液體中在透析袋、多孔容器中、或固定在合適的支持物上，以至于沒有激酶部分被釋放到大量液體中，但是滅菌條件以與對(duì)全部樣品相同的方式在指示物上起作用。包含或固定蛋白質(zhì)，以允許液體樣品全面擴(kuò)散但是限制指示物樣品移動(dòng)的寬范圍的可能方法，將是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的?？赡艿氖纠ǖ幌抻谕肝瞿?、Visking管(Viskingtubing)、多孔膜、蛋白結(jié)合樹脂、剛性凝膠或如對(duì)所論述的其它指示物所描述的固體支持物。可以用前述任一方法，將指示物連接于表面，或僅包封在合適的膜中而不連接，這樣，可以在過程結(jié)束時(shí)將指示物簡單地從大量液體中移出。定義部分術(shù)語“生物因子”(biologicalagent)包括感染因子和非感染因子。與本發(fā)明相關(guān)的生物因子的具體例子包含細(xì)菌、病毒、芽孢、蛋白質(zhì)、肽和朊病毒(感染性PrPk形式和非感染性ft·!^形式)，也包含實(shí)施例14-20中描述的特定因子。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，生物因子是傳染性海綿狀腦病。術(shù)語“處理”(treatment)或“處理過程”(treatmentprocess)包括設(shè)計(jì)用來降低樣品中生物因子量或活性的任何過程。合適的處理包括下列中的一種或多種選擇的PH值、溫度或壓力，將樣品暴露于蛋白酶或其它酶，將樣品暴露于去污劑、化學(xué)殺菌劑或氣態(tài)殺菌劑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將處理設(shè)計(jì)為，降低感染性生物因子如TSE的感染活性(也稱為感染性)。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，處理包括將樣品暴露于蛋白酶，溫度是50-120°C之間、優(yōu)選地是60°C或更高、更優(yōu)選地是100°C或更高，和/或?qū)悠繁┞队谥辽?的pH值下、優(yōu)選地PH值是至少12。術(shù)語“處理”也包括清潔和失活過程如利用濕蒸氣或干蒸氣的高溫高壓滅菌、臭氧滅菌、H2O2滅菌、熔解(rendering)或設(shè)計(jì)用于消除或失活生物因子的其它方法。術(shù)語“樣品”(sample)包括任何物品、器械、表面、流體或材料。示例包括但不限于，外科器械和醫(yī)療器械、醫(yī)院衣物、床上用品、大量液體、收集的動(dòng)物材料、藥品、工作臺(tái)、墻壁和地板。術(shù)語“RLU”意味著相對(duì)光單位(RelativeLightUnit)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解，相對(duì)光單位是相對(duì)的而不是絕對(duì)的測定值。說明書中給出的圖涉及用帶有進(jìn)樣系統(tǒng)的BertholdOrion96孔微孔板發(fā)光計(jì)，用“閃光型(flash)”光測定法取得的測定值，在加入螢光素/螢光素酶試劑后即刻2秒鐘測得(光電倍增管的技術(shù)規(guī)范測定在波長300-650nm發(fā)出的光)。為了著眼于此問題，制造商生成了用于RLU“因數(shù)”的數(shù)據(jù)，這使得能夠針對(duì)校準(zhǔn)過的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)給定發(fā)光計(jì)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。因此，可以在不同器械間進(jìn)行比較。本說明書描述的試驗(yàn)中應(yīng)用的BertholdOrion96孔微孔板發(fā)光計(jì)的RLU因數(shù)是1。因此，本說明書給出的RLU值可以被認(rèn)為是標(biāo)準(zhǔn)化的/規(guī)格化的(standardized/normalised)RLU值。關(guān)于絕對(duì)值，RLU值可以與得到所述值所需的ATP濃度相關(guān)，其中應(yīng)用方法(例如，實(shí)施例1的方法)中描述的試劑。作為近似的轉(zhuǎn)變，給出RLU值和ATP濃度之間的線性關(guān)系，可以應(yīng)用下列值權(quán)利要求1.熱穩(wěn)定激酶作為確認(rèn)降低樣品中或樣品上污染生物因子的量或活性的處理過程的指示物的用途其中所述熱穩(wěn)定激酶是腺苷酸激酶、乙酸激酶或丙酮酸激酶；其中所述生物因子選自細(xì)菌、病毒、芽孢、蛋白質(zhì)、肽和朊病毒；其中所述處理過程包括所述樣品和所述熱穩(wěn)定激酶暴露于選擇的PH值、壓力、酶、去污劑、化學(xué)滅菌劑、氣相滅菌劑或者利用濕蒸氣或干蒸氣的高溫高壓滅菌中的一種或多種；以及其中在使用時(shí)，所述激酶和所述生物因子均被直接暴露于所述處理過程。2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中所述激酶催化由含ADP底物形成ATP。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的用途，其中所述激酶是三腺苷酸激酶或單腺苷酸激酶。4.根據(jù)權(quán)利要求3的用途，其中所述激酶是三腺苷酸激酶。5.根據(jù)權(quán)利要求3的用途，其中所述激酶是硫化葉菌各種三腺苷酸激酶或Thermotogasp.單腺苷酸激酶。6.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中所述激酶是來自下列的腺苷酸激酶酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌、A.fulgidus、敏捷氣熱菌、嗜火產(chǎn)液菌、B.caldotenaxBT1、桿菌屬種PS3、嗜熱脂肪芽孢桿菌11057、嗜熱脂肪芽孢桿菌12001、B.thermocatenulatus、C.stercocorarium、甲烷球菌各種、M.ruber、P.abyssi、激烈熱球菌、P.horikoshii、沃氏熱球菌、R.marinus、嗜酸熱硫化葉菌、芝田硫化葉菌、S.solfataricus、產(chǎn)乙醇熱厭氧桿菌、T.thermosulfurogenes、Τ.celere、Τ.litoralis、水生棲熱菌YT1、Τ.caldophilusGK24、嗜熱棲熱菌HB8、T.maritimagJcΤ.neapolitBnB07.根據(jù)權(quán)利要求1-6的任一項(xiàng)的用途，其中在所述處理過程之前，所述熱穩(wěn)定激酶的所述激酶活性被限定為在所述樣品和熱穩(wěn)定激酶暴露于70°C30分鐘使嗜溫性激酶失活的起始步驟后殘余的激酶活性。8.根據(jù)權(quán)利要求1-7的任一項(xiàng)的用途，其中在所述樣品和熱穩(wěn)定激酶起始暴露于700C30分鐘使嗜溫性激酶失活后，所述熱穩(wěn)定激酶保留至少500，000相對(duì)光單位/mg激酶的激酶活性，是在螢光素/螢光素酶存在的情況下，通過發(fā)光計(jì)測定的。9.根據(jù)權(quán)利要求1-8的任一項(xiàng)的用途，其中所述激酶被固定化在固體支持物中或固定化在固體支持物上。10.根據(jù)權(quán)利要求9的用途，其中所述固體支持物是基質(zhì)，所述激酶被分散在所述基質(zhì)中。11.根據(jù)權(quán)利要求10的用途，其中所述固體支持物包括聚合物基質(zhì)。12.根據(jù)權(quán)利要求9-11中任一項(xiàng)的用途，其中所述固體支持物是指示條、蘸棒或珠子。13.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的用途，其中所述指示物還包括穩(wěn)定所述激酶的試劑。14.根據(jù)權(quán)利要求13的用途，其中所述穩(wěn)定劑選自金屬離子、糖、糖醇和凝膠-形成劑。15.根據(jù)權(quán)利要求9-14中任一項(xiàng)的用途，還包括將所述支持物連接于表面的手段。16.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的用途，其中所述生物因子是傳染性海綿狀腦病。17.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的用途，其中所述處理過程包括(i)暴露于至少9的pH、()暴露于蛋白酶、或(iii)暴露于103千帕的壓力和121°C的溫度中的一種或多種。18.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的用途，其中所述處理過程包括，在至少60°C的溫度下和至少為9的pH下，將所述樣品暴露于熱穩(wěn)定蛋白酶。19.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的用途，其中所述激酶具有選自SEQIDNos:l-25的氨基酸序列，或由選自SEQIDNos26-30的核酸序列編碼。20.熱穩(wěn)定激酶氨基酸序列，其選自SEQIDNos17-19。21.包含熱穩(wěn)定激酶氨基酸序列的生物過程指示物，其中所述氨基酸序列選自SEQIDNos:17-19。22.生物過程指示物，其包括(i)熱穩(wěn)定激酶，其中所述激酶是腺苷酸激酶、乙酸激酶或丙酮酸激酶；和()固體支持物，其選自(a)指示條、蘸棒、珠子或基質(zhì)，其中所述激酶被固定化在所述固體支持物內(nèi)，或被共價(jià)偶聯(lián)到所述固體支持物上；或者(b)基質(zhì)，其中所述激酶被分散在所述基質(zhì)中。23.根據(jù)權(quán)利要求22的生物過程指示物，其中所述激酶是三腺苷酸激酶或單腺苷酸激酶。24.根據(jù)權(quán)利要求23的生物過程指示物，其中所述激酶是三腺苷酸激酶。25.根據(jù)權(quán)利要求23的生物過程指示物，其中所述激酶是硫化葉菌各種三腺苷酸激酶或Thermotogasp.單腺苷酸激酶。26.根據(jù)權(quán)利要求22的生物過程指示物，其中所述激酶是來自下列的腺苷酸激酶酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌、A.fulgidus、敏捷氣熱菌、嗜火產(chǎn)液菌、B.caldotenaxBT1、桿菌屬種PS3、嗜熱脂肪芽孢桿菌11057、嗜熱脂肪芽孢桿菌12001、B.thermocatenulatus、C.stercocorarium>禾中、M.ruber>P.￡ibyssi、i^^|f!ii求胃、P.horikoshii、$ft熱球菌、R.marinus、嗜酸熱硫化葉菌、芝田硫化葉菌、S.solfataricus、產(chǎn)乙醇熱厭氧桿菌、T.thermosulfurogenes>T.celere、T.litoralis、7jC生棲熱菌ΥΤ1、Τ·caldophilusGK24、嗜熱棲熱菌HB8、T.maritima或T.neapolitana。27.根據(jù)權(quán)利要求22-26中任一項(xiàng)的生物過程指示物，其中所述熱穩(wěn)定激酶的所述激酶活性被限定為在所述熱穩(wěn)定激酶暴露于70°C30分鐘的起始步驟后殘余的激酶活性。28.根據(jù)權(quán)利要求27的生物過程指示物，所述在所述熱穩(wěn)定激酶暴露于70°C30分鐘后，所述熱穩(wěn)定激酶保留至少500，000相對(duì)光單位/mg激酶的激酶活性，是在螢光素/螢光素酶存在的情況下，通過發(fā)光計(jì)測定的。29.根據(jù)權(quán)利要求22-28中任一項(xiàng)的生物過程指示物，其中所述激酶催化由含ADP底物形成ATP。30.根據(jù)權(quán)利要求22-28中任一項(xiàng)的生物過程指示物，其中所述固體支持物是基質(zhì)，所述激酶被分散在所述基質(zhì)中。31.根據(jù)權(quán)利要求30的生物過程指示物，其中所述支持物包括聚合物基質(zhì)。32.根據(jù)權(quán)利要求22-29中任一項(xiàng)的生物過程指示物，其中所述支持物是指示條、蘸棒或珠子。33.根據(jù)權(quán)利要求22-32中任一項(xiàng)的生物過程指示物，還包括穩(wěn)定所述激酶的試劑。34.根據(jù)權(quán)利要求33的生物過程指示物，其中所述穩(wěn)定劑選自金屬離子、糖、糖醇和凝膠-形成劑。35.根據(jù)權(quán)利要求22-34中任一項(xiàng)的生物過程指示物，還包括將所述指示物連接于表面的手段。36.用于確認(rèn)降低樣品中生物因子的量或活性的處理過程的試劑盒，包括(i)根據(jù)權(quán)利要求21-35中任一項(xiàng)的生物過程指示物；和()所述激酶的底物。37.根據(jù)權(quán)利要求36的試劑盒，還包括檢測ATP的裝置。38.根據(jù)權(quán)利要求37的試劑盒，還包括螢光素/螢光素酶。39.根據(jù)權(quán)利要求36-38中任一項(xiàng)的試劑盒，還包括發(fā)光計(jì)。40.根據(jù)權(quán)利要求36-39中任一項(xiàng)的試劑盒，還包括將所述指示物的激酶活性與所述生物因子的量或活性的降低程度相關(guān)聯(lián)的查詢表。41.根據(jù)權(quán)利要求36-40中任一項(xiàng)的試劑盒，用于監(jiān)測TSE失活。42.根據(jù)權(quán)利要求36-41中任一項(xiàng)的便攜式試劑盒。43.確認(rèn)處理過程的方法，包括(i)獲得樣品，所述樣品含有污染生物因子，或者懷疑其含有污染生物因子，其中所述生物因子選自細(xì)菌、病毒、芽孢、蛋白質(zhì)、肽和朊病毒；()在確定量的熱穩(wěn)定激酶存在的情況下，使所述樣品接受處理，所述處理包括暴露于選擇的PH值、壓力、酶、去污劑、化學(xué)滅菌劑、氣相滅菌劑或者利用濕蒸氣或干蒸氣的高溫高壓滅菌中的一種或多種，其中所述激酶是腺苷酸激酶、乙酸激酶或丙酮酸激酶；其中所述激酶和所述生物因子均被直接暴露于所述處理過程；和其中所述處理過程降低所述生物因子的量或活性；(iii)測定殘余的激酶活性；和(iv)將所述殘余活性與預(yù)先確定的激酶活性相比較，其中所述預(yù)先確定的激酶活性相當(dāng)于在相同處理?xiàng)l件下，所述生物因子量或活性的確認(rèn)的降低程度。44.根據(jù)權(quán)利要求43的方法，其中所述激酶是三腺苷酸激酶或單腺苷酸激酶。45.根據(jù)權(quán)利要求44的方法，其中所述激酶是三腺苷酸激酶。46.根據(jù)權(quán)利要求44的方法，其中所述激酶是硫化葉菌各種三腺苷酸激酶或Thermotogasp.單腺苷酸激酶。47.根據(jù)權(quán)利要求43的方法，其中所述激酶是來自下列的腺甘酸激酶酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌、A.fulgidus、敏捷氣熱菌、嗜火產(chǎn)液菌、B.caldotenaxBTl、桿菌屬種PS3、嗜熱脂肪芽孢桿菌11057、嗜熱脂肪芽孢桿菌12001、B.thermocatenulatus、C.stercocorarium、甲烷球菌各種、M.ruber、P.abyssi、激烈熱球菌、P.horikoshii、沃氏熱球菌、R.marinus、嗜酸熱硫化葉菌、芝田硫化葉菌、S.solfataricus、產(chǎn)乙醇熱厭氧桿菌、T.thermosulfurogenes、Τ.celere、Τ.litoralis、水生棲熱菌YT1、Τ.caldophilusGK24、嗜熱棲熱菌HB8、T.maritimagJcΤ.neapolitBnB048.根據(jù)權(quán)利要求43-47中任一項(xiàng)的方法，其中所述激酶具有選自SEQIDNos:l-25的氨基酸序列，或由選自SEQIDNos26-30的核酸序列編碼。49.根據(jù)權(quán)利要求43-48的任一項(xiàng)的方法，其中已知所述樣品含有所述生物因子。50.根據(jù)權(quán)利要求43-49中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物因子是傳染性海綿狀腦病。51.根據(jù)權(quán)利要求43-50中任一項(xiàng)的方法，其中所述處理包括(i)暴露于至少為9的pH、(ii)暴露于蛋白酶、或(iii)暴露于103千帕的壓力和121°C的溫度中的一種或多種。52.根據(jù)權(quán)利要求51的方法，其中所述處理包括，在50-120°C范圍的溫度下，將所述樣品暴露于熱穩(wěn)定蛋白酶。53.根據(jù)權(quán)利要求52的方法，其中所述處理過程包括，在60°C或更高的溫度下，將所述樣品暴露于所述蛋白酶。54.根據(jù)權(quán)利要求51的方法，其中所述處理過程包括在pH值為9或更高時(shí)，將所述樣品暴露于所述蛋白酶。55.根據(jù)權(quán)利要求43-54中任一項(xiàng)的方法，包括在處理所述樣品前和處理所述樣品后測定激酶活性。56.根據(jù)權(quán)利要求55的方法，其中在所述處理過程之前所述熱穩(wěn)定激酶的所述激酶活性被限定為在所述樣品和熱穩(wěn)定激酶暴露于70°C30分鐘使嗜溫性激酶失活的起始步驟后殘余的激酶活性。57.根據(jù)權(quán)利要求55或56的方法，其中所述熱穩(wěn)定激酶在所述處理過程之前的活性是至少500，000相對(duì)光單位/mg激酶，是在螢光素/螢光素酶存在的情況下，通過發(fā)光計(jì)測定的。58.根據(jù)權(quán)利要求57的方法，其中所述預(yù)先確定的激酶活性低于10，000相對(duì)光單位/mg激酶，是在螢光素/螢光素酶存在的情況下，通過發(fā)光計(jì)測定的。59.根據(jù)權(quán)利要求43-58的任一項(xiàng)的方法，其中所述預(yù)先確定的激酶活性降低程度等于或高于6個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)的降低。60.根據(jù)權(quán)利要求59的方法，其中所述預(yù)先確定的激酶活性降低程度相當(dāng)于激酶的量或濃度降低至少6個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)。61.根據(jù)權(quán)利要求43-60的任一項(xiàng)的方法，其中所述預(yù)先確定的激酶活性降低程度相當(dāng)于相對(duì)光單位降低至少900，000RLU。62.根據(jù)權(quán)利要求43-61的任一項(xiàng)的方法，其中所述生物因子的量或活性的確定降低程度是至少6個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)的降低。63.根據(jù)權(quán)利要求43-62的任一項(xiàng)的方法，包括在測定殘余激酶活性之前，于80°C處理所述樣品至少10分鐘。64.根據(jù)權(quán)利要求43-63的任一項(xiàng)的方法，其中測定殘余激酶活性包括向所述殘余激酶中加入含ADP底物，和測定ATP的形成。65.根據(jù)權(quán)利要求43-64的任一項(xiàng)的方法，包括持續(xù)所述處理，直至所述殘余激酶活性或所述激酶活性降低程度相當(dāng)于所述生物因子的量或活性的確定降低程度是至少6個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)。66.將樣品中污染生物因子的量或活性的降低程度與根據(jù)權(quán)利要求21-35中任一項(xiàng)的指示物的熱穩(wěn)定激酶活性關(guān)聯(lián)的方法，其中所述生物因子選自細(xì)菌、病毒、芽孢、蛋白質(zhì)、肽和朊病毒，包括(i)制備含有確定量的所述生物因子的樣品和含有確定量的所述熱穩(wěn)定激酶的樣品；()使所述樣品接受處理，包括暴露于選擇的PH值、壓力、酶、去污劑、化學(xué)滅菌劑、氣相滅菌劑或者利用濕蒸氣或干蒸氣的高溫高壓滅菌中的一種或多種，其中所述激酶和所述生物因子被直接暴露于所述處理；(iii)測定所述激酶的殘余活性；(iv)測定所述生物因子的殘余量或殘余活性；和(ν)重復(fù)步驟(i)至(iv)，其中至少一個(gè)處理參數(shù)被改變。67.根據(jù)權(quán)利要求66的方法，其中所述生物因子是傳染性海綿狀腦病。68.根據(jù)權(quán)利要求66或67中任一項(xiàng)的方法，其中所述處理參數(shù)包括時(shí)間、溫度、pH值、壓力、蛋白酶濃度和殺菌劑或去污劑濃度中的一個(gè)或多個(gè)。69.根據(jù)權(quán)利要求66-68中任一項(xiàng)的方法，其中所述處理包括，在50-140°C之間的溫度下，加熱所述樣品；所述處理參數(shù)是時(shí)間；以及其中通過使所述樣品接受所述處理1、5、10、20、40和60分鐘，重復(fù)所述步驟(i)至(iv)。70.根據(jù)權(quán)利要求66-69中任一項(xiàng)的方法，其中所述處理包括，將所述樣品暴露于9-14的pH下；所述處理參數(shù)是時(shí)間；以及其中通過使所述樣品接受所述處理1、5、10、20、40和60分鐘，重復(fù)所述步驟(i)至(iv)。71.根據(jù)權(quán)利要求66-70中任一項(xiàng)的方法，其中所述處理包括，將所述樣品暴露于濃度為0.5-2mg/ml的蛋白酶；所述處理參數(shù)是時(shí)間；以及其中通過使所述樣品接受所述處理1、5、10、20、40和60分鐘，重復(fù)所述步驟(i)至(iv)。全文摘要將激酶用在生物指示物中，用于驗(yàn)證設(shè)計(jì)用來降低樣品中生物因子的量或活性的處理過程?？梢詫⒅甘疚镉糜隍?yàn)證滅菌處理。從包含ADP的底物形成ATP是通過發(fā)光計(jì)中的螢光素/螢光素酶系統(tǒng)得以測定。來自嗜酸熱硫化葉菌的熱穩(wěn)定腺苷酸激酶特別適合用于驗(yàn)證失活傳染性海綿狀腦病(TSE)因子的步驟。文檔編號(hào)C12Q1/48GK102174643SQ201110045849公開日2011年9月7日申請(qǐng)日期2005年3月22日優(yōu)先權(quán)日2004年3月22日發(fā)明者J·M·薩頓,N·D·H·雷文申請(qǐng)人:健康保護(hù)機(jī)構(gòu)